Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Факторы, определяющие амплитуду и длительность многоквантовых токов концевой пластинки

>•; / 11

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАЮОХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

имени С. В. КУРАЩОВА

На правах рукописи

ГИНИАТУЛЛИН Рашид Асхатович

удк 612. 815

ФАКТОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ АМПЛИТУДУ И ДЛИТЕЛЬНОСТЬ МНОГОКВАНТОВЫХ ТОКОВ КОНЦЕВОЙ ПЛАСТИНКИ

14.00. 17 - нормальная физиология

Научный доклад

на соискание ученой степени доктора медицинских наук

КАЗАНЬ - 1992

ч

ч

Работа выполнена в Казанском государственном медицинском институте им. С.В.Курашова и институте эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Сеченова.

Официальные оппоненты - заслуженный деятель науки Удмуртии

доктор медицинских наук, профессор Г.Е.Данилов доктор медицинских наук, профессор В.Б.Долго-Сабуров доктор биологических наук, профессор Ю. П.Пушкарев

Ведущее учреждение - Московский государственный

университет

Защита состоится " ^ " УЛк-^^З 1992 г, _ часов на заседании специализированного теоретическое

Ученого Совета Д 084.29.03 Казанского ордена Трудового Красной Знамени государственного медицинского института им. С.В.Курашов; С420012, г.Казань, ул.Бутлерова, 49).

Доклад разослан "_"_ 1992 г.

в

Ученый секретарь специализированного теоретического Совета кандидат медицинских наук

Р.X.Ахмедзянов

\

РССС^'СчЛЯ ГООУДА "С Ы^Л"

библио !*:::< А

йтдгл

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Нервно-мышечный синапс - традиционная модель исследования как механизма секреции медиатора, так и процессов активации постсинаптической мембраны, на которой разработаны основные современные представления о механизмах синаптической передачи. Однако, несмотря на детальное мультидисциплинарное исследование многих вопросов синаптологии на этом объекте, ряд важных физиологических аспектов нервно-мышечной передачи остается малоизученным.

Как известно, первичной электрической реакцией постсинаптической мембраны на медиатор в нервно-мышечном синапсе является генерация тока концевой пластинки СТКГО, представляющего собой суммацию токов, протекающих через отдельные ионные каналы холинорецептора [Anderson, Stevens, 1973]. Анализ амплитудно-временных характеристик ТКП позволяет получить информацию о кинетике взаимодействия АХ с холинорецептором и других факторах, определяющих процесс генерации синаптических сигналов [Anderson, Stevens, 1973, Katz, Miledi, 1973, Магазаник и др., 19841. Однако подавляющее большинство работ, посвященных постсинаптическому электрогенезу, базируется на анализе ТКП, возникающих на секрецию одного (миниатюрный ТКП) или нескольких квантов АХ. Нормальный хе акт синаптической передачи основан на появлении в синаптической щели нескольких сот квантов АХ [Katz, Miledi, 1979]. Анализ амплитудно-временных характеристик таких "физиологических" ТКП представляет особый интерес в связи с тем, что в ходе генерации многоквантового ТКП могут возникать процессы, качественно отличающиеся от тех, которые имеют место при генерации низкоквантовых ТКП. Одно из отличий заключается в том, что одновременная секреция множества квантов АХ мохет приводить к увеличению концентрации эндогенного АХ. Такая возмохность ярко проявляется в синапсе с ингибированной АХЭ [Hartzell et al. , 1975], но не исключена и при активной АХЭ. Вместе с тем многочисленные данные, полученные в последнее время при регистрации токов одиночных каналов, свидетельствуют о целом ряде концентрационно-зависимых эффектов экзогенного АХ на кинетику холинорецептора, таких как залповая кинетика ионных каналов в присутствии десенситизирующих концентраций АХ СSakmann et al. , 1980], изменение времени хизни каналов.ILabarca et al., 1*985], блокада ионных каналов самим АХ [Sine, Steinbach, 1984, Ogden, Colquhoun, 1985]. Физиологическая значимость этих эффектов, то

есть их реализация за счет эндогенного АХ, еще не определена.

Другой, остающийся нераскрытым вопрос касается временного ходг секреции квантов медиатора при генерации одиночного многоквантовогс ТКП. Имеющиеся оценки степени синхронности секреторного процесс« базируются на данных, полученных при уменьшении нормального квантового состава ТКП в 50-100 раз [Katz, Miledi, 1965, Barrett, Stevens, 19723. По мнению Katz и Miledi С19793, при массированном выделении квантов А> асинхронность секреции может быть ведущим фактором, определяющик длительность постсинаптического тока. Актуальность вопроса о вкладе кинетики секреции квантов АХ во временной ход многоквантовых ТКГ связана и с возможными изменениями степени синхронности во вреш активности синапса.

• Ритмическая активность является естественным режимок функционирования нервно-мышечного синапса. Реакции, возникающие в ходе ритмической активности, в виде увеличения или снижения амплитуды ТКП, так называемые формы кратковременной пластичности, связывались ранее только с пресинаптическими процессами [Kätz, 1966, Zucker, 1989]. Однако можно предполагать, Что при высоком квантовом составе ТКП, когда велика вероятность повторной активации одних и тех же участков постсинаптической мембраны, возможны изменения чувствительности этой мембраны к медиатору в результате развития постсинаптическо® потенциации (ПСГО или десенситизации, как это описано для действия экзогенного АХ СKatz, Thesleff, 1957, Feltz, Trautmann, 19803. Не физиологическая роль как ПСП, так и десенситизации остается предмето!« дискуссий.

Кроме того, совершенно не изученным является вопрос с долговременных эффектах десенситизации на функцию нервно-мышечногс синапса, хотя имеются данные о том, что десенситизированные холинорецепторы являются нормальным, компонентом постсинаптическоИ мембраны [Cohen, Strnad, 19873. Не исключено, что их наличие связано с АХ, выделяемым в неквантовой форме [Katz, Miledi, 19773. Существует также представление, что эффективную регуляцию процесса десенситизации, а возможно и ПСП, в естественных условиях могуч выполнять регуляторные пептиды [Rehav et al. , 1987, Mulle et al. , 19833. Решение этих вопросов также требует специальных исследований.

Таким образом, целый ряд ключевых вопросов функционирования синапса в условиях, приближенных к физиологическим Свысокий уровень

квантового состава ТКП, ритмический характер активности, наличие неквантовой секреции, действие эндогенных веществ-регуляторов и т.д.), остается малоизученным. Подходы к оценке кинетики пре- и постсинаптических процессов в большинстве случаев являются разобщенными. Не решены вопросы пространственно-временной организации секреции при высоком уровне выделения медиатора. Поэтому для получения более полного представления о механизмах синаптической передачи в естественных условиях в настоящем исследовании проводился комплексный анализ как пресинаптических, так и постсинаптических факторов, участвующих в генерации многоквантового ТКП у холоднокровных и теплокровных животных.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 1ель работы: Исследование пре- и постсинаптических факторов, зпределяющих амплитуду и длительность многоквантовых токов концевой шастинки в условиях одиночного и ритмического раздражения. Задачи: 1. Исследовать значение временного хода секреции квантов (едиатора для формирования амплитуды и длительности многоквантового 'КП при одиночном и ритмическом раздражении. Провести "анализ (еханизмов синхронизации процесса секреции квантов медиатора. ¡. Исследовать вклад постсинаптической потенциации во временной ход 'КП при одиночном и ритмическом раздражении. Провести анализ (еханизмов постсинаптической потенциации.

'. Исследовать роль десенситизации как фактора, определяющего .мплитуду и длительность одиночного ТКП, и выяснить возможность азвития десенситизации под влиянием эндогенного АХ в ходе ритмической ктивности синапса. Провести анализ механизмов десенситизации к ндогенному АХ.

. Исследовать влияние неквантовой секреции медиатора на амплитуду и лительность одиночных ТКП.

. Изучить особенности эффектов блокирования АХ-активируемых ионных аналов на амплитуду и временной ход многоквантовых ТКП. Провести нализ механизмов действия заряженных и незаряженных блокаторов аналов.

. Сравнить вероятность развития десенситизации и постсинаптической угенцйации у холоднокровных и теплокровных. . Изучить молекулярные механизмы процессов, возникающих в синапсе

после нарушения гидролиза медиатора с целью детализации функций АХЭ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые проведен комплексный анализ факторов, определяющих амплитуду и длительность ТКП при высоком, близком к физиологическому, уровне секреции медиатора, что позволило раскрыть новые механизмы передачи двигательных команд и полнее представить процессы, происходящие в синапсе в естественных условиях. Предложенное в работе представление о постсинаптических формах кратковременной пластичности открывает новые контуры регуляции и саморегуляции функции химического синапса.

Впервые описан феномен постсинаптической потенциации как следового процесса, способного участвовать в механизмах кратковременной пластичности, .изучены его механизмы. Впервые показана возможность постсинаптического взаимодействия квантов АХ при активной АХЭ.

Установлена возможность развития десенситизации в ходе ритмической активности синапса при физиологическом Сне- модифицированном снижение* или увеличением) уровне квантового состава. Показано совместное развитие при этом и постсинаптической потенциации, причем установлено, что последняя маскирует проявления десенситизации. Сформулирована гипотеза о роли десенситизированных холинорецепторов как "ловушек" дл* свободного медиатора, что позволяет по-новому взглянуть на роль этогс явления в процессе генерации одиночного синаптического сигнала. Описана способность ускорять десенситизации к эндогенному АХ у ряд; фармакологических агентов (верапамил, винбластин, форсколин) ] биологически активных соединений (субстанция Р).

Разработана модель, позволяющая проанализировать кинетику секреци] квантов АХ в ходе генерации многоквантового ТКП и сопоставить кинетик; пре- и постсинаптических событий для оценки эффекта снижения амплитуд: из-за асинхронности секреции квантов АХ. Описаны различные проявлени асинхронности, наблюдаемые после блока К-каналов нервных окончаний

Обнаружена способность, блокировать открытый ионный канал п быстрому типу у реактиватора АХЭ дипироксима. Показана зависимост проявлений блока каналов от квантового состава ТКП. Описан новы гомологический ряд незаряженных блокаторов ионных каналов.

Показана функциональная роль АХЭ в синапсе как фактора регулирующего выраженность постсинаптической пластичности. Показан

большая значимость этого фермента в синапсах теплокровных.

Впервые описан и проанализирован эффект развития десенситизации под влиянием неквантового АХ. Изучено влияние ряда факторов, способных повлиять на чувствительность постсинаптической мембраны к медиатору через модуляцию уровня неквантовой секреции АХ.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Асинхронность секреции квантов медиатора из нервного окончания увеличивает время роста, снижает амплитуду, но не влияет на длительность спада одиночного многоквантового ТКП. Усиление асинхронности секреторного процесса является одним из компонентов депрессии синаптических сигналов во время ритмической активности синапса.

2. Превышение длительности спада многоквантового ТКП над длительностью одноквантового ответа при активной АХЗ является результатом перекрытия зон действия квантов медиатора на постсинаптической мембране, приводящего к усилению повторной активации рецепторов медиатором. Вероятность повторной активации рецепторов ограничивается за счет гидролиза медиатора и связывания свободного АХ в синаптической щели десенситизированными рецепторами.

3. Противоположные по функциональному значению формы кратковременной постсинаптической пластичности - постсинаптическая потенциация и десенситизация - параллельно развиваются в ходе ритмической серии многоквантовых ТКП. Прекращение активности приводит к быстрому исчезновению потенциации и более медленному устранению десенситизации. Основой постсинаптической пластичности служат вариации временного хода концентрации АХ в синапсе и соответствующие конформационные изменения холинорецептора.

4. Одна'из функций фермента ацетилхолинэстеразы в нервно-мышечном синапсе заключается в регуляции выраженности кратковременной постсинаптической пластичности.

5. Нервно-мышечные синапсы разных животных различаются по способности проявлять постсинаптическую пластичность в ходе ритмической активности. Одним из наиболее чувствительных критериев этой способности является превышение длительности многоквантового ТКП над длительностью одноквантового ответа', которое наблюдается при определенном и разном у разных животных уровне секреции медиатора.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ

Основное теоретическое значение имеет разработанное представление о комплексе факторов, определяющих процесс генерации постсинаптического тока в химическом синапсе. Эти данные являются основой для анализа работы синапса в естественных условиях и могу! быть использованы при исследовании сигналов в других типах химически» синапсов, а также для трактовки процессов, происходящих в синапсе I онтогенезе. Разработанное представление о постсинаптических форма! кратковременной пластичности вскрывает новые механизмы регуляции I саморегуляции синаптической передачи и открывает перспективы д,т целенаправленной модуляции функции синапса через посгсинапгическск звено. Полученные данные служат основой для построения обобщенно! модели функционирования химического синапса.

В работе предложены новые тесты для оценки развития в синапсе постсинаптической потенциации и десенситизации, которые могут быт] использованы в практике электрофизиологического и фармакологическое эксперимента. Разработана математическая модель для оценки временное хода секреции медиатора в ходе генерации многоквантового ТКП позволяющая оценить эффект "потери" амплитуды ТКП из-за асинхронност; секреции при разных воздействиях на кинетику пре- и постсинаптически: событий. Эти данные могут быть использованы для более корректны способов расчета уровня . вызванной секреции медиатора. Обнаружен способность ускорять десенсйтизацию у ряда широко используемы лекарственных средств,' что следует учитывать в клинической практике Установлена способность АХ, выделяемого в неквантовой форме, вызыват десенситизацию и роль десенситизированных рецепторов как фактора компенсирующего функциональную недостаточную активность АХЭ, что може служить основой для разработки новых принципов терапии при отравления ингибиторами АХЭ. Полученные данные могут способствовать раскрыта патогенеза ряда заболеваний нервно-мышечной системы.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты работы были доложены на: Всесоюзном симпозиум "Нейромедиаторы в норме и патологии" С Казань, 1979), Всесосзнь конференциях по физиологии и биохимии медиаторов, посвященных памят Х.С.Коштоянца СМосква, 1980, 1985, 1990), Всесоюзном I биофизическс съезде СМосква, 1982), II Всесоюзном семинаре "Молекулярные механиз»

регуляции синаптической передачи" СПущино, 1983), Всесоюзном симпозиуме "Физиология медиаторов" (Казань, 1984), Координационных рабочих совещаниях по периферическому синапсу (Киев, 1983, Казань, 1986), Международном симпозиуме по холинэстеразам (Блад-, Югославия, 1984), Всесоюзных симпозиумах по одиночным ионным каналам (Пущино, 1985, 1987), Всесоюзных съездах физиологического общества им. И.П.Павлова САлма-Ата, 1979, Баку, 1983, Кишенев, • 1987), Поволжской конференции по вегетативной нервной- системе (Куйбышев, 1988), Всесоюзной конференции "Механизмы действия гормонов и медиаторов" (Суздаль, 1989), Всесоюзных симпозиумах по ионным каналам (Кара-Даг, 1989, 1990), Международном симпозиуме "Механизмы образования памяти" (Майнц, Германия, 1989), Международном симпозиуме "Пластичность мотонейрона" (Бонн, Германия, 1990), Научных семинарах отдела ИЭФБ им. И.М.Сеченова (Ленинград, 1987, 1988, 1989), Международном конгрессе по физиологическим наукам (Прага, Чехословакия, 1991), заседании Татарского отделения Всесоюзного физиологического общества им.И. П.Павлова (Казань, 1992).

РЕАЛИЗАЦИЯ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Результаты проведенных экспериментов включены в лекционный курс по физиологии и биофизике для студентов КаэанскогЪ медицинского института и Казанского университета и используются в научных исследованиях в институтах эволюционной физиологии и биохимии (Санкт-Петербург), токсикологии (Санкт-Петербург), органической и физической химии (Казань), институте физиологии (Прага, Чехословакия).

По теме диссертации опубликовано 65 научных работ (35 статей и 30 коротких сообщений). Обзорные статьи [13,37,59] вошли в книги "Холинэстеразы" (ФРГ, 1984), "Основы памяти" (ФРГ, 1989), "Холинергические основы терапии болезни Альцгеймера" (США, 1991).

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты проводили на изолированных нервно-мышечных препаратах мыши (диафрагма), крысы (диафрагма) и лягушки Спортняжная мышца). Для получения ТКП с высоким, близким к физиологическому, уровнем секреции медиатора блокирование мышечных сокращений осуществляли поперечным рассечением мышечных волокон СВа^аб, ЬШеЬеП, 1962, Волкова и др..

1975) или детубуляцией с помощью глицерина CGage, Eizenberg, 1967). ТКП, отводимые в этих препаратах далее именовали "многоквантовые ТКП", а ТКП, регистрируемые в мышцах, в которых блокирование осуществляли за счет снижения квантового состава ионами магния - "низкоквантовые ТКП".

В работе использовали различные электрофизиологические методы регистрации синаптических токов и потенциалов: а) внутриклеточное отведение вызванных стимуляцией нерва ТКП и МТКП с помощью двух микроэлектродов в условиях фиксации потенциала, б) внеклеточное отведение ТКП и МТКП, в) фокальную регистрацию ПД двигательных нервных окончаний; г) определение времени жизни ионных каналов постсинаптической мембраны методом анализа автокорреляционной функции ацетилхолинового шума, д) величину "Н-эффекта" - гиперполяризации, вызванной d-тубокурарином при блокированном гидролизе медиатора для определения уровня неквантовой секреции АХ, е) аппликацию АХ из микропипетки для оценки чувствительности постсинаптической мембраны.

С помощью компьютера С"Электроника ДЗ-28", IBM PC/AT) решали следующие задачи: а) накопление, усреднение и вычисление амплитудно-временных. характеристик синаптических сигналов: времени роста, максимальной амплитуды, постоянной времени спада, б) проверку характера спада на соответствие экспоненте и при необходимости -расчет количества экспонент и их параметров, в) стимуляция нерва в заданном режиме, г) моделирование ТКП на базе заданного распределения временного хода секреции медиатора и реконструкция этого распределения исходя из параметров ТКП и МТКП, д) моделирование действия блокаторов ионных каналов н^ базе математической модели МТКП, е) статистическую обработку данных.

В части опытов блокировали гидролиз АХ. Для этого использовали ингибиторы АХЭ армин С экспозиция в растворе 10"®- моль/л в

течение 30 мин с последующей отмывкой свободного армина), прозерин С3-10~®моль/л). Ряд фармакологических агентов использовали для целенаправленного воздействия на разные звенья синаптической передачи: агонисты ХР карбахолин и АХ, блокаторы холинорецепторов d-тубокурарин и «L-бунгаротоксин, различные блокаторы ионных каналов холин(?рецептора, блокатор Ыа+-каналов тётродотоксин, К+-каналов - 4-аминопиридин, ингибитор Na+, К+-АТФазы оуабаин, ускоритель десенситизации проадифен (SKF-525A), ингибитор транспорта АХ в синаптические везикуль везамикол.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.' ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МТКП И МНОГОКВАНТОВЫХ ТКП У ТЕПЛОКРОВНЫХ

И ХОЛОДНОКРОВНЫХ.

1.1. Характеристика ШТШ

Прежде чем приступить к анализу многоквантовых ТКП, первоначально исследовали параметры одноквантовых ответов - МТКП у разных животных: лягушки, мыши, крысы. Эти данные, полученные при температуре 20-21°С и потенциале фиксации -70 мВ, представлены в Табл.1. Спад МТКП у всех животных аппроксимировался одной экспонентой, что отражало функционирование однородной популяции ионных каналов в концевой пластинке. Постоянная времени спада МТКП у лягушки составляла

1,09±0,05мс Сп=45 синапсов), что практически совпадало с временем жизни ионных каналов холинорецептора - 1,08±0,0бмс Сп=4), измеренным с помощью автокорреляционной функции АХ-шума [56]. Это соответствует представлению, что спад МТКП при активной АХЭ отражает скорость закрытия ионных каналов [Anderson, Stevens, 1973], и позволяет соотносить временные характеристики 'многоквантовых. ТКП со средним временем жизни постсинаптических ионных каналов.

Габл. 1. Амплитудно-временные характеристики МТКП у разных животных.

Название животного Амплитуда МТКП нА Постоянная времени спада MC Коэффициент потен- циалозависимости "Н" мВ

Лягушка 2,97±0,17 1,09±0,05 104±6

* С 45) (45) С23)

Мышь 3,92±0,45 1,43±0,07 108±6

СЮ) СЮ) г-л со

Крыса 3,55 ±0,12 1,18*0,05 10б±7

С 29) С 29) СЗ)

В скобках указано количество исследованных синапсов.

1.2. Характеристика многоквантовых ТКП.

Анализ многоквантовых ТКП проводили на "рассеченных" и детубулированных мышцах, что позволило сохранить высокий, близкий к физиологическому, уровень вызванной секреции. Средний квантовый состав ТКП в синапсах лягушки при температуре 20-21°С, рассчитанный как отношение амплитуд ТКП и МТКП, составил 157,6±8,8 кванта на один нервный импульс Сп=40 синапсов). При этом Срис.1) постоянная времени спада ТКП (fTKn) превышала на 24±4% Сп=40;Р<0,05) постоянную времени спада МТКП в этих же синапсах [8,12,13,54,61]. Следовательно,

в отличие от МТКП, спад многоквантовых- ТКП определялся не только временем жизни ионных каналов. Наиболее важный результат этой серии заключался в том, что длительность спада ТКП зависела от квантового состава Срис.lg). Однако данная закономерность наблюдалась лишь в синапсах, в которых квантовый состав ТКП был выше 100,_ а ниже этой величины отношение *ткп/т'ихкп Равнялось 1< то есть Уже не зависело от количества квантов, выделившихся на нервный-импульс [36,61].

2.0

0.5

300

Рис.1. Отношения постоянных времени спада ТКП и МТКП в синапсах с разным квантовым составом Са) и в одном синапсе по мере снижения квантового состава ТКП С б).

Такие же результаты, но с меньшим разбросом были получены в отдельных синапсах, в которых квантовый состав ТКП плавно снижали за счет введения в раствор ионов Мд^+ (рис.16). Квантовый состав ТКП,выше

которого происходило зависимое от уровня секреции увеличение <ткп> было названо "критический уровень секреции медиатора" - КУСМ [54,61]. У'лягушки КУСМ составил 110±12 (п=10).

Аналогичное превышение т-ткп над fj^jj на 25'/. (Р<0,05) наблюдали при генерации многоквантовых (средний квантовый состав 65±4, п=23) ТКП в синапсах крысы [23,60]. Следовательно, и в этом случае спад многоквантовых ТКП определялся дополнительными факторами, по сравнению с МТКП.

Эффект превышения <гткп над мог быть объяснен двумя

механизмами: асинхронной секрецией квантов [Katz, Miledi, 1979] или постсинаптическим взаимодействием квантов АХ tHartzell et al., 19751.

2. ВКЛАД АСИНХРОННОСТИ D АМПЛИТУДУ И ВО ВРЕМЕННОЙ ХОД

МНОГОКВАНТОВОГО ТКП.

I.1. Реконструкция временного хода секреции в процессе генерации дюгоквантового ТКП. Оценка вклада асинхронности секреции во временной

ход многоквантового ТКП.

Для оценки роли асинхронности в процессе генерации многоквантового ГКП прежде всего необходимо было реконструировать временной ход зекреции квантов АХ. Однако для многоквантового ТКП с этой целью не юг быть использован прямой метод измерения синаптических задержек эдноквантовых ответов [Katz, Miledi, 1965]. Поэтому нами была зазработана компьютерная программа реконструкции временного хода зекреции по амплитудно-временным характеристикам ТКП и МТКП [53].. Для знижения вклада постсинаптических событий использовали ТКП и МТКП, . «регистрированные при уменьшении времени жизни постсинаптических юнных каналов. С этой целью меняли мембранный потенциал [Kordas, .972] от -40 до +50 мВ с одновременным введением октанола [Gage, 1977] I концентрации 0,5 ммоль/л. При этом спад МТКП, отражающий время жизни :аналов, укорачивался примерно в 10 раз. Полученная в результате юделирования кривая временного хода секреции практически совпала рис.2а) с аналогичной кривой, экспериментально полученной нами для жзкоквантовых ТКП по прямому методу Katz, Miledi С1965). !ледовательно,степень асинхронности во время генерации одиночного ногоквантового ТКП Сс квантовым составом больше 100) не выше, чем у

низкоквантового ТКП. Подтверждением этого явилось то, что время роста ТКП, которое отражает степень асинхронности секреции квантов.АХ [Rang, 1982], в эксперименте не менялось при изменениях квантового состава ТКП в широком диапазоне [54].

Таким образом, асинхронность секреции не является фактором, определяющим эффект превышения длительности спада многоквантового ТКП над длительностью спада МТКП.

2.2. Эффект "потери" амплитуды ТКП в результате асинхронности секреции

квантов АХ.

Предполагается, что асинхронность, то есть неодновременность секреции квантов АХ, может влиять на амплитуду ТКП, занижая ее по сравнению с синхронным ТКП [Магазаник, Миненко, 1986, Adams, 19893. Этот эффект Сдалее - эффект "потери" амплитуды ТКП), по-видимому, должен зависеть от длительности одноквантового ответа - МТКП, из которых складывается многоквантовый -ТКП. Для количественной характеристики эффекта "потери" амплитуды многоквантового ТКГ необходимо его сопоставление с модельным ТКП, полученным для случая синхронного выделения квантов АХ. Поэтому следующим этапом былс моделирование ТКП на базе полученной кривой временного хода секреции

а б

Рис.2. Нормированные кривые временного хода секреции С а) дл. многоквантового ТКП С1) и низкоквантового ТКП С2) и зависимост: амплитуды ТКП от длительности одноквантового ответа Сб).

квантов АХ. Вторым входным параметром модели был _МТКП. При этом оказалось, что при 'гмткп=1.°9 мс, эффект "потери" амплитуды многоквантового ТКП составляет около 24% Срис.26). Поскольку длительность МТКП является вариабельной величиной, для систематического анализа эффекта "потери" амплитуды ТКП от <. меняли длительность модельного МТКП в широком диапазоне. В зависимость амплитуды ТКП от ^мткп описывалась кривой, имеющей пологий и крутой участки, разделенные физиологическими значениями ^мткп Срис.26). Согласно этому графику, эффект "потери" амплитуды ТКП значительно возрастает при снижении т,мткп, но становится существенно

гмткп

мткп целом

меньше С около 6%) в синапсе с "ингибированной" АХЭ, где -г____= 4 мс.

МС

б

Рис.3. Изменения амплитуды Са), времени роста С б) и постоянной времени спада ТКП С в) при увеличении временного хода секреции квантов АХ.

0.0

0.0

0.5

1.0

1.5

Усиление асинхронности, имитируемое в модели увеличением дисперсии зременного хода секреции, приводило к большей "потере" амплитуды ТКП ! рис.За), резко повышало время роста (рис. 36) и мало сказывалось на дательности спада Срис.Зв).

Таким образом, формирование амплитуды ТКП определяется соотношением между' кинетикой секреции медиатора и длительностью

одноквантового ответа СМТКП). Наличие эффекта "потери" амплитуды ТКП создает потенциальную возможность как возрастания амплитуды сигнала (при синхронизации секреции и неизменном квантовом составе ТКП), так и его дополнительного снижения при усилении исходной асинхронности. Исходя из этого, поддержание определенного уровня синхронности секреции медиатора является важным условием сохранения надежности синаптической передачи. Поэтому представляло интерес выяснение вопроса: как изменится синхронность секреции при увеличении длительности пресинаптического ПД?

Для ответа на этот вопрос проводили эксперименты, в которых исследовали действие на многоквантовый ТКП блокатора потенциалозависимых калиевых каналов 4-аминопиридина С4-АП).

2.3. Влияние ' на амплитуду и временной ход многоквантового ТКП ¿локаторов калиевых каналов.

На роль естественных регуляторов длительности ПД в разных клетках [Hille, 1984], в том числе в нервных окончаниях, прежде всего претендуют калиевые каналы [Mallart, 1984, Зефиров, 1985].

В литературе имеются противоречивые данные о способности блокатора потенциалозависимых калиевых каналов 4-АП влиять на временной ход ТКП [Molgo et al., 1977, Datyner, Gage, 1980, Lambert et al., 1981, Tomsen, Wilson, 1983]. S наших экспериментах, проведенных при физиологическом уровне квантового состава ТКП, 4-АП в концентрации 10"^ моль/л увеличивал средний квантовый состав ТКП до 424 квантов [54]. При этом *ткп увеличивалась с 1,5±0,1 мс (Р<0,05; п=28) до 2,1±0,1 мс СР<0,05;-n=17), а время роста ТКП с 0,45 ±0,02 мс до 0,58±0,03 мс СР<0,05; п=14). Десинхронизирующее действие 4-АП проявлялось не только в увеличении времени роста ТКП, но и в ряде явлений, возникающих во время спада ТКП - закругленности верхушки ТКП, появлении "горбов" и повторных многоквантовых ТКП в ответ на одиночное раздражение [54,63]. Все эти явления носили явно пресинаптический характер и, по-видимому, были связаны с повышенным входом ионов кальция в терминаль за счет продления периода активации кальциевых каналов. Снижение квантового состава ТКП ионами Мд2+ устраняло проявления асинхронности [54, 63]. тткп при этом также возвращалась к исходным значениям [54]. При исходно низком уровне квантового состава

ТКП продление ПД ¿локаторами каналов увеличивало амплитуду ТКП, но не влияло на их временной ход. Это позволяет понять причины противоречивых данных о влиянии 4-АП на временной ход ТКП у других авторов, поскольку, как следует из наших данных, действие' этого агента зависит от исходного квантового состава ТКП.

Таким образом, система потенциалозависимых калиевых каналов нервных окончаний является одним .из механизмов синхронизации секреторного процесса, причем эффекты десинхронизации, наблюдаемые после блокирования этих каналов, зависят -от исходного уровня секреции.

2.5. Усиление асинхронности во время ритмической серии

многоквантовых ТКП.

По данным Ригг1ег, Бейка С1979, 1982) при длительной Сдесятки минут) серии низкоквантовых ТКП развиваются признаки выраженной асинхронности секреции. В данном разделе работы исследовали, как меняется синхронность секреции у многоквантовых ТКП. Ритмическая активность с частотой 10 Гц в течение 60с вызывала (рис.4) три эффекта:

а б

Зис.4. Изменения амплитуды С1), времени роста С2) и постоянной времени :пада (3) многоквантовых ТКП при стимуляции нерва с частотой 10 Гц в сонтроле С а) и в присутствие 4-АП Сб).

увеличение времени роста, снижение амплитуды ТКП и <ткп [54]. Изменение времени роста ТКП свидетельствовало о нарастающей асинхронности секреции [Rang, 19821. Это подтверждалось и корреляцией этого эффекта с увеличением длительности ПД нервного окончания [54]. Наиболее значительно время роста ТКП возрастало при исходно высоком квантовом составе ТКП, в том числе при повышенном содержании ионов кальция или в присутствии 4-АП Срис.46).

Укорочение спада ТКП происходило при снижении квантового состава ТКП до КУСМ, величина которого Соколо 100 квантов) совпадала с КУСМ, определенным при снижении вызванной секреции ТКП ионами Ниже

КУСМ падение квантового состава ТКП не влияло на тткп.

Таким образом, хотя в ходе одиночного многоквантового ТКП асинхронность секреции квантов АХ была не выше, чем у низкоквантового ТКП, для многоквантовых ТКП роль этого фактора быстро Св секундном диапазоне) возрастала в ходе ритмической активности. Поэтому одним из компонентов депрессии амплитуд ТКП во время ритмической активности может быть эффект, связанный с нарастающей асинхронностью секреции медиатора. Количественные оценки, проведенные с помощью модели ТКП (рис.4), показали, что этот эффект составляет 33% при увеличении времени роста ТКП на 50%.

3. ИССЛЕДОВАНИЕ ВКЛАДА ПОСТСИНАПТИЧЕСКОИ ПОТЕНЦИАЦИИ В АМПЛИТУДУ И ВО ВРЕМЕННОЙ ХОД МН0Г0КВАНГ0В0Г0 ТКП.

Другой причиной, способной замедлить спад многоквантового ТКП, могло быть постсинаптическое взаимодействие квантов, приводящее к локальному повышению концентрации АХ, - так называемый феномен постсинаптической потенциации (ПСП). Ранее такое постсинаптическое взаимодействие квантов в синапсах змеи было обнаружено только при ингибированной АХЭ [Hartzell et al., 1975]. Поскольку этот феномен зависел от активности АХЭ, эксперименты проводили как при активной, так и ингибированной АХЭ, что позволило более детально исследовать как разные проявления, так и механизмы ПСП. ПСП, возникающую в ходе генерации одиночного ТКП в результате пространственного взаимодействия квантов АХ, мы назвали ПСП "в пространстве", а ПСП, наблюдаемую при повторном действии квантов на ранее активированный участок мембраны -ПСП "во времени".

3.1. Постсинаптическая потенциация "в пространстве".

3.1.1. ПСП "в пространстве"при активной АХЭ.

Для оценки возможности постсинаптического взаимодействия квантов АХ во время генерации многоквантового ТКП при активной АХЭ мы провели эксперименты с использованием необратимого блокатора ХР сС-бунгаротоксина Ссс-БТ) и холинолитика d-тубокурарина Cd-ТЮ. Поскольку ПСП приводит к усилению повторной активации ХР медиатором [Hartzell et al., 1975], то агенты, способные снижать вероятность повторной активации холинорецепторов, к которым относится «f-БТ и d-TK [Katz, Miledi, 1973], должны уменьшать длительность многоквантового ТКП. Эксперименты показали, что действительно оба блокатора ХР, помимо уменьшения амплитуды синаптических сигналов, снижали величину f^j, практически не влияя на длительность МТКП [541. Причем эффект был тем сильнее выражен, чем выше был квантовый состав ТКП, то есть чем более была выражена повторная активация рецепторов АХ (рис.5). При. низком квантовом составе ТКП (ниже КУСМ, когда нет превышения длительности ТКП над длительностью МТКП), et-БТ был не эффективен [33].

нА

200

150

100

0.5 0.8 1.0 13 1.5

Рис. ' 5. Влияние на длительность спада многоквантовых ТКП себунгаротоксина Са) и б-тубокурарина (б). Способность б-тубокурарина укорачивать спад ТКП Ссветлые столбики) тем выше, чем больше исходное превышение длительности спада ТКП над МТКП Сзаштрихованные столбики).

Полученные данные свидетельствуют о том, что "даже при активной АХЭ кванты медиатора при физиологическом уровне секреции ■ способны взаимодействовать на постсинаптической мембране, что увеличивает локальную концентрацию эндогенного АХ и повышает вероятность повторной активации рецепторов медиатором. Результатом ПСП является зависимое от квантового состава ТКП увеличение ^ткп- ПСП "в пространстве" такой же выраженности, как в наших экспериментах, была воспроизведена и в модельный экспериментах [Bartol at al, 1991]. Функциональная роль постсинаптического взаимодействия квантов заключается, по-видимому, в увеличении надежности синаптической передачи при меньшем числе выделенных квантов. Вполне вероятно, что устранение ПСП при. снижении квантового состава ТКП ниже КУСМ, например, во время ритмической активности Сем раздел 2.5), является дополнительным механизмом депрессии синаптической передачи.

3.1.2 ПСП "в пространстве" при ингибированной АХЭ.

Ингибирование АХЭ армином или прозерином резко усиливало ПСП "в пространстве" [8,12,13]. У лягушки спад ТКП,так£же,как и спад МТКП, в большинстве синапсов сохранял экспоненциальность. Длительность спада ТКП превышала, в 3-6 раз. При этом КУСМ снижался примерно в 2

раза по сравнению с данными, полученными при активной АХЭ.

Резкое снижение КУСМ при устранении гидролиза медиатора, по-видимому, объясняется тем, что ПСП при ингибированной АХЭ отражает взаимодействие между квантами, выделенными из соседних активных зон [Hartzell et. al., 1975], а ПСП при активной АХЭ связана с взаимодействием квантов, выделенных из одной активной зоны [543. Это подтверждается и расчетными данными по распространению АХ в синаптической щели [Bartol et al., 1991]. Следовательно, ингибирование АХЭ резко увеличивает дистанцию между квантами, способными взаимодействовать на постсинаптической мембране.'

3.1.3. Особенности ПСП "в пространстве" в синапсах теплокровных.

Еще более выраженная ПСП после ингибирования АХЭ наблюдалась у крысы. Общая длительность ТКП превышала длительность МТКП в 10-50 раз. КУСМ у крысы при ингибированной АХЭ составлял всего 11±5 Сп=6), т.е.

выделение более 10 квантов одновременно на один нервный импулыз уже приводило к их взаимодействию на постсинаптической мембране [233. Таким образом, у теплокровных существуют более благоприятные условия для продления пребывания эндогенного АХ в синаптической щели.

Однако различие было не только количественным. В отличие от лягушки, спад ТКП у крысы мог быть описан 1, 2 или 3 экспонентами. Характер спада зависел от квантового состава ТКП и при снижении вызванной секреции спад из трехэкспоненциального мог быть последовательно превращен в двух-, а далее - в моноэкспоненциальный [23,603. Скорость спада медленного компонента ТКП была в 3 раза более чувствительна к изменениям мембранного потенциала, чем 'гмткп- У лягушки спад многоквантового ТКП был, наоборот, менее чувствителен к мембранному потенциалу [11,20]. При действии обгБТ многоквантовые ТКП у крысы первоначально расширялись [52,603, тогда как у лягушки происходило только укорочение многоквантовых ТКП [123. В синапсах крысы даже при снижении амплитуды ТКП до 10% от исходной величины длительность ТКП превышала время жизни ионных каналов примерно в 10 раз [603.

Таким образом, у теплокровных животных ПСП в условиях ингибированной АХЭ является как более выраженным явлением, так, по-видимому, и более сложным по механизму, чем у холоднокровных. Одним из компонентов ПСП была, вероятно, модификация эндогенным АХ в повышенной концентрации нормальной кинетики ионных каналов ХР. Не исключено, что механизмом этой модификации является блок ионных каналов самим медиатором, который высокочувствителен к изменениям мембранного потенциала [Sine, Steinbach, 19843 и может служить дополнительной причиной замедления спада ТКП после ингибирования АХЭ [603.

3.1.4. Механизм ПСП "в пространстве".

При сравнении ПСП "в пространстве" у разных животных можно прийти с заключению, что этот феномен включает два разных механизма. Основной леханизм базируется, по-видимому, на нелинейных свойствах юстсинаптической мембраны, связанных с особенностями кинетики жтивации ХР. По современным представлениям предполагается, что ютивация ХР -достигается после присоединения двух молекул АХ

[АпёегБоп, 81еуепБ, 1973, Ререг е! а1. , 1982]:

ах2К

ах2и*

С1)

Поэтому помимо К - холинорецептора в покоящемся состоянии, коротко существующей конформации кХ^Р, .и АХ2Е*- холинорецептора с открытьм ионным каналом, имеется комплекс холинорецептор, связанный с одной молекулой АХ САХ^Ю. Такие комплексы образуются прежде всего на периферии действия кванта [У/аУчеу е1 а1., 1979] и их число резко возрастает после ингибирования АХЭ [Слободов и др., 1990]. В местах перекрытия зон действия соседних квантов происходит дополнительная активация этих ранее "молчавших" ХР, что проявляется в первую очередь замедлением спада ТКП. Этот механизм, по-видимому, в наиболее чистом виде представлен у холоднокровных. У теплокровных животных ПСП "в пространстве", помимо более выраженного первого механизма, может включать и дополнительный эффект. Механизм его до конца не установлен, но можно думать, что он основан на изменении кинетики работы ионных кана;.ов медиатором в повышенной концентрации. Более благоприятные услоьия для накопления медиатора при этом могут создаваться за счет компактной организации и других особенностей микроархитектуры синапса у этих животных [Федоров, 1983].

В условиях парной стимуляции двигательного нерва с интервалом, превышающим длительность одиночного многоквантового ТКП, у лягушки было обнаружено ранее не описанное явление - замедление спада второго ТКП, т.е. ПСП "во времени" [8,12]. Величина ПСП была обратно пропорциональна длительности межимпульсного интервала. При интервале между ТКП в 17 мс, различия * первого и второго ТКП составили 16°/ СР<0,05; п=25). Проведенный анализ показал, что ПСГ! "во времени не была связана с пресинаптическими причинами [12]. Аналогичная ПСП "во времени" величиной около 21±2% (п=10) при активной АХЭ наблюдалась и у крысы [23,60]. Предположение о пресинаптической природе ПСП в данное случае было отвергнуто на основании того, что эффект возрастания <_

3.2. Постсинаптическая потенциация "во времени".

3.2.1. ПСП "во времени"при активной АХЭ.

не сопровождался увеличением времени роста второго ТКП и пресинаптическим облегчением. Следовательно, эффект не был связан с усилением асинхронности секреции или увеличением квантового состава ТКП, а был обусловлен сохранением на постсинаптической мембране следовых явлений, вызванных первым ТКП.

Ингибирование АХЭ значительно усиливало ПСП "во времени" [11,12,13]. Как видно из рис.6, следовая реакция после одиночного ТКП, приводящая к последующей ПСП, сохранялась десятки секунд, т.е. являлась механизмом кратковременной пластичности синапса [37]. При отведении от небольшого участка синапса с помощью внеклеточного электрода ПСП могла быть обнаружена при локальной величине квантового' состава ТКП всего один или два кванта в результате их повторного попадания на один и тот же участок постсинаптической мембраны, что дополнительно подтверждало постсинаптическую природу исследуемого феномена.

3.2.2 ПСП "во времени" при ингибированной АХЭ.

100

80

60

40

20

О

0.01

0.1

1

10 С 1СЮ

Рис.6. Зависимость постсинаптической потенциации "во длительности межстимульного интервала.

3.2.3. Сравнение ПСП "во времени" в синапсах крысы и лягушки.

В синапсах крысы ПСП "во времени" так же, как ПСП "в пространстве", была более выражена, чем у лягушки: при интервале 100 мс степень замедления второго ТКП в паре у крысы составляла 80±14'/. Сп=5) вместо 3916% Сп=25) у лягушки [23]. Эти данные хорошо согласовались с результатами о большей выраженности ПСП "в пространстве" у теплокровных, то есть продленный временной ход концентрации АХ в синаптической щели в ходе генерации первого многоквантового ТКП увеличивал вероятность сохранения следовой реакции у теплокровных.

3.2.4. Анализ механизма ПСП "во времени".

Анализ механизма феномена ПСП "во времени" позволил первоначально исключить пресинаптические причины этой следовой реакции [12,23]. То, что ПСП наблюдалась при межстимульном интервале большем, чем длительность одиночного ТКП, привело к представлению, что это явление обусловлено проявлениями функциональной роли кинетических состояний холинорецептора с закрытым ионным каналом, способных сохранять молекулы медиатора в межстимульном интервале в связанном виде. На эту роль могли .претендовать либо десенситизированные ХР [61ау1поу1с, 1988], либо, как и в других проявлениях ПСП Сем раздел 3.1.4,), комплексы ХР с одной молекулой АХ.

Снижение плотности ХР с помощью <£-БТ снижало ПСП "в пространстве", но не влияло на ПСП "во времени" [23]. Это хорошо согласуется с тем, что блокирование части ХР <1-БТ не влияло на другие проявления ПСП [Ререг е1 а1., 1982].

Изменение мембранного потенциала не влияло на отношение постоянной времени спада 1-го и 2-го ТКП, т.е. ПСП "во времени" была независима от уровня поляризации постсинаптической мембраны [11,20]. Коэффициент "Н" Ссдвиг мембранного потенциала, вызывающий изменение < в е раз) составлял 177±29 Сп=8) для 1-го ТКП и 178±31 Сп=8) для 2-го ТКП [20]. Согласующиеся с этим данные получены при исследовании действия на ПСП этанола [27]. Этот агент, хотя и замедлял спад одиночного ТКП, но так"же,как и мембранный потенциал, не влиял на сохранение постсинаптической следовой реакции. Таким образом, механизм ПСП "во времени не обладает заметной потенциалозависимостыо. Это

свидетельствует против предположения о прямом участии в механизмах ПСП деренситизированных ХР [&ау1поу1с, 1988], так как десенситизация усиливается с.гиперполяризацией постсинаптической мембраны [МадагапИс, УузкосП, 1970].

Более сложным оказался анализ влияния на ПСП температуры [11,20], поскольку ее изменение влияет и на квантовый состав ТКП. Послр уравнивания квантового состава ТКП при разных температурах [20] оказалось, что ПСП усиливается при охлаждении и этого процесса

составляет 2,0±0,2 Сп=7) [20]. Это также говорило против прямого участия в этом эффекте десенситизированных ХР, поскольку десенситизация при охлаждении ослабевает [Мада2аги)с, УузкосП, 1975], но согласовывалось с тем, что при снижении- температуры усиливаются другие проявления ПСП [Ре11г, Тгаи1тапп, 1980].

Таким образом, исследование ПСП "во времени" в разных экспериментальных режимах позволяет прийти к заключению, что это явление, так^же, как другие проявления ПСП, связано с комплексами ХР-одна молекула АХ, в частности, с их относительно длительным Сдо десятков секунд) сохранением на постсинаптической мёмбране [8,12,20,37]. Следовательно, это кинетическое состояние ХР может служить основой для реализации кратковременной постсинаптической пластичности 137].

* * *

Таким образом, роль ПСП как фактора, определяющего амплитуду и длительность ТКП,основывается на том, что комплекс АХ^ХР может быть активирован всего одной (вместо обычных двух) молекулой АХ, выделенной в составе соседнего кванта (ПСП "в пространстве") или при повторном выделении кванта (ПСП "во времени"). Необходимые для этого условия создаются 'при высоком (выше КУСМ) уровне секреции медиатора. Результатом как ПСП "в пространстве", так и ПСП "во времени" является открытие дополнительных ионных каналов, увеличение амплитуды и длительности ТКП. То есть развитие ПСП служит повышению надежности синаптической передачи при меньшем числе выделенных квантов.

4. ДЕСЕНСИГИЗАЦИЯ КАК ФАКТОР, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЙ АМПЛИТУДУ И ДЛИТЕЛЬНОСТЬ ОДИНОЧНОГО СИНА1ГГИЧЕСКОГО СИГНАЛА

Значение десенситизации для синаптической передачи мы рассматривали в двух аспектах: 1) роль десенситизации как долговременного явления, влияющего на процесс генерации одиночного ТКП и 23 развитие десенситизации в ходе ритмической активности .Скак форму кратковременной пластичности).

Данный раздел работы посвящен первому аспекту - исследованию функциональной роли десенситизированных ХР СДС-ХР) в процессе генерации одиночного ТКП. Значимость ДС-ХР для генерации ТКП будет, по-видимому, зависеть от: 1) числа ДС-ХР; 2) способности ДС-ХР связывать АХ, а следовательно, влиять на судьбу медиатора в синаптической,щели; 3) кинетики развития десенситизации и кинетики восстановления чувствительности. Образование ДС-ХР может быть вызвано экзогенным АХ [Katz, Thesleff,1957], эндогенным АХ Сем. раздел 5 и 6), веществами десенситйзаторами [Магазаник, • 1970], а согласно данным биохимического исследования холинорецептивных мембран, предполагается наличие предсуществующих ДС-ХР [Cohen, Strnad, 1987].

4.1. Десенситизация холинорецепторов экзогенным АХ.

При решении вопроса о роли ДС-ХР как фактора, определяющегс амплитуду и длительность ТКП, прежде всего необходимо было выявит! десенситизацию "в чистом виде",без сопутствующей ПСП, что потребовалс предварительного изучения взаимоотношений между десенситизацией и ПСП.

4.1.1. Соотношения между постсинаптической потенциацией ] десенситизацией при действии экзогенного АХ.

Для исследования взаимоотношений между ПСП и десенситизацией npi действии экзогенного АХ в экспериментах на . лягушке первоначальна использовали отведение МТКП при ингибированной АХЭ, что позволил! оценивать развитие ПСП и десенситизации не только по амплитуде, но по длительности сигналов [Feltz, Trautmann, 1980]. При введени экзогенного АХ происходило незначительное увеличение амплитуды сильное замедление спада МТКП, т.е. наблюдались преимущественн признаки ПСП Срис. 7) [22,37,46]. Поэтому далее величину ПС

рассчитывали по величине прироста по сравнении с исходной

длительностью сигнала. Пороговая концентрация, вызывающая ПСП величиной 10% (Р<0,05), оказалась равной 5-Ю"8 моль/л. Интересно, что это соответствует рассчитанной концентрации неквантово секретируемого АХ [уузкосП е1 а1., 1983]. При использовании АХ в концентрации 2-10 моль/л ПСП увеличилась до 112%.

После отмывки АХ наблюдалось снижение амплитуды и <ткп ниже исходных значений С рис.7). Анализ этого явления привел к заключению, что оно связано с быстрым устранением ПСП и более медленным восстановлением чувствительности С22,46]. Таким образом, после отмывки АХ и устранения ПСП десенситизация предстает в "чистом виде", что позволяет оценить ее количественно. Следует отметить, что длительность сигналов Скак в случае с ПСП), оказалась параметром гораздо более чувствительным к развитию десенситизации, чем их амплитуда.

Таким образом, в присутствии свободного АХ в синаптической щели на постсинаптической мембране развиваются одновременно два процесса: ПСП и десенситизация, причем первый из них способен маскировать снижение чувствительности мембраны.

10

т, мс

8

2 О

1 гт •

¿Д-П \ А

» » мин » '

8

А, нА

о

О

15 30 45 60 75

Рис. 7. Изменения амплитуды СА) и постоянной времени спада С«) МТКП ьп время действия и после отмывки АХ в концентрации 2 мкмольхл.

4.1.2. Анализ процесса восстановления чувствительности.

При анализе процесса восстановления постсинаптической мембраны от десенситизации выявились важные закономерности, связанные с концентрацией используемого АХ. Оказалось, что в зависимости от глубины десенситизации возможны три варианта процесса восстановления: а) полное восстановление амплитуды и С концентрация АХ менее

2-10~®моль'/л); б) восстановление амплитуды при неполностью восстановленной длительности С2-10~®моль/л); в) неполное восстановление в течение несколько часов как амплитуды, так и •гыткп С5-10~6моль/л и более).

Последний результат свидетельствовал о том, что феномен десенситизации сопряжен с медленным, возможно необратимым процессом инактивации ХР. [22,63]. Это подтвердилось в специальных экспериментах, в которых повторное Счерез несколько часов) введение экзогенного АХ вызывало значительно меньший ток, чем при первом введении агониста. Такой процесс необратимого снижения чувствительности был обнаружен и для никотиновых ХР из клеток феохромоцитомы [Boyd, 1987].

Медленное восстановление чувствительности позволяло оценить функциональную роль продуцированных экзогенным АХ десенситизированных рецепторов. Наиболее яркий феномен, который подвергся последующему анализу, заключался в том, что при полностью восстановленной после пребывания в десенситизированном состоянии амплитуде сигнала, тмткп оставалась почти вдвое"короче исходных значений [46].

Представлялось важным выяснить следующий вопрос: было ли это следствием снижения числа свободных' ХР, . аналогично их необратимому блокированию й-БТ,-или же ДС-ХР, хотя и не участвовали в электрогенезе, но сохраняли способность связывать АХ и соответственно влияли на судьбу АХ в синаптической щели?

4.1.3. Повторная активация холинорецепторов в условиях десенситизации и при блокировании рецепторов а-бунГаротоксином.

Для ответа на вопрос о способности ДС-ХР связывать свободный АХ после блокирования гидролиза АХ сравнивали влияние на амплитуду и длительность спада МТКП: а) частичной десенситизации и б) необратимого блокирования части ХР с помощью ос-БТ. Известно, что ofc-БТ способен уменьшать повторную активацию ХР за счет необратимого блокирования ХР,

А Б

1 нА

2 мс

Рис.8. Сравнение действия на МТКП частичной десенситизации, вызванной АХ СА) и блокирования холинорецепторов ¿-бунгаротоксином СБ).

то есть препятствуя связыванию) АХ [ Ка1г, МНесИ, 1973]. Однако из сопоставления МТКП в двух указанных ситуациях [46] следует, что ДС-ХР осуществляют эффект снижения повторной активации ХР гораздо более эффективно, чем блокированные л-БТ Срис.8). В последнем случае такое же, как при развитии десенситизации, укорочение МТКП сопровождалось существенным уменьшением амплитуды сигнала [46]. Полученный результат может быть объяснен, если ДС-ХР, в отличив от блокированных сеБТ, способны связывать АХ. Причем по биохимическим данным они обладают более высоким сродством к агонисту, чем обычные свободные ХР [НеЫтапп, СЬапдеих, 1979]. В таком случае ДС-ХР можно рассматривать как высокоаффинные "ловушки" для улавливания свободного медиатора из синаптической щели.

Следует отметить, что и при активной АХЭ в опытах с низкими концентрациями карбахолина наблюдалось укорочение многоквантовых ТКП, по-видимому, также за счет проявлений функциональной роли ДС-ХР.

Таким образом, ДС-ХР, хотя и не способны открывать ионный канал, но могут выступать в_ качестве фактора связывания свободного АХ в синаптической щели, дополняя функциональную роль АХЭ, также направленную на ограничение повторной активации рецепторов.

4.2. Влияние на повторную активацию холинорецепторов времени дсизки

АХ-активируемых ионных каналов.

Поскольку АХ находится на ХР пропорциально длительности открытого состояния ионного канала Ссхема 13, время жизни ионных каналов также может повлиять на вероятность повторной активации ХР. Для исследования роли этого фактора мы проводили эксперименты в условиях ингибированной АХЭ, когда эффект повторной активации ХР медиатором наиболее выражен [Katz, Miledi, 1973].

Оказалось, что после ингибирования АХЭ разные способы увеличения времени жизни ионных каналов - гиперполяризация [Kordas, 1972], охлаждение [Gage, McBurney, 1975], действие этанола [Gage et al., 1975] - значительно менее эффективны в замедлении спада МТКП, чем при активной АХЭ [11,15,20,25, 40]. Так, степень замедления спада МТКП (отношение xieiKn при ингибированной АХЭ к -гмткп при активной АХЭЗ в синапсах мыши при 20°С составило 3,9, а при 26°С - 6,0 [40]. Систематическое изучение зависимости от температуры при активной

и ингибированной АХЭ позволило установить ее экспоненциальный характер и экстраполировать данные к естественной температуре тела животного 36°С, когда это отношение составило 7,6.

Таким образом, увеличение времени жизни ионных каналов,так же,как и наличие ДС-ХР, может быть фактором, снижающим вероятность повторной активации рецепторов медиатором, а отсюда - и вероятность развития десенситизации [30].

Полученные данные позволяют понять, почему длительное время жизни ионных каналов в онтогенезе [Schuetze, Role, 1985] сочетается с низкой активностью АХЭ [Lomo, Slater, 1976]. Очевидно, что в этих условиях даже полное отсутствие АХЭ лишь незначительно скажется на временном ходе ТКП, в отличие от синапсов с быстрыми ионными каналами у взрослых животных.

4.3. Влияние на амплитуду и длительность ТКП веществ, ускоряющих

десенситизации.

Если ДС-ХР действительно способны через связывание АХ повлиять На амплитуду и длительность ТКП, то такая их роль должна усилиться при действии веществ, ускоряющих 'десенситизацию, но к" т-ообных активировать ХР. Для проверки этого предположения проводили эксперимеь

ты с агентом, ускоряющим десенситизацию - проадифеном (SKF-525A) [Магазаник, 1970, Maleque et al., 1983]. Проадифен в концентрации 5"10~® моль/л, не влияющей на параметры МТКП при активной АХЭ, на фоне ингибированной АХЭ приводил к укорочению МТКП, первоначально не влияя на их амплитуду Срис.96) [33,36]. Эффект проадифена значительно усиливался при гиперполяризации мембраны [331, что хорошо объясняется исходя из потенциалозависимости десенситизации [Magazanik, Vyskocil., 1970]. Интересно, что эффект проадифена значительно быстрее развивался у лягушек R.Ridibunda, чем у R.Temporaria [33], что сочеталось с большим замедлением спада МТКП в результате ингибирования АХЭ у последних Срис.9а). Этот факт предполагает большее число предсуществующих ДС-ХР у первого вида лягушек. Наличие предсуществующих ДС-ХР показано у некоторых животных в биохимических исследованиях [Cohén, Strnad, 1987].

CL

Т, %

120 i

100 80 60 40 20 О

5

FLTemporaria

R-Ricfibunde

MUH

R.Ridibunda RTemporaria

o 10 20 зо 40 50 60 70

Рис. 9. Влияние ингибирования АХЭ на постоянную времени спада МТКП С а) и динамика действия проадифена на длительность спада МТКП С б) у двух видов лягушек.

Таким образом,так же, как в опытах с экзогенным АХ, наличие десенситизированных ХР явилось мощным фактором, регулирующим характеристики синаптического сигнала и в первую очередь его длительность, что наиболее выражено при несинхронных открытиях ионных каналов.

Способность ускорять десенситизацию была обнаружена также у ряда других соединений, широко применяемых в экспериментальной и клинической практике: антимитотических агентов винбластина и колхицина [25,28], блокатора кальциевых каналов верапамила [41], активатора аденилатниклазы форсколина [31]. И в этих случаях влияние на длительность МТКП было гораздо более значительным, чем на их амплитуду.

* * *

Результаты, изложенные в данном разделе, хорошо согласуется с представлением Ссхема 2) о существовании высокоаффинной десенситизированной конформации ХР , которое впервые было предложено Katz, Thesleff С1957), а в последующем подтвердилось в биохимических исследованиях [Heidmann, Changeux, 1979]. Линия активации в схеме 2 по сравнению со схемой 1 упрощена.

2АХ + R --- AX2R*

I ]

2АХ + R ---- АХ2Е!Д —* RH

Наши результаты, базируясь на этой модели, могут получить следующую трактовку. Десенситизированные рецепторы (Ид), обладающие высоким сродством к АХ, связывают молекулы свободного медиатора в синаптической щели и прерывают процесс повторной активации свободных рецепторов, что приводит прежде всего к укорочению спада ТКП и последующему падению амплитуды ТКП при более глубокой степени десенситизации. Из десенситизированного состояния предполагается переход в инактивировак.чое CRH) состояние, что означает, по-видимому, необратимое устранение рецепторов из постсинаптической мембраны. Вещества-ускорители десенситизации предпочтительно связываются с Rд формой и сдвигают равновесие между различными кинетическими состояниями ХР в десенситизированное состояние.

Еще более значимой, чем для одиночного ТКП, может быть функциональная роль десенситизации в ходе ритмической серии многоквантовых ТКП, когда высока вероятность повторной активации одних и тех же участков постсинаптической мембраны.

5. РАЗВИТИЕ ПСП И ДЕСЕНСИТИЗАЦШ В ХОДЕ РИТМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СИНАПСА

5'. 1. Постсинаптическая потенциация и десенситизация во время ритмической активности при ингибированной АХЭ.

Оценку развития ПСП и десенситизации и исследование характера их взаимоотношений при ритмической активности первоначально проводили при ингибировании АХЭ, повышающем вероятность развития этих феноменов [19,22]. Во время ритмической активности с частотой 10Гц как амплитуда, так и длительность ТКП первоначально увеличивались, а затем прогрессирующе снижались. Эти эффекты могли отражать последовательное развитие ПСП, а затем десенситизации, но могли быть связаны и с пресинаптическими процессами. Для выяснения причин изменения амплитуды и гткп нами был разработан тест, который заключался в регистрации МТКП в течение 2-5с сразу после короткой (2с), средней С5с) или длинной (60с) пачки ТКП. Оказалось, что после короткой и средней пачки

5.1.1. Влияние длительности ритмической активности.

А, Т

150

100

%

А

50

ЮНг

о

о

100 200 ЗОО с 400

Рис.10. Изменение амплитуды (А) и постоянной времени спада С*) МТКП при ритмической активности синапса на фоне ингибированной АХЭ.

происходило увеличение тмткп(рис. 10). В результате воздействия длинной пачки ТКП происходило снижение амплитуды МТКП (рис. 10). После прекращения ритмической активности так же, как в опытах с экзогенным АХ, наблюдалось продолжающееся укорочение МТКП, несмотря на то, что амплитуда сигналов уже начала восстанавливаться. Это свидетельствует о том, что во время ритмической активности, как и в присутствии свободного агониста, ПСП и десенситизация сосуществуют, а после выключения стимуляции ПСП устраняется быстрее, в отличие от более медленного восстановления чувствительности. Постсинаптическая природа падения амплитуды МТКП, связанная с десенситизацией, подтвердилась в экспериментах с использованием вещества,. ускоряющего десенситизацию -проадифена, который значительно усиливал исследуемый эффект [22].

Таким образом, так же, как в опытах с экзогенным АХ, ПСП и десенситизацию нельзя рассматривать как два строго последовательных процесса, развивающихся в ходе ритмической активности. Эти процессы, имеющие противоположное функциональное значение, развиваются параллельно, но отличаются как скоростью возникновения, так и устранения.

5.1.2. Роль квантового состава ТКП в проявлениях ПСП и десенситизации при ритмической активности.

Поскольку в отдельных синапсах одной мышцы квантовый состав ТКП может значительно различаться (раздел 1), то усредненные данные могли выявить лишь очень выраженные эффекты. Кроме того противоположное влияние ПСП и десенситизации на параметры МТКП могло маскировать их проявления. Поэтому было проведено сопоставление изменений МТКП с величиной вызванной секреции в индивидуальном синапсе. Оказалось (рис.11), что судя по тГ;ГГКП одна и та же длинная пачка в зависимости от квантового состава ТКП способна либо вызывать ПСП (квантовый состав ТКП менее 100), либо не вызывать эффекта (квантовый состав ТКП=100-140), по-видимому, в,результате одновременного развития ПСП и десенситизации, либо приводить к снижению тмткп, т.е. вызывать десенситизацию (квантовый состав ТКП более 140).

Таким образом, в зависимости от величины квантового состава ТКП в одной и той же мышце в наиболее высококвантовых синапсах развивается процесс снижения чувствительности, играющий роль ограничения возбуждения, а в других, наоборот, чувствительность к медиатору возрас-

тает, то есть повышается надежность синаптической передачи. Возможно, эти постсинаптические механизмы являются одной из причин качественно разного поведения разных синапсов одной мышцы в 'ритмическом ряду [Балезина, 1990]. Увеличение длительности периода активности приводит к росту числа синапсов, в которых на смену ПСП приходит противоположный по функциональной роли процесс десенситизации.

5.1.3. Десенситизация в ходе коротких пачек ТКП.

Поскольку физиологическая команда, приходящая к мышце в естественных условиях, представляет собой короткие пачки импульсов [Hennig, Lomo, 1985], интересно было выяснить," сможет ли десенситизация в соответствующих условиях проявиться в ходе пачки ТКП, состоящей всего из нескольких сигналов?

CL

А,%

zoo

150

100

50

б

т ,%

*2с

ЧТ/ 0Р а ■О 5с

** 60с

200

150

1сю

КС

о 100 200 зоо

Рис.11. Влияние квантового состава ТКП и длительности периода активности на амплитуду С а) и постоянную времени спада МТКП С б).

В опытах с проадифеном в ходе пачки ТКП из 15-17 сигналов СЮ Гц) происходило значительное Сдо 25% от исходной) снижение амплитуды ТКП Срис. 12а). Постсинаптическая природа данного явления подтвердилась тем, что эффект был потенциалозависимым, усиливаясь при гиперполяризации мембраны [33,36]. Аналогичное падение чувствительности к АХ в ходе пачки ТКП Срис. 126) вызывало сочетание

условий: повышение концентрации ионов Са2+до 2,5 ммоль/л, повышение температуры до 26°С и гиперполяризация [33,36], а также субстанция Р в концентрации 5-Ю"6 моль/л [47,55]. Кроме того, способность ускорять десенситизацию в ходе короткой пачки ТКП обнаружилась у таких агентов, как блокатор кальциевых каналов верапамил [41] и антимитотические средства винбластин и колхицин [28]. Данные вещества приводили к ускорению десенситизации, вызываемой не только эндогенным, но и экзогенным АХ [28] в условиях его ритмической ионофоретической аппликации из микропипетки.

5.1.4. Сравнение десенситизации в синапсах теплокровных и

холоднокровных.

В синапсах крысы при ингибированной АХЭ уже 5 секундная пачка ТКП Счастота 10Гц) вызывала снижение амплитуды МТКП до 45±6% Сп=6, Р<0,01),.то есть значительно в большей степени, чем у лягушки [49]. Анализ причин этих различий показал, что более быстрое развитие десенситизации на эндогенный АХ в синапсах теплокровных по сравнению с холоднокровными связано не со свойствами холинорецепторов, а зависит от структурно- функциональной организации синапсов теплокровных,

сх б

А,% А,%

Рис. 12. Изменения амплитуды многоквантовых ТКП в присутствии проадифена Са) и при повышении содержания ионов кальция и увеличении температуры Сб).

обеспечивающих большее накопление медиатора в синаптической щели, так как быстрая фаза десенситизации при введении карбахолина или экзогенного АХ в синапсах крысы и лягушки имеет сходную кинетику [49]. Это вполне согласуется с данными, изложенными в предыдущих разделах, свидетельствующих о более благоприятных условиях для накопления эндогенного АХ в синапсах теплокровных и с .данными о сходной скорости десенситизации в синапсах мыши и лягушки [Franke et al., 1991].

5.2. ПСП и десенситизация во время ритмической активности при активной

АХЭ.

Сосуществование ПСП и десенситизации в ходе ритмической активности и зависимость их проявлений от квантового состава ТКП при ингибированной АХЭ привело нас к использованию аналогичного методического подхода и при активной АХЭ. По усредненным данным в 21 синапсе амплитуда МТКП через 60с стимуляции составляла 97,8±3,9% (Р>0,05) от исходной. Однако, при сопоставлении эффекта с уровнем вызванной секреции оказалось, что если при квантовом составе ТКП менее 100 квантов амплитуда МТКП не менялась - 112±7% Сп=12, Р>0,05), то при квантовом составе ТКП более 100 наблюдалось достоверное снижение этого параметра до 85,4±3,l/ÍCn=9, Р<0,01), т.е. развивалась десенситизация.

Этот вывод получил подтверждение и в опытах с использованием проадифена, а также тем, что стимуляция нерва при низком квантовом составе ТКП в магниевом препарате ни в одном из синапсов не меняла параметры МТКП.

У крысы короткая (5 с - 10 Гц) пачка ТКП при активной АХЭ также приводила к небольшому падению амплитуды МТКП [49].

Полученные результаты свидетельствуют о возможности развития десенситизации при активной АХЭ. Это согласуется с аналогичным выводом Magleby и Pallotta С1981), который был сделан на основании экспериментов у лягушки, но, в отличие от наших опытов, при увеличении квантового состава ТКП за счет повышения концентрации ионов кальция в

среде и более высокочастотной стимуляции.

* * *

Таким образом, десенситизация при активной и ингибированной АХЭ может развиваться в ходе ритмической активности синапса и служить

одним из компонентов депрессии синаптической передачи. Одновременное присутствие при этом ПСП может маскировать признаки десенситизации. Разное соотношение ПСП и десенситизации определяется величиной квантового состава ТКП и длительностью периода активности. Десенситизация в соответствующих условиях может развиваться после прохождения всего нескольких ТКП. К числу ускорителей десенситизации относится целый ряд фармакологических агентов, применяемых в качестве лекарственных средств, а также некоторые эндогенные вещества, например, субстанция Р. Исходя из известной зависимости десенситизации [Magazanik, Vyskocil, 1975] и квантового состава ТКП от температуры [22], можно думать, что развитие десенситизации при естественной температуре тела теплокровных еще более вероятно. Кроме того, десенситизация in vivo может быть значительнее и благодаря более высокочастотной естественной импульсации в двигательных нервах [Hennig, Lomo, 1985] и наличию •биологически активных соединений, которые в физиологических концентрациях способны значительно ускорять развитие десенситизации [Rehav et al. , 1987, Mulle et al. , 1988).

6. НЕКВАНТОВАЯ СЕКРЕЦИЯ АХ КАК ФАКТОР, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЙ АМПЛИТУДУ И ДЛИТЕЛЬНОСТЬ СИНАПТИЧЕСКОГО СИГНАЛА.

Способность экзогенного АХ в ■ концентрации. соответствующей расчетному уровню неквантового АХ, влиять на параметры МТКП, позволила нам предположить, что и эндогенный АХ, секретируемый в неквантовой форме, может модулировать функциональное состояние постсинаптической мембраны. Для проверки возможности влияния неквантового АХ на параметры ТКП были проведены эксперименты на диафрагме мыши и крысы, где уровень неквантовой секреции выше, чем у холоднокровных [Vyskocil et al., 1983]. Оценку уровня неквантовой секреции производили по величине "Н-эффекта" - гиперполяризации, возникающей" после введения d-тубокурарина на фоне ингибированной АХЭ [Katz, Miledi, 1977].

6.1. Динамика неквантовой секреции и параметров МТКП.

В первой серии экспериментов выясняли динамику - неквантовой секреции, чтобы сопоставить ее с изменениями параметров МТКП. Оказалось Срис. 13), что на . фоне ингибированной армином АХЭ

Стемпература 20°С, потенциал фиксации -70 мВ) после латентного периода в 60-80 мин неквантовая секреция начинала снижаться вплоть до полного исчезновения к 180 мин [40]. Параллельно с этим происходило укорочение МТКП с <мткп= 5,4 ±0,6 мс до 3,2±0,4 мс Сп=9 синапсов; Р<0,05) [40,58,60,63]. Амплитуда МТКП при этом достоверно не изменялась. Аналогичные данные получены при ингибировании АХЭ прозерином [58,601. Совпадение динамики изменений неквантовой секреции и Тмткп предполагает, что между этими процессами имеется взаимосвязь. Одно из объяснений такой взаимосвязи могло заключаться в том, что неквантовый АХ первоначально вызывает ПСП, которая постепенно устраняется по мере уменьшения уровня неквантовой секреции. Другой механизм мог основываться на развитии десенситизации постсинаптической мембраны за счет постоянного присутствия агониста в синаптической щели.

Для проверки возможности влияния ПСП на длительность МТКП за счет неквантового АХ сравнивали степень первичного замедления спада МТКП

6.4. Способен ли "неквантовый" АХ вызвать ПСП?

6

т мс

"Н", мВ

8

Ю

4

6

4

2

2

О

-J-'-LX-J О

100 150 200 MUH

О

50

Рис. 13. Динамика уровня неквантовой секреции С"Н") и постоянной времени спада МТКП СО.

сразу после ингибирования АХЭ в контроле и при различных способах выключения неквантовой секреции [40,58,60,63,65]. При этом предполагалось, что если неквантовый АХ способен замедлять спад МТКП за счет ПСИ, то в условиях выключения неквантовой секреции степень прироста t^jyj будет меньше. Для выключения неквантовой секреции использовали денервацию in vivo [Никольский и др., 1985], in vitro [Nikolsky et al., 1991], оуабаин [Оранская, 1990] и ионы магния [Zemkova r Vyskocil, 1989]. Из рис 14 следует, что выключение неквантовой секреции АХ с помощью оуабаина, ионов магния, денервации in vitro достоверно не влияли на степень прироста сразу после

ингибирования АХЭ. Наблюдалось лишь незначительное снижение г,_„„ по

мткп

сравнению с контролем, что соизмеримо с величиной ПСП около 10'/., описанной нами при действии экзогенного АХ в "неквантовой" концентрации Сраздел 43.

Согласующиеся с изложенными данными результаты были получены в синапсах крысы, где также наблюдался процесс укорочения МТКП с течением времени. Введение ингибитора транспорта АХ везамикола,

Т

8

б

4

2

О

о 20 180 о 20 180 о 20 180 о 20 180

мин

Рис.14. Динамика изменений длительности МТКП после ингибирования АХЭ в контроле СК) и при воздействиях, .выключающих неквантовую секрецию: действие оуабаина (1), денервация С 2) и действие ионов магния (3).

, МС

к 1 2 3

1 ! 1 1 й ¡ 1 1 1 1 1 ш в I 1

который блокирует неквантовую секрецию АХ [Edwards et al. , 1989], не влияло на fjfpjyj. В контроле f^^ составляла 5,4±0,6 мс и 5,3±0,5 ыс (п=4; Р>0,05) после действия везаыикола.

Таким образом, ПСП за счет неквантового АХ вносит лишь слабый вклад в длительность постсинаптических токов. Следовательно, основная причина укорочения МТКП со временем базируется на развитии десенситизации постсинаптической мембраны.

6.3. Развитие десенситизации за счет неквантового АХ

Наблюдение в динамике за длительностью спада МТКП в условиях, когда выключена неквантовая секреция С с помощью денервации in vivo и in vitro, ионами Mg^+ и оуабаина) позволило установить,1 что во всех четырех случаях устраняется и эффект укорочения, регистрируемый при наличии неквантовой секреции Срис. 14) [40,58,60,63,65]. Кроме того, оказалось, что процесс укорочения МТКП, как и десенситизации [Magazariik, Vyskocil, 1975], явл.тется высоко температуро чувствительным - при 26°С он значительно ускорялся и сопровождался вслед за снижением firrvrT падением амплитуды сигналов [40]. Напротив,

_ MIKll

при 16 С укорочения МТКП в течение 180 мин не наблюдалось. Снижение -с;ггкп развивалось быстрее в тех синапсах, где исходная длительность ЖКП, а следовательно и концентрация эндогенного АХ, была выше. Введение ускорителя десенситизации проадифена вызывало гораздо более быстрое снижение <ткп с последующим падением амплитуды МТКП, чем в отсутствии этого агента. И наконец, усиление неквантовой секреции за счет удаления ионов [Zemkova, Vyskocil, 1989] усиливало и

ускоряло эффект укорочения [58,60].

Итак, все полученные данные однозначно свидетельствовали о том, что неквантовый АХ вызывает появление десенситизированных ХР на постсинаптической мембране и за счет этого приводит к укорочению синаптических сигналов. Это хорошо согласуется с изложенными в разделе 4 наблюдениями о том, что именно длительность МТКП наиболее чувствительна к развитию десенситизации, хотя при более выраженной десенситизации начинает падать и амплитуда сигнала. Накопление десенситизированных ХР первоначально может маскироваться за счет ПСП [40,631, а после выключения неквантовой секреции десенситизация представлена в "чистом виде".

Таким образом, неквантовая секреция АХ является существенным фактором, способным влиять на амплитуду и временной ход ТКП через продуцирование десенситизированных ХР на постсинаптической мембране. Этот эффект неквантового АХ, направленный на увеличение количества десенситизированных ХР в сочетании со способностью последних как "ловушек" [46] улавливать свободный АХ в синаптической щели, может служить компенсаторным механизмом, направленным на устранение избытка медиатора, что особенно важно при разных формах функциональной недостаточности АХЭ [Магазаник и др., 1984, Кривой и др., 1987, Роо et al., 1983, Lomo, Slater, 1976, Vrbova, Vyskocil, 1992]. Поскольку холиномиметики способны подавлять не только вызванную [2,3,5,10] и спонтанную квантовую [6,14,16], но и неквантовую секрецию [Никольский, 1990], возможнр и более сложное участие неквантового АХ в процессах саморегуляции функции синапса. Не исключено, что в условиях сниженной активности АХЭ, после продуцирования "ловушек" на постсинаптической мембране, неквантовый АХ по принципу обратной связи сам же выключает этот дополнительный источник медиатора в синаптической щели, что повышает эффективность "ловушек" в отношении АХ, входящего в состав кванта.

7. БЛОКИРОВАН® ОТКРЫТЫХ П0СТСИНА1ТГИЧЕСКИХ ИОННЫХ КАНАЛОВ, КАК ФАКТОР, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЙ АМПЛИТУДУ И ДЛИТЕЛЬНОСТЬ ТКП.

Описанные в разделе 3 особенности механизмов ПСП у крысы, привели нас к необходимости более детально исследовать механизм блока открытого ионного канала и его влияние на амплитуду и длительность многоквантовых ТКП. Кроме того, требовало специальных исследований выяснение особенностей действия каналоблокаторов на многоквантовые ТКП.

Известно, что многочисленные фармакологические агенты разной химической структуры обладают способностью воздействовать непосредственно на ионный канал ХР [Adams, 1976, Neher, Ste'inbach, 1978, Lambert et al. , 1983, Магазаник, 1986, Скок и др., 1986]. Значительно менее исследована такая возможность для эндогенных биологически активных соединений, хотя сам АХ, по-видимому, способен проявлять свойства быстрого Спо кинетическим свойствам) блокатора ионного канала [Sine, Steinbach, 1984, Ogden, Colquhoun, 1985], a предполагаемый модулятор нервно-мышечной передачи гистамин проявляет свойства медленного блокатора [Ariyoshi et al., 1985].

Для установления основных форм модификации спада ТКП за счет механизма блока открытых ионных каналов первоначально изучали закономерности блокирования ионного канала в гомологическом ряду блокаторов, относящихся к производным оксафосфоланола.

7.1. Закономерности блокирования ионных каналов холинорецептора в гомологическом ряду производных оксафосфоланола.

При исследовании действия на никотиновый холинорецептср малотоксичкых ФОС, синтезированных в ИОФХ им. А.Е.Арбузова, была обнаружена способность производных оксафосфоланола С ПОФ) влиять на временной ход ТКП [45]. Дальнейшее исследование позволило установить, что ПОФ обладают способностью блокировать постсинаптические ионные каналы [45].

Наибольший интерес представляло то, что в гомологическом ряду из 5 представителей ПОФ СПОФ^, П0Ф2, ПОФд, ПОФд, П0Ф5Э, отличающихся друг от друга на одну метиленовую группу, получены все три возможных варианта блокирования открытого ионного канала [45]. Первый ПОФ^ проявлял свойства быстрого блокатора, замедляя спад ТКП, П0Ф2, ПОФд и ПОФд приводили к появлению двухфазного спада ТКП, который представлял сумму двух экспонент, а П0Ф5 приводил к укорочению спада ТКП, причем спад, как и в контроле, аппроксимировался одной экспонентой [45]. Несмотря на многообразие внешних проявлений, все варианты модификации спада ТКП можно было описать простой последовательной моделью блокирования ионного канала [Adams, 197S, Neher, Stelnbach, 1978]. которая требует введения всего одной дополнительной стадии в кинетическую схему 1:

kl k2 „ ck3 '

АХ + R —► AXjR + AX •*-* AX2R* + В AX2R*B C3)

k-l -k-2 k-3

где В - молекула блокатора, AXgR*B - комплекс с открытым, но непроводящим Сблокированным) состоянием канала, kg - константа скорости блокирования, к_3 - константа скорости деблокирования, с -концентрация блокатора. Остальные обозначения те же, что и на схеме 1.

Благодаря использованию гомологического ряда путем экстраполяции удалось получить [45] значения констант скоростей блокирования для

быстрого. СПОФ^) и деблокирования для медленного (ПОФ^Э блокаторов, для которых эти параметры не удается измерить в эксперименте. Оказалось, что кд не зависит, а к_д существенно уменьшается с каждой новой метиленовой группой, включенной в структуру блокатора, что коррелировало с растущей в этом ряду гидрофобностью соединений, оцениваемой по коэффициенту Обертона- Мейера [45].

Исходя из уменьшающейся в ряду ПОФ константы скорости деблокирования канала, в этом же ряду можно было ожидать нарастания способности подавлять амплитуду многоквантовых ТКП во время ритмической стимуляции за счет кумулятивного постсинаптического блока. Эксперименты полностью подтвердили это предположение. ПОФ^ не влиял на динамику амплитуд ТКП при частоте стимуляции 10Гц, а ПОФд вызывал депрессию амплитуд последовательных ТКП. По внешним проявлениям эффект кумулятивного « блока каналов совпадал с результатом действия веществ-десенситизаторов в условиях-ритмической активности (раздел 5). Однако две эти группы веществ имеют разные молекулярные механизмы действия. В случае блока ионного канала (схема 3) вещество-блокатор связывается с ХР с открытым ионным каналом (.КХ.^Ъ*'), переводя его в блокированное состояние (АХ21?*В), а вещество-десенситизатор связывается с закрытой конформацией ХР (схема 2), стабилизируя его в десенситизированном состоянии (Ид). Критерием различия в механизмах действия этих веществ может быть то, что десенситизаторы в концентрациях, вызывающих блок при ритмической подаче АХ, не влияют ни на т^^, ни на потенциалозависимость спада МТКП [33,36]. Блокаторы же приводят к укорочению ТКП в тех же концентрациях [45], в которых вызывают блок при ритмической активности синапса.

7.3. Влияние на параметры ТКП быстрого блокатора дипироксима.

Быстрый потенциалозависимый блок ионного канала ХР является наименее изученным кинетическим вариантом блока [Нигматуллин и др. , 1988]. Вместе с тем, для нас этот тип блока представлял интерес в связи с гипотезой о способности эндогенного АХ потенциалозависимым образом блокировать открытый ионный канал [61].

Нами [24,29,43] было обнаружено, что реактиватор АХЭ дипироксим (ТМБ-43 вызывает следующие изменения амплитуды и длительности ТКП: продление спада ТКП с сохранением экспоненциальности в широком диапазоне изменений мембранного потенциала; пропорциональное продлению

спада падение амплитуды ТКП; сохранение переносимого в ходе МТКП заряда; изменение вольтамперной характеристики ТКП с областью "отрицательной проводимости"; увеличение коэффициента

потенциалозависимости спада МТКП "Н"; увеличение кажущегося времени открытого состояния ионного канала при анализе АХ-шума; отсутствие эффекта ct-БТ на временной ход МТКП, продленный дипироксимом. Все эти данные полностью соответствовали теоретическому описанию действия быстрого потенциалозависимого блока каналов [Ререг el al. , 1982, Нигматуллин и др., 1988]. Получено [43] полное соответствие экспериментальных-данных с математической моделью МТКП [Магазаник и др., 1986], включающей стадию блока ионного канала (схема 3).

При сравнении эффекта дипироксима в синапсах крысы и лягушки оказалось, что при одинаковой температуре и потенциале фиксации, у крысы требуется гораздо меньшая концентрация дипироксима для осуществления такой же степени замедления спада ТКП, как у лягушки [24,303. То есть у теплокровных быстрый блок канала осуществляется более эффективно, что, по-видимому, объясняется разным сродством места связывания на ионном канале к блокатору у этих животных. Интересно, что и АХ, проявляющий свойства быстрого блокатора открытых ионных каналов [Sine, Steinbach, 1984], как и дипироксим, в синапсах крысы как блокатор более эффективен, чем у лягушки [Colquhoun et al., 1989]. Приведенные данные являются дополнительными аргументами в пользу гипотезы о возможной реализации каналоблокирующего эффекта самого АХ в ходе многоквантовых ТКП у крысы при ингибированной АХЭ (раздел 3).

7.5. Зависимость проявления блока ионного канала от квантового

состава ТКП

То, что во время генерации многоквантового ТКП может происходить изменение временного хода концентрации эндогенного АХ, предполагает, что при этом могут меняться эффекты экзогенных блокаторов открытых ионных каналов.

В связи с этим, действие хорошо изученных на примере низкоквантовых ТКП блокаторов ионных каналов атропина и QX-314 [Katz, Miledi, 1973, Feltz et al. , 1977, Adler, Albuquerque, 1976] было исследовано нами в опытах с многоквантовыми ТКП. В контрольной серии подтвердилось, что медленный блокатор атропин в соответствии с кинетической характеристикой блока вызывал ускорение спада МТКП и

низкоквантовых ТКП с сохранением его моноэкспоненциальности, что соответствует приведенным данным литературы. Однако при регистрации многоквантовых ТКП (квантовый состав более 100), атропин в той же концентрации (5-10~^ моль/л) вызывал появление второй, более медленной экспоненты в спаде ТКП. Относительная амплитуда второй экспоненты составила 9,7%, а постоянная времени спада - 12,0±0,8мс (п=12).

Ингибирование АХЭ, в еще большей степени увеличивающее концентрацию АХ, повышало амплитуду второй экспоненты до 25,0%. Другие способы увеличения концентрации АХ (парная стимуляция в условиях вызывающих ПСП "во времени"; добавление экзогеннного АХ; генерация МТКП-гигантов) также повышали амплитуду и несколько замедляли постоянную времени спада второй экспоненты. Аналогичные- данные получены с медленным блокатором ОХ-314.

Следовательно, характер вызываемого блокатором изменения временного хода ТКП зависит от концентрации и длительности действия АХ в синаптической щели. Одновременно это подтверждает ранее сделанный вывод о постсинаптическом взаимодействии квантов АХ на фоне активной АХЭ при физиологическом уровне секреции, меняющем временной ход

концентрации АХ в синаптической щели.

* * *

Таким образом, особенности действия блокаторов открытых ионньо каналов при физиологическом уровне секреции базируются на высокой вероятности повторного попадания квантов на один и тот же участок постсинаптической мембраны, что создает основу для кумулятивного постсинаптического блока каналов в ходе ритмической активности, который отличается от аналогично проявляющейся десенситизации изменениями кинетики ионных каналов. Повышенная концентрация АХ, создающаяся за счет ПСП, может изменять проявления блока канала, в ходе одиночного ТКП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование амплитудно-временных характеристик ТКП в условиях, когда сохранен высокий уровень вызванной секреции медиатора из нервньи окончаний, позволило описать основные факторы, участвующие в генерации одиночного многоквантового ответа, и на основе этого провести анализ

более сложных форм активности синапса, какими являются ритмические серии многоквантовых ТКП.

Нами установлено, что асинхронность секреции квантов медиатора из двигательного нервного окончания при генерации одиночного многоквантового ТКП не выше, чем у низкоквантового ТКП. Результаты проведенного в работе моделирования, в сочетании с экспериментальными данными, свидетельствуют о том, что фактор асинхронности не влияет на длительность спада одиночного многоквантового ТКП, но увеличивает время роста ТКП и снижает его амплитуду. По полученным оценкам, эффект снижения амплитуды многоквантового ТКП из-за асинхронности составляет около 23%. Эта разница между амплитудой реального сигнала и амплитудой модельного ТКП, полученного для случая с абсолютно синхронным выделением квантов, отражает сбалансированность между кинетикой секреции и длительностью одноквантовых ТКП, из которых формируется многоквантовый ответ. В работе количественно описано, как меняется амплитуда ТКП при вариациях как того, так и другого параметра.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что для поддержания высокого гарантийного фактора синаптической передачи необходимо соблюдение определенных соотношений между кинетикой пре- и постсинаптических событий. В связи с этим, интерес представляет и оценка надежности пресинаптических механизмов, обеспечивающих синхронность во время массированного выделения медиатора. Выяснилось, что блокирование потенциалозависимых калиевых каналов нервных окончаний, приводящее к затягиванию фазы реполяризации пресинаптического ПД, не сказывается на временном ходе низкоквантовых ТКП, но вызывает разнообразные проявления асинхронности в случае многоквантовых ТКП. Это является, по-видимому, свидетельством высокой нагрузки на пресинаптические механизмы, обеспечивающие синхронность при массированном выделении квантов АХ. В пользу такого заключения говорит и то, что асинхронность секреции во время ритмических серий многоквантовых ТКП возрастала тем сильнее, чем выше был исходный квантовый состав ТКП. Данный механизм может служить причиной дополнительного Спомимо известного эффекта снижения квантового состава) угнетения синаптической передачи во время ритмической активности.

В Уионевральном синапсе, одном из наиболее быстрых синапсов в организме, высокая степень синхронности секреции АХ должна, очевидно, сочетаться с соответствующей кратковременностью протекания

г.остсинаптических событий. В ограничении длительности постсинаптического тока в фазных мышцах традиционно предполагалась ведущая роль фермента АХЭ и быстрой кинетики ионных каналов. Однако наши данные, полученные при анализе многоквантовых ТКП, как и данные других авторов, базирующиеся на изучении одноквантовых ответов [Магазаник и др., 1984, Кривой и др., 1987], ' позволяют подвергнуть сомнению представление об избыточности АХЭ в синапсе. Нами показано, что если квантовый состав ТКП превышает определенный и разный для разных животных уровень, то кванты медиатора при активной АХЭ взаимодействуют на прилегающих участках постсинаптической мембраны, что приводит к локальному увеличению концентрации АХ. Эти вариации временного хода концентрации АХ .повышают вероятность повторной активации рецепторов, что проявляется в продлении спада ТКП, то есть развивается постсинаптическая потенциация, описанная ранее только при ингибированной АХЭ [Hartzell et al., 1975]. Молекулярной основой этого феномена являются, по-видимому, особенности кинетики холинорецептора и, в частности, необходимость двух молекул- АХ для открытия ионного канала [Hartzell et al., 1975, Dreyer et al., 1979, Peper et al., 1982].. Возникающее в результате потенциации продление спада многоквантового ТКП будет увеличивать амплитуду соответствующего потенциала концевой пластинки [Gage, 1976], то есть повысит надежность синаптической передачи при меньшем числе выделенных квантов. Однако значительное продление одиночного ответа в условиях высокочастотной естественной активности [Hennig, Lomo, 1985] может быть причиной нарушений проведения ритмических серий сигналов [Магазаник и др., 1984].'Можно думать, что в этом случае особое значение приобретает наличие дублирующих механизмов, способных уменьшить вероятность повторной активации рецепторов. Согласно нашим данным, эффективную роль ограничения длительности ТКП, наряду с известной функцией АХЭ, могут выполнять десенситизированные рецепторы. Нами установлено, что в отсутствие гидролиза АХ небольшое число десенситизированных рецепторов может в значительной степени нормализовать длительность синаптических сигналов, незначительно влияя на их амплитуду. В основе эффекта десенситизированных рецепторов лежит, по-видимому, их способность к высокоаффинному связыванию АХ в синаптической щели, что подтверждается биохимическими исследованиями [Heidmann, Changeux, 1979]. Очевидно, что такая роль десенситизированных рецепторов как "ловушек" для свободного АХ будет особо возрастать при физиологических

Полю, Slater, 1976, Poo et al., 1985, Vrbova, Vyskocil, 19921 и патологических [Engel et al., 19811 формах функциональной недостаточности АХЭ, а также при отравлениях ингибиторами АХЭ [Прозоровский, Саватеев, 19761.

В настоящей работе исследован ряд механизмов, способных привести к появлению десенситизированных рецепторов на постсинаптической мембране. Впервые установлен факт, что их появление может происходить даже в отсутствие импульсной активности - за счет эндогенного АХ, секретируемого в неквантовой форме! Такой механизм саморегуляции параметров синаптических сигналов, наблюдаемый на фоне блокированного гидролиза АХ может объяснить необходимость существования этой формы секреции медиатора, которая составляет до 96% АХ, выделяемого в покое [Vyskocil et al., 19831. Способность неквантовой секреции при нативной АХЭ достигать постсинаптической мембраны ярко проявляется в раннем синаптогенезе [Роо et al. , 19851 и в постнатальном периоде [Vrbova, Vyskocil, 19921, но влияние ее на постсинаптическую мембрану есть и у взрослых животных [Воронин, 19851. Возможно, эффект неквантового АХ -основная причина обнаружения так называемых "предсуществующих" десенситизированных рецепторов [Cohen, Strnad, 19871.

Кроме того, в работе показана способность влиять на временной ход ТКП за счет десенситизации у целого ряда веществ-десенситизаторов, не обладающих агонистической активностью, в число которых входят и вещества эндогенного происхождения.

Роль фактора десенситизации, как установлено в настоящем исследовании, еще более возрастает во время ритмической серии многоквантовых ТКП. В этом случае десенситизация за счет эндогенного АХ проявляется в виде кумулирующегося постсинаптического блока, приводящего к депрессии синаптических сигналов. Эффект накапливается при ритмической серии дискретных сигналов и сохраняется после их окончания в течение нескольких десятков секунд, то есть является формой кратковременной пластичности [Zucker, 19891. Развитие десенситизации в ходе ритмической активности наблюдалось нами только при высоком, близком к физиологическому, уровне квантового состава ТКП. Это объясняет, почему данный феномен не был обнаружен при сниженном уровне квантового состава, когда низка вероятность повторной актизации одних и тех же участков постсинаптической мембраны [Bennett, Florin, 1974, Magazanik, Vyskocil, 19761. В условиях высокого квантового состава ТКП нами показана возможность реализации и другого

механизма кумулирующегося постсинаптического блока - за счет взаимодействия медленных блокаторов с открытым ионным каналом холинорецептора. Такой механизм представляет особый интерес в связи с тем, что один из предполагаемых модуляторов нервно-мышечной передачи гистамин проявляет способность блокировать ионный канал холинорецептора [Ariyoshi et al., 1985].

Наиболее ярко десенситизация проявляется при ингибированной АХЭ, но наблюдается в наиболее высококвантовых синапсах лягушки- и в синапсах крысы и при активной АХЭ. На фоне ингибированной АХЭ десенситизация у теплокровных развивается значительно быстрее, чем у амфибий. Проведенный анализ показал, что это связано не со свойствами самих рецепторов, а со структурно-функциональными особенностями синапса теплокровных, обеспечивающими более продленный временной ход концентрации АХ в синаптической щели. Этот вывод подтвердился и значительно более выраженными проявлениями постсинаптического взаимодействия квантов АХ у этих животных. В связи с этим возникает предположение о большей функциональной значимости фермента АХЭ у теплокровных животных, по сравнению с холоднокровными. Возможно, у них следует ожидать и более выраженной функциональной роли десенситизации в естественных условиях, поскольку ín vivo проявлениям этого эффекта будет способствовать повышение квантового состава [Каменская, 1976], более высокочастотнаяимпульсацияСНепгйд, Lomo, 1985], температурная зависимость самого молекулярного механизма десенситизации [Magazanik, Vyskocil, 1975] и присутствие эндогенных веществ-десенситизаторов СRehav et al., 1987, Mulle et al., 1988].

Наряду с десенситизацией при ритмической серии многоквантовых ТКП нами впервые описано развитие и постсинаптической потенциации как следового процесса Спотенциация "во времени"), что позволяет и это явление отнести к формам кратковременной постсинаптической пластичности синапса. Так же как потенциация, проявляемая в ходе одиночного сигнала Спотенциация "в пространстве"), потенциация "во времени" имеет функциональную направленность, противоположную процессу десенситизации. Проведенный нами анализ показал, что постсинаптическая потенциация "во времени" связана со способностью комплексов холинорецептор-одна молекула АХ длительно Сдо десятков секунд) сохраняться после прекращения активности. Постсинаптическая потенциация, так же как десенситизация, сильнее проявляется при блокировании гидролиза медиатора, но имеет место и при активной АХЭ. В

работе установлено, что эти-два феномена, как правило сосуществуют, оба они связаны с разными закрытыми состояниями рецепторно-канального комплекса, однако после прекращения ритмической активности потенциация устраняется быстро, в отличие от более медленного восстановления чувствительности. С функциональной точки зрения представляет интерес' тот факт, что один и тот же режим активности в синапсах с более низким исходным квантовым составом вызывает потенциацию, а в высококвантовых десенситизацию. Это может служить одним из механизмов неодновременного вовлечения мышечных волокон в процесс поддержания силы мышечных сокращений [Балезина, 1990].

Таким образом, установленные в работе механизмы постсинаптической пластичности могут реализовать как эффект повышения эффективности синаптической передачи за счет потенциации, так и угнетение передаточной функции синапса в результате развития десенситизации. Они наиболее ярко проявляются при.инактивации АХЭ, но имеют место и при активной АХЭ, дополняя такие известные пресинаптические формы кратковременной пластичности как облегчение и депрессию освобождения АХ CKatz, 1966, Zucker, 1989]. В основе постсинаптической пластичности лежат, очевидно, вариации временного хода концентрации эндогенного АХ квантового и неквантового происхождения и соответствующие переходы между различными конформационными состояниями холинорецептора. На основании настоящего исследования можно говорить о том, что модуляция синаптической передачи во время ритмической активности в зависимости от конкретных условий Спредшествующей активности, функционального состояния АХЭ, величины квантового состава, частоты и длительности стимуляции, наличия веществ-регуляторов) может представлять собой сложное явление, в котором взаимодействуют как пресинаптические, так и постсинаптические факторы.

Совокупность представленных данных позволяет сформулировать концепцию, согласно которой генерация токов концевой пластинки, входящих в ритмическую серию сигналов, зависит от исходного уровня квантового состава, кинетики секреции медиатора и от сложившейся к началу активности определенной функциональной настройки постсинаптической мембраны, основанной на балансе между различными кинетическими состояниями холинорецептора, а также от реализации пре-и постсинаптических механизмов кратковременной пластичности в ходе выполнения двигательной команды.

ВЫВОДЫ

1. Неодновременность секреции квантов АХ (асинхронность) является фактором, увеличивающим время роста, снижающим амплитуду, но не влияющим на длительность спада одиночного многоквантового ТКП. Влияние асинхронности на амплитуду ТКП возрастает при снижении длительности одноквантовых ответов, из которых формируется многоквантовый ТКП. Для сохранения высокой надежности синаптической передачи требуется сохранение определенного соотношения между кинетикой секреции и длительностью одноквантового ответа.

2. Во' время ритмической серии многоквантовых ТКП происходит усиление асинхронности секреции квантов АХ. Эффект нарастает тем быстрее, чем выше исходный квантовый состав ТКП. Усиление асинхронности коррелирует с увеличением длительности пресинаптического ПД. Нарастающая асинхронность является одним из компонентов депрессии амплитуды ТКП во время ритмической активности.

3. Затягивание фазы реполяризации пресинаптического ПД за счет блока потенциалозависимых калиевых каналов'не"влияет на временной ход низкоквантового ТКП, но изменяет временной ход многоквантового ТКП в результате усиления асинхронности квантовой секреции. Проявления асинхронности выражаются увеличением времени роста ТКП и нарушением экспоненциального характера спада одиночного ТКП.

4. Постсинаптическая потенциация является фактором, приводящим к замедлению спада одиночного ТКП при активной АХЭ в случае превышения определенного критического уровня секреции медиатора. Взаимодействие квантов на постсинаптическом уровне, лежащее в основе постсинаптической потенциации Спотенциация "в пространстве"), усиливает повторную - активацию холинорецепторов медиатором.

5. Вероятность повторной активации холинорецепторов медиатором находится в обратной зависимости от времени жизни ионных каналов холинорецептора, о чем свидетельствует тот факт, что при ингибированной АХЭ различные способы увеличения времени жизни каналов (охлаждение, гиперполяризация, этанол) значительно менее эффективны в замедлении спада одиночного ТКП, чем при активной АХЭ.

6. Постсинаптическая потенциация проявляется в виде замедления спада последовательных ТКП (постсинаптическая потенциация "во времени"), при ритмической стимуляции с интервалом, превышающим длительность одиночного ТКП, то есть является механизмом кратковременной постсинаптической пластичности синапса, направленным

на повышение эффективности синаптической передачи. После^ийтибирования АХЭ время сохранения этой следовой постсинаптической реакции возрастает до десятков секунд.

7. Постсинаптическая потенциация "во времени" усиливается при понижении температуры и не зависит от мембранного потенциала и плотности холинорецепторов. Она не связана с прямым участием в этом процессе десенситизированных холинорецепторов. Молекулярную основу постсинаптической потенциации составляют длительно существующие комплексы холинорецептор - одна молекула АХ.

8. Наличие десенситизированных ХР является важным фактором эграничения повторной активации ХР за счет связывания свободного АХ в синаптической щели, что приводит к укорочению синаптических сигналов. Роль этого фактора резко возрастает при функциональной недостаточности АХЭ. Десенситизированные холинорецепторы способны гораздо более эффективно уменьшать вероятность повторной активации ХР и снижать длительность ТКП, чем необратимо блокированные сб-бунгаротоксином.

9. Степень развития десенситизации определяет скорость и зероятность восстановления амплитуды и длительности одиночного синаптического сигнала после удаления агониста. При достижении определенной глубины десенситизации развивается агонист-яндуцированная необратимая инактивация ■ холинорецепторов, что одтверадаетсяснижением амплитуды интегрального тока при повторных введениях агониста.

10. Постсинаптическая потенциация и десенситизация развиваются параллельно при действии экзогенного АХ или в результате накопления эндогенного АХ во время ритмической активности синапса. Удаление экзогенного АХ или прекращение ритмической стимуляции быстро устраняет ютенциацию и более медленно - десенситизацию. В коротких ритмических сериях ТКП преобладают проявления потенциации, а в длинных сериях :ризнаки потенциации маскируются за счет выраженной десенситизации. )дин и тот же режим ритмической активности способен в зависимости от свантового состава вызывать потенциацию или С в высококвантовых синапсах) - десенситизацию.

И. Десенситизация становится ведущим фактором депрессии амплитуд оюгоквантовых ТКП в коротких ритмических сериях ТКП, аналогичных ¡вигательной команде мотонейрона при действии экзогенных (проадифен, зинбластин, верапамил, форсколин) и эндогенных (субстанция Р) зеществ-десенситизаторов. Десенситизация является противоположным по

функциональному значению механизмом кратковременной постсинаптической пластичности, по сравнению с постсинаптической потенциацией.

12. АХ, выделяемый в неквантовой форме, вызывает укорочение одиночных синаптических сигналов за счет развития десенситизации в синапсах с низкой активностью АХЭ. Этот эффект возрастает при воздействиях, способствующих ускорению развития десенситизации и повышающих уровень неквантовой секреции. Выключение неквантовой секреции " ионами магния, оуабаином, денервацией устраняет эффект укорочения синаптических сигналов. Постсинаптическая потенциация за счет неквантового АХ выражена слабо.

13. Блокирование открытых постсинаптических ионных каналов вызывает различные изменения в фазе спада одиночного ТКП (замедление, двухфазный спад и ускорение спада) в зависимости от значений константы скорости деблокирования канала, меняющейся в исследованном гомологическом ряду нейтральных~ блокаторов. Это сопровождается усилением способности вызывать кумулятивный постсинаптический блок во время ритмической активности синапса. Проявления каналоблокирующего эффекта на временной ход одиночного ТКП зависят от уровня вызванной секреции медиатора.

14. У теплокровных, по сравнению с холоднокровными, в условиях сниженной активности АХЭ более выражены проявления постсинаптической потенциации и десенситизации. Это связано с особенностями структурно-функциональной организации синапсов теплокровных, обеспечивающими более продленный временной ход концентрации АХ в синаптической щели. Функциональная значимость АХЭ выше в синапсах теплокровных, чем холоднокровных.

15. Нервно-мышечные синапсы холоднокровных и теплокровных обладают способностью проявлять постсинаптическую пластичность в ходе выполнения двигательных команд, выраженность которой определяется уровнем квантового состава, активностью АХЭ, частотой и продолжительностью периода активности.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

.. Волкова И.Н., Волков Е.М., Гиниатуллин P.A. и др. Особенности зункциональной организации синаптических аппаратов фазной мышцы гягушки // Тез. докл. XIII Всесоюз. съезда физиол. об-ва им. I. П.Павлова, Алма-Ата, 1979.- С. 89-90.

Волкова И.Н., Никольский Е.Е. . Гиниатуллин P.A. Пре- и юстсинаптический компоненты в действии карбахолина на нервно-мышечный грепарат // Нейромедиаторы в норме и патологии: Тез. докл. Всесоюз. :импоз. - Казань, 1979.- С.76-77.

¡. Никольский Е.Е., Гиниатуллин P.A. Прекращение пресинаптического (ействия карбахолина тубокурарином // Бюлл. эксперим. биологии и (едицины. - 1979,- 87, N 2. - С. 171-174.

[. Волкова И. Н. , Гиниатуллин P.A., Никольский Е. Е., Полетаев Г. И. {еханизм декураризирующего действия холина // Физиология и биохимия (едиаторных процессов: Тез. докл. III Всесоюз. конфер.- Москва, 1980.:. 49-50.

S. Волкова Vi. Н. , Никольский Е.Е., Гиниатуллин P.A. Связано ли [ресинаптическое действие карбахолина. с активацией постсинап-•ической мембраны? //.Бюлл. эксперим. биологии и медицины.- 1981,- 91, I 4,- С. 393-396.

¡. Никольский Е.Е., Гиниатуллин P.A. Механизм действия карбахолина на шонтанное освобождение медиатора из моторных нервных окончаний // 'ез. докл. I Всесоюз. биофизического съезда.- Москва, 1982.- т.2. -!. 106.

'. Волкова И.Н., Ахтямова Д.А., Воронин В.А., Гиниатуллин P.A., 1ефиров А.Л., Никольский Е.Е. Регуляция освобождения медиатора в :ервно-мышечном синапсе // Тез. докл. XIV съезда Всесоюз. физиол. |бщ-ва им. И.П.Павлова.- Баку, 1983,- т.1,- С.53.

1. Магазаник Л.Г., Никольский Е.Е., Гиниатуллин P.A. Зависимость корости спада токов концевой пластинки от величины квантового состава предшествующей синаптической активности // Докл.АН СССР,- 1983,71, N 3.- С. 489-492.

L Гиниатуллин P.A. Никольский Е.Е. Влияние холина на функцию пре- и остсинаптических структур мионеврального соединения лягушки //В кн: Физиология медиаторов. Периферический синапс",- Тез. докл. Всесоюз. импоз.- Казань, 1984,- С. 67-68.

0. Никольский Е.Е., Гиниатуллин P.A. Пресинаптическое действие

карбахолина на нервно-мышечный препарат лягушки после перерезю двигательного нерва // Докл. АН СССР.- 1984.- 284. N 6. - С. 250-252.

11. Магазаник Л.Г. Гиниатуллин P.A. Зависимость постсинаптическо{ потенциации в нервно-мышечном синапсе лягушки от уровня мембранногс потенциала и температуры // В кн: "Физиология медиаторов. Периферический синапс".- Тез. докл. Всесоюз. симпоз., Казань, 1984, С. 146-148.

12. Magazanik L.G. , Nikolsky Е. Е.", Giniatullin R. A. End-plate currents evoked by paired stimuli in frog muscle fibres // Pflugers Arch. -1984. - 4QL' N 1. - P. 185-192.

13. Magazanik L. G. , Fedorov V. V. , Giniatullin R.A. , Nikolsky E.E. , Snetkov V.A. Functional role of Cholinesterase in different types of neuromuscular junction // Cholinesterases. - Berlin - New York: Walter de Gruyter, 1984.- P. 229-242.

14. Бухараева Э.A., Никольский E.E., Гиниатуллин P.A. Оуабаин снимает угнетающее действие карбахолина на спонтанное квантовое освобождение медиатора в нервно-мышечном соединении лягушки // В кн: "Физиология и биохимия медиаторных процессов". - Тез. докл. IV Всесоюз. конфер,-Москва, 1985.- С. 55-56.

15. Магазаник Л.Г., Волкова И.Н., Гиниатуллин P.A., Хазипов Р.Н. Влияние этанола на постсинаптическую потенциацию в нервно-мышечном синапсе лягушки // В кн: "Физиология и биохимия медиаторных процессов".- Тез. докл. IV Всесоюз. конфер.- Москва, 1985,- С. 200.

16. Бухараева Э.А., "Никольский Е.Е., Гиниатуллин P.A. Влияние холинергических соединений на спонтанное квантовое освобождение медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки // Нейрофизиология.-1986. - 18, N 5. - С. 586-593.

17. Магазаник Л.Г., Гиниатуллин P.A., Никольский Е.Е., Снетков В.А., Федоров В.В. Исследование механизмов постсинаптической потенциации в нервно-мышечном синапсе // В кн: "Актуальные проблемы современной физиологии",- Киев, 1986.- С. 15-17.

18. Гиниатуллин P.A., Бальцер С.К. Зависимость эффекта винбластина на нервно-мышечную передачу от синаптической активности // Тез. докл. Всесоюз. конф. по нейронаукам.- Киев, 1986.- С. 73-74.

19. Гиниатуллин Р.А., Бальцер С.К., Никольский Е.Е., Магазаник Л.Г. Исследование постсинаптической потенциации и десенситизации в мионевральном синапсе лягушки, вызванных ритмической стимуляцией двигательного нерва // Тез. докл. Всесоюз. конф. по нейронаукам.-

Киев, 1986,- С. 74-75.

20. Магазаник Л.Г., Гиниатуллин Р. А. Влияние изменений мембранного потенциала и температуры на постсинаптическую потенциацию в нервно-мышечном соединении лягушки // Нейрофизиология.- 1986.- 18, N 4,- С. 512-518.

21. Khamitov Kh.S. , Nikolsky Е. Е. , Bukharaeva Е. А. , Giniatullin R.A. Effects of cholinergic drugs on spontaneous quantal transmitter release at the frog neuromuscular junction // Molecular basis of neural function CEd. S.Tucek, S.Stupek, F.Stastny, J.Krivanek)- Abstr. Gen. Meet. ESN. - Prague, 1986,- P. 142.

22. Гиниатуллин P. A., Бальцер С. К. , Никольский Е.Е., Магазаник Л. Г. Исследование постсинаптической потенциации и десенситизации в мионевральном синапсе лягушки, вызванных ритмической стимуляцией двигательного нерва // Нейрофизиология.- 1986.- 18, N 5.- С. 645-654.

23. Гиниатуллин Р.А., Магазаник Л.Г., Швецов А.Б. Особенности временного хода многоквантовых токов концеьой пластинки, выявляемые ингибированием ацетилхолинэстеразы // Доклады АН СССР.- 1987.- 297, N 1,- С. 128- 130.

24. Гиниатуллин Р.А., Шабунова И.А., Никольский Е.Е., Бухараева Э.А. Дипироксим как блокатор ионных каналов, активируемых ацетилхолином, 'в скелетной мышце крысы // Бюлл. эксперим. биологии и медицины.- 1987.-97, N 6,- С. 690-692.

25. Гиниатуллин Р.А., Швецов А.Б., Талантова М.А. Особенности функционирования холинергического синапса -после нарушения гидролиза медиатора // В кн.: "Вопросы нейробиологии". - Казань, 1987.- С. 21-28.

26. Никольский Е.Е., Гиниатуллин Р.А., Бальцер С.К., Бухараева Э.А. , Воронин В.А., Оранская Т. И. Пре- и постсннаптические эффекты медиатора, накапливающегося в ходе ритмической активности холинергического синапса // Тез. докл. XV съезда Всесоюз. физиологического общества им. И.П.Павлова.- Кишинев, 1987.- С. 208-209.

27. Волкова И.Н. , Гиниатуллин Р.А., Хазипов Р.Н. , Швецов А.Б. Изменения функциональных свойств- пре- и постсинаптической мембраны под влиянием выделенного в синаптическую щель ацетилхолина // Тез. докл. Всесоюз. конф. по вегет. нервной системе,- Куйбышев,- 1988,- С. 86.

28. Гиниатуллин Р.А., Бальцер С.К., Волков Е.М. Влияние винбластина и колхицина на постсинаптическую мембрану мионеврального соединения лягушки // Нейрофизиология,- 1988.- 20, N 1,- С. 75-81.

29. Гйниатуллин P.А., Шабунова И.А., Никольский Е.Е., Бухараева Э.А Реактивирующее и холинолитическое действие дипироксима в мионеврально: синапсе теплокровных // Нейрофизиология.- 1988.- 20. N 3.- С

-351-357.

30. Гиниатуллин Р.А., Хазипов Р.Н. Роль плотности холинорецепторов механизмах замедления спада постсинаптического тока // Бюлл. эксп биологии и медицины.- 1988. - N 8.- С. 134-136.

31. Гиниатуллин Р.А., Хазипов Р.Н., Волков Е.М. Усилени десенситизации, возникающей в ходе ритмической активности синапса активатором аденилатциклазы форсколином // Тез. докл. Всесоюз. конф по нейронаукам.- Киев, 1988,- С. 22-23.

32. Гиниатуллин Р.А., Хазипов Р.Н., Хамитов.X.С. Сравнение действи гиперполяризации и этанола на токи концевой пластинки лягушки пр: различной плотности холинорецепторов // Нейрофизиология. - 1988.- 20 N1.- С. 128-130.

33. Giniatullin R.А., Khamitov Kh.S. , Khazipov R. , Magazanik L.6. Nikolsky E.E., Sneikov V.A., Vyskocil F. Development о desensltization during repetitive end-plate activity and singl end-plate currents in frog muscle // J. Physiol. (London).- 1989. 412. - P. 113-122.

34. Гиниатуллин P.А., Нигматуллин H.P., Никольский E.E. Анали действия дипироксима на ионные каналы холинорецептора: модификация ил быстрый блок канала? // Тез. докл. Всесоюз. симпоз. "Одиночные ионны каналы в биомембранах".'- Пущино, 1989.- С. 75.

35. Гиниатуллин Р.А., Хазипов Р.Н., Хамитов X.С. Десенситизаци никотиновых холинорецепторов в ходе ответа на одиночный кван ацетилхолина // Тез. докл. Всес. симп. "Одиночные ионные каналы биомембранах".- Пущино, 1989.- С. 26.

36. Гиниатуллин Р.А., Хазипов Р.Н. Развитие десенситизации пр ритмической активности синапса и в ходе генерации одиночного сигнал // Бюлл. эксп. биологии и медицины,- 1989, N12.- С. 654-657.

37. Magazanik L.G., Giniatullin R.A. Postsynaptic potentiation as short-term form of memory // Fundamentals of Memory Formation, (Ed. Rahmann), Gustav Fisher Verlag, Stuttgart.- Progr. Zoology, 1989.

37,- P. 197-208.

38. Хамитов X.C., Швецов А.Б., Хазипов Р.Н., Гиниатуллин P. А Десенситизация на эндогенный и экзогенный ацетилхолин в синапсах крыс и лягушки // Тез. докл. Всес. конф. "Механизмы действия медиаторов

■ормонов".- Суздаль, 1989.- С. 203.

19. Vyskocil F, Magazanik L. G. , Giniatullin R. A. , Nikolsky E.E. ^sensitization during repetitive and single quantal release of .cetylcholine in frog muscle // Physiol. Bohemos1оv.- 1989.- 38, N 4.-'. 380-381.

r0. Гиниатуллин P. A., Оранская Т. И. , Воронин В. А., Никольский Е.Е. ¡лияние неквантового ацетилхолина на миниатюрные токи концевой шастинки мыши // Нейрофизиология.- 1990.- 22, N 4.- С. 507-513. ,1. Гиниатуллин P.A., Хамитов Х.С. Влияние блокаторов кальциевых :аналов на проведение ритмической серии импульсов через синапс // Тез. юкл. Всес. конф. по нейронаукам.- Киев, 1990.- С. 45-46. ÍZ. Гиниатуллин P.A., Швецов А.Б., Хамитов Х.С. Ингибирование щетилхолинэстеразы меняет не только организацию актов открытия щетилхолинактивируемых ионных каналов, но и их кинетику // Тез. Эсесоюз. симп. "Ионные каналы в биологических мембранах.- Москва, .990,- С. 19.

13. Нигматуллин Н.Р., Гиниатуллин P.A. Анализ действия веществ на шкотиновый холинорецептор: модификация или медленный блок открытого юнного канала? // Тез. Всесоюз. симп. "Ионные каналы в биологических «ембранах".- Москва, 1990.- С. 65.

14. Хазипов Р.Н., Гиниатуллин Р.А. , Хамитов Х.С. Влияние Мд+* Са+Г 3a+t Sr+T А1+++ на миниатюрные токи концевой пластинки лягушки // Тез. Зсесоюз. симп. "Ионные каналы в биологических мембранах".- Москва, 1990. - С. 98.

15. Хазипов Р. Н. , Хамитов Х.С. , Гиниатуллин P.A., Гараев P.C. Закономерности блокирования ионного канала холинорецептора 1роизводными оксафосфоданола // Биологические мембраны.- 1990.- 7, N 3.- С. 1001-1007.

Í6. Magazanik L. G. , Snetkov V. А. , Giniatullin R. А. , Khazipov R.N. Changes in the time course of miniatute end plate currents induced by Dath applied acetylcholine // Neurosci. Letters. - 1990.- 113, N3,- P. 281-285.

47. Гиниатуллин P.A., Зефиров А.Л., Ощепкова С.Ф., Хазипов Р.Н. Субстанция Р модулирует постсинаптическую потенциацию и цесенситизацию, вызванную эндогенным ацетилхолином // В кн. : "Физиология и биохимия медиаторных процессов",- Тез. симп. V Всес. конф.: Москва, 1990.- С. 73.

48. Гиниатуллин Р.А., Хазипов Р.Н., Магазаник Л.Г., Снетков В.Н.

Механизмы действия десенситизации на длительность синаптических сигналов // В кн.: "Физиология и биохимия медиаторных процессов".-Тез. симп. V Всес. конф.: Москва, 1990.- С.74.

49. Швецов А. Б., Хазипов Р.Н., Хамитов: X. С., Гиниатуллин Р. А. Модуляция чувствительности постсинаптической мембраны под влиянием ритмической стимуляции нерва, спонтанной квантовой и неквантовой секреции ацетилхолина // В кн.: "Физиология и биохимия медиаторных процессов".- Тез. симп. V Всес. конф.: Москва, 1990.-С. 328.

50. Гиниатуллин Р.А., Хазипов Р.Н. Особенности действия ионов кальция на миниатюрные токи концевой пластинки после ингибирования ацетилхолинэстераз // Нейрофизиология.- 1990,- 22, N 4.- С. 556-559.

51. Giniatullin R.A. , Snetkov S. V. , Magazanik L.G. Long-lasting phenomena in neuromuscular junction evoked by acetylcholinesterase inhibition // Abstr. Int. Symp. "Motoneuronal Plasticity".- Bonn,

1990.- P. 36-37.

52. Гиниатуллин P. A. , Швецов А. Б. Различия в эффектах ct-бунгаротоксина на длительность одноквантовых и многоквантовых токов концевой пластинки крысы // Тез. VI • Всесоюз. симп. Физиология медиаторов. Периферический синапс.- Казань, 1991.- С. 32.'

53. Хируг Л.С., Лайков Т.В., Гиниатуллин Р.А. Влияние десинхронизации процесса секреции ацетилхолина на амплитуду токов концевой пластинки // Тез. VI Всесоюз. симп. "Физиология медиаторов. Периферический синапс".- Казань, 1991.- С. 118.

54. Гиниатуллин Р.А.,- Хазипов Р.Н. Токи концевой пластинки при физиологическом уровне квантовой секреции и после потенциации освобождения медиатора 4-аминопиридином // Нейрофизиология.- 1991.-23, N 1.- С. 48-56. .

55. Гиниатуллин Р.А., Зефиров А.Л., Магазаник Л.Г., Ощепкова С.Ф. Постсинаптические эффекты ' субстанции Р. в нервно-мышечном синапсе лягушки // Нейрофизиология.- 1991.- 23, N 4.- С. 436-441.

56. Magazanik L.G., Bolschakov V.L., Giniatullin R. A. , Lukomskaya N. Y. , Molgo M. N. , Potapyeva N. N. , Samoylova. M. V. , Snetkov V. A. Neurophysiology of cholinesterase inhibitors: pre- and postsynaptic effects // Abstr. 2 Int. Symp. "Advances in Alzheimer ,Dis. Therapy".-

1991,- P. 26. x

57. Земскова С.H., Эдер К. , Гиниатуллин Р.А., Зефиров А.Л., Хазипов Р.Н. Ранние постденервационные изменения свойств постсинаптической мембраны мышечного волокна амфибий // Физиол. журн. СССР,- 1991.-77, N

Z. - С. 57-65. х

58. Khazipov R. N. , Giniatullin R. A. , Vyskocil F. Effect of magnesium on the functional state of postsynaptic membrane mediated by non-quantal acetylcholine leakage // Abstr. reg. meeting of the Int. Union of Physiol. Sciences.- Prague, 1991.- P. 143.

59. Magazanik L. G. , Bolschakov V. L. , Lukomskaya N. Y. , Potapyeva N. N. , Samoylova M.V. , Snetkov V. A. , Giniatullin R. A. , Molgo M.N. Pre- and postsynaptic effects of cholinesterase inhibitors // "Cholinergic basis for Alzheimer therapy".- Birkhauser, (Ed. R.Becker, E. Giacobini), 1991,- P. 74-81.

60. Хазипов P.H., Гиниатуллин P.А. Влияние ионов магния на функциональное состояние постсинаптической мембраны через модуляцию уровня неквантовой секреции медиатора // Нейрофизиология,- 1992.- 24, N 1,- С. 97-100.

61. Гиниатуллин Р.А., Швецов А.Б. Влияние квантового состава, мембранного потенциала и плотности рецепторов на временное течение токов концевой пластинки в условиях ингибирования ацетилхолинэстеразы // Нейрофизиология,- 1992,- 24, N3.- С.269-279.

62. Giniatullin R.А., Khazipov R.N., Vyskocil F. Critical quantum content for shortening of endplate currents in the frog skeletal muscle // Physiol. Res.- 1992,- 41, N6,- P. 254-256.

53. Гиниатуллин P.А., Оранская Т. И., Хазипов P.H. Влияние "неквантового" ацетилхолина на чувствительность постсинаптической мембраны: действие оуабаина и имитация эффектов экзогенным ацетилхолином // Нейрофизиология, - 1992,- 24, N 4. - С. 396-404.

54. Гиниатуллин Р. А. Повторная активность в двигательных нервных окончаниях: модуляция двухвалентными катионами, ритмической активацией •л холинергическими агентами // Нейрофизиология,- 1992,- 24, N4.-

387-395.

35. Гиниатуллин Р.А., Хазипов Р.Н., Оранская Т.И. Неквантовая секреция медиатора как фактор, определяющий последствия ингибирования ацетилхолинэстеразы // Бюлл. эксперим. биологии и медицины.- 1992.-:xiv, N 7.- С. 6-7.