Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Агонист-индуцированные изменения функциональных свойств постсинаптической мембраны в нервно-мышечном соединении

г >

2 1 М1Р 1М7

На правах рукописи

Талантова Мария Владимировна

АГОНИСТ-ИНДУЦИРОВАННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ПОСТСИНАПТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ В НЕРВНО-МЫШЕЧНОМ СОЕДИНЕНИИ

14.00.17 - нормальная физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

КАЗАНЬ 1997

Работа выполнена в Казанском государственном медицинском Университете. Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Гиниатуллин P.A.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Никольский Е.Е. доктор биологических наук, профессор Гайнутдинов Х.Л.

Ведущая организация - Московский государственный Университет.

Защита состоится 1997г. в // часов на заседани

диссертационного совета Д 084.29.03 при Казанском государственно медицинском Университете (420012, г.Казань, ул Бутлерова, 496).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Университе-(Казань, ул. Бутлерова, 496).

Автореферат разослан 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета,

профессор Р.Х.Хафизьянова

ВВЕДЕНИЕ

Iктуальность исследования: Одной из актуальных проблем современной [ейрофизиологии является изучение особенностей функционирования синапса . условиях, близких к физиологическим. В таких условиях проявляются [ризнаки кратковременного изменения функциональных свойств гостсинаптической мембраны в виде снижения (десенситизация) или ювышения (постсинаптическая потенциация) чувствительности юстсинаптических рецепторов к медиатору [Гиниатуллин и др.,1986; »fagazanik & Giniatullin, 1989; Scuka & Mozrzymas, 1992]. Физиологическая роль [вления десенситизации остается до конца не выясненной, хотя в синапсе с ютибированной ацетилхолинэстеразой показана способность (есенситизированных холинорецепторов высокоаффинно связывать свободный щетилхолии [Magazanik et al., 1990]. Признаки функциональной 1едостаточности ацетилхолинэстеразы могут проявляться и при активной щетилхолинэстеразе, если квантовый выброс близок к физиологическому Giniatullin et al., 1990]. Однако, исследования функциональной роли {есенситизированных рецепторов при высоком квантовом составе и активной щетилхолинэстеразе к настоящему моменту проведены не были..

Другая форма кратковременного изменения чувствительности юстсинаптической мембраны - постсинаптическая потенциация - проявляется в увеличении амплитуды [Katz & Thesleff, 1957] и длительности [Feliz & ["rautmaim, 1980] синаптических ответов. Высказывалось предположение о :пособности десенситизированных холинорецепторов служить основой для швития постсинаптическои потенциации [Glavinovic, 1988], но »кспериментально эта гипотеза не была проверена.

До настоящего времени существовало представление о том, что скорость ¡осстановления чувствительности постсинапгической мембраны не зависит от •лубины десенситизации [Vyskocil, 1975]. Это согласуется и с классической моделью десенситизации [Katz, Thesleff, 1957]. Однако на. клетках [зеохромоцитомы крысы [Boyd, 1987] были получены данные о развитии потери

чувствительности за счет процесса, отличного от десенситизации - деактиваш холинорецепторов. Аналогичные данные для нервно-мышечного синапса литературе отсутствуют.

Таким образом, многие аспекты функциональной роли десенситизащ как формы кратковременного снижения чувствительности постсинаптическс мембраны, ее связь с постсинаптической потенциацией и возможность развит! долговременных агонист-индуцированных изменений функциональных свойс постсинаптической мембраны, во многом остаются малоизученными. Изучен! механизмов кратковременного и долговременного изменения свойс: постсинаптической мембраны находится в рамках традиционного научно! направления Казанской физиологической школы - изучения регуляции саморегуляции синаптической функции.

Цели и задачи исследования: Целью настоящего исследования было изучен! процессов кратковременного и долговременного изменения свойс" постсинаптической мембраны нервно-мышечного синапса, вызванного АХ его аналогами. В соответствии с этой целью были сформулированы следующ! задачи:

1. Выяснить влияние десенситизированных холинорецепторов на параметр синаптических токов при высоком, приближенном к физиологическом уровне квантового выброса медиатора.

2. Изучить концентрационную и температурную зависимое постсинаптической потенциации, вызванной экзогенным агонистом.

3. Исследовать роль десенситизированных холинорецепторов в развита постсинаптической потенциации.

4. Выявить эффективность действия ингибиторов ацетилхолинэстеразы присутствии десенситизированных холинорецепторов.

5. Выяснить возможность развития необратимой агонист-индуцированнс деактивации холинорецепторов.

Толожения, выносимые на защиту:

. Десенситизированные холинорецепторы являются дополнительным путем элиминации свободного медиатора при физиологическом уровне квантовой секреции и нативной АХЭ. . Агонист - индуцированное снижение чувствительности постсинаптической мембраны к действию медиатора является комплексным процессом, включающим десенситизапию и деактивацию холинорецепторов.

Таучная новизна: Новизна настоящего исследования заключается в том, что ыяснен один из новых аспектов физиологического значения десенситизации, роявляющийся в способности десенситизированных холинорецепторов граничивать избыточную длительность синаптического ответа при шзиологическом уровне квантовой секреции и нативной АХЭ. Впервые становлено, что десенситизированные холинорецепторы снижают в этих словиях вероятность повторной активации рецепторов постсинаптической гембраны медиатором. Впервые получены экспериментальные доказательства ого, что десенситизированные рецепторы не могут служить основой для швития постсинаптической потенциации. Установлено, что увеличение числа [есенситизированных холинорецепторов на постсинаптической мембране с юмощью кратковременной аппликации ацетилхолина или действия промотора (есенситизации проадифена не вызывает соответствующего усиления юстсинаптической потенциации. Показана неоднородность процесса потери [увствительности постсинаптической мембраны к медиатору - впервые становлена возможность развития долговременного снижения [увствительности холинорецепторов постсинаптической мембраны деактивации) к медиатору в результате интенсивной активации юстсинаптической мембраны в нервно-мышечном соединении.

Научно-практическая ценность: Полученные результаты позволяют [риблизиться к пониманию процессов, происходящих на постсинаптической

мембране в нервно-мышечном синапсе в физиологических условиях, частности, эти данные свидетельствуют о том, что функциональная рол десенситизированных холинорецепторов состоит в синхронизаци синаптических ответов и возможности проведения высокочастотных команд мышце. При использовании ингибиторов ацетилхолинэстеразы как инструмент исследования функции синапса, необходимо учитывать выраженност десенситизации, так как даже небольшое количество десенситизированны холинорецепторов резко снижает эффекты ингибировани ацетилхолинэстеразы. Разделение механизмов потери чувствительности н обратимый процесс - десенситизациго и необратимый - деактивацию, открывае новые перспективы для воздействия на состояние чувствительно« постсинаптической мембраны к медиатору и объясняет механизм! долговременной адаптации синапса к действию повышенных концентраци: агониста.

Апробация работы Основные результаты доложены на Всероссийско] конференции "Растущий организм, адаптация к возрастающей физическо: нагрузке" (Казань ,1994), на Международной Школе молодых ученых & нейрохимии (Санкт-Петербург, 1995), на 9 Международном симпозиуме m холинергическим механизмам (Майнц, Германия, 1995), на Конференци] молодых ученых по холинергическим и пуринергическим механизмам (Казань 1996), на заседаниях кафедры нормальной физиологии КГМУ (1996) i заседаниях Татарского отделения Всероссийского Физиологического обществ им. И.П. Павлова (Казань, 1996).

Структура и объем диссертации Диссертация объемом 130 страниц состой из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результата исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемо! литературы. Список цитируемой литературы включает 217 источников, из ни; 151 иностранных авторов. Диссертация содержит 21 рисунок и 4 таблицы.«*

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования был нервно-мышечный препарат седалищный 2рв - портняжная мышца лягушек Rana Rídibunda и Rana Temporaria. Для эедотвращсния мышечных сокращений во время регистрации сигналов и «ранения высокого уровня квантового освобождения медиатора, мышечные шокна поперечно рассекали [Волкова и др., 1975]. В части экспериментов, в этгорых изучали действие высоких концентраций агпниста, использовали для гих же целей тетродотоксин (10'7моль/л). Ванночка, в которой размещался грвно-мышечный препарат, имела рабочую емкость 2 мл. В течение ч'сперимснта через ванночку непрерывно протекал раствор Рингера, эдержащий (в ммоль/л): NaCI - И5,0; КС1 - 2,5; СаС12 - 1,8; Na2HCO.-, - 11.0; рН ,2-7,4. Эксперименты проводили при температуре 20±2°С и 10+1 "С. лгибирование ацетилхолинэстеразы (АХЭ) проводили прозерином (3x10"6 оль/л). Количество десенситизированных холинорецепторов на остсинаптической мембране увеличивали аппликацией ацетилхолина (АХ), арбахолина (КХ) или стабилизацией рецепторов в десенситизированном эстоянии проадифеном [Магазаник, 1970]. Токи концевой пластинки (ТКП) и иниапорные токи (МТКП) отводили в условиях двухэлектродной фиксации отенциала. Накопление и усреднение синаптических сигналов производили ри помощи персонального компьютера с периодом опроса 20-60 мкс на точку, асчет параметров и характера спада МТКП и многоквантовых ТКП роизводили при помощи оригинальных компьютерных программ (авторы В.А. Снетков и Т.В. Лайков). Достоверность различий оценивали по критерию 'тьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ

ПОСТСИНАПТИЧЕСКАЯ ПОТЕНЦИАЦИЯ И ДЕСЕНСИТИЗАЦИЯ, ИНДУЦИРОВАННЫЕ ЭКЗОГЕННЫМ АГОНИСТОМ

Постсинаптическая потенциации при активной АХЭ

Одним из проявлений постсинаптической потенциации являет замедление спада ТКП при действии АХ на фоне ингибированной АХЭ [Рекг Тгаийпапп, 1980]. Однако аналогичные данные для синапса с сохраненн активностью АХЭ в литературе отсутствуют. Поэтому в первой сер экспериментов исследовали эффекты агониста КХ на параметр многоквантового ТКП при интактной АХЭ.

В контроле, при потенциале фиксации -40 мВ и температуре 20° средняя амплитуда ТКП составляла 214,2±15,0 нА (п=6 синапсов), а постоянн времени спада (т) составила 1,43±0,08 мс. После введения КХ 10"5моль/л п] интактной АХЭ, в начальной фазе (1-3 мин) действия КХ наблюдало кратковременное замедление спада многоквантового ТКП, отражавшее развит постсинаптической потенциации. При дальнейшем воздействии агониста постсинаптическую мембрану развивалось ускорение спада ТКП и паден: амплитуды ТКП, что отражало снижение чувствительности постсинаптичесю мембраны к медиатору, вызванное аппликацией агониста.

Феномен постсинаптической потенциации в виде начального замедлен! спада ТКП воспроизводился в одном и том же синапсе при несколью последовательных аппликациях агониста и был более выражен в синапсах, п ТКП имели высокий квантовый состав.

По аналогичной схеме были проведены эксперименты, в которь возможность развития постсинаптической потенциации исследовали п[ регистрации одно квантовых ответов - МТКП. В контроле при потенциа1 фиксации - 70 мВ, температуре 20° С и активной АХЭ значения амплитуд МТКП были и 2,92±0,2 нА и т=1,01±0,09 (п=9 синапсов). Однако в отличие ( результатов, полученных при анализе многоквантовых ТКП, ни в одном I

гаапсов действие КХ не сопровождалось замедлением сигналов, то есть еномен постсинаптической потенциации в этом случае не выявлялся.

Таким образом, для выявления постсинаптической потенциации при гйствии экзогенного АХ при активной АХЭ необходим высокий уровень жреции медиатора (многоквантовый ТКП), временной ход которого пределяется не только временем жизни ионных каналов, но и зависит так же от овторной активации рецепторов медиатором.

Концентрационная зависимость эффектов АХ на МТКП

Известно, что при ингибированной АХЭ усиливаются проявления остсинаптической потенциации [НаЛге! е1 а!., 1975]. Это дает возможность сследовать в деталях механизм этого до конца неизученного феномена и его заимоотношения с противоположным по функциональной роли явлением -есенситизацией.

В серии экспериментов с ингибированной АХЭ изучали действие разных онцентраций АХ на параметры МТКП. В контроле, при потенциале фиксации -О мВ и температуре 20°С амплитуда МТКП составила 2,7±0,18 нА. а остоянная времени спада МТКП т составила 4,31±0,28мс (п=9 синапсов). При ведении АХ в концентрациях 0,05-5x10"6 моль/л происходили изменения мплитуды и длительности МТКП, представленные в табл. 1. аблица 1. Концентрационная зависимость эффектов АХ на амплитуду и лительность миниатюрных токов концевой пластинки

концентр Число 3-5 минут действия 3-5 минут отмывки

щия АХ, АХ АХ

0"бмоль/л синапсов А мткп% "СМГКП% Амткп% т мткп%

0.05 (п=4) 103±1 108±2* 100+1 99+2

0.2 (ч=5) 107±4 137±9* 100±2 93±3

0.5 (п=5) Ю9±7 . 145±5* 96±4 69+4*

2 (п=9) 102±4 190+12'" 74±3* 49+4* N

5 (п=8) 83±6* 197+8* 57+5* 47+4*

Достоверные отличия от контрольных значений (Р<0,05)

Как следует из табл. 1, в начальную фазу действия (3-5 мин экзогенного АХ, постсинаптическая потенциация проявляется как в увеличения амплитуды МТКП, так и в замедлении спада сигналов. Причем сг МТКП оказался значительно более чувствительным параметром, реагируют; на развитие феномена постсинаптической потенциации.

Интересно, что уже в концентрации агониста 5x10"8 моль/л, сравнимой величине с концентрацией АХ неквантового происхождения ["Ууэкосй е1 ; 1983], наблюдалось замедление спада МТКП, которое сохранялось только присутствии агониста и исчезало в начальной стадии отмывки АХ.

Для раздельной оценки процессов десенситизации и постсинаптическ потенциации далее анализировали параметры МТКП на ранней (3-5 мин) стад отмывки, когда потенциация, как быстро обратимый процесс, уже бы устранена [Гиниатуллин и др., 1986], но чувствительность постсинаптическ мембраны к трансмиттеру еше была снижена.

При отмывке к 3-5 минуте наблюдалось снижение амплитуды МТКП и укорочение ниже контрольных значений, что отражало развит десенситизации, которая в данном случае не маскировалась проявления? постсинаптической потенциации. Как следует из табл. 1, призна десенситизации были тем более выражены, чем выше была концентрац агониста.

Полученные данные позволяют считать, что в зависимости концентрации апплицируемого агониста, функциональное состоян постсинаптической мембраны определяется взаимодействием дв противоположно направленных процессов - постсинаптической потенциации десенситизации.

Другим подходом для разделения проявлений десенситизации постсинаптической потенциации были эксперименты со снижение температуры. Известно, что проявления постсинаптической потенциации бол выражены при низкой температуре [Магазаник и Гиниатуллин, 1986]. Однако 1 ясно, связано ли это с устранением десенситизации, либо с температурнс зависимостью постсинаптической потенциации.

Действительно, в наших опытах степень замедления МТКП при 10°С под йствием экзогенного АХ (2x10"6) моль/л оказалась более выраженной. Это провождалось устранением эффекта укорочения МТКП при отмывке, то есть сенситизация при этой температуре не развивалась.

Таким образом, при низкой температуре десенситизация не вносит шественного вклада в ограничение спада МТКП при действии экзогенного К. Иначе говоря, усиление проявлений постсинаптической потенциации, гдуцированной агонистом, связано с устранением противоположно травленного феномена - десенситизации.

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ДЕСЕНСИТИЗАЦИИ В МЕХАНИЗМАХ ПОСТСИНАПТИЧЕСКОЙ ПОТЕНЦИАЦИИ

Молекулярный механизм постсинаптической потенциации до сих пор >статочно не изучен, но в 1988 году С1аушоу)'с была высказана гипотеза о (зможном участии десенситизированных холинорецепторов в развит™ гномена постсинаптической потенциации, хотя экспериментально эта гипотеза юверена не была. В настоящем исследовании на модели потенциации в ¡ловиях парной стимуляции двигательного нерва [Мадагашк й а1., 1984] ¡учали возможную роль десенситизированных рецепторов в феномене >стсинаптической потенциации. При этом ожидали, что в случае ¡посредственной связи между этими феноменами, развитие десенситизации шкно привести к соответствующему усилению потенциации.

Увеличения числа десенситизированных холинорецепторов на эстсинаптической мембране добивались двумя различными способами: >атковременной аппликацией агониста (АХ) при активной и ингибированной ХЭ и стабилизацией холинорецепторов в десенситизированном состоянии с змощью промотора десенситизации проадифена.

Эффекты АХ, проадифена и мембранного потенциала на постсинаптическую потенциацию

При ингибированной АХЭ появление десенситированных рецепторо первоначально вызывали путем кратковременной аппликации экзогенного АХ низких концентрациях. В контроле постсинаптическая потенциация, выявляема как отношение постоянной времени спада (т) второго ТКП к т первого ТКЕ составила 119±3 % (п=5 синапсов).

При действии АХ в концентрации 5x10"6 моль/л первоначально (к 5 мин постсинаптическая потенциация исчезала и составляла 100±3 % (п=4) за сче замедления спада первого ТКП. В процессе отмывки АХ постсинаптическа потенциация медленно возрастала, но не превышала исходных значений ни и раннем этапе отмывки, когда длительность ТКП была наиболее короткой, ; следовательно, десенситизация максимальна, ни после полного восстановлена амплитуды ТКП.

Аналогичные результаты были получены при аппликации АХ 1 концентрации 10'3 моль/л при активной АХЭ, а так же при стабилизащп холинорецепторов в десенситизированном состоянии с помощью промотор; десенситизации проадифена (5x10"6 моль/л). При аппликации проадифена был* обнаружено, что несмотря на усиливающийся эффект укорочения одиночной ТКП под действием возрастающих концентраций проадифена, значени; постсинаптической потенциации не менялись. Полученные данные с независимости постсинаптической потенциации и десенситизации получил! подтверждение и в экспериментах, где десенситизация усиливалась за счет гиперполяризации [Мадагашк & УуБкосй, 1970], и в опытах с резкта увеличением квантового выброса за счет повышения концентрации ионов Са2' (для компенсации сниженного квантового состава ТКП).

Таким образом, во всех ситуациях, когда постсинаптическая потенциацш анализировалась после усиления десенситизации, полученные данньк однозначно свидетельствовали против участия десенситизированны> рецепторов в развитии феномена постсинаптической потенциации.

ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РОЛИ ДЕСЕНСИТИЗАЦИИ В СИНАПСЕ С НАТИВНОЙ АХЭ.

Следующий раздел работы был посвящен изучению функциональной роли номена десенситизации в условиях приближенных к физиологическим, то гъ при высоком (физиологическом) уровне квантового состава и нативной СЭ.

Эффекты агонистов на многоквантовые ТКП.

Ранее было показано, что десенситизированные холинорецепторы при гибированной АХЭ способны служить «ловушками» для АХ в синаптической :ли [Ма§агашк е1 а1., 1990]. Первая серия экспериментов была посвящена >^ению функциональной роли десенситизированных холинорецепторов при гивной АХЭ и высоком уровне квантовой секреции, которая, как и гибирование АХЭ, увеличивает локальную концентрацию медиатора в иаптической щели по сравнению с одноквантовыми ответами [ОкиаиШт ег а1., 93].

Для исследования влияния десенситизированных холинорецепторов на наптические сигналы, вызванные секрецией 100-200 квантов АХ, в данной зии экспериментов изучали действие КХ на параметры многоквантовых ТКП. контроле при потенциале фиксации -40 мВ амплитуда ТКП составила 4,2±15,0 нА(п=6), а постоянная времени спада т была 1,43±0,08 мс (п=6), что евышало на 23% длительность спада МТКП и свидетельствовало о наличии вторной активации холинорецепторов медиатором. После 20 минут действия L амплитуда ТКП снизилась и, на фоне действия холиномиметика, спад ТКП 1л достоверно быстрее, чем в контроле. В процессе отмывки к 15 минуте блюдали полное восстановление амплитуды ТКП до контрольных значений, (иако несмотря на восстановление амплитуды ТКП, постоянная времени спада :П т составила 74,8±5,5% от исходной величины (п=6; Р<0,05). Это могло идетельствовать о том, что десенситизированные рецепторы, небольшое гсичество которых еще сохранилось в процессе отмывки, укорачивают спад

ТКП за счет снижения вероятности повторной активации рецепторе медиатором (рис.1). Аналогичные результаты были получены в эксперимента в которых появление десенситизированных холинорецепторов I постсинаптической мембране вызывали за счет действия экзогенного АХ.

ТКП МТКЛ

; юо на

| 1 нА

Рис.1. Влияние десенситизированных холинорецепторов i многоквантовый ТКП и МТКП при активной АХЭ.

При исследовании влияния десенситизации на параметры одноквантовь ответов было установлено, что аппликация агониста по аналогичному протоко: не вызывала изменения спада МТКП (рис. 1).

Данные, полученные при регистрации МТКП, хорошо согласуются с те: что спад МТКП определяется преимущественно скоростью закрытия ионнь каналов [Anderson & Stevens, 1973].

Эффект проадифена.

Другой подход для ускорения развития десенситизации и выявлен! функциональной роли десенситизированных холинорецепторов заключался использовании проадифена (5x10"6 моль/л). При действии проадифена в течеш 60 минут было обнаружено, что этот агент действительно приводил первоначальному укорочению т ТКП с 1,16±0,08 мс до 0,83±0,08 мс, (п= Р<0,05). Причем проадифен первоначально укорачивал ТКП без влияния i

мплитуду сигнала, и лишь затем, при более глубокой десенситизашш, меньшая амплитуду ТКП.

Таким образом, эксперименты, проведенные как с использованием гониста, так и с промотором десенситизации проадифеном, подтвердили вывод способности десенситизированных холинорецепторов ограничивать овторную активацию рецепторов медиатором в условиях физиологического ровня секреции АХ.

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПОСТСИНАПТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ И ИНГИБИРОВАНИЕ АХЭ

Известно, что способность ингибиторов АХЭ замедлять спад ТКП, арьирует в разных лабораторных условиях, у разных животных и в разных инапсах у одного животного. Поскольку нами было показано, что есенситизированные холинорецепторы эффективно предотвращают повторную ктивацию рецепторов медиатором, не исключено, что именно присутствие азного числа десенситизированных холинорецепторов может играть ешшощую роль в способности ингибиторов АХЭ удлинять спад ТКП. Для сследования этого вопроса нами была изучена эффективность ингибирования 1ХЭ в присутствии различного количества десенситизированных олинорецепторов.

Влияние проадифена и АХ на эффекты ингибиторов АХЭ

В контроле в результате ингибирования АХЭ прозерином Зх10"6моль/л роисходило удлинение спада ТКП с -с =1,43±0,08 мс до 7,81±0,51 мс (п=8; <0,05), (рис.2). Основной причиной этого удлинения спада ТКП является овторная активация рецепторов медиатором, находящимся длительное время в янаптической щели [Кагг, МИесИ, 1973]. Согласно нашим данным, присутствие аже небольшого числа десенситизированных холинорецепторов практически олностью устраняло эффект удлинения спада ТКП при ингибировании АХЭ.

Так, ингибирование АХЭ прозерином в присутствии проадифена (5х10"6моль/ привело к увеличению т ткп лишь до 1,78+0,38 мс (п=6; Р>0,05), (рис. 2).

Время, мин

Рис.2. Эффект ингибирования АХЭ в контроле и в присутствии промото десенситизации проадифена.

Аналогичные результаты были получены в сериях экспериментов, которых ингибирование АХЭ производили в присутствии десенситизированш холинорецепторов, продуцированных аппликациями АХ. Было обнаружено, ч ингибирование АХЭ после подачи АХ Ю-4 моль/л, приводит к меньше? замедлению спада ТКП, чем в контроле. Способность ингибиторов удлиня спад ТКП обратно пропорциональна количеству десенситизированш холинорецепторов на постсинаптической мембране. Увеличение количест десенситизированных холинорецепторов после 2 и 3 подачи агоний практически полностью устранило эффект удлинения спада ТКП п] ингибировании АХЭ.

Таким образом, присутствие десенситизированных холинорецепторов на стсинаптической мембране эффективно предотвращает возможность вторной активации холинорецепторов медиатором, что проявляется в ижении способности ингибиторов АХЭ пролонгировать спад ТКП.

ИССЛЕДОВАНИЕ ФЕНОМЕНА НЕОБРАТИМОГО СНИЖЕНИЯ

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ (ДЕАКТИВАЦИЯ)

Помимо обратимой десенситизации, для никотиновых холинорецепторов клеток феохромоцитомы крыс (PC 12) показано наличие дополнительного оцесса снижения чувствительности - "деактивации" рецепторов [Boyd, 1987]. ш нервно-мышечного синапса возможность развития такого процесса до сих р не исследована. Поэтому в следующей части работы мы изучали зможность развития необратимого снижения чувствительности к медиатору линорецепторов постсинаптической мембраны, вызванной аппликацией эниста.

Деактивация при ингибированнон АХЭ.

Для изучения возможности развития деактивации были предприняты сперименты, в которых исследовали последствия кратковременных пликаций различных концентраций АХ. Было обнаружено, что в синапсе с [гибированной АХЭ, после 15 минут действии АХ в концентрации 2x1 >ль/л, последующая отмывка в течение 60-80 минут не приводит к сстановлению исходной длительности МТКП. Более того, после начавшегося сстановления данного параметра, развивалось прогрессирующее ускорение ада МТКП, что могло свидетельствовать об уменьшении количества ободных рецепторов на постсинаптической мембране.

Таким образом, при ингибированнон АХЭ на нервно-мышечном «парате была показана возможность развития процесса, протекающего в ачительно более длительной временной шкале, чем десенситизация -активация холинорецепторов постсинаптической мембраны.

Деактивация при активной АХЭ.

Для исключения возможной роли ингибирования АХЭ в развит долговременного изменения чувствительности в следующей сер экспериментов аналогичные исследования проводили с использованием КХ л активной АХЭ.

Исходная амплитуда МТКП в этой серии была 2,6±0,32 нА (п=8). Пос введения КХ (10"4 моль/л) в течение 15 минут происходило быстрое снижен амплитуды МТКП до уровня шума. Интенсивная отмывка в течение 120 мш частично восстанавливала амплитуду МТКП до 1,42 ±0.21 нА, Однако пос этого параметры МТКП стабилизировались на данном уровне без всяк тенденции к восстановлению в течение часа регистрации МТКП. Наблюдение параметрами МТКП в течение 180 минут без воздействия агониста не выяви достоверного снижения амплитуды.

Таким образом, эти эксперименты показали возможность развит деактивации и в синапсе с активной АХЭ.

Деактивация, вызванная повторным введением агониста

В данной серии экспериментов изучали изменение амплитуд интегрального тока в ответ на повторное введение КХ. В ответ на струйн введение КХ (10"4 моль/л) происходила генерация входящего тока, достигавше средней амплитуды 404±116 нА (п=4) и быстро спадавшего в результг развития десенситизации. После первой кратковременной (10 с) аппликац агониста опытный раствор быстро заменялся на контрольный и мыш интенсивно перфузировалась в течение 40-60 мин нормальнь физиологическим раствором, что достаточно для полного восстановлен исходной чувствительности рецепторов [Feltz & Trautmann, 1980]. Однако п повторной аппликации агониста амплитуда интегрального тока оказала сниженной на 54% при аппликации КХ, и на 52% при аппликации АХ (табл.2)

Таблица 2 Изменения амплитуды интегральных агонист-индуцированных <ов при повторном введении АХ и КХ.

Амплитуда Амплитуда

Агонист интегрального тока, нА интегрального тока, нА

1 подача 2 подача

КХ 404+116 нА 187±49 нА

10"4 моль/л (п=4) (п=3)

АХ 336± 94 нА 164±47 нА

5x10"4 моль/л (п=7) (п=5)

Эти данные свидетельствовали о том, что после первой подачи агониста постсинаптической мембране помимо обратимой десенситизации развивается лее медленный процесс потери чувствительности - деактивация линорецепторов.

Таким образом, различные экспериментальные подходы, использованные настоящей работе, свидетельствуют о том, что кроме обратимой сенситизации, агонисты могут вызвать процесс долговременного снижения вствительности холинорецепторов постсинаптической мембраны к медиатору, •от процесс тем более вероятен, чем выше концентрация агониста или чем лее продолжителен контакт агониста с постсинаптической мембраной; •

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показывают, что в нервно-мышечном синапсе >д действием агониста могут изменяться функциональные свойства ютсинаптической мембраны, проявляемые в виде увеличения остсинаптическая потенциация) или снижения (десенситизация) вствительности холинорецепторов к медиатору. Таким образом, ,гнкционалыюе состояние постсинаптической мембраны определяется аимодействием этих разнонаправленных процессов, которые могут " звиваться одновременно в присутствии агониста. В зависимости от

концентрации, времени контакта с агонистом и температуры, преобладают г, проявления потенциашш, либо проявления десенситизации. Постсинаптиче< потенциация и десенситизация имеют разные механизмы, поскольку усилении десенситизации не увеличиваются проявления постсинаптичес потенциашш. Кроме того, оба эти процесса имеют разную температур! зависимость, а так же различную временную шкалу разви Постсинаптическая потенциация является достаточно кратковремеш процессом, а скорость развития (и обращения) десенситизации, значите/; более медленная. Восстановление чувствительности постсинаптичес мембраны после развития десенситизации обратно пропорционально степен] выраженности. Действие высоких концентраций агониста, л продолжительный контакт агониста с мышцей, могут привести к необрати потере чувствительности холкнорецептора в результате развития деактива!. Возможное функциональное значение десенситизации состоит в ограниче длительности синаптического ответа, основу которого состав; предотвращение повторной активации рецепторов медиатором, по-видимс благодаря высокоаффинному связыванию медиатора десенситизированш холинорецепторами. Десенситизированные холинорецепторы могут б дополнительным путем связывания медиатора при недостаточном гидролизе ферментом АХЭ.

ВЫВОДЫ

1. В нервно-мышечном синапсе при физиологическом уровне секрет трансмиттера и активной АХЭ, аппликация экзогенного холиномимеп вызывает постсинаптическую потенциацию в виде транзиторного замедле! спада многоквантового тока концевой пластинки.

2. При ингибированной АХЭ признаки постсинаптической потенциаи наблюдаются при действии на миниатюрные токи низких концентраций А соизмеримых с уровнем трансмиттера, выделенного в неквантовой форме.

Снижение температуры усиливает проявления агонист - индуцированной постсинаптической потенциации за счет снижения проявлений десенситизации.

Увеличение числа десенситизированных холинорецепторов на постсинаптической мембране с помощью кратковременной аппликации АХ или действия промотора десенситизации проадифена не вызывает усиления постсинаптической потенциации, выявляемой путем парной стимуляции двигательного нерва.

Десенситизированные холинорецепторы дополняют функцию АХЭ в укорочении заднего фронта синаптических сигналов.

Способность десенситизированных холинорецепторов укорачивать спад синаптических сигналов тем более выражена, чем выше квантовый выброс трансмиттера.

Небольшое число десенситизированных рецепторов способно снизить эффективность ингибиторов АХЭ в замедлении спада постсинаптического тока.

При достижении определенной глубины десенситизации замедляется или прекращается процесс восстановления чувствительности постсинаптической мембраны в результате развития процесса деактивации. Постсинаптическая мембрана нервно-мышечного синапса под действием агониста может изменять функциональные свойства в виде развития противоположных по функциональной роли кратковременных процессов десенситизации и постсинаптической потенциации, а так же долговременное снижение чувствительности к медиатору в виде деактивации рецепторов, что инициируется воздействием АХ на рецепторы, находящиеся в состоянии десенситизации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Гиниатуллин P.A., Швецов А.Б., Талантова М.В. Особенности /нкциониропания холинергического синапса после нарушения гидролиза щиатора // В книге "Вопросы нейробиологии", Казань, 1986, С. 21-28.

2. Гиниатуллин Р.А., Талантова М.В. Изменения синаптической перед при продолжительной активации постсинаптической мембраны // Тез. Все[ симп., Растущий организм: Адаптация к физической и умственной нагру: Казань, 1994,0. 112.

3. Гиниатуллин Р.А., Талантова М.В., Швецов А.Б. Постсинаптичес формы кратковременной пластичности в нервно-мышечном сина теплокровных и холоднокровных // Успехи физиологических наук, 1994, т. N1,C. 103.

4. Giniatullin R.A. & Talantova M.V. The adaptation of synaptic transmissioi the lowering acetylcholinesterase activity// J. ofNeuropathol, 1994, v.382, N4, P3-

5. Гиниатуллин P.A., Талантова М.В. Влияние десенситизироваш холинорецепторов на временной ход синаптических ответов при актив! ацетилхолинестеразе // Физиол. и биохим. основы жизнедеятельности мо: Санкт-Петербург, Международный симпозиум, С. 62-63.

6. Гиниатуллин Р.А., Талантова М.В. Физиологическая р десенсигазированных рецепторов в скелетной мышце // Бюлл. Экспериме биол. и медицины, 1995, N, С. 578-581.

7. Giniatullin R.A.& Talantova M.V. Desensitized receptors as an additic pathway for elimination of free acetylcholine under AChE inhibition // Abstr. 9th Symp. of Cholinergic mechan, Mainz, Germany, 1995, P 23.

8. Talantova M.V., Giniatullin R.A., Sokolova E., Khabibullina N. Desensiti receptors prevented the repetitive • activation of postsynaptic membrane acetylcholine under high level of transmitter release // Abstr.9th Int. Symp Cholinergic mechanisms, Mainz, Germany, 1995, P 25.

9. Гиниатуллин P.A., Талантова М.В. Роль , десенситизироваш холинорецепторов в развитии постсинаптической потенциации Нейрофизиология, 1995, N 5/6, С. 361-367.

10. Гиниатуллин Р.А., Талантова М.В., Хируг Л.С., Нистри А. Влия! ионов кальция на функцию нейрональных холинергических и пуринергичеа рецепторов // Нейрохимия, 1996, т. 13, С. 221.

11. Giniatullin R.A., Khiroug L.S., Talantova M.V. & Nistri A. Fading i rebound of currents induced by ATP on rat PC12 cells // British J. Pharmacol, 1996 11, P. 1045-1053. —^