Автореферат и диссертация по медицине (14.00.19) на тему:Поздние гематологические эффекты локального терапевтического гамма-облучения больных лимфомой Ходжкина

На правах рукописи

ТЕРЕХОВА Алена Юрьевна

ПОЗДНИЕ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ЛОКАЛЬНОГО ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ГАММА-ОБЛУЧЕНИЯ БОЛБНЫ1Х ЛИМФОМОЙ ХОДЖКИНА

14.00.19 - лучевая диагностика, лучевая терапия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Обнинск -2004

Диссертационная работа выполнена в Государственном учреждении -Медицинском радиологическом научном центре РАМН

Научные руководители:

кандидат медицинских наук В.В.Павлов доктор биологических наук ИАЗамулаева

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук П.В. Даценко

доктор биологических наук, профессор А.Г. Конопляников

Ведущая организация: Гематологический научный центр РАМН, Москва

в // часов на заседании диссертационного совета Д001.011.01 в ГУ-Медицинском радиологическом научном центре РАМН (249036, Калужская область, г. Обнинск, ул. Королева, 4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ-Медицинского радиологического научного центра РАМН.

Защита диссертации состоится » 2004г.

Автореферат разослан

»

2004 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

В.А. Куликов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. В связи с широким применением лучевой терапии в онкологии и гематологии, актуальной проблемой является изучение поздних последствий облучения кроветворной ткани, которая вследствие высокой пролиферативной активности и быстрого обновления относится к одной из наиболее радиочувствительных систем организма (А.Г. Конопляников, 1984). Исследование механизмов поздних лучевых реакций на клеточном уровне необходимо как для понимания механизмов развития поздних лучевых поражений, так и в практическом плане для возможной оптимизации терапевтических программ. Представляет особый интерес изучение клеток стволового типа, которые, по общему мнению, определяют непосредственные и поздние реакций кроветворной ткани на облучение.

Благодаря значительному улучшению результатов лечения больных

лимфомой Ходжкина (ЛХ) и возможности длительного наблюдения за ними

после излечения, эта группа пациентов может служить моделью для изучения

поздних последствий облучения. К настоящему времени накоплены достаточно

обширные сведения, касающиеся поздних лучевых изменений кроветворной

системы у больных ЛХ, полученные с применением методов морфологического

анализа, иммунологических подходов, а также с помощью культуральных

методов исследования гемопоэтических и стромальных клеток-

предшественников. Установлено, что пороговая доза, вызывающая

необратимую аплазию облученных участков костного мозга, соответствует

СОД ЗО±5 Гр (В.В. Павлов, Г.Д. Байсоголов, 1971). В необлученных участках

костного мозга наблюдается компенсаторная активация кроветворения,

прослеженная до 10 лет после окончания лечения (И.П. Шишкин, 1976). Между

10 и 20 годами наблюдения развивается гипоплазия необлученных участков

костного мозга (Г.Д. Байсоголов, Т.И. Богатырева, 1986; М.А. Данилова, 1997).

Следует отметить, что диагностическая спленэктомия, осуществлявшаяся у

НАЦИОНАЛЬНАЯ I

БИБЛИОТЕКА I , ]

части пациентов, оказывает значительное воздействие на характер кроветворения в отдаленном постлучевом периоде (Т.И. Осалчая, 1981). Большое количество литературных данных свидетельствует о значительных изменениях, которые претерпевают субпопуляции лимфоцитов крови в отдаленные сроки после обличения лимфоидной ткани у больных ЛХ (Z. Fuks et al., 1976; M.R. Posner et al., 1983; G.S. Haas et al., 1984).

Однако, полученные сведения не позволяют в полной мере представлять целостную картину развития поздних реакций со стороны различных клеточных популяций кроветворной и иммунной систем человека. Отсутствуют критерии оценки состояния кроветворения больных ЛХ в отдаленные сроки после окончания лечения, поскольку в литературе нет сведений об особенностях субпопуляционного состава костного мозга у лиц соответствующих возрастных групп контроля.

Можно было полагать, что новую ценную информацию об отдаленном влиянии радиации на состояние кроветворной и иммунной систем человека, а также о компенсаторных возможностях гемопоэза можно получить с помощью метода проточной цитометрии, который, как известно, обладает высокой информативностью для анализа линейной принадлежности клеток, их уровня дифференцировки и пролиферативной активности.

При проведении лучевой терапии на область шеи в зону прямого воздействия ионизирующего излучения попадает щитовидная железа - орган, состояние которого сказывается на функционировании разных систем и, в том числе, системы гемопоэза. В частности, известен факт влияния гипотиреоза на развитие гипопластической и некоторых других видов анемий (L.H. Duntas et al., 1999). Поэтому нам представлялось целесообразным также исследовать влияние функционального состояния щитовидной железы на эритроидный росток кроветворения у больных лимфомой Ходжкина в отдаленные сроки после лучевой терапии.

Цель работы. Целью настоящей работы явилось изучение состояния кроветворения в отдаленные сроки после локального терапевтического облучения больных лимфомой Ходжкина. В задачи исследования входило:

1. Изучение динамики показателей гемопоэза в необлученных участках костного мозга больных ЛХ в ремиссии длительностью 20 и 25 лет в сравнении с возрастным контролем.

2. Исследование особенностей кроветворения в зависимости от лечебного воздействия на селезенку (облучение/спленэктомия).

3. Оценка состояния компенсаторных возможностей кроветворения по данным исследования необлученных участков костного мозга.

Научная новизна. В работе приводятся новые сведения, полученные с использованием метода проточной цитометрии, о состоянии клеточных популяций необлученного костного мозга больных ЛХ в отдаленный постлучевой период в сравнении со здоровыми лицами аналогичного возраста.

Установлен факт преждевременного старения кроветворной и иммунной систем вследствие лучевой аплазии части кроветворного костного мозга и лимфоидной ткани, о чем свидетельствует:

-снижение общей клеточности костного мозга за счет сокращения гранулоцитарного, эритроидного и лимфоидного ростков кроветворения;

-сокращение эритроидного ростка кроветворения за счет более зрелых субпопуляций эритроидных предшественников GPA+CD71-;

-дефицит Т-лимфоцитов CD3+CD19- (в основном за счет фракции цитотоксических/супрессорных клеток).

Проведено подробное изучение стволовых клеток, как полипотентных, так и находящихся на более поздних этапах дифференцировки. При этом установлено, что общее количество стволовых кроветворных клеток CD34+-, наименее дифференцированных, из исследованных нами, стволовых клеток CD34+CD38-, а также клеток стволового типа, коммитированных в миелоидном

CD34+CD33-r и В-лимфоидном направлении CD19+CD20- соответствует возрастной норме.

Получены новые сведения о модифицирующем влиянии спленэктомии на гемопоэз. В частности у больных через 16-34 года после спленэктомии по сравнению с лицами после облучения селезенки отмечено:

- высокое содержание NK-клеток CD3-CD 16,56+;

- увеличение содержания цитотоксических/супрессорных клеток CD4-CD8+;

-сокращение пула стволовых гемопоэтических клеток CD34+, наименее дифференцированных стволовых клеток CD34+CD38-, клеток коммитированных в В-лимфоидном направлении CD19+CD20-.

Изучены компенсаторные возможности кроветворения, в условиях аплазии • 20-25% кроветворного костного мозга при этом обнаружено:

-нормальное содержание клеток в S-фазе среди миелокариоцитов; -нормальное содержание клеток в S-фазе среди стволовых кроветворных клеток.

Практическая ценность работы. Данные проведенного исследования имеют важное значение, как для практической онкологии, так и для теоретической медицины в плане разработки подхода к изучению поздних лучевых изменений кроветворной системы. Полученная информация может быть использована как для прогноза отдаленных эффектов неравномерного облучения организма человека, так и для разработки оптимальных схем лучевой и комбинированной терапии ЛХ с минимальным риском поздней гипоплазии кроветворной системы.

Полученные результаты являются обоснованием для сокращения объема и уменьшения суммарных очаговых доз лучевой терапии ЛХ с целью минимизации риска поздней .гипоплазии кроветворной системы. Нашими-исследованиями показана необходимость систематического наблюдения за

состоянием кроветворной и иммунной систем излеченных пациентов в отдаленные сроки после лучевой терапии.

Апробация работы. Материалы исследования были представлены: на IV съезде по радиационным исследованиям; (Москва, 2001); на - VIII Международной конференции по злокачественным лимфомам (г. Лугано, 2001); на Российско-Голландской конференции «Диагностика и лечение лимфом» (Санкт-Петербург, 2002); на конкурсе научных работ «Наука-клинической практике» (Обнинск, 2002). Диссертационная работа апробирована 25 марта 2004 г. на научной конференции клинического сектора ГУ-МРНЦ РАМН. Публикации. Основные результаты исследований, представленных в диссертационной работе, изложены в 5 публикациях.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает введение, 6 глав и выводы. Работа содержит 123 страницы машинописного текста, включающего 17 таблиц, 7 рисунков, 4 диаграммы. Список цитированной литературы насчитывает 131 источник, из них 50 отечественных и 81 зарубежный.

Основные положения диссертации., выносимые на защиту;

1. Лучевая терапия ЛХ приводит к развитию трехростковой гипоплазии в необлученных участках костного мозга в отдаленные сроки (24-34 года) после лечения; эти изменения, трактуются как преждевременное старение кроветворной и иммунной систем, вследствие необратимых повреждений, происходящих в центральных и периферических органах гемопоэза, получивших лучевые нагрузки в ходе лечения.

2. Изменения кроветворения затрагивают поздние этапы дифференцировки. клеток в необлученных участках костного мозга, в то же время количество кроветворных клеток стволового типа соответствует контрольному уровню.

3. Спленэктомия, являясь модифицирующим гемопоэз фактором, приводит к изменению лимфоидных субпопуляций в необлученных областях костного мозга (к более высокому содержанию цитотоксических/супрессорных

лимфоцитов и NK-клеток). В отдаленные сроки после спленэктомии наблюдается сокращение пула стволовых гемопоэтических клеток, вероятно, вследствие их более интенсивного потребления в ранний постлучевой период.

4. Пролиферативная активность необлученного костною мозга, оцененная, по содержанию клеток в S-фазе, соответствует возрастной норме, что позволяет предположить существование механизмов компенсации сдвигов, развивающихся в отдаленные сроки после относительно небольшого сокращения плацдарма кроветворения.

МАТЕРИАЛЫ и МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Нами были изучены показатели кроветворения у 53 пациентов в отдаленные сроки после проведения лучевой терапии по поводу ЛХ. Все пациенты, включенные в исследование, находились в стойкой клинико-гематологической ремиссии ЛХ. В соответствии с задачами работы все пациенты были разделены на группы, продолжительность ремиссии в которых составила 16-22 года (медиана 20 лет) - первая группа и 23-34 года (медиана 25 лет) - вторая группа. Первую группу составили 42 человека в возрасте от 33 до 66 лет (медиана 42 года), среди которых было 12 мужчин и 30 женщин. Вторую группу составили 23 человека в возрасте от 41 до 60 лет (медиана 47 лет), среди которых было 7 мужчин и 16 женщин. 12 человек обследованы дважды и входили в состав как-первой, так и второй группы. Таким образом, число наблюдений в данном исследовании составило 65.

Всем больным в период с 1968 по 1985г была проведена дистанционная гамма-терапия на установках «Рокус» и «Агат» со встречных полей при расстоянии источник - кожа 75 или 84 см, в разовой очаговой дозе 1,9-2,1 Гр, недельной- порядка 10-11 Гр. Суммарную дозу на очаги поражения доводили до 40-45Гр. Оценку поглощенной дозы проводили расчетным методом. Облучению

подвергали лимфатические коллекторы выше диафрагмы и селезенку, лучевая терапия осуществлялась в два этапа. Большинству больных на первом этапе проводили дистанционную гамма-терапию на шейно-надключичные области и средостение, затем облучали лимфатические коллекторы подмышечных областей и селезенку. На диагностическом этапе 14 пациентам была выполнена спленэктомия, остальным пациентам проводилось облучение селезенки.

Группу возрастного контроля составили 22 человека без наличия гематологических заболеваний, среди которых было 7 женщин и 15 мужчин, в возрасте 35-64 лет (медиана 48 лет). Средний возраст в контроле соответствовал возрасту пациентов, находящихся в 25 летней ремиссии.

Материалом для исследования служили аспираты костного мозга, полученные при пункции передней ости крыла подвздошной кости в количестве 1,0 мл, и периферическая кровь.

Оценивали следующие показатели:

- морфологический состав периферической крови (п= 87);

- количество миелокариоцитов, морфологический состав пунктатов костного мозга из подвздошной кости (п=72);

С помощью проточноцитометрического исследования пунктатов костного мозга (п=50) определяли:

-долю клеток, экспрессирующих общий лейкоцитарный антиген CD45, характерный для лимфоцитов, а также долю клеток, несущих на своей поверхности гликофорин А (СРА)-маркер эритроидного ряда дифференцировки;

-относительное и абсолютное содержание клеток, представляющих основные субпопуляции лимфоцитов: CD4+CD8- хелперные/эффекторные лимфоциты, CD4-CD8+ супрессорные/цитотоксические лимфоциты, CD3+CD19- Т-лимфоциты, CD3-CD19+ В-лимфоциты, CD3-CD16, 56+ натуральные киллеры;

-относительное и абсолютное содержание клеток, представляющих эритроидные субпопуляции: GPA+CD34+ наименее дифференцированные эритроидные предшественники, GPA+CD71+, GPA+CD71- клетки на разных этапах эритроидной дифференцировки;

-долю стволовых гемопоэтических CD34+ клеток и их субфракции: CD34+CD38- наиболее ранние предшественники из исследованных нами, не имеющие признаков линейной принадлежности, CD34+CD33+ предшественники клеток миелоидного ростка кроветворения, CD19+CD20-про-В клетки;

-относительное содержание S-фазных клеток среди миелокариоцитов и среди стволовых кроветворных клеток костного мозга.

Иммунофенотипический метод определения содержания клеточных субпопуляций в костном мозге. Иммунофенотипирование клеток костного мозга проводили с помощью окрашивания клеток костного мозга моноклинальными антителами (МКАТ). Использовали следующие комбинации антител, меченных разными флуорохромами (ФИТЦ-флюоресцеин-5-изотиоцинатом и ФЭ-фикоэритрином), производства Becton- Dickinson Immunocytometry Systems (BDIS, США): антитела к гемоцианину Fissurella IgGl-ФИТЦ/ IgGZ-ФЭ (контроль неспецифического связывания); СО45-ФИТЦ/ CDM-ФЭ/ GPA-ФЭ; СОЗ-ФИТЦ/СО(16+56)-ФЭ; СО4-ФИТЦ/СО8-ФЭ; CD71-ФИТЦ/СРА-ФЭ; CD34- ФИТЦ/GPA-ФЭ; СО34-ФИТЦ; СО34-ФИТЦ/СОЗЗ-ФЭ; СО34-ФИТЦ ДЛШ-ФЭ; СО20-ФИТЦ /СО19-ФЭ.

Окраску образцов костного мозга проводили по стандартной методике рекомендованной фирмой-изготовителем моноклональных антител, в два этапа: 1) окрашивание клеток костного мозга с помощью указанных МКАТ; 2) лизирование эритроцитов в гипотоническом растворе Facs Lysing (BDIS, США). Анализ иммунофенотипа клеток костного мозга проводили на проточном цитофлуориметре FACS Vantage (BDIS, USA), оборудованным 488 нм аргоновым лазером (Enterprise 621, Coherent Inc., USA). Результаты

измерения показателей светорассеяния и флюоресценции каждой клетки записывали в файл, затем проводили компьютерную обработку с использованием программы Lysys II (BDIS, США). На первом этапе

обработки данных выделяли популяцию клеток с низким боковым светорассеянием, характерным для зрелых лимфоцитов и низкодифференцированных клеток-предшественников различных ростков кроветворения, включая эритроидные (F. Silvestri et al., 1992). На втором этапе анализировали флуоресценцию выделенных клеток с учетом контроля песпецифического связывания.

Абсолютное количество клеток в лимфоидных и эритроидных субпопуляциях костного мозга определяли, пересчитывая процент каждой клеточной субпопуляции на абсолютное количество эритроидтгых и лимфоидных клеток по данным миелограммы.

Исследование содержания S-фазных клеток в костном мозге с помощью метода проточной цитометрии. Долю клеток в фазе синтеза ДНК определяли, основываясь на анализе содержания ДНК в каждой клетке. Для окрашивания ДНК использовали йодистый пропидий (Sigma, США) после предварительной пермебеализации мембран с помощью обработки неионным детергентом тритоном Х-100 (Sigma, США). С помощью программы Cell FIT (BDIS, США) анализировали распределение клеток по интенсивности флуоресценции указанного красителя. Долю S-фазных клеток определяли в соответствии, с моделью RFIT среди миелокариоцитов и среди CD34+ клеток.

Оценка функционального состояния щитовидной, железы. Функциональное состояние щитовидной железы оценивали по содержанию в крови тиреотропного гормона (ТТГ), свободного тироксина (Т4). Кроме того, исследовали антитела к тиреоглобулину и микросомальные антитела.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку всех результатов проводили с помощью программы Origin 6.0 (Microcal

Software. Inc.). Рассчитывали достоверность различий, используя критерий Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ОБСУЖДЕНИЕ

Показатели периферической- крови. Морфологический состав периферической крови пациентов, обследованных в отдаленные сроки после лучевой терапии,. не зависел от продолжительности ремиссии и соответствовал показателям группы возрастного контроля. Исключение составило содержание тромбоцитов, количество которых у пациентов, подвергнутых спленэктомии, было повышено по сравнению с группой неоперированных пациентов и с группой контроля (р<0,05).

Морфологическая характеристика- необлученного костного мозга.

Исследование аспиратов костного мозга, продемонстрировало статистически значимое снижение клеточности пунктатов с увеличением продолжительности ремиссии, что в определенной степени отражает возрастную динамику костномозгового кроветворения, выражающуюся в снижении клеточности костного мозга с увеличением возраста (Г.И. Козинец и соавт., 2002). Однако снижение клеточности костного мозга у лиц, получавших лучевое лечение, было более выраженным по сравнению с возрастной нормой. Так, в костномозговых аспиратах, через 25 лет после окончания лечения происходило значительное снижение содержания миелокариоцитов по сравнению с группой возрастного контроля (табл. 1). Морфологическое исследование костномозговых пунктатов свидетельствоваю о развитии двухростковой гипоплазии, заключавшейся в значительном снижении относительного и абсолютного содержания клеток эритроидного ряда, а также в снижении абсолютного количества незрелых гранулоцитов у пациентов, находящихся в ремиссии 25 лет, в сравнении с нормальными показателями (р<0,05).

Таблица 1

Клеточный состав костного мозга из крыла подвздошной кости у больных ЛХ в отдаленные сроки после терапевтического гамма-облучения с захватом 2035% объема гемопоэтической ткани (М ± т).

Продолжительность ремиссии 20 лет п=39 25 лет п= 19 контроль п=14

Возраст Диапазон 33-66 41-60 39-64

Медиана 42 47 48

Клеточность, тыс/мкл 46,0±4,7А 30,8±3,6* 47,2±6,1

Лимфоидные клетки, % содержание абс. кол-во, тыс/мкл 20,7± 1,3 8,7±0,6Л 20,2±1,4 5,7±0,7 16,1±1,2 7,3±1,0

Гранулоциты незрелые, % содержание абс. кол-во, тыс/мкл 15,2±1,0 8,3±1,3Л 13,8±0,9 4,3±0,6* 15,2±1,4 6,8±1,3

Эритроидный росток, % содержание абс. кол-во, тыс/мкл 14,8±1,1 8,0±1,1л 13,1±1,2* 4,4±0,7* 19,8±1,9 11,0±1,7

лр<0,05 в сравнении с группой больных ЛХ спустя 25 лет после терапевтического облучения *р<0,05 в сравнении с группой возрастного контроля

Абсолютное количество лимфоидных клеток в миелограмме через 25 лет после лечения статистически значимо не отличалось от нормы.

Выраженных различий в изученных показателях кроветворения у пациентов с удаленной и облученной селезенкой не было выявлено.

Соотношение лимфоидных и эритроидных элементов. При проведении иммунофенотипического исследования костного мозга установлено (таблица 2), что у пациентов через 20 и 25 лет после завершения лучевой терапии происходит повышение относительного количества клеток с иммунофенотипом, характерным- для лимфоидных клеток (СБ45+ОРЛ-), и снижение относительного содержания эритроидных клеток (СБ45-ОРЛ+) в необлученных областях костного мозга в сравнении с группой контроля (р<0,05). Данные об

уменьшении доли С045-ОРЛ+ клеток в костном мозге больных ЛХ в отдаленные сроки после ЛТ подтверждают результаты морфологического анализа, свидетельствующие о преимущественном сокращении эритроидного ростка кроветворения.

Таблица 2

Процентное содержание клеток с иммунофенотипом С045+ОРА- и С045-ОРЛ+ в костном мозге у больных ЛХ, находящихся в длительной ремиссии (М±т)..

Иммуно- Продолжительность ремиссии • . Группа контроля

фенотип 20 лет 25 лет

п=14 п=20 п=16

СО 45-КЗРА- 63,9±2,5» 70,6±2,6* 58,1±2,9

СЭ 45-СРА+ 31,4±2,9* 28,2±2,1* 41,1±3,1

*р<0,05 в сравнении с группой возрастного контроля.

Содержание лимфоидных субпопуляций. Результаты

проточноцитометрического исследования лимфоидных субпопуляций костного-мозга отражены в таблице 3.

Мы определяли долю каждой лимфоидной субпопуляции среди клеток, экспрессирующих общий лейкоцитарный антиген, то есть принимали клетки, имеющие иммунофенотип СШ5+ОРА-, за 100%.

Таблица 3

Соотношение основных лимфоидных субпопуляций среди общего количества С045+ОРА- клеток необлученного костного мозга у больных ЛХ в отдаленные сроки после лучевой терапии, % (М±т)._

Иммунофенотип Продолжительность ремиссии Группа

субпопуляций 20 лет 25 лет контроля

лимфоидных клеток п=14 п=20 п=16

С0 3+С019- 61,6±3,5 56,1±2,8* 67,9±2,7

СО 3- СО 19+ 18,4±3,3 22,2±1,9 18,5±1,9

СО 4+ С08- 34,5±4,3 26,3±2,0 28,3±2,3

СО 4- С08+ 34,0±2,5 37,8±2,8 39,4±4,0

СОЗ-СО 16,56+ 19,2±2,8 19,5±2,2 14,7±1,7

*р<0,05 в сравнении с группой возрастного контроля.

Установлено снижение доли Т-лимфоцитов в костном мозге пациентов с увеличением продолжительности ремиссии; через 25 лет после окончания

лучевой терапии количество Т-клеток оказалось существенно ниже, чем в контрольной группе (р<0,05). Доля В-лимфоцитов и НК- клеток несколько увеличивалась с удлинением срока ремиссии, но не достигала статистически -значимых различий по сравнению с контролем.

Были выявлены различия в соотношении основных субпопуляций Т-лимфоцитов в зависимости от предшествовавшего воздействия на селезенку. Так, в группах спленэктомированных пациентов через 25 лет после лечения соотношение CD4+/CD8+ клеток составляет в среднем 0,53; у неспленэктомированных - 0,74, что соответствует средней величине этого показателя в контроле - 0,71. После спленэктомии содержание КК-клеток было значительно выше, чем в группе контроля,- и лиц после облучения селезенки (р<0,05). Не было выявлено статистически достоверной разницы в относительном содержании Т- и В-лимфоцитов у пациентов с удаленной и облученной селезенкой.

У бальных ЛХ, находящихся в ремиссии 25 лет, выявлено существенное снижение абсолютного количества Т-лимфоцитов в сравнении с контрольным уровнем (3,0±0,4тыс/мкл против 4,9±0,7тыс/мкл; р<0,05). Сравнительный анализ Т-лимфоидных субпопуляций костного мозга в зависимости от воздействия на селезенку показал (рисунок 1), что количество Т-лимфоцитов снижалось главным образом у больных после облучения селезенки. Дефект в Т-клеточном звене обусловлен, главным образом, низким содержанием фракции цитотоксических/супрессорных лимфоцитов после облучения селезенки по сравнению со спленэктомированными пациентами (р<0,05). Количество хелперных/эффекторных лимфоцитов в сравниваемых группах статистически достоверно не различалось. Аналогичные результаты получены и другими исследователями в отношении Т-клеток периферической крови (М.Я. Рс«пег е! а1., 1983; ШЬишкат Watanabe ег.а1., 1997; А. Ие^ег е! а1., 2002). По всей видимости, наблюдаемый нами эффект является результатом отсроченных нарушений процесса дифференцировки Т-клеток в облученном тимусе. Следует

отметить, что наиболее ярко уменьшение Т-лимфоцитов было выражено в подгруппе неспленэктомированных больных, по-видимому, за счет распределения зрелых Т-лимфоцитов между костным мозгом и селезенкой, сохраняющей хотя бы частично свои функции после радиационного повреждения. Характерным для спленэктомированных больных явилось повышенное содержание цитотоксических/супрессорных клеток по сравнению с лицами, не подвергнутыми спленэктомии, вероятно, в результате избирательного процесса накопления именно этой лимфоидной субпопуляции клеток в костном мозге.

Рис. 1. Содержание Т-клеток и Т-клеточных субпопуляций в костном мозге у больных ЛХ в зависимости от терапевтического воздействия на селезенку. *р<0.05 в сравнении с группой спленэктомированных пациентов.

Менее выраженным изменениям был подвержен В-лимфоидный росток (рисунок 2). Через 25 лет после завершения лучевой терапии абсолютное количество В-лимфоцитов оказалось незначительно снижено по сравнению с контрольным уровнем. Спленэктомия не являлась фактором, влияющим на количество В-лимфоцитов в костном мозге. Можно сказать, что процесс снижения В-лимфоцитов в необлученном костном мозге отражает в большей степени возрастную динамику кроветворения (Е. М. Rego et al., 1998; P. Clark et al., 1986; R. W. McKenna et al., 2001).

Рис. 2. Содержание КК и В-клеток в костном мозге у больных ЛХ в зависимости от терапевтического воздействия на селезенку. лр=0,07 в сравнении с показателями в группе после спленэктомии.

В группе больных после облучения селезенки абсолютное количество КК-клеток соответствовало нормальному уровню. Отсутствие снижения количества КК-клеток в костном мозге больных ЛХ подтверждает теорию о тимуснезависимом пути дифференцировки этих клеток. В тоже время

тимуснезависимом пути дифференцировки этих клеток. В тоже время предшествовавшая спленэктомия приводила к увеличению числа КК-клеток в необлученных областях костного мозга по сравнении с нормальным уровнем (р=0,07).

Содержание эритроидных субполуляций. При проведении

морфологического исследования, наиболее выраженные изменения были обнаружены в эритроидном ростке, что послужило основанием для более детального изучения эритроидных субпопуляций с помощью метода проточной цитометрии. Была проведена количественная оценка эритроидных субпопуляций на разных этапах дифференцировки. Эритроидные клетки идентифицировали по связыванию антител к гликофорину А, который экспресснруется практически на всех этапах эритропоэза. Самые ранние этапы дифференцировки выявляли по наличию маркера клеток стволового типа СБ34; более поздние этапы - по наличию рецептора к трансферину (СБ71+); и, наконец, самые поздние этапы дифференцировки - по отсутствию этого рецептора на поверхности эритроидной клетки.

С увеличением времени после окончания лечения происходит возрастание в необлученном костном мозге доли наименее дифференцированных клеток эритроидного ряда СБ34+ вРЛ+ клеток: их относительное количество через 25 лет после окончания лечения было выше, чем у больных, продолжительность ремиссии у которых достигла 20 лет (р=0,05), и в группе контроля. (р=0,09).

Принимая количество вРЛ+ клегок за 100%, определяли долю СБ71+вРЛ+ и СБ71-вРЛ+ клеток. С увеличением продолжительности ремиссии возрастает доля клеток, экспрессирующих рецептор к трансферину (СБ71+вРЛ+), и уменьшается относительное содержание клеток, более продвинутых по пути эритроидной дифференцировки и утративших рецептор к трансферину (СБ71-вРЛ+).

СБ71+вРЛ+ и более выраженном снижении количества более дифференцированных СБ71-вРЛ+ клеток у больных, находящихся в 25 летней ремиссии. Так, количество наиболее дифференцированных клеток эритроидного ряда у больных, находящихся в ремиссии 20 лет было выше, чем у больных через 25 лет после лечения (р<0,05). В сравнении с показателями в группе контроля количество СБ71-вРЛ+ клеток в группе больных (ремиссия 25 лет) оказалось также снижено, хотя из-за малого количества наблюдений имелась лишь тенденция к статистической разнице (р=0,09).

Таблица 4

Абсолютное количество клеток в эритроидных субпопуляциях (тыс/мкл) необлученного костного мозга у больных ЛХ в длительной ремиссии (М±т).

Иммуно- Продолжительность ремиссии Группа

фенотип возрастного

20 лет 25 лет контроля

С071+0РА+ 5,9±2,3 2,3±1,1 4,3±0,8

С071-СРА+ 8,4±0,9 2,8±0,8Л 8,9±2,0

Ар<0,05 в сравнении с группой больных ЛХ спустя 20 лет после терапевтического облучения.

Выявленные нами изменения в системе эритрона соответствуют более поздним возрастным нормам, поскольку, как известно из литературных данных, с возрастом - происходит увеличение относительного количества молодых эритроидных форм и сокращение зрелых форм- (Н.И. Шмелева, 1977). Причиной преждевременного старения системы эритрона, возможно, явилась высокая продукция клеток эритроидного ряда в необлученном костном мозге в более ранние сроки после лучевой терапии (В.В. Павлов и Г.Д. Байсоголов, 1971).

Содержание стволовых гемопоэтических клеток. Количественную оценку ранних гемопоэтических предшественников в пунктатах костного мозга проводили также с использованием метода проточной цитометрии. Поскольку морфологически в данном типе клеток отсутствует зернистость, то анализ

проводили также с использованием метода проточной цитометрии. Поскольку морфологически в данном типе клеток отсутствует зернистость, то анализ проводили среди клеток, характеризующихся низкими показателями бокового светорассеяния, как рекомендуется в ряде работ (Б. БИуевМ й а1, 1992).

В необлученных областях костного мозга у больных в отдаленные сроки после завершения лучевой терапии общее содержание стволовых клеток (СБ34+) и фракции СБ34+СБ38- клеток соответствовало нормальному уровню. Содержание стволовых клеток, коммитированных в сторону В-лимфоидной и миелоидной дифференцировки, оказалось незначительно повышено в сравнении с их содержанием у здоровых лиц. После спленэктомии, как следует из данных представленных в таблице 5, выявлено уменьшение общего пула стволовых гемопоэтических клеток и про-В-клеток в сравнении с лицами после облучения селезенки (р<0,05).

Таблица 5

Относительное содержание стволовых гемопоэтических клеток и их субпопуляций в необлученном костном мозге у больных ЛХ после облучения селезенки и спленэктомированных, % (М±т).

Иммуно- Продолжительность ремиссии

фенотип 20 лет 25 лет

Воздействие Воздействие

на селезенку на селезенку

у-облучение СЭ у-облучение СЭ

п=10 п=4 п=15 п=4

С034+ 3,7±0,6* 1,2+0,1 4,3±0,6* 1,7±0,3

СОЗЗ+ С034+ 1,6±0,5 0,9±0,5 2,1 ±0,6 0,4±0,1

СО 19+ С020- 3,4±0,8* 1,0±0,5 5,2+1,1* 1,7±0,4

С034+ С038- 0,4±0,1 0,2±0,1 0,5+0,1 0,2±0,0

*р<0,05 в сравнении с пациентами после спленэктомии (СЭ). Кроме того, в сравнении с возрастной нормой обнаружено уменьшение количества клеток стволового типа, лишенных признаков линейной принадлежности СБ34+СБ38- и про-В-клеток (р<0,05).

Снижение доли СБ34+СБ334- клеток у больных после спленэктомии не было статистически значимым в сравнении с группой после облучения селезенки и группой контроля.

Ранее было показано, что спленэктомия приводит в ранние сроки к более выраженной активации кроветворения в необлученных участках костного мозга. Можно предположить, что этот процесс был связан с повышением пролиферативной активности стволовых клеток, что, вероятно, и привело к уменьшению их доли именно в группе спленэктомированных пациентов.

Оценка пролиферативной активности. Исследование ставило также задачу оценить компенсаторные возможности кроветворения. Для этого определяли пролиферативную активность миелокариоцитов и стволовых гемопоэтических клеток (таблица 6).

Таблица 6

Относительное количество клеток, находящихся в 8-фазе клеточного цикла, в необлученном костном мозге больных ЛХ в отдаленные сроки после лучевой терапии, % (М±т).

Доля клеток в фазе Продолжительность.

синтеза ДНК, % ремиссии Группа

20 лет 25 лет контроля

п=10 п—16 п=13

Среди миелокариоцитов 11,7±1,8 12,3±0,5 13,6±1,4

Среди СБ34+ 20,4±3,3 19,5±2,4 22,3 ±2,4

Относительное количество клеток, находящихся в 8-фазе клеточного цикла в костном мозге у больных ЛХ, соответствовало контрольному уровню как среди миелокариоцитов, так и среди клеток стволового типа, что свидетельствует о стабильности исследованных показателей клеточного цикла кроветворных клеток.

Влияние функционального состояния щитовидной железы на количество эритроидных клеток в костном мозге. Функциональное

состояние щитовидной железы, оцениваемое на основании клинических и

гормональных данных, выявило у значительного количества обследованных лиц нарушения в тиреоидном статусе через 16-34 года после завершения-лучевого лечения. Гормональное исследование содержания ТТГ в сыворотке крови 44 пациентов показало повышение этого показателя по сравнению с нормой в 22 (50%) случаях. Изолированное повышение ТТГ было выявлено в 19 (43,2%) случаях, данное состояние трактовалось нами как субклинический гипотиреоз. Вместе с тем, уровень свободного Т4 у обследованных с повышенным содержанием ТТГ был снижен только у 3 (6,8%) человек. В результате проведенного анализа не было обнаружено влияния состояния щиговидной железы на содержание эритроидных клеток в костном мозге.. Количество эритроидных клеток не отличалось у лиц с гипотиреозом и нормальным содержанием ТТГ, а также не зависело от уровня антител к ткани щитовидной железы.

Таким образом, при изучении отдаленных гематологических эффектов локального терапевтического гамма-облучения с использованием метода проточной цитометрии выявлены существенные изменения со стороны клеточных популяций необлученного костного мозга. Обнаруженные изменения диктуют необходимость систематического наблюдения за лицами, подвергавшимися лучевому воздействию, а также служат обоснованием для разработки оптимальных схем лучевой и комбинированной терапии ЛХ.

ВЫВОДЫ:

1. В отдаленные сроки (24-34 года) после локальной лучевой терапии больных лимфомой Ходжкина в необлученных участках костного мозга наблюдается нарастание гипоплазии, затрагивающей гранулоцитарный, эритроидный и лимфоидный ростки.

2. Уровень СБ34+ стволовых кроветворных клеток и их фракций, включая наименее дифференцированные СБ34+СБ38- стволовые клетки, а также клетки стволового типа, коммитированные в миелоидном (СБ34+СБ33+) и

В-лимфоидном направлении (CD19+CD20-), сохраняется в пределах нормы. У больных, подвергавшихся спленэктомии, в необлученных участках костного мозга отмечено сокращение пула стволовых клеток.

3. Гипоплазия эритроидного ростка выражается в снижении абсолютного и относительного количества клеток поздних этапов дифференцировки при сохранении нормального содержания низкодифференцированных предшественников.

4. Изменения лимфоидных субпопуляций в необлученном костном мозге характеризуются дефектом Т-лимфоцитарного звена, в основном за счет уменьшения фракции цитотоксических/супрессорных клеток.

5. Спленэктомия, являясь модифицирующим фактором, изменяет соотношение лимфоидных субпопуляций в сторону более высокого содержания NK-клеток и цитотоксических/супрессорных клеток.

6. Показано, что у больных ЛХ в отдаленный постлучевой период содержание клеток костного мозга в S-фазе, соответствует возрастной норме.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Терехова А.Ю., Замулаева И.А., Богатырёва Т.И., Селиванова Е.И., Данилова М.А., Денискина Е.В., Павлов В.В., Саенко А.С. Сокращение эритроидного ростка в необлученном костном мозге спустя тридцать лет после терапевтического облучения // Тезисы докладов 4 съезда по радиационным исследованиям, 2001, Москва, Издательство Российского университета дружбы народов.ТЛ, стр 228.

2. Terekhova A., Zamulaeva I., Pavlov V., Bogatyreva Т., Selivanova E., Danilova M., Saenko A. Flow cytometry characterization of haemopoietic cells from unirradiated bone morrow of Hodgkin's disease survivars// Annals of Oncology, 2002, v.13, Suppl 2, p.174.

3. Терехова А. Ю., Замулаева И. А., Павлов В. В., Богатырёва Т.Н., Селиванова Е. И., Данилова М.А., Тенникова О. В., Саенко А, С. Гемопоэз в необлучённом костном мозге больных лимфогранулематозом спустя 20 и более лет после лучевой терапии // "Диагностика и лечение лимфом" Материалы Российско-Голландской конференции, 2002, Санкт-Петербург, с.229-230.

4. Terentyva A., Terekhova A., Bogatyreva Т., Terentyv R., Danilova M., Ilyin A., Abrosimov A., Chebotareva I., Pavlov V. Thyroid pathology among long-term survivors from Hodgkin's disease // European Journal of Cancer, 2001,v.37,Suppl.6,p.94.

5. Ryabchenko N., Nasonova V., Antoshina M., Fesenko E., Kondrashova Т., Ivanova Т., Pavlov V., Ryabikhina N., Terekhova A. Chromosome aberrations in peripheral lymphocytes from Hodgkin's lymphoma remission patients // Int. J. Radiat. Biol, 2003, v.79, Suppl. 4, p. 251-258.

Заказ № 899 от 20.08ю04г. Тираж 100 экз. 249037, Россия, Калужская область, г.Обнинск типография ОГИЦ, ул. Гурьянова 21, тел.: (08439) 55-646

# 15 7 56

Актуальность темы исследования. В связи с широким применением лучевой терапии в онкологии и гематологии, актуальной проблемой является изучение поздних последствий облучения кроветворной ткани, которая вследствие высокой пролиферативной активности и быстрого обновления относится к одной из наиболее радиочувствительных систем организма (А.Г. Конопляников, 1984). Исследование механизмов поздних лучевых реакций на клеточном уровне необходимо как для понимания механизмов развития поздних лучевых поражений, так и в практическом плане для возможной оптимизации терапевтических программ. Представляет особый интерес изучение клеток стволового типа, которые, по общему мнению, определяют непосредственные и поздние реакций кроветворной ткани на облучение.

Благодаря значительному улучшению результатов лечения больных лимфомой Ходжкина (ЛХ) и возможности длительного наблюдения за ними после излечения, эта группа пациентов может служить моделью для изучения поздних последствий облучения. К настоящему времени накоплены достаточно обширные сведения, касающиеся поздних лучевых изменений кроветворной системы у больных JIX, полученные с применением методов морфологического анализа, иммунологических подходов, а также с помощью культуральных методов исследования гемопоэтических и стромальных клеток-предшественников. Установлено, что пороговая доза, вызывающая необратимую аплазию облученных участков костного мозга, соответствует СОД 30±5 Гр (В.В. Павлов, Г.Д. Байсоголов, 1971). В необлученных участках костного мозга наблюдается компенсаторная активация кроветворения, прослеженная до 10 лет после окончания лечения (И.П. Шишкин, 1976). Между 10 и 20 годами наблюдения развивается гипоплазия необлученных участков костного мозга (Г.Д. Байсоголов, Т.И. Богатырева, 1986; М.А.

Данилова, 1997). Следует отметить, что диагностическая спленэктомия, осуществлявшаяся у части пациентов, оказывает значительное воздействие на характер кроветворения в отдаленном постлучевом периоде (Т.И. Осадчая, 1981). Большое количество литературных данных свидетельствует о значительных изменениях, которые претерпевают субпопуляции лимфоцитов крови в отдаленные сроки после облучения лимфоидной ткани у больных JTX (Z. Fuks et al., 1976; M.R. Posner et al., 1983; G.S. Haas et al., 1984).

Однако, полученные сведения не позволяют в полной мере представлять целостную картину развития поздних реакций со стороны различных клеточных популяций кроветворной и иммунной систем человека. Отсутствуют критерии оценки состояния кроветворения больных JIX в отдаленные сроки после окончания лечения, поскольку в литературе нет сведений об особенностях субпопуляционного состава костного мозга у лиц соответствующих возрастных групп контроля.

Можно было полагать, что новую ценную информацию об отдаленном влиянии радиации на состояние кроветворной и иммунной систем человека, а также о компенсаторных возможностях гемопоэза можно получить с помощью метода проточной цитометрии, который, как известно, обладает высокой информативностью для анализа линейной принадлежности клеток, их уровня дифференцировки и пролиферативной активности.

При проведении лучевой терапии на область шеи в зону прямого воздействия ионизирующего излучения попадает щитовидная железа - орган, состояние которого сказывается на функционировании разных систем и, в том числе, системы гемопоэза. В частности, известен факт влияния гипотиреоза на развитие гипопластической и некоторых других видов анемий (L.H. Duntas et al., 1999). Поэтому нам представлялось целесообразным также исследовать влияние функционального состояния щитовидной железы на эритроидный росток кроветворения у больных лимфомой Ходжкина в отдаленные сроки после лучевой терапии.

Цель работы. Целью настоящей работы явилось изучение состояния кроветворения в отдаленные сроки после локального терапевтического облучения больных лимфомой Ходжкина.

В задачи исследования входило: 1 .Изучение динамики показателей гемопоэза в необлученных участках костного мозга больных J1X в ремиссии длительностью 20 и 25 лет в сравнении с возрастным контролем.

2. Исследование особенностей кроветворения в зависимости от лечебного воздействия на селезенку (облучение/спленэктомия).

3. Оценка состояния компенсаторных возможностей кроветворения по данным исследования необлученных участков костного мозга.

Научная новизна. В работе приводятся новые сведения, полученные с использованием метода проточной цитометрии, о состоянии клеточных популяций необлученного костного мозга больных JIX в отдаленный постлучевой период в сравнении со здоровыми лицами аналогичного возраста.

Установлен факт преждевременного старения кроветворной и иммунной систем вследствие лучевой аплазии части кроветворного костного мозга и лимфоидной ткани, о чем свидетельствует:

-снижение общей клеточности костного мозга за счет сокращения гранулоцитарного, эритроидного и лимфоидного ростков кроветворения;

-сокращение эритроидного ростка кроветворения за счет более зрелых субпопуляций эритроидных предшественников GPA+CD71-;

-дефицит Т-лимфоцитов CD3+CD19- (в основном за счет фракции цитотоксических/супрессорных клеток).

Проведено подробное изучение стволовых клеток, как полипотентных, так и находящихся на более поздних этапах дифференцировки. При этом установлено, что общее количество стволовых кроветворных клеток CD34+, наименее дифференцированных, из исследованных нами, стволовых клеток CD34+CD38-, а также клеток стволового типа, коммитированных в миелоидном CD34+CD33+ и В-лимфоидном направлении CD19+CD20-соответствует возрастной норме.

Получены новые сведения о модифицирующем влиянии спленэктомии на гемопоэз. В частности у больных через 16-34 года после спленэктомии по сравнению с лицами после облучения селезенки отмечено:

- высокое содержание NK-клеток CD3-CD16,56+;

- увеличение содержания цитотоксических/супрессорных клеток CD4-CD8+;

-сокращение пула стволовых гемопоэтических клеток CD34+, наименее дифференцированных стволовых клеток CD34+CD38-, клеток коммитированных в В-лимфоидном направлении CD19+CD20-.

Изучены компенсаторные возможности кроветворения, в условиях аплазии 20-35% кроветворного костного мозга при этом обнаружено:

-нормальное содержание клеток в S-фазе среди миелокариоцитов; -нормальное содержание клеток в S-фазе среди стволовых кроветворных клеток.

Практическая ценность работы. Данные проведенного исследования имеют важное значение, как для практической онкологии, так и для теоретической медицины в плане разработки подхода к изучению поздних лучевых изменений кроветворной системы. Полученная информация может быть использована как для прогноза отдаленных эффектов неравномерного облучения организма человека, так и для разработки оптимальных схем лучевой и комбинированной терапии JIX с минимальным риском поздней гипоплазии кроветворной системы.

Полученные результаты являются обоснованием для сокращения объема и уменьшения суммарных очаговых доз лучевой терапии JIX с целью минимизации риска поздней гипоплазии кроветворной системы. Нашими исследованиями показана необходимость систематического наблюдения за состоянием кроветворной и иммунной систем излеченных пациентов в отдаленные сроки после лучевой терапии.

Выводы

1. В отдаленные сроки (24-34 года) после локальной лучевой терапии больных лимфомой Ходжкина в необлученных участках костного мозга наблюдается нарастание гипоплазии, затрагивающей гранулоцитарный, эритроидный и лимфоидный ростки.

2. Уровень CD34+ стволовых кроветворных клеток и их фракций, включая наименее дифференцированные CD34+CD38- стволовые клетки, а также клетки стволового типа, коммитированные в миелоидном (CD34+CD33+) и В-лимфоидном направлении (CD19+CD20-), сохраняется в пределах нормы. У больных, подвергавшихся спленэктомии, в необлученных участках костного мозга отмечено сокращение пула стволовых клеток.

3. Гипоплазия эритроидного ростка выражается в снижении абсолютного и относительного количества клеток поздних этапов дифференцировки при сохранении нормального содержания низкодифференцированных предшественников.

4. Изменения лимфоидных субпопуляций в необлученном костном мозге характеризуются дефектом Т-лимфоцитарного звена, в основном за счет уменьшения фракции цитотоксических/супрессорных клеток.

5. Спленэктомия, являясь модифицирующим фактором, изменяет соотношение лимфоидных субпопуляций в сторону более высокого содержания NK-клеток и цитотоксических/супрессорных клеток.

6. Показано, что у больных J1X в отдаленный постлучевой период содержание клеток костного мозга в S-фазе, соответствует возрастной норме.