Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Постсинаптическая потенциация и десенситизация в нервно-мышечных синапсах теплокровных животных

РГ6 ОА !о ди «96

На правах рукописи

ШВЕЦОВ АНДРЕЙ БОРИСОВИЧ

ПОСТСИНАПТИЧЕСКАЯ ПОТЕНЦИАЦИЯ И ДЕСЕНСИТИЗАЦИЯ В НЕРВНО-МЫШЕЧНЫХ СИНАПСАХ ТЕПЛОКРОВНЫХ ЖИВОТНЫХ

14.00.17 - нормальная физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

КАЗАНЬ 1996

Работа выполнена в Казанском государственном медицинском Университете.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Гшиатуллин P.A.

Научный консультант: Заслуженный деятель науки Росийской Федерации и Республики Татарстан доктор медицинских наук, профессор Хамитов Х.С.

Официальные оппоненты: Заслуженный деятель науки Республики Татарстан, доктор биологических наук, профессор Ситдиков Ф.Г.

доктор медицинских наук, профессор Волков Е.М.

Ведущая организация - Московский государственный

Университет.

на заседании диссерт; )84.29.03 при

Казанском государственном медицинском Университете (420012, г.Казань, ул Бутлерова, 496).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Университета (Казань, ул. Бутлерова, 496).

Автореферат разослан / " /-I0j2c?/>if 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета профессор Р.Х. Хафизянова

Защита состоится

часов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Проблема пластичности синаптических Зразаваний является в настоящее время одним из наиболее етуальных вопросов нейрофизиологии. Нервно-мышечные синапсы зляются той моделью, на которой получены новые данные о эханизмах долговременной [Зефиров и др., 1992] и ратковременной [Zucker, 1989; Гиниатуллин, 1992] пластичности, кратковременной пластичности описана пресинаптические [Zucker, Э89] и постсинаптические формы [Magleby, Pallotta, 1981; agazanik, Giniatullin, 1990; Гиниатуллин, 1992]. К эстсинаптическим формам кратковременной пластичности относятся эстсинаптическая потенциация и десенситизация. Если эстсинаптическая потенциация приводит к увеличению ффективности синаптической передачи, то десенситизация обладает ротивоположным действием, являясь своеобразным механизмом аморегуляции функции синапса, ограничивающим его избыточную ктивность [Гиниатуллин и др., 1986; Ruzzier, Scuka, 1986].

В настоящее время в литературе указывается, что' как эстсинаптическая потенциация, так и десенситизация имеют ложный комплексный характер, складывающийся из нескольких олекулярных механизмов [Boyd, 1987; Mozrzymas, Scuka, 1992; иниатуллин и др., 1992]. Проявления этих феноменов во многом ависят и от структурно-функциональных особенностей синапсов Thesleff, 1959]. Однако исследование как молекулярных еханизмов этих феноменов, так и функциональной роли потенциации десенситизации в деятельности синапса проводилось в основном а нервно-мышечных синапсах холоднокровных [Katz, Thesleff, 957; Magazanik, Vyskocil, 1979; Magleby, Pallotta, 1981; agazanik et al., 1984; Ruzzier, Scuka, 1986; Giniatullin et al, 993]. В то же время, есть основания полагать, что у еплокровных зависимые от концентрации АХ механизмы могут быть ораздо более выраженными [Thesleff, 1959; Franke et al., 1992]. связи с этим представлялось интересным провести исследование остсинаптической потенциации и десенситизации в нервно-мышечных инапсах теплокровных и сравнить ' с аналогичными данными для инапсов холоднокровных.

Цели и задачи. Целью настоящей работы являлось исследован механизмов и функциональной роли постсинаптической потенциации десенситизации в нервно-мышечных синапсах теплокровных животны: Б соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать проявления постсинаптической потенциации результате пространственного взаимодействия квантов медиатора, также при парной стимуляции нерва в нервно-мышечных синапс; крысы. Сравнить эти данные с проявлениями потенциации нервно-мышечном синапсе лягушки.

2. Для раскрытия механизмов постсинаптической потенциац] проанализировать факторы, определяющие временной х< многоквантовых токов концевой пластинки у теплокровных (крыс! при активной и икгибированной ацетилхолинэстеразе.

3. Изучить возможность развития постсинаптической потенциации : счет ацетилхолина, выделенного в неквантовой форме.

4. Сравнить эффективность действия блокаторов открытых ионш каналов постсинаптической мембраны у теплокровных холоднокровных животных.

5. Исследовать возможность развития десенситизации I постсинаптической мембране в ходе ритмической активное: нервно-мышечного синапса крысы. Оценить выраженное; десенситизации, вызванной эндогенным ацетилхолином теплокровных, по сравнению с холоднокровными животными.

Положения, выносимые на защиту

1. В синапсах теплокровных наблюдаются .призна! функциональной недостаточности фермента ацетилхолинэстеразь проявляющиеся в феномене постсинаптической потенциации пространстве" - замедлении скорости спада многоквантовых токе концевой пластинки по сравнению с одноквантовыми ответами феномене постсинаптической потенциации "во времени" - замедлен! спада сигнала при парной стимуляции нерва.

2. Длительность спада и число компонентов спада токе концевой пластинки в нервно-мышечных синапсах диафрагмы крысь при ингибированной АХЭ зависит от количества квантов А) выделяемых из нервного окончания в ответ на нервный импульс.

Научная новизна: В работе приведены новые данные''- о механизмах, лежащих в основе постсинаптической потенциации в нервно-мышечном синапсе крысы. Выявлены изменения кинетики фунционирования постсинаптических ионных каналов под влиянием повышенных концентраций эндогенного АХ, которые приводят к дополнительному замедлению синаптических сигналов. Установлен минимально необходимый уровень квантового выброса медиатора, превышение которого приводит к кумуляции следовых явлений на постсинаптической мембране. Получены оригинальные данные об особенностях действия широко используемых холинергических соединений таких как альфа-бунгаротоксин, ионы магния, реактиватор ингибированной ацетилхолинэстеразы дипироксим. Оценена возможность развития постсинаптической потенциации за счет неквантовой секреции трансмиттера в синапсах крысы. Приведены данные о возможности развития десенситизации за счет накопления эндогенного АХ в синапсах теплокровных.

Научно-практическая ценность: Полученные данные позволяют приблизиться к более глубокому пониманию постсинаптических механизмов, участвующих в генерации синаптических сигналов в нервно-мышечных синапсах теплокровных животных при уровне секреции трансмиттера, близкого к физиологическому. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о важной роли постсинаптической потенциации и десенситизации как форм кратковременной пластичности синаптической передачи в регуляции функции синапса. Вскрыты механизмы тех изменений, которые развиваются в синапсе после действия ингибиторов ацетилхолинэстеразы. Установлены особенности действия ряда известных и широко применяемых холинергических лигандов на нервно-мышечную передачу у теплокровных. Сравнение с холоднокровными показывает, что в целом ряде случаев действие таких агентов не носит универсального характера. Различия могут быть не только количественными, но и противоположными по функциональной направленности, что необходимо учитывать при использовании действия этих препаратов в экспериментальной практике.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложен и обсуждены на Всесоюзной конференции "Физиология и биохими медиаторнкх систем" (Москва, 1985), Съезде Физиологическог общества СССР (Кишинев, 1987), Всесоюзных симпозиумах по ионны каналам биологических мембран (Пущино, 1987, Кара-Даг, 1939 1990), на Всесоюзной конференции "Физиология периферическог синапса" (Казань, 1988), Всесоюзной конференции "Физиологи гормонов и медиаторов" (Суздаль, 1989 ), Всесоюзной конференции посвященной памяти Х.С.Коштоянца (Москва, 1990), на научны заседаниях кафедры нормальной физиологии Казанского мединститут и Татарского отделения Всероссийского Физиологического обществ им.И.П.Павлова (Казань, 1989, 1993, 1996).

Реализация результатов исследования: По материала диссертации опубликовано 10 работ. Данные исследования включен: в лекционные курсы по нормальной физиологии для студенто Казанского государственного медицинского университет им.С.В.Курашова.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит и: введения, обзора литературы, изложения методов исследования результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов ] указателя литературы. Работа изложена на стр.

иллюстрирована 15 рисунками и 4 таблицами. Указатель литератур! включает 217 работ, из них 148 иностранных авторов.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили нервно-мышечные препараты диафрагмы и камбаловидной мышц крыс, а также портняжной и кожно-грудинной мышц лягушек. Для предотвращения сокращений мышцы во время регистрации сигналов и сохранения высокого уровня квантового состава мышечные волокна рассекали [Волкова и др., 1975] или глицеринизировали [Е1эепЬе^ et а1., 1971].

Ванночка, где размещался нервно-мышечный препарат, имела рабочую емкость 2 мл. В' течение эксперимента через ванночку непрерывно протекал раствор Рингера - Локка следующего состава (з ммоль/л):КаС1 - 137,0; КС1 - 5,0; СаС12 - 2,0; МеС12 - 1,0; МаНС03 - 11,0; ИаН2Р04- 1,0; глюкоза - 11,0; рН раствора поддерживали на уровне 7,3-7,35. 3 течение 40-50 минут до начала и во время эксперимента раствор аэрировали газовой смесью, состоящей из 95% кислорода и 5% углекислого газа.

Для холоднокровных использовали раствор следующего состава (в ммоль/л):ЫаС1 - 115,0; КС1 - 2,5; СаС12 - 1,8; ИаНС03 - 11,0. Эксперименты проводили при комнатной температуре.

Ингибирование ацетилхолинэстеразы (АХЭ) проводили либо прозерином (3*10-^ ммоль/л), либо предварительной экспозицией мышцы с в физиологическом растзоре, содержащим армин (1*10-^ ммоль/л), в течение 30 минут.

Токи концевой пластинки и миниатюрные токи отводили в условиях двухэлектродной фиксации потенциала. Накопление и усреднение синаптических сигналов производили при помощи персонального компьютера с периодом опроса 20-60 мкс на точку. Расчет параметров и характера спада миниатюрных токов концевой пластинки и многоквантовых токов (количество экспонент) производили при помощи оригинальной программы, (автор - Костылев К.К.). Достоверность различий оценивали по ^критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ПОСТСМНАПТИЧЕСКАЯ ПОТЕНЦИАЦИЯ ПРИ АКТИВНОЙ АХЭ

В первой серии экспериментов анализировали параметры токо) концевой пластинки (ТКП) в диафрагме крысы при сохраненно! высоком (близком к физиологическому) уровне квантового состава Параметры многоквантовых ТКП сопоставляли с параметрам] миниатюрных ТКП (МТКП - одноквантовых ответов) в том же синапсе Нас интересовало, совпадает ли скорость спада МТКП и ТКП у крыс! при физиологическом уровне секреции АХ.

При фиксации потенциала мышечных волокон диафрагмы н< уровне -70 мВ и температуре 20-21°С средняя амплитуда МТК1 составляла 2,7+0,10 нА (п=17 синапсов), а спад МТК1 аппроксимировался одной экспонентой с постоянной времени

М1 К11

равной 1,17+0,05 мс (п=17). Средняя амплитуда многоквантовых ТК1 составляла 1бЗ,4±11,5 нА (п=20). Квантовый состав ТКП варьировав в пределах 25 - 140 квантов. Спад ТКП независимо от квантовогс состава был ыоноэкспоненциальным с равной 1,51±0,07 мс

(п=20), т.е. на 29% больше, чем длительность МТКП (Р<0,05).

Таким образом, в синапсах теплокровных при высоком (близкo^ к физиологическому) уровне квантозой секреции ацетилхолинг наблюдаются признаки функциональной недостаточности ферменте АХЭ, проявляющиеся в феномене постсинаптической потенциации "е пространстве" (замедлении скорости спада многоквантовых токое концевой пластинки по сравнению с одноквантовьзми ответами). Интересно, что этот феномен имеет такую же выраженность, как и ъ синапсах холоднокровных, несмотря на 10 кратное превышение числе активных центров АХЭ в нервно-мышечных синапсах у теплокровных [Anglister е1 а1., 1993], что говорит о больших функциональных последствиях компартментализации этого фермента, чем о значение общей активности АХЭ.

ПОСТСИНАПТИЧЕСКАЯ ПОТЕНЦИАЦИЯ ПРИ ИНГИ5ИР0ВАНН0Й АХЭ

Для анализа постсинаптической потенциации при генерации многоквантовых ТКП при ингибированной АХЭ прежде всего

еобходимо было описать параметры ответов постсинаптической ембраны на одиночные кванты АХ - миниатюрные ТКП.

В нервно-мышечных синапсах диафрагмы крысы с ингибированной ХЭ при потенциале фиксации -70 мВ и температуре 20-21°С редняя амплитуда МТКП составляла 2,9±0,1 нА (п=36). Спад ГКП в большинстве синапсов был моноэкспоненциальный с мткп=3,8±0,3 мс (п=36).

В следующей серии экспериментов исследовали параметры ногоквантовых ТКП. Средняя амплитуда многоквантовых ТКП, была 72±14нА (п=48), квантовый состав ТКП колебался от 15 до НО вантов. Длительность спада ТКП во всех исследованных синапсах ила больше, чем у МТКП. Причем в большинстве случаев спад ногокзантовых ТКП имел более сложный характер, чем эноэкспоненциальный спад МТКП. Многоквантовые ТКП по характеру пада в можно было разделить на три группы (Табл.1): 1) имеющие эноэкспоненциальный спад; 2) имеющие двухэкспоненциальный спад; ) имеющие спад, который мог быть описан 3-мя экспонентами, ложный комплексный спад ТКП мог быть зарегистрирован не только условиях фиксации потенциала, но и при внеклеточном отведении игналов. В аналогичных условиях у лягушки спад как ногоквантового ТКП, так и МТКП, был моноэкспоненциальным.

Более систематически связь характеристик спада ТКП с вантовым составом ТКП удалось проследить в опытах с медленной одачей ионов магния (конечная концентрация 6-10 ммоль/л). В летках, в которых спад ТКП был первоначально двухфазным, по ере снижения квантового состава ТКП происходило ускорение спада эдленного компонента, а затем, при квантовом составе равном 1±0,3 (п=6) и ниже, тткп уже не отличалась от тмтк1Г

То, что при квантовом составе ниже 10-12 спад ТКП не гличался от спада МТКП з этих же синапсах означало, что эроятность перекрытия зон действия квантов на постсинаптической эмбране крайне низка. Интересно, что аналогичный "критический эовень" квантовой секреции в портняжной мышце лягушки составил -соло 60-70 квантов. При полном квантовом составе длительность тада ТКП у крыс была в 3 - 5 раз больше, чем у лягушек.

Таблица - 1. Многоквантовые токи концевой пластинки в синапс диафрагмы крысы при ингибированной АХЭ.

Кол - во экспонент в спаде ТКП Число синапсов Квантовый состав ТКП Постоянная времени спада

быстрого компонента (мс) промеж-ого компонента (мс) медленного компонента (мс)

1 3 16+1 — — 8,5+2,1

2 36 56+4 — 3,3+0,2 53,5+6,2

3 9 71+9 0,6+0,07 5,3+0,4 90,2+4,7

Причина значительных различий в длительности спада ТКП теплокровных и холоднокровных заключается, по-видимому, в разн плотности и различном взаимном расположении активных зон синапсе. У млекопитающих активные зоны расположены более плот: и организованы в совокупности в виде "бляшек" [Cole, 1955], в время как у холоднокровных активные зоны располагают последовательно по ходу пространственно разобщенных терминальн; веточек [Bennet, 1983].

Таким образом, расположение активных зон у млекопитающ: создает более благоприятные условия для постсинаптическо: взаимодействия квантов АХ и более выраженного проявлен: постсинаптической потенциацш - замедления спада ТКП по ме; роста квантового состава ТИП при ингибированной АХЭ [Hartzell al., 1975].

ВЛИЯНИЕ МЕМБРАННОГО ПОТЕНЦИАЛА НА АМПЛИТУДНО-ВРЕМЕННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МНОГОКЗАНТОВЫХ ТКП.

При интактной АХЭ гиперполяризация мембраны вызывала амедление спада МТКП. Коэффициент потенциалозависимости "Н" величина сдвига мембранного потенциала, которая необходима для зменения т,,_„_ в е раз) при этом составил 106+7 мВ (п=3). Этот

Mi, Kil

ффект объясняется ' потенциалозависимостью времени жизни Х-активируемых ионных каналов, в частности, более родолжительным временем открытого состояния при иперполяризации мембраны [Anderson, Stevens, 1973].

Ингибирование АХЭ снижало чувствительность спада МТКП к .вменениям мембранного потенциала. Коэффициент "Н" в этом случае оставил 136±10 мВ (п=12), по-видимому, з результате замедления .иффузионного удаления АХ из синаптической щели при 'иперполяризации за счет более длительной задержки молекул АХ на »ецепторной молекуле.

Потенциалозависимость быстрого компонента спада ¡вухэхспоненциальных ТКП также как у МТКП была низкой - "Н" 1Коло 200 мВ. Неожиданно высокой во всех исследованных синапсах «азалась зависимость от мембранного потенциала скорости спада [едленного компонента. Коэффициент "Н" при этом составил 45+5. мВ п=11), то есть он был в три раза меньше, чем "Н" для МТКП з ¡тих же условиях.

Вольтамперная характеристика МТКП при активной и шгибированной АХЭ, а также ТКП в большинстве клеток была ганейной. Все три компонента спада многоквантовых ТКП имели ютенциал реверсии около 0 мВ, что говорит о том, что они. .были ;бусловлены открытием одного'типа ионных каналов..

Необходимо отметить, что выявленная в наших экспериментах зысокая потенциалозависимость спада ТКП наблюдалась при ^пользовании в качестве анти-АХЭ агента как прозерина, так и фмина, причем в последнем случае свободный ингибитор в растворе отсутствовал. Следовательно, полученные данные не были связаны с ^специфическими эффектами этих веществ на холинорецептор.

Высокая потенциалозависимость спада синаптических сигналов иблюдалась ранее при действии блокатора открытых ионных

каналов быстрого типа дипроксима [Гиниатуллин и др., 1938 Быстрый блок открытых ионных каналов самим АХ был показан так в экспериментах с регистрацией одиночных каналов [Sin Steinbach 1984; Ogden, Colquchoun, 1985]. Это послужи, основанием как для более подробного изучения эффект дипироксима, так и анализа возможного блока ионных канал-повышенной концентрацией эндогенного АХ.

ВЛИЯНИЕ ДИПИРОКСИМА НА ПАРАМЕТРЫ МТКП У КРЫСЫ И ЛЯГУШКИ,

В наших экспериментах, проведенных .на нервно-мышечн( препарате диафрагмы крысы холинолитическое действие дипироксим; выражающееся в снижении амплитуды МТКП при интактной АХ; начинало проявляться в концентрации 5-10""6 моль/л и значителы усиливалось при дальнейшем росте содержания вещества в раствор! Наряду с уменьшением амплитуды сигналов наблюдалось увеличен] длительности спада МТКП с сохранением экспоненциальное™ з спада. Так, после введения дипироксима в концентрации 5-10" моль/л средняя амплитуда МТКП снижалась в два раза, а сп; удлинялся в двое, оставаясь при этом моноэкспоненциальным, ч: характерно для быстрых блокаторов. Постоянная времени спада этом случае составила 2,3±0,3 мс (п=8,Р<0,05). Эффект дипироксима как на амплитуду, так и на длительность MTF зависели от мембранного потенциала мышечного волокна. В контро: вольтампернэя характеристика МТКП была линейной, а в присутств;> дипироксима наблюдалась не только нелинейность этой зависимости но и область отрицательной проводимости, характерная д; действия блокаторов ионных каналов [Peper et al., 1982].

В экспериментах на портняжной мышце лягушки дипирокст проявлял аналогичные эффекты, которые в целом так» характеризовали его как блокатор открытых ионных канале быстрого типа. Однако чувствительность конных каналов у лягушк к данному блокатору оказалась в 3-5 раз ниже, чем у крысы. Эт данные также свидетельствовали о более высокой вероятное! развития блока постсинаптических ионных каналов самим АХ крысы, что подтверждается и данными по регистрации одиночны каналов [Colquchoun et.al., 1986].

ВЛИЯНИЕ а-БУНГАРОТОКСИНА НА МТКП И МНОГОКВАНТОВЫЕ ТКП

Снижение плотности свободных холинорецепторов необратимо блокирующим агентом а-бунгаротоксином в экспериментах на 1иафрагме крысы приводило к снижению амплитуды МТКП и к ускорению спада одноквантовых сигналов, что соответствует данным гагературы [Guinan, 1980; Katz, Miledi, 1973]. Однако динамика вменений временного хода многоквантовых ТКП носила иной сарактер. Так, при снижении амплитуды ТКП под действием х-бунгаротоксина до 75-50% от исходной величины происходило эасширение сигнала за счет замедления спада медленного компонента. При дальнейшем действии а-бунгаротоксина и падении шплитуды ТКП, сигналы спадали быстрее и постоянная времени :пада снижалась ниже исходных значений. В экспериментах на юртняжной мышце лягушки под действием этого агента происходило укорочение как МТКП, так и мнсгоквантовых ТКП.

Различия между эффектами а-бунгаротоксина на МТКП и ТКП у <рысы также как и данные, приведенные в предыдущих разделах, югут получить объяснение на базе представления о самоблскаде юнных каналов АХ. В этом случае расширение ТКП после блока шсти рецепторов а-бунгаротоксином может быть следствием увеличения эффективной концентрации эндогенного АХ, зоздействующего на открытые ионные каналы неблокированных солинорецепторов, так как длительность нахождения каналов в блокированном состоянии линейно зависит от • концентрации злокатсра [Neher, Steinbach, 1978].

ПОСТСИНАПТИЧЕСКАЯ ПОТЕНЦИАЦИЯ "ВО ВРЕМЕНИ" (ПРИ ПАРНОЙ СТИМУЛЯЦИИ)

Одним из методов выявления постсинаптической потенциации шляется парная стимуляция двигательного нерва [Магазаник и др., .983,1984]. В экспериментах на диафрагме крысы при интактной АХЭ феменной ход первого и второго ТКП при межстимульном интервале .00 мс совпадал. Однако при менстимульном интервале 17 мс тблюдали замедление спада второго ТКП на 21+2% (Р<0,05; п=10), :отя время подъема первого ТКП (0,69±0,03 мс) и второго ТКП

(0,68+0,03 мс) было одинаковым. Также не было отличий в амплитуде первого (178+11 нА) и второго (175±9 нА) ТКП.

Таким образом впервые были получены прямые аргументы е пользу того, что различие между постоянными времени спада парных ТКП отражает именно постсинапгическую потекциацию, а не пресинаптические эффекты, поскольку во-первых, замедление спадг второго ТКП не сопровождалось изменением времени его подъема, т.е. это не может быть объяснено асинхронной секрецией АХ и; нервного окончания и во-вторых, при интактной АХЭ не наблюдалось увеличения амплитуды второго ТКП, что говорит о том, чтс выявленная потенциация не является следствием увеличения числг или размера высвобождаемых квантов АХ.

После ингибирования АХЭ уже при межимпульсном интервале ЮС мс скорость спада второго ТКП была значительно ниже. При этоь оба сигнала имели двухфазный спад, но у второго ТКП постоянна? времени второго компонента спада была на 80+14% больше (Р<0,05; п=5). В аналогичных экспериментах на портняжной мышце лягушк! постсинаптическая потенциация при парной стимуляции нервг составляла около 40%.

Кроме этого, в ряде экспериментов на нервно-мышечно1 препарате крысы, первый ТКП был моноэкспоненциальнык, а спа; второго ТКП уже описывался двумя экспонентами, что говорило о( увеличении концентрации эндогенного АХ в ходе генерации 2-гс ТКП.

Таким образом, после ингибирования АХЭ условия дл; проявления постсинаптической потенциация в нервно-мышечны: синапсах крысы становятся гораздо более благоприятными, чем } синапсах лягушки. Исходя из этого можно предположить, что 1 нервно-мыаечных синапсах теплокровных животных (крыса функциональная роль АХЭ более значима, чем у холоднокровны: животных (лягушка), поскольку ингибирование АХЭ у теплокровны: приводит к более глубоким изменениям в генераци] постсинаптического ответа.

ВЛИЯНИЕ НЕКВАНТОВОЙ СЕКРЕЦИИ НА ПАРАМЕТРЫ МТКП У КРЫСЫ

Известно, что помимо квантовой секреции АХ, выполняющее

главную функциональную роль в синапсе, существует неквантовое выделение АХ в молекулярной форме [КаЬг, МПесЦ, 1977]. В экспериментах на скелетных мышцах мыши было показано, что "неквантовый" АХ способен вызывать десенситизацию постсинаптической мембраны, что проявляется в укорочении МТКП [Гиниатуллин и др., 1989]. Вопрос о способности неквантового АХ вызывать противоположный десенситизации процесс

постсинаптической потенциации оставался спорным.

Поэтому в экспериментах на диафрагме крысы производили оценку возможности развития постсинаптической потенциации при ингибированной АХЭ по параметрам МТКП, которые высоко чувствительны к появлению даже низких, соизмеримых с "неквантовым" АХ, концентраций агониста в синаптической щели. Если "неквантовый" АХ вызывал дополнительное замедление спада МТКП (постсинаптическую потенциацию), то выключение этого источника должно было привести к укорочению МТКП. Для выключения неквантовой секреции использовали блокатор транспорта АХ в синаптические везикулы везамикол, который по данным литературы является высокоспецифическим ингибитором' неквантовой секреции IVускосИ ей а1. , 1989].

В первой серии экспериментов выбирали эффективную концентрацию везамикола и выясняли возможность влияния везамикола на транспорт АХ в синаптические везикулы нервных окончаний крысы. Для этого стимулировали двигательный нерв с частотой 10 Гц в течение 12 минут в присутствии везамикола (1,5-10_^моль/л). При этом наблюдалось резкое снижение амплитуды МТКП с 3,20±0,22 нА до 1,42±0,09 нА (п=4, Р<0,05). Кроме того, происходило также укорочение постоянной времени спада МТКП с 4,9±0,18мс до 1.8±0,09мс (п=4, Р<0,05).

Однако при действии везамикола в этой же концентрации на МТКП в покое, как амплитудные, так и временные параметры МТКП не изменялись. Так, к 20 минуте амплитуда МТКП составила 3,3+0,31 нА, а постоянная времени спада МТКП - 4.53+0,27 мс (п=6, Р < 0,05).

Полученные данные свидетельствуют о том, что неквантовый АХ в синапсах крысы не приводит к добавочному замедлению спада синаптических сигналов за счет развития феномена постсинаптической потенциации.

ДЕСЕНСКТИЗАЦИЯ В ХОДЕ РИТМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СИНАПСА

Для оценки развития десенситизации под влиянием эндогенное АХ регистрировали МТКП как тестирующие постсинаптическу; чуствительность сигналы после периода активности синапса [Ка1г 1966]. В экспериментах на диафрагме крысы стимуляци: двигательного нерва с частотой 10 имп/с в течение 5с приводила : снижению амплитуды МТКП уже при активной АХЭ (94+3%, п=7 Р<0,05). Это свидетельствовало о том, что небольшое снижен» чувствительности может быть достигнуто на этом объекте даж^ после прохождения 50 многоквантовых ТКП. Эффект десенситизаци! значительно усилился при нарушении гидролиза АХ. Так, поел' ингибирования АХЭ амплитуда МТКП, зарегистрированных поел! прохождения серии импульсов с частотой 10 Гц в течение 5с уменьшалась до 45+9% от исходных значений (Р<0,05; п=9).

В аналогичных экспериментах, проведенных на портняжно! мышце лягушки при . активной АХЭ чувствительное^ постсинаптической мембраны не менялась, а при ингибированной АХ: снижалась только после прохождения 600 ТКП.

Таким образом, в ходе- ритмической стимуляции нерв; чувствительность концевой пластинки к медиатору снижаете) намного быстрее в нервно-мышечном синапсе крысы, по сравнению < синапсом лягушки. Эти данные хорошо согласовались с результатам! экспериментов.по исследованию постсинаптической потенциации, 1 которых также получены подтверждения о большем накопленш эндогенного АХ в синаптической щели.

Различия в скорости десенситизации у теплокровных I холоднокровных могли быть связаны как с различиями в кинетикЕ десенситизации, связанной с особенностями холинорецепторов, таг и с разными условиями для накопления эндогенного АХ I синаптической щели, что следовало из наших экспериментов с выявлением постсинаптической потенциации.

СРАВНЕНИЕ ДЕСЕНСИТИЗАЦИИ, ВЫЗВАННОЙ ЭКЗОГЕННЫМ АГОНИСТОМ, В СИНАПСАХ КРЫСЫ И ЛЯГУШКИ*

Эксперименты проведены совместно с Р.Н. Хазипозым.

В ответ на добавление в проточный раствор АХ в концентрации 30 мкмоль/л, в экспериментах на диафрагме крысы, регистрировали жи концевой пластинки (ТКПэкз), которые достигали максимума, а 1тем уменьшались вследствие развивающейся десенситизации.

Спад ТКПэкз аппроксимировался двумя экспонентами, причем сорость спада тока в синапсах крысы т^=12,4±0,4, и лягушки =12,6±1,0, совпадали. Следовательно, можно полагать, что сорость десенситизации постсинаптических холинорецепторов данакова на обоих объектах.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что ¡сенситизация развивается в ходе * ритмической стимуляции жгательного нерва быстрее в нервно-мышечном синапсе шлокровных, по сравнению с холоднокровными, не в результате 1зличий в скорости десенситизации самих холинорецепторов, а ¡ляется результатом структурно-функциональной организации :напса теплокровных, обеспечизающих большее накопление диатора в синаптической щели.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в нервно-мышечных синапсах теплокровных вотных постсинаптическая потенциация и десенситизация играют щественную роль при передаче возбуждения с нервной клетки на шечное волокно. Эти постсинаптические формы кратковременной астичности имеют не только гораздо более выраженные оявления, чем у холоднокровных, но включают и новые механизмы, описанные ранее для холоднокровных животных. Причины раженных проявлений потенциации и десенситизации в синапсах плокровных базируются как на структурно-функциональных обенностях синапсов, обеспечивающих большее накопление догенного АХ (особенно при ингибированной АХЭ), так и на таких ханизмах постсинаптической потенциации, как самоблокада ионных налов эндогенным АХ. Обнаруженный в синапсах теплокровных зкий "критический уровень" квантового состава, превышение торого приводит к постсинаптическому взаимодействию квантов , также предрасполагает к развитию кумулятивных реакций на стсинаптической мембране нервно-мышечных синапсов при передаче

ритмических серий двигательных команд от мотонейрона к скелета мышце.

ВЫВОДЫ

1. В нервно-мышечном синапсе диафрагмальной мышцы крысы г физиологическом уровне квантовой секреции АХ фермент АХЭ способен полностью предотвратить повторную активах холинорецепторов и следовые реакции на постсинаптичесь мембране.

2. Спад многоквантового тока концевой пластинки нервно-мышечном синапсе крысы после ингибирования АХЭ нос многокомпонентный характер, зависящий от квантового выброса.

3. Отклонение характера спада тока концевой пластинки экспоненциального не связано с каналоблокирующим эффект использованных ингибиторов ацетилхолинэстеразы.

4. Все компоненты спада многоквантового тока конце! пластинки имеют потенциал реверсии около нуля, что говорит том, что они обусловлены открытием одного типа ионных каналов.

5. Критическая величина квантового состава, превыше} которой приводит к постсинаптическому взаимодействию кзантов, нервно-мышечном синапсе крысы составляет около 10 квантов.

6. Замедление спада многоквантовых ТКП (постсинаптическг потенциация) в синапсах крысы содержит компонент, обусловленнь модификацией работы АХ-активируемах ионных (предположитель самоблокада каналов эндогенным АХ) повышенной концентращ трансмиттера.

7. Постсинаптическая потенциация за счет ацетилхолш выделяемого в неквантовой форме, -не вносит существенного вкле в длительность тока концевой пластинки в синапсах крыс поскольку ингибирование неквантовой секреции везамиколом влияет на длительность постсинаптических токов.

8. В нервно-мышечных синапсах теплокровных десенситизащ развивающаяся под действием эндогенного ацетилхолю значительно более выражена, чем у лягушки. Это связано с бо; благоприятными условиями для накопления медиатора

гнаптической щели у теплокровных, поскольку динамика гсенситизации на экзогенный ацетилхолин и холиномиметик фбахолин у этих животных совпадает.

9. Структурно-функциональные особенности синапсов шлокровных предрасполагают к выраженным проявлениям )стсинаптической потенциации и десенситизации, зависимых от ювня активности АХЭ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Гиниатуллин Р.А., Магазаник Л.Г., Швецов А.Б. Особенности >еменного хода многоквантовых токов концевой пластинки, [являемые ингибированием ацетилхолинэстеразь: // Доклады АН ;СР,- 1987,- 297,- N1,- С.128-130.

Гиниатуллин P.A., Швецов A.B., Талантова М.А. Особенности акционирования холинергического синапса после нарушения [дролиза медиатора // В кн.: "Вопросы нейробиологии".- Казань.-187,- С.21-28.

Волкова И.Н., Гиниатуллин Р.А., Хазипов Р.Н., Швецов A.B. ;менения функциональных свойств пре- и постсинаптической ¡мбраны под влиянием выделенного в синаптическую щель ¡етилхолина // Тез. докл. Всесоюз. конф. по вегет. нервной [стеме.- Куйбышев,- 1988,- С.86.

Гиниатуллин P.A., Швецов А.Б., Хамитов Х.С. Ингибирование ;етилхслинэстеразы меняет не только организацию актов открытия ;етилхолинактивируемьзх ионных каналов, но и их кинетику // Тез. есоюз. симп. "Ионные каналы в биологических мембранах".-сква.- 1990,- С.19.

Гиниатуллин P.A., Швецов А.Б. Различия в эффектах бунгаротоксина на длительность одноквантовых и многоквантовых ков концевой пластинки крысы // Тез. Всесоюз. симп. Физиология диаторов. Периферический синапс. - Казань,- 1991,- С.32.

Гиниатуллин P.A., Швецов А.Б. Влияние квантового состава, мбранного потенциала и плотности рецепторов на временное чение токов концевой пластинки в условиях ингибирования етилхолинэстеразы // Нейрофизиология,- 1992.- 24.- N3. -269-279.

7. Хамитов Х.С., Швецов А.Б., Хазипов Р.Н., Гиниатуллин Р. Десенситизация на эндогенный и экзогенный ацетилхолин в синапс крысы и лягушки // Тез.докл. Всесоюз. конф. "Механизмы действ медиаторов и гормонов",- Суздаль- 1989.- С.203.

8. Швецов А.Б., Хазипов Р.Н., Хамитов Х.С., Гиниатуллин Р. Модуляция чувствительности постсинаптической мембраны п влиянием ритмической стимуляции нерва, спонтанной квантовой неквантовой секреции ацетилхолина // В кн.: "Физиология биохимия медиаторных процессов".- Тез. Всесоюз. конф. Москв 1990,- С.328.

9. Талантова М.В., Швецов А.Б., Гиниатуллин Р. Постсинаптические формы кратковременной пластичности нервно-мышечном синапсе теплокровных и холоднокровных // Успе физиологических наук.- 1994.- 25,- N1.- С.103.

10. Швецов A.B., Гиниатуллин P.A. Влияние блокатора транспор ацетилхолина везамикола на параметры миниатюрных токов концев пластинки крысы // В кн.: "Растущий организм: адаптация физической и умственной нагрузке".- Тез. симп. Казань- 1996 С.111.

I

J