Автореферат и диссертация по медицине (14.01.14) на тему:Повышение эффективности процессов репаративной регенерации при замещении дефектов нижней челюсти

На правах рукописи

Овчарова Луиза Владимировна

«Повышение эффективности процессов репаративной регенерации при замещении дефектов нижней челюсти " (Экспериментальное исследование )

14.01.14 - стоматология (медицинские науки) 03.03.04 - клеточная биология, цитология,гистология (медицинские науки)

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени Кандидата медицинских наук

15 ЯНВ 2015

Москва 2014

005557292

005557292

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО МГМСУ имени А.И. Евдокимова Минздрава России). Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Чергештов Юрий Иосифович член - корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор Банин Виктор Васильевич Официальные оппоненты:

Байриков Иван Михайлович - доктор медицинских наук, профессор

(ГБОУ ВПО « Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой челюстно-лицевой хирургии и стоматологии).

Торбек Виктория Эдуардовна - доктор медицинских наук, профессор (ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии). Ведущая организация: ФГБУ ««Центральный научно-исследовательский

институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии» Министерства

здравоохранения Российской Федерации. ^

Защита состоится « 2015 г. ъУ^ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.041.07 при ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И.

Евдокимова Минздрава России по адресу: 127473, г. Москва, ул. Делегатская,

д.20, стр. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «МГМСУ им.

А.И. Евдокимова» Минздрава России (127206, Москва, ул. Вучетича, д.Юа.) и

на сайте http://dissov.msmsu.ru/

Автореферат разослан «

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук, доцент Дашкова Ольга Павловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Предложено большое количество методик и материалов для замещения дефектов нижней челюсти.

Поиск новых костнопластических материалов и хирургических методик последнее время получил большое распространение. В этом направление работают многие исследователи [Базикян Э.А.,2008; Дробышев А.Ю.,1999,2001; Иванов С.Ю. 1999; Лосев Ф.Ф. 2001] В соответствии с потребностями клинической практики последние традиционно классифицируют, в зависимости от источника, на аутогенные, аллогенные, ксеногенные и аллопластические (комбинированные).

Аллогенные трансплантаты.

Эффективность аутологичной костной ткани была доказана многолетним опытом ее использования в клинической практике., принимая во внимание некоторые существенные ее свойства [И.С.Алексеева с соавт., 2012]. Однако, несмотря на ее положительные свойства (полная биосовместимость, отсутствие иммуногенности, способность к быстрой реваскуляризации) этот подход имеет и ряд недостатков, к числу которых можно отнести необходимость создания дополнительной операционной зоны и ограниченный объем донорского материала [Королев В.М., 2006; Canalis Е.,2001].

В качестве альтернативы аутогенной кости были предложены аллогенные материалы (лиофилизированные, замороженные, деминерализованные, гамма-облученные и другие), позволяющие исключить необходимость нанесения дополнительной операционной травмы, сократить длительность проведения реконструктивной процедуры, получить относительно доступный и недорогой материал для трансплантации.

Использование аллопластических материалов в качестве костного матрикса и остеоиндукгора [Нагиева С.Э. 2010; Нагиев Э.Р. 2008; Лаврищева Г.И. 2006], позволяет в ряде случаев достичь значительного клинического

улучшения. Основным недостатком аллогенных трансплантатов является нарушение «баланса» процессов регенерации и рассасывания трансплантатов, что особенно демонстративно проявляется при замещении относительно больших дефектов.

С переменным успехом используются также и синтетические_и

натуральные аналоги кости или ее компонентов: гидроксиапатит, бета-трикальций фосфат. Как показывает практика и многочисленные экспериментальные исследования [Байриков, И.М. 2009; Беззубик, С.Д. 2009; Беззубов А.Е. 2010] эти материалы с успехом могут выступать как вспомогательные в комбинированном лечении и действительно способствуют костной регенерации, но не в состоянии обеспечить требования, предъявляемые к трансплантату.

Комбинированные материалы.

Комбинированные трансплантаты представляют собой ту или иную комбинацию различных тканевых структур: аутогенных трансплантатов и аллогеных костных тканей, гидроксиапатита и ксенотканей, ксенотканей и синтетических пластических материалов [Лосев Ф.Ф., 2000,2001]. Формирование кости при их использовании может быть более эффективным, чем при применении каждого из компонентов.

Несмотря на достаточное разнообразие и широкий спектр материалов и различные модификации хирургических подходов, репарация костей и восполнение дефектов в челюстно-лицевой области остается пока одной из сложнейших проблем стоматологии и челюстно-лицевой хирургии.

В последние годы возможностям репаративной регенерации с применением мультипотентных мезинхимальных стволовых клеток (ММСК) костного мозга в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии посвящено большое количество исследований [Воложин А.И.2006,2008;Мальгинов H.H., 2007,2011].

Использование мультипотентных клеток-предшественников в

регенераторной медицине вообще является весьма перспективным направлением в медицине. Уникальные свойства ММСК, обладающих широким диапазоном дифференцировки и высоким пролиферативным потенциалом, позволяют использовать их для коррекции самых различных патологических ситуаций. О положительном влиянии ММСК на регенерацию кости сообщается во многих публикациях, хотя реальные механизмы такого влияния остаются пока малоизученными.

Можно привести ряд примеров и в области челюстно-лицевой хирургии. Так, H.H. Мальгинов (2011) для повышения эффективности остеоинтеграции титановых дентальных имплантатов использовал мезенхимальные клетки из жировой клетчатки собак, оптимизируя при этом структуру поверхности имплантата с целью повышения адгезивности клеток.

А.И. Воложин и соавторы (2005,2006,2008) определяли с помощью различных методов скорость репаративной регенерации дефектов нижней челюсти без их замещения трансплантатами, а также, с использованием мезенхимальных стволовых клеток для активации репаративных процессов костной ткани челюсти с применением остеопластических материалов, проводили сравнительный анализ использую аутологичные и аллогенные материалы.

Тарасенко C.B. и соавторы (2009) определяли скорость репаративной регенерации в зависимости от методов хирургического лечения с использованием физиодиспенсора и хирургического лазера методом микрофокусной рентгенографии.

И в экспериментальных, и в клинических условиях заключения об эффективности регенерации кости в области костного дефекта основываются на скорости и полноте восстановления кости, однако клинический успех зависит не только от этих важных параметров, но и от характера и свойств самой новообразованной костной ткани. Анализ данных свойств невозможен без детального морфологического исследования. Принимая во внимание

вышеизложенное, мы провели серии экспериментов по замещению операционного дефекта нижней челюсти кроликов различными материалами. Об эффективности остеорегенерации и ее динамике судили по результатам гистологического исследования, данным компьютерной томографии и денситометрии, полученным в ближайшие (2-4 недели) и отдаленные (16-18 недель) сроки после операции.

Степень разработанности темы

Дефекты и деформации челюстно-лицевой области занимают значительное место в практике хирургов-стоматологов и челюстно-лицевых хирургов. Предложены различные способы замещения дефектов нижней челюсти. Существует большое количество методик и материалов для восстановления дефектов нижней челюсти. Однако проблема эффективного лечения и ускорения сроков репаративной регенерации окончательно не решена. До настоящего времени научно-обоснованные рекомендации по лечению больных с дефектами нижней челюсти недостаточно разработаны. Хирурги-стоматологи, челюстно-лицевые хирурги и врачи-онкологи недостаточно информированы о данной проблематике. Принимая во внимание все вышесказанное, очевидно, что повышение эффективности процессов репаративной регенерации костной ткани, ускорение сроков регенерации дефекта кости и поиск оптимального костнопластического материала является актуальной проблемой современной хирургической стоматологии, челюстно-лицевой хирургии [Воложин А.И., 2005; Дробышев А.Ю., 1999;Тарасенко C.B. и соав., 2009].

Цель исследования

Повышение эффективности процессов репаративной регенерации костной ткани после экспериментального замещения дефектов нижней челюсти различными остеопластическими материалами и мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга.

Задачи исследования

1. Изучение динамики формирования костного регенерата при трансплантации в область операционного дефекта фрагмента аутологичной кости (аутотрансплантат).

2. Гистологический анализ репаративного остеогенеза при имплантации в

область дефекта кости лиофилизированного деминерализованного костного матрикса (матрикс).

3. Гистологический анализ динамики костной регенерации при замещении

костного дефекта лиофилизированным деминерализованным костным матриксом, заселенным мультипотентными мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга (матрикс+ММСК).

4. Изучение динамики репаративного остеогенеза на основании анализа

визуальных и денситометрических параметров, полученных при компьютерной томографии, и сопоставление данных компьютерной томографии с результатами гистологического исследования. Научная новизна

1. Впервые проведен сравнительный гистологический анализ динамики

репаративной регенерации костной ткани при замещении дефекта нижней челюсти аутокостью, костным матриксом и ткане-инженерным комплексом.

2. Получены новые данные о характере и свойствах костной ткани,

образующейся в области операционного дефекта при разных видах трансплантируемого материала.

3. Получены доказательства стимулирующего влияния на репаративный

остеогенез мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток в Отношении скорости оетеообраювания и качеетва формирующейся коети.

4. Впервые проведен сравнительный анализ гистологического исследования

с данными компьютерной томографии, денситометрии, подтверждающий результативность этого метода клинического исследования.

Теоретическая и практическая значимость работы

Описан алгоритм получения ММСК костного мозга и формирования наиболее благоприятных условий для их роста при использовании их в костнопластических операциях.

Проведена сравнительная оценка эффективности различных костнопластических трансплантатов и разработана методика использования их в сочетании с ММСК костного мозга. Результаты подтверждены данными мультиспиральной компьютерной томографии (МСКТ), денситометрии и гистологического исследования.

Результаты сравнительного анализа динамики остеогенеза после замещения дефектов нижней челюсти различными трансплантатами, полученные с помощью морфологических, рентгенологических и денситометрических методов, в совокупности являются экспериментальным обоснованием возможности эффективного использования аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в клинике челюстно-лицевой хирургии. Применение этого вида клеточной технологии позволяет сократить сроки заживления дефекта, избежать дополнительной операционной травмы и сформировать на месте дефекта полноценную пластинчатую кость.

Методология и методы исследования В основании работы стоит эксперимент по получению ММСКТ в условиях лаборатории и использования их на моделях кроликов для проведения костнопластических операций.

Оценка результатов работы проводилась с помощью патоморфологических исследований и рентгенологической картины с трехмерным моделированием и денситометрией.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту 1. Фрагменты аутологичной кости, трансплантированные в область операционного дефекта, подвергаются частичной резорбции и в последующем ремоделируются с образованием относительно тонкой

костной пластинки.

2. Замещение костного дефекта лиофилизированным деминерализованным костным матриксом приводит к формированию на месте дефекта губчатой кости, структура которой сохраняется до конца периода наблюдения.

3. Использование мезенхимальных стволовых клеток в сочетании с костным матриксом существенно уменьшает сроки репарации костной раны и приводит к формированию в области дефекта полноценной компактной (пластинчатой) костной ткани с отчетливой остеонной структурой.

4. Результаты компьютерной томографии, включая и денситометрические данные, не позволяют в полной мере судить о полноте и скорости замещения костного дефекта новообразованной костной тканью и в экспериментальных условиях нуждаются в верификации данными гистологического исследования.

Апробация диссертации Материалы диссертации доложены на:

1. Юбилейной конференции Института экспериментальной медицины и биотехнологий Самарского государственного медицинского университета (г. Самара, 29 июля 2013г.)

2. Всероссийской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы морфологии, адаптогенеза и репаративных гистогенезов» (г.Оренбург, 19-20 ноября 2013 г.)

3. Заседании кафедр челюстно-лицевой хирургии стоматологического факультета МГМСУ им. А. И. Евдокимова, кафедры лучевой диагностики стоматологического факультета МГМСУ им. А. И. Евдокимова и научно-исследовательского центра биомедицинских технологий ГНУ ВИЛАР ФАНО России 13.12.2013 г.

Личное участие автора Автором лично прооперировано 27 и исследовано 27 кроликов породы Шиншилла (3 кролика выведены из эксперимента в связи с воспалительными

осложнениями), подготовлено и проанализировано 54 морфологических препарата.

При выполнении экспериментальной части диссертационной работы лично автором была проведена сравнительная морфологическая, рентгенологическая и денситометрическая оценка скорости репаративной костной регенерации при замещении дефектов нижней челюсти аутотрансплантатом, лиофилизированным трансплантатом и ЛДКМ с мезенхимальными стволовыми клетками.

Лично автор, проанализировав данные морфологического, рентгенологического и денситометрического исследования, подготовил текст и иллюстрации данных морфологических и рентгенологических примеров.

Лично автором проводилась подготовка публикаций по выполненной работе, научных работ по тебе диссертации.

Полнота опубликования в печати

Основное содержание диссертационного исследования достаточно полно отражено в 4 научных работах соискателя в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура диссертации

Работа написана по монографическому типу и изложена на 120 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5-ти глав, включающих обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований (2 главы), заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 192 источника, из них 100-отечественных и 92 — зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 87 рисунками и содержит 3 таблицы.

Содержание работы Материалы и методы исследования

Работа выполнялась на базе кафедры челюстно-лицевой хирургии МГМСУ и вивария кафедры патофизиологии МГМСУ. Выращивание культур

и

клеток проводили на базе института экспериментальной медицины и биотехнологий Самарского государственного медицинского университета. Компьютерную томографию и денситометрию проводили на базе отделения лучевой диагностики ФГБУ «ЦИТО им. H.H. Приорова» МЗ РФ. Подготовка и оценка морфологических препаратов выполнялась на базе научно-исследовательского центра биомедицинских технологий ГНУ ВИЛАР ФАНО России.

В качестве экспериментальных животных мы использовали 27 кроликов обоего пола, породы шиншилла весом 2.5-2.8 кг. Данное количество животных в зависимости от задачи исследования были подразделены на следующие группы:

1. Кролики с аутотрансплантатами (AT) — 9 особей.

2. Кролики с лиофилизированными трансплантатами (ЛДКМ) - 9 особей.

3. Кролики с тканевым конструктом (технология «Лиопласт®»), содержащим мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (ММСК) (лиофилизированный декальцинированный костный матрикс (ЛДКМ)+ММСК) - 9 особей.

Эксперименты выполнялись в соответствии с правилами лабораторной практики в Российской Федерации (№ 61-ФЗ от 12.04.2010), и с учетом рекомендаций, принятых Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (ETS 123, Strasbourg, 1986). Протокол эксперимента был разработан при участии и одобрении этического комитета МГМСУ им. А.И.Евдокимова.

Кроликов содержали в условиях сертифицированного стационарного вивария на растительном витаминизированном рационе при свободном доступе к воде; всем животным перед началом экспериментов была проведена дегельминтеризация. За день до операции животные были осмотрены и обследованы ветеринарным врачом. В процессе эксперимента у животных под наркозом (ксилазин и золетил) резецировали фрагмент наружней кортикальной пластинки нижней челюсти (5x5мм), и в образованное дефект в зависимости от

группы, помещали тот или иной трансплантат. Забор костного мозга для культивирования ММСК проводили в стерильных условиях пунктированием гребня подвздошной кости. Культивированные и предварительно тестированные ММСК (3-й пассаж) клетки высевали в дозе 5х103 на 1 мм3 на образец носителя (ЛДКМ) и проводили совместное культивирование в С02-инкубаторе в течение двух недель. Перед забором материала для гистологического исследования проводили компьютерную томографию и денситометрию. Исследования выполнялись на базе отделения лучевой диагностики ФГБУ «ЦИТО им. H.H. Приорова» МЗ РФ на мультиспиральном (многосрезовом, мультидетекторном) компьютерном томографе GE LightSpeed VCT(General Elektric, USA). Описанная выше методика дает возможность получать максимально резкие изображения самых тонких срезов в любых условиях и для любого пациента.

Для проведения гистологического исследования фрагменты нижней челюсти, включающие зону операции, иссекались в пределах здоровых тканей. Материал фиксировался в 10% нейтральном формалине, декальцинировался в ЭДТА, заливался в парафин. Гистологические срезы окрашивались гематоксилином и эозином (Г-Э).

Статистическая обработка полученных результатов

Все полученные в процессе исследований цифровые данные были

подвергнуты статистической обработке методами вариационной статистики с

использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows, release 6,0

компания StatSoft Inc. США (2003) с вычислением средней величины признака

(М) и среднего квадратичного отклонения (5). Достоверность различий

определяли при помощи t-критерия достоверности Стьюдента. Критическое

значение уровня значимости принималось равным 5% (р<0,05) [Glantz S.A.

Медико-биологическая статистика. - М.: Практика, 1999.- 459 е.].

р>0,1 статистически не достоверное отличие; р<0,001 статистически высоко достоверное отличие.

Результаты исследования

В настоящем исследовании мы провели сравнительный рентгенологический и морфологический анализ репаративной регенерации костной ткани в области дефекта нижней челюсти у кроликов. Основной целью исследования была оценка эффективности регенерации при замещении костного дефекта тремя видами имплантатов: аутогенной костью, деминерализованным лиофилизированным костным матриксом (ЛДКМ), полученным из губчатых костей кроликов и ЛДКМ, в который предварительно заселялись при инкубации мультипотентные мезенхимные стволовые клетки (ММСК) костного мозга кроликов.

Мы обращали внимание не только на скорость регенерации но и на полноту ее и характер новообразующейся костной ткани. Небольшие размеры операционного дефекта позволяли при выполнении гистологического исследования анализировать практически всю область регенерации. Компьютерная томография служила клиническим контролем хода регенерации и ее полноты, но ее результаты не позволяют анализировать сам механизм развития костной ткани в области дефекта. Другим своеобразным контролем при проведении гистологического исследования служила внутренняя кортикальная пластинка, которая в ходе операции не повреждалась, и ее морфология являлась актуальным эталоном состояния нативной костной ткани в различные временные интервалы. Временная шкала включала три интервала в диапазоне от 2 недель до 18 недель с тем, чтобы проследить не только ближайшие, но и отдаленные результаты.

Мультиспиральная компьютерная томография в контроле остеорепарации экспериментальных дефектов

По данным МСКТ, на сроке 2-4 недели, во всех случаях мы наблюдали начальные признаки периферической остеорепарации пострезекционного дефекта, выраженного в виде нечетких и неровных контуров дефекта. В группе с использованием аутотрансплантата пострезскционный дефект по своим размерам практически не изменился по сравнению с первоначальным, и был

равен 4,83±0,2б мм (Таблица 1). Наиболее выраженные признаки отмечались во 2-ой и 3-ей группах, о чем говорит уменьшение размеров дефекта. Так в группе с ЛДКМ пострезекционный дефект в половине случаев имел первоначальные размеры, в остальных - статистически достоверно уменьшился до 3,17±0,26 мм (Таблица 1). На ранних сроках в послеоперационном периоде в 3-ей группе (стволовые клетки) дефект костной ткани достоверно уменьшился (2,33+0,52мм) по сравнению с первоначальным (Таблица 1).

Таблица 1.

Динамика изменений продольных размеров дефектов кости нижней

челюсти кроликов (мм) в послеоперационном периоде

группы Всего Исходный Сроки наблюдения

препаратов размер (М±5)

2-4 6-8

1.Ат 12 5 4,83±0,26 3,33±0,52 *

2. ЛДКМ 12 5 3,17+0,26 * 0,75±0,82 *

3. лдкм+ммск 12 5 2,33±0,52 * 0,00±0,00 *

р по сравнению с исходным значением: р>0,1 статистически не достоверное отличие; р<0,001 статистически высоко достоверное отличие -* Через 6-8 недель после операции в группе с АТ , пострезекционный

дефект во всех наблюдениях достоверно уменьшился до 3,33±0,52, также

отмечались признаки перестройки аутотрансплантата (АТ). Плотность костной

ткани на этом сроке составляла 393,3+33,9 Ни, что в 3 раза ниже плотности

интактной кости (1233,3±87,6 Ни) (Таблица 2). В группе с ЛДКМ в половине

наблюдений мы отмечали полное закрытие пострезекционного дефекта со

сформированным тонким кортикальным слоем, его плотностные значения

(583,3±56,1) существенно ниже по сравнению с интактным корковым слоем

(1478,3+93,3). В остальных случаях отмечено достоверное уменьшение

размеров костного дефекта до 0,75±0,82 мм, с наличием в его проекции

лиофилизированного трансплантата с признаками идущей перестройки

( Таблица 2).

Таблица 2.

Измерение плотности костной ткани в области дефектов нижней челюсти _кроликов (Ни)__

группы Всего препарат ов интактная кость на сроке 6-8 недель Сроки наблюдения (М±5) интактная кость на сроке 16-18 недель

6-8 недель 16-18 недель

1.Ат 12 1233,3±87,6 393,3+33,9 566,3±28,4 1201,1+93,6

2. ЛДКМ 12 1478,3±93,3 583,3±56,1 * 771,0+57,7 * 1545,0±144,7

з.лдкм+мм ск 12 1575,0+112,9 1101,7+85,0 * 1569,2±160,2 1588,8+159,0

р по сравнению с исходным значением: р>0,5 статистически не достоверное отличие; р<0,001 статистически высоко достоверное отличие -* Наиболее выраженные признаки репарации пострезекционного дефекта в

эти сроки мы отмечали в группе с мультипотентными мезенхимальными

стволовыми клетками. Во всех случаях дефект отсутствовал, вновь

сформированный кортикальный слой был несколько деформирован, истончен,

его плотностные значения (1101,7±85,0 Ни) были достоверно в два раза ниже по

сравнению с интактным корковым слоем (1575,0+112,9 Ни) (Таблица 2).

Через 16-18 недель после операции во всех трех группах

пострезекционный дефект отсутствовал. Однако в 1-ой группе (АТ)

кортикальный слой несколько деформирован, истончен. Отмечалась тенденция

к увеличению плотности костной ткани до значений равных 566,3±28,4 Ни, что

в два раза ниже по сравнению с интактным корковым слоем (1201,1+93,6 Ни)

( Таблица 2). Во 2-ой группе (ЛДКМ) толщина кортикального слоя

соответствовала интактному, его плотностные значения достоверно

увеличились и были равны 771,0±57,7 Ни, однако по-прежнему оставались в

два раза ниже показателей нативной костной ткани (1545,0±144,7 Ни) (Таблица

2). В 3-ей группе (ЛДКМ+ММСК) мы наблюдали полное восстановление дефекта. Вновь сформированный кортикальный слой по толщине и плотностным характеристикам (1569,2±160,2Ни) соответствовал интактному корковому слою (1588,8±159,0Ни) ( Таблица 2).

Следует отметить, что восстановление костного дефекта в группе с использованием стволовых клеток начинается уже на 2-4 неделе, в то время как в группах с использованием аутотрансплантата и лиофилизированного аллотрансплантата на этих сроках наблюдаются лишь начальные этапы остеорепарации. А к 6-8 неделе в этой группе происходило уже полное закрытие пострезекционного дефекта с формированием коркового слоя.

Таким образом, результаты компьютерной томографии свидетельствуют о том, что наиболее благоприятная динамика репарации костного дефекта наблюдается при использовании в качестве активного, действующего компонента мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток, распределенных в носителе (лиофилизированном деминерализованном костном матриксе). В этой группе (группа 3) ранее всего происходило визуально полное закрытие дефекта и восстанавливалась оптическая плотность кости. Наименее эффективно замещение костного дефекта по данным КТ происходило при использовании в качестве имплантата аутокости. Костная пластинка, которая формировалась на базе аутологичной костной ткани и в отдаленные сроки (1618 недель) еще заметно отличалась от интактной кости.

Анализ данных МСКТ позволяет сделать вывод о наибольшей эффективности использования для закрытия дефектов костей лиофилизированных аллотрансплантатов (ЛАТ) со стволовыми клетками, что подтверждается сокращением сроков остеорепарации и полнотой восстановления костной структуры и ее плотности [Чергештов Ю.И. и соав.2014].

Динамика развития костной ткани в области замещения операционного дефекта аутологичной костью и аллогенным материалом

(гистологическое исследование)

При проведении экспериментов мы резецировали фрагмент нижней челюсти кролика на ее наружней поверхности. При заготовке материала для гистологического исследования резецировали тотальный фрагмент нижней челюсти так, чтобы ложе трансплантата присутствовало целиком.

Гистологические срезы проводили через середину резецированного фрагмента. Таким образом, на срезе можно было видеть трансплантат, поперечный разрез края челюсти, а также внутреннюю кортикальную пластинку.

Трансплантация аутологичной кости

Через 2-4 недели после трансплантации фрагмента аутологичной кости в ложе операционного дефекта пересаженный фрагмент костной пластинки подвергался интенсивной резорбции за счет активации соединительно-тканных компонентов подлежащей ткани. Деструкция кости происходила, преимущественно, со стороны внутренней поверхности, т.е. ложа трансплантата. Богатая сосудами и остеокластами ткань, прилежащая к костной пластинке, врастала, по мере резорбции, в ее толщу, вплоть до кортикального слоя, формирующего ее наружную поверхность. После 2-х недель мы уже не отмечали выраженную клеточную реакцию со стороны ложа трансплантата.

Один из вариантов структуры аутоимплантата встречался достаточно часто, но не во всех зонах пересаженной пластинки. Костная ткань здесь представляла собой тонкую кортикальную пластинку с линейной ориентаций слоев, идущих параллельно поверхности, сравнительно немногочисленными лакунами остеоцитов и редкими капиллярами. В этот же временной интервал, ближе к 4-м неделям после аутотрансплантации, можно видеть, что на большей площади имплантата структура пластинки более сложная. Наружная поверхность костной пластинки образована несколькими параллельными слоями пластинчатой кости. Внутренняя поверхность костной пластинки сформирована одним-двумя слоями пластинчатой кости, параллельными

поверхности. В целом, структура костной пластинки свидетельствует о новообразовании костной ткани.

Через 6-8 недель после трансплантации аутологичной кости наружная пластинка нижней челюсти представлялась более толстой. Аутотрансплантат на большем протяжении представлен сплошной пластинчатой костью с неровными, извитыми или «рваными» границами. Внутренняя поверхность костной пластинки подстилалась активной соединительной тканью, эта соединительная ткань обладает заметными остеогенными свойствами.

На сроке 8 недель аутоимплантат представлял собой уже относительно толстую костную пластинку с более или менее гладкими границами. Наружные кортикальные слои этой пластинки пронизаны широкими каналами, содержащими микрососуды. В толще костной пластинки можно наблюдать достаточно широкие каналы, содержащие крупные тонкостенные сосуды, и более узкие каналы с капиллярами.

Гистологический анализ в отдаленные сроки после аутотрансплантации (16-18 недель) показал, что последующие преобразования костной ткани связаны с ее «компактизацией». Костная ткань, заключенная между наружной и внутренней костными пластинками представляла собой хаотически ориентированные слои с многочисленными костными лакунами и не очень частыми капиллярами. Типичных остеонов или подобных им структур практически не видно, Подобная организация костной ткани свидетельствовала о практически законченном новообразовании кости.

Замещение дефекта лиофилизированным деминерализованным костным матриксом (ЛДКМ) ЛДКМ представляет собой лиофилизированный коллагеновый каркас кости - губчатую структуру с микроскопическими ячейками и довольно толстыми (в гидратированном состоянии) коллагеновыми волокнами.

Формирование костной ткани в трансплантате происходило в зоне контакта его с окружающими мягкими тканями.

Уже через 2 недели после имплантации в участках костеобразования выявлялись две тонкие костные пластинки, между которыми располагалась сотовидная соединительная ткань. Пластинки не были сплошными, хотя костные фрагменты каждой из них были ориентированы, примерно, в одной плоскости. К концу 4-ой недели в операционном дефекте обнаруживалась губчатая кость с крупными костными трабекулами. На протяжении последующего месяца (6-8 недель после имплантации) наружная пластинка челюсти сформирована губчатой костью с крупными балками и обширными пространствами между ними. Заметные различия, по сравнению с предыдущим сроком, относятся к структуре самой костной ткани. Пластинчатая кость

сохранялась на внешней поверхности и появлялась в крупных балках в облаетн

контакта с соединительной тканью, заполняющей лакуны.

Развитие наружней пластинки нижней челюсти на сроке 16-18 недель представляло собой хорошо прогнозируемый процесс. Костные трабекулы разделены обширными лакунами соединительной ткани, в которой превалируют жировые клетки. Формирование костной пластинки в отдаленные сроки после операции шло в двух направлениях: утолщение костных пластин и наращивание массы костных трабекул. Однако в любом случае, костеобразование в зоне имплантации ЛДМК происходило на основе первичного образования губчатой кости. В последующем губчатая кость сохранялась, хотя и существенно изменялась.

Трансплантация ЛДКМ, содержащего мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (ЛДКМ+ММСК)

Эксперименты с имплантацией ЛДКМ, содержащего мультипотентные мезенхимные стволовые клетки (ММСК) в ложе операционного дефекта представляют особенный интерес не только с точки зрения развития новых высокоэффективных методов регенеративной медицины. Как показали наши исследования, динамика развития кости в этом случае существенно отличалась от той последовательности процессов, которые можно наблюдать

при аутотраисплаитации костного фрагмента или имплантации одного лишь носителя — ЛДКМ.

Через 2-4 недели после имплантации ЛДКМ, содержащего ММСК (ЛДКМ+ММСК) на месте операционного дефекта наблюдалась уже достаточно толстая, на большем протяжении, костная пластинка, которая лишь в некоторых участках имела глубокие инвагинации, края которых напоминали трабекулы губчатой кости. Сама пластинка сформирована пластинчатой костной тканью, слои которой ориентированы более или менее параллельно. Костная пластинка подстилалась сетевидной соединительной тканью, участки которой проникали в инвагинации.

Уже к концу первого месяца после имплантации ЛДКМ+ММСК, наружная пластинка нижней челюсти была достаточно сформирована, однако структура костной ткани, ее образующей, воспроизводилась на этом сроке только ламеллярной костью.

В течение 6-8 недель после имплантации ЛДКМ+ММСК отчетливо выявлялась динамика формирования костной пластинки. Глубокие слои сравнительно толстой костной пластинки представляли собой губчатую кость. В большей части каналов и лакун отчетливо видно, что остеогенные клетки (остеобласты) практически непрерывным слоем покрывали костные поверхности, образованные новообразованным костным матриксом. Таким образом, мы можем констатировать, что через 6-8 недель после имплантации в ложе дефекта ЛДКМ, населенного мезенхимальными клетками, формировалась уже достаточно толстая костная пластинка, которая в основной массе состояла из трансформирующейся губчатой кости. Остеогенез в пластинке активно продолжался и направлен в сторону преобразования губчатой кости в кость компактную.

В отдаленные сроки после имплантации (16-18 недель) ЛДКМ с мезенхимальными клетками на большем протяжении наружная костная пластинка нижней челюсти выглядела вполне сформированной костью, Она

представляла собой толстую плоскую пластину, наружные слои которой образованы пластинчатой костью с ориентацией слоев параллельно поверхности. В некоторых случаях мы отмечали хаотическое переплетение слоев новообразованной костной ткани, текстура которой напоминала плотную грубоволокнистую костную ткань.

Таким образом, можно заключить, что в этой серии экспериментов, спустя 16-18 недель после имплантации ЛДКМ+ММСК, процессы остеогенеза в уже сформированной костной пластинке направлены на преобразование губчатой кости в кость пластинчатую.

Многочисленные публикации последних лет свидетельствуют о настойчивых попытках найти альтернативу аутотрансплантации или возможности направленного управления остеогенезом. Хотя с этой целью делаются попытки использования самых разнообразных ткане-инженерных конструкций, включающих и молекулярные продукты (регуляторные белки, фрагменты генов и др.), как правило, в их состав включаются и клеточные элементы [Деев Р.В. и соав., 2013]. Наиболее перспективными в этом отношении являются мультипотентные мезенхимные стволовые клетки, которые можно получить из разных источников и в нужном количестве даже из тканей самого пациента. Известно, что ММСК способны в культуре тканей или при гетеротопической пересадке дифференцироваться как в остеогенные клетки, так и в специфические клетки зубной ткани [Graziano А., 2008; Seo В.М., 2008]. Данный путь дифференцировки не требует создания специальных условий, хотя, безусловно, нуждается в наличии дифференцировочных стимулов (факторов роста и дифференцировки) которые, как правило, присутствуют в культуральной среде или в нормальных тканях. В частности в определенных условиях in vitro ММСК дентальной пульпы продуцировали минерализованный матрикс, a in vivo дифференцировались в остеоциты и формировали компактную кость [Laino G., 2006]. Следует ожидать, поэтому, что при использовании ММСК в зоне репаративной регенерации кости, факторы,

способствующие остеогенной дифференцировке стволовых клеток, должны присутствовать обязательно. Для успешной репаративной регенерации кости необходимо, чтобы имплантированные клетки были достаточное время иммобилизованы в зоне повреждения, с тем, чтобы оказать свой положительный эффект. С этой целью используются обычно биодеградируемые материалы, натуральные или синтетические, которые, помимо прочего, являются и некоторой матрицей, организующей в тканевом пространстве те взаимодействия, которые нужны в ходе костной репарации [Банин В.В.,2013; Овчарова Л.В., 2013],

С точки зрения успеха регенерации костной раны стимуляция ангиогенеза и привлечение растущих микрососудов в зону репарации является, возможно, самым важным фактором, способствующим регенерации. Возможно, что основное влияние ММСК именно в этом и проявляется [Овчарова JI.B., 2014].

По мнению большинства исследователей, занимающихся регенерацией костной ткани, для получения конечного продукта, полноценной кости в зоне костного дефекта или перелома, важно стимулировать сам каскад регенерационного цикла [Мальгинов H.H. и соав., 2007; Матвеева В.Н., 2007 ], и не очень важно, что это делает-фибриновый сгусток в ране, аутотрансплантат, коллагеновый матрикс или мезенхимные клетки в нем. Просто клетки, в составе ткане-инженерных конструкций делают это более эффективно и с точки зрения времени регенерации, и в отношении качества полученного регенерата.

Выводы

1 .Плотностные характеристики новообразованной кости в отдаленные сроки после пересадки аутотрансплантата были в 2 раза ниже интакгного коркового слоя. При имплантации лиофилизированного деминерализованного костного матрикса они были меньше характеристик интактного коркового слоя в 1,5 раза. При трансплантации ЛДКМ, содержащего стволовые клетки, плотность новообразованной кости

приближалась к плотности интактной кости.

2.Результаты компьютерной томографии, которая широко используется для клинического контроля полноты репаративного остеогенеза, не отражают в полной мере динамику замещения костного дефекта и, поэтому, в экспериментальных условиях должны быть верифицированы данными гистологического анализа.

3.Имплантация лиофилизированного деминерализованного костного матрикса (ЛДКМ) в область операционного дефекта недостаточна для формирования полноценной костной ткани в зоне репарации, поскольку даже в отдаленные сроки новообразованная кость сохраняет строение губчатой кости.

4.Имплантация ткане-инжереного конструкта, включающего ДЛКМ и мультипотентные мезенхимные стволовые клетки, может быть хорошей альтернативой аутотрансплантации, с точки зрения скорости и полноты сформированного регенерата и качества новообразованной костной ткани.

Практические рекомендации

1. Для проведения клинической апробации применения лиофилизированного

декальцинированного костного матрикса с мультипотентными мезенхимальными стволовыми клетками с целью повышения эффективности процессов репаративной регенерации рекомендуем использовать лиофилизированный декальцинированный костный матрикс, изготовленный по оригинальной технологии «Лиопласт®» (аллогенный материал).

2. Использование мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток

костного мозга позволяет сократить сроки восстановления дефекта кости, приводит к восстановлению структуры полноценной (компактной) костной ткани и позволяет снизить процент осложнений при проведении

костнопластических операций, в связи с чем, мы рекомендуем применять их при замещении дефектов нижней челюсти в клинической практике.

3.Для объективной оценки эффективности костнопластических трансплантатов в экспериментальном исследовании рекомендуем использовать гистологический анализ, позволяющий оценить динамику замещения костного дефекта, в то время как для применения в клинике , достаточно рентгенологического исследования.

4. Резекция фрагмента нижней челюсти кроликов (наружней пластинки) является удобной моделью для изучения репаративного остеогенеза, особенно в челюстно-лицевой хирургии.

Публикации по теме диссертации

1. Банин В.В. Особенности формирования костной ткани у кроликов призамещении дефекта нижней челюсти аутологичной костью и аллогеннымматериалом. [Текст] / В.В. Банин, Л.В. Овчарова // Морфологическиеведомости № 3 2013. С. 14-20.

2. Овчарова Л.В., Замещение дефектов нижней челюсти путем имплантации модифицированных фрагментов костной ткани [Текст] / Овчарова Л.В.// Морфология № 5 Эскулап 2013; тезисы том 144.№5; Оренбург, 19-20 ноября 2013. С.101.

3. Овчарова Л.В. Влияние ангиогенеза на формирование костной ткани [Текст] /Овчарова Л.В., Костяева М.Г. // Морфология Эскулап 2014 том 145№3 Санкт-Петербург 2014. С. 146.

4. Чергештов Ю.И. Динамика репаративной регенерации дефектов нижней челюсти, замещенных различными имплантатами с использованием стволовых клеток по данным компьютерной томографии (экспериментальное исследование) [Текст] /Чергештов Ю.И., Лежнев Д.А., Овчарова Л.В. //Российская стоматология № 1/2014. С. 8-15

Подписано к печати 10.12.2014 Протокол № 24(3) Тираж 100 экземпляров Отпечатано в ООО «Бланк Принт» г. Москва, ул. Автозаводская, д. 13/1 тел.: 8(495)675-65-33