Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Пресинаптическая холинорецепция в нервно-мышечном синапсе

я \} 2 S О

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР

КАЗАНСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ им, C.B. КУРАШОВА

На правах рукописи

НИКОЛЬСКИЙ ЕВГЕНИЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ

УДК 612. 815

ПРЕСИНАПТИЧЕСКАЯ ХОЛИНОРЕЦЕПЦИЯ

В НЕРВНО-МЫШЕЧНОМ СИНАПСЕ

14. 00. 17 — нормальная физиология

Научный доклад

на соискание ученой степени доктора медицинских наук

КАЗАНЬ 1990

Работа выполнена в Казанском государственном медицинском институте им. С. В. Курашова, Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова АН СССР и Институте физиологии АН ЧСФР.

Официальные оппоненты — заслуженный деятель науки УдССР

доктор медицинских наук, профессор Г. Е. ДАНИЛОВ; доктор медицинских наук, профессор Р. С. ОРЛОВ; доктор медицинских наук, профессор В. Б. ДОЛГО-САБУРОВ

Ведущее учреждение — Инстшут биоло: ической физики

АН СССР

Защита состоится . ' Рж&с^кк_1990 г.

в часов на заседании специализированного теоретического Ученого Совета Д 084. 29. 03 Казанского ордена Трудового Красного Знамени государственного медицинского института им. С. В. Курашова (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49 а).

Доклад разослан „. _1990 г.

Ученый секретарь специализированного теоретического Совета.

кандидат медицинских наук Р. X. АХМЕДЗЯНОВ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблеш. Проблема регуляции синаптической передачи на протяжении многих лет привлекает к cede пристальное внимание исследователей. Особый интерес вызывают механизмы регуляции функционального состояния нервной терминали, обеспечивающие высокую надежность нейросекреторного процесса [Матшкин, 1973, 1975, 1980; Полетаев, 1974; Прозоровский, 1980; Starke, 1981, 1986; Göthert, 1985].

Сегодня совершенно ясно, что без глубокого понимания закономерностей функционирования пресинаптнческих регуляторных систем невозможно постичь механизмы таких физиологических процессов, как память и обучение, представить патогенез многих заболеваний нервной и мышечной систем, создавать фармакологические препараты, избирательно воздействующие на передачу информации в синапсе С Kandel, Spencer, 1968; Castelluccí, Kandel, 1974; Прозоровский, Саватеев, 1976; Глебов, Крыжановский, 1978; Голиков и соавт., 19853.

Одним из механизмов, контролирующих освобождение медиатора, является активация пресинаптнческих ауторецепторов СПАР) - рецепторов, расположенных на нервных окончаниях, активация которых медиатором йзи его экзогенными аналогами модифицирует нейросекрецию tKölle, 1960; Eccles, 1963]. Физиологическая роль ПАР наиболее изучена в синапсах ЦНС [Starke, 1979; Timmermans, 1987; Годухин, 1987] и синапсах, образованных вегетативными волокнами [Brown, Gillespie, 1957; Langer, 1974, 1979],

Значение ПАР двигательных нервных окончаний позвоночных изучено значительно слабее, несмотря на то, что именно благодаря экспериментам на этом объекте и возникла сама идея о способности ацетил-холина САХ), освобожденного в синаптическую щель, модулировать выход последующих его порций íMasland, Wighton, 1940; Feng. Li. 1941 ]. Одной из причин недостаточности сведений о роли ПАР в нервно-мышечной системе является наличие в литературе большого количества противоречащих друт другу данных, полученных при исследовании пресинаптических эффектов различных холинергических агентов на процессы спонтанного и вызванного освобождения медиатора. Так, согласно ряду данных [Ciani, Edwards, 1963; Hubbard, Yokota, 1964; Duncan, Publicover, 1979], в присутствии вецеств, активирующих хо-линорецепторы СХР), секреция квантов медиатора угнетается, по мнению других исследователей (Galindo, 1971; Miyamoto, Volle, 1974] -

она усиливается, а по наблюдениям некоторых авторов tCastillo, Katz, 1954, 1955; I to, 1967; Hubbard, Willis, 1962, 1958; Kalsner, 19853 - не изменяется. Даже среди исследователей, описывающих угнетение квантовой секреции под действием АХ и его аналогов, не существует единства мнений о свойствах ХР, опосредующих эти эффекты: если одни [Ciani, Edwards, 1963; Hubbard, Schmidt, Yokota, 1965; Gun-dersen, Tenden, 1980] связывают пресинаптическое действие холиномн-метиков С ХМ) с активацией никотиновых ХР СНХРЭ, то другие [Duncan, Publicover, 1979; Abbs, Joseph, 1981; Kilbinger, Krueb, 1981J приводят факты, свидетельствующие об участии в этих процессах мускари-новых ХР СМХР). Более того, до настоящего времени широко распространено мнение, что влияние ХМ на освобождение медиатора может быть объяснено и без привлечения представления о ПАР. В частности, L. . Fritz и A. R. Gardner-Medwin С1976) и В. Katz С1977) полагают, что изменение нейросекрецгш при действии ХМ возможно вследствие ионных и метаболических сдвигов в околосинаптической области, сопровождающих активации постсинаптической мембраны.

Ничего пе известно о возможности модуляции системой ПАР неквантового освобождения медиатора- процесса, посредством которого освобождается основное количество трансмиттера в покое [Katz, Miledi, 1977; Vy^ko&l, liles, 1977], точно не определена роль ПАР в развитии нервно-мышечного блока, наступающего при введении в организм миорелаксантов деполяризующего типа действия, антихолинестеразных препаратов. И, наконец, что представляется особенно важным для оценки физиологического-значения ПАР, экспериментально не доказана способность эндогенного медиатора оказывать влияние на нейросекре-цию и функциональное состояние синапса в целом при интактной аце-тилхолинестеразе (АХЭ).

Цель и основные задачи исследования. Цель настоящей работы -изучить роль АХ в процессах ауторегуляции функционального состояния мионеврального синапса и выяснить механизмы реализации этих ро-гуляторных влияний на все формы секреции медиатора.

Для достижения этой цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Исследовать возможность модуляции процесса квантового Сспо-нтанного и вызванного) и неквантового освобождения медиатора из двигательных нервных окончаний холоднокровных и теплокровных животных экзогенным АХ и его аналогами через ПАР.

2. Выяснить, не являются ли пресинаптические эффекты АХ л других ХМ результатом действия этих агентов не непосредственно на нервное окончание, а следствием активации постсинаптической мембраны мышечного волокна.

3. Выяснить природу и свойства ПАР, раскрыть механизм Влияния ПАР на интенсивность освобождения медиатора. Оценить возможность воздействия холиномиметиками на двигательное нервное окончание минул ПАР.

4. Определить скорость удаления из синаптической щели АХ, ос-ьобоаденного в ходе предшествующей активности, в условиях ингьбиро-ванной и лнтактной АХЭ. Оценить возможность накопления эндогенного АХ в синаптической щели в концентрации, достаточной для осуществления модуляции освобождения медиатора из двигательных нервных окончаний.

5. Экспериментально проверить возможность регуляции квантовой секреции медиатора из нервных окончаний эндогенным АХ.

6. Сформулировать общее представление о роли ПАР в функционирований нервно-мышечного синапса в физиологических условиях и реализации эффектов фармакологических и токсических агентов.

Научная новизна работы. Впервые доказано, что действие АХ и других ХМ на квантовое освобождение медиатора в синапсах холоднокровных и теплокровных не обусловлено ионными и метаболическими сдвигами, сопровождающими активацию ХР концевой пластинки, а являются результатом прямого влияния ХМ на двигательные нервные окончания. Установлено, что пресинаптическое действие АХ на вызванную секрецию медиатора связано с активацией ПАР, приводящей к укорочению длительности потенциалов действия нервных окончаний и уменьшению входящего кальциевого тока. Показано, что сила пресинаптического действия ХМ на квантовую секрецию зависит от исходного функционального состояния терыиналей: снижение квантового состава Сш) потенциалов концевой пластинки СПКГО под влиянием ХМ было более выражено в синапсах, характеризующихся высоким исходным уровнем квантового освобождения. Впервые экспериментально доказано, что происходящие под влиянием экзогенных ХМ изменения секреции медиатора являются не фармакологическими феноменами, так как аналогичные изменения освобождения вызывает и эндогенный АХ, выделяющийся при раздражении нерва и угнетающий по принципу отрицательной обратной связи секрецию последующих порций медиатора. Установлено, что ПАР нервных окончаний

относятся к ХМ никотинового типа, отличающихся от аналогичных ХР постсинаптической мембраны тем, что при длительном контакте с ХМ в них не развивается процесс десенситизации. Впервые показано наличие на нервных терминалях теплокровных ХР, возбуждение которых увеличивает проницаемость пресинаптической мембраны для ионов кальция в условиях покоя.

Установлено, что в условиях нормальной ионной среды в синапсах крысы ХМ угнетает спонтанную секрецию квантов АХ. Этот эффект имеет место лишь в узком температурном диапазоне, соответствующем температуре теплового ядра животного. Аналогичное угнетающее действие ХМ на частоту миниатюрных ПКП С Г МПКГО отмечено и у лягушки, где оно регистрируется в широком температурном диапазоне. Показано, что ре-гуляци спонтанной секреции медиатора не связана с активацией ПАР, . . управляющих ионными каналами или ферментными системами.

Приоритетными являются данные о том, что процесс неквантового освобождения медиатора также может модулироваться ХМ. Эта модуляция не связана с актисацией ПАР. Доказано, что неквантовое освобождение - активный транспортный процесс, роль переносчика АХ в котором играет, видимо, транспортная система холина, высокого сродства. Установлено, что АХ, выделявшийся неквантовым путем, участвует в контроле вел-тчины мембранного потенциала мышечного волокна в области концевой пластинки.

Сформулирована концепция, согласно которой в многоконтурной системе химической саморегуляции синаптической функции существенная роль принадлежит АХ, реализующему свои влияния на нервные окончания ' через разные механизмы.

Положения, выносимые на защиту.

1. АХ и его аналоги в мионервальных синапсах холоднокровных и теплокровных путем прямого влияния на двигательные нервные окончания способны модулировать, интенсивность как квантового, так и неквантового освобождения медиатора, используя для реализации этих влияний как систему ПАР, так и нерецепторные механизмы контроля синтеза и секреции медиатора.

2. Пресинаптические ауторецепторы в нервно-мышечных синапсах холоднокровных и теплокровных осуществляют угнетение вызванного освобождения медиатора. Они представляют собой ХР никотинового типа, которые управляют ионной проницаемостью пресинаптической мембраны и

характеризуются высокой чувствительностью к ХМ и низкой способностью к развитию десенситизации.

3. Угнетающее влияние АХ и его аналогов на спонтанную секрецию квантов медиатора в синапсах теплокровных и холоднокровных при физиологических температурах не обусловлено ПАР, а связано с непосредственным изменением физико-химических свойств прескнаптической мембраны.

4. Влияние АХ на неквантовое освобождение медиатора в нервно-мышечных синапсах осуществляется без использования пресинаптнческих ХР. Неквантовое освобождение холинергического медиатора - процесс активного транспорта молекул АХ через пресинаптическую мембрану с участием системы захвата холина. В физиологических условиях АХ "неквантового" происхождения участвует в контроле величины мембранного потенциала мышечного волокна в зоне концевой пластинки, а при инги-бировании ацетилхолинестеразы - вносит вклад в развитие блока проведения возбуждения.

Научно-практическая значимость работы. Проведенное исследована: вносит существенный вклад в разработку проблеет модуляции секреции медиатора в нервно-мышечном синапсе через систему ПАР. Развиваемая в работе концепция о том, что эндогенный АХ и его экзогенные аналоги оказывают многостороннее воздействие на функциональное состояние нервных окончаний через активацию ПАР и другие пути, позволяет более широко оценить физиологическое значение этого пресинап-тического регуляторного механизма. Важным в теоретическом отношении является положение о том, что наличие у хояинергических агентов пресинаптического действия, не всегда является доказательством существования специализированных пресянаптпческих ХР. Фундаментальное значение имеют приоритетные исследования механизма и физиологического значения неквантового освобождения АХ.

Некоторые положения работы представляют практический интерес. Получены данные, свидетельствующие о том, что при анализе механизма действия применяющихся в медицинской практике препаратов синап-тического действия, в частности, миорелаксантов, необходимо учитывать значение пресинаптического компонента, заключающегося в угнетении процесса вызванной квантовой секреции медиатора. Особенно важным является установление факта, что в условиях гипокинезии чувствительность пресинаптических структур к холиномиметикам снижается и это сопровождается необходимостью использовать б льшие дозы миоре-

лаксантов для создания надежного ыионеврального блока. Этот факт следует учитывать при подборе доз ыиорелаксантов при оперативных вмешательствах, осуществляемых у лиц, длительное время находившихся в состоянии гипокинезии.

Установление определенного вклада, вносимого АХ неквантового происхождения в развитие мионеврального блока при отравлении ингибиторами ацетилхолинестеразы, делает перспективным поиск антидотов, работающих по принципу избирательного угнетения неквантовой секреции АХ.

Апробация работы. Материалы исследования были доложены на: Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия медиаторных процессов" (Москва, 1975, 1980, 1985, 1990), XII Всесоюзном съезде физио-. логов (Тбилиси, 19753, Международном симпозиуме "Структура и функция синапсов" (Киев, 1976), Всесоюзном совещании по проблеме гисто-гематических барьеров (Москва, 1978), Всесоюзной конференции "Физиология вегетативной нервной системы" (Куйбышев, .1979), Всесоюзном симпозиуме "НеЯромедиаторьг в норме и патологии" (Казань, 1979), Всесоюзном симпозиуме "Биофизика мембран" (Паланга, 1979), рабочем совещании Структура и функция холинорецепторов" СПущино, 1979), ХШ Всесоюзном съезде физиологов (Алма-Ата, 1979), Заседании отдела нейрофизиологии АН ЧСФР (Прага, 1981, 1990), Заседаниях Татарского отделения Всесоюзного физиологического Общества им.И.П.Павлова (Ка-; зань, 1981, 1985, 1988, 1990), Заседании Пермского отделения Всесоюзного физиологического Общества им. И. П. Павлова (Пермь, 1982), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Совещании "Механизмы синаптической передачи" (Киев, 1983), Советско-Западногерманском симпозиуме "Возбудимые мембраны" (Киев, 1983), Совещании "Регистрация одиночных каналов биологических мембран" (Пущино, 1984), Международном симпозиуме "Холинэстеразы" (Блэд, 1984), Всесоюзном симпозиуме "Физиология медиаторов. Периферический синапс" (Казань, 1984), XIV Всесоюзном съезде физиологов (Баку, 1984); Заседании Казанского отделения Всесоюзного Общества фармакологов (Казань, 1984), Ш Сессии научного Совета АН СССР по физиологии висцеральных систем (Ленинград , 1986), VI съезде Европейского нейрохимического общества (Прага, 1986), Рабочем совещании отдела нейробиологии II физиологического института им. М. Планка (Хоыбург, 1989).

Реализация результатов исследования. Основные результаты ра-

боти опубликованы & 65 печатных трудах. Данные о способности медиатора модулировать состояние секреторного аппарата двигательных нервов, а также материалы о механизме и физиологической роли неквантового освобождения АХ излагаются в лекционных курсах нормальной физиологии, физиологии человека и животных, биофизики Казанского медицинского института. Ленинградского санитарно-гигиенического института, Ленинградского педиатрического института, Пермского медицинского института. Казанского государственного университета. Материалы исследования о роли неквантового освобождения АХ в развитии ми-оневрального блока при отравлениями ФОС широко используются в Институте токсикологии МЗ СССР (Ленинград), Институте органической и физической химии АН СССР (Казань). Разработанный метод автоматизации электрофизиологических исследований принят к реализации учреждениями МЗ РСФСР. Получено 1 авторское свидетельство СССР на изобретение, 7 удостоверений на рационализаторские предложения.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основная часть экспериментов была выполнена на изолированных нервно-мышечных препаратах m, sartorius, т. cutaneus pectoris и т.submentalis лягушек R.temporaria и R.ridibunda; га. diaphragma белых мышей; ra. soleus, a.extensor digitorum longus и т. diaphragma крыс линии Wisrtar; т.thyreohyoideus человека.

В работе были использованы следующие методические подходы:

Электрофизиологический - применялись стандартные методы микроэлектродного исследования синаптической передачи, позволяющие регистрировать синапттЛеские токи и потенциалы, характеризовать интенсивность процессов квантового и неквантового освобождения АХ, оценивать чувствительность постсинаптической мембраны к медиатору, анализировать амплитудно-временные характеристики токов действия нервных окончаний.

Фармакологический - заключающийся в исследовании влияния на освобождение медиатора ряда соединений, имеющих определенные черты сходства и различия в строении по сравнению с молекулой естественного медиатора, изучении характера взаимодействия агонистов и антагонистов с холинорецепторами..

Морфологический и гистохимический - использовали простую и фа-зово-контрастную микроскопию для визуализации нервных окончаний, морфометрию поперечных срезов мышц, изучение активности в них лак-

тат- и сукцинатдегидрогеназ, выявление ацетилхолинестеразы на поверхности отдельных мышечных волокон.

Биохимический - для определения активности Na , К - АТФазы в гомогенатах нервной ткани.

Радиоэнзиматический - для количественного определения выхода в инкубационную среду КХ. из нервно-мышечного препарата.

Статистический - включающий в себя изучение закона распределения потока миниатюрных потенциалов концевой пластинки, отражающего определенные стороны механизма освобождения медиатора.

Математического моделирования - заключающийся в создании и использовании моделей процессов активации и блокады пре- и постсинап-тических рецепторно-канальных комплексов молекулами агонистов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. УЧАСТИЕ ПРЕСИНАПТИЧЕСКИХ ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ В РЕГУЛЯЦИИ ВЫЗВАННОГО ОСВОБОЖДЕНИЯ МЕДИАТОРА.

1.1. Влияние экзогенных М. Н-холиномиметических агентов - АХ и карбахолина - на квантовый состав потенциалов концевой пластинки.

На первом этапе исследования изучали влияние АХ и его негидролиз уемого аналога - карбахолина СЮО на m ПКП при добавлении агонистов в раствор, омывающий нервно-мышечный препарат. Исследования были проведены на m.&artorius, m.cutaneus pectoris, m. submental is лягушек Нала Temporarla и Rana Ridlbunda, а также на m.soleus и m. extensor digitorum longus кр с линии Vistar. Сокращения иышц и генерацию в них потенциалов действия СПД) блокировали либо поперечным рассечением мышечных волокон С "рассеченный" препарат) IBarstad, Lllle-heil, 1963; Никольский, 1974; Волкова, Никольский, Полетаев, 1975], либо уменьшением содержания в инкубационной среде Са^+ и добавлением Mg2+ ("магниевый" препарат) IKatz, Miledi, 1965].

В "рассеченных" нервно-мышечных препаратах, для Которых характерно сохранение высокого исходного m ПКП [Полетаев, 1973; Никольский, 1974], под действием АХ и КХ происходило угнетение вызванного освобожления медиатора, усиливающегося по мере увеличения дозы ми-метика. Эти эффекты хорошо отмывались проточным раствором Рингера и воспроизводились вновь. Анализ полученных данных показал, что пре-скнаптическая чувствительность синапсов;®.soleus крысы была заметно

ниже к действии агонистов, чем синапсов амфибий и быстрых мышечных волокон крысы.

Эксперименты на лягушке показали, что сила дрссинаптического действия в разных синапсах одной мышцы существенно различается. Особенно отчетливо это было видно в опытах с КХ на га. заг1ог1и5. Так, КХ в концентрации 5-10е моль/л снижал га ПКП в среднем на 30,1 ±7,3% (п=113; Р<0,05). При этом в одних синапсах эффект составлял более чем 50%, в то время как в других снижение ш ПКП было на границе достоверности.

Анализ показал (рис.1), что угнетение т ПКП как правило было больше в синапсах с исходно высоким значением т ПКП С рис. 1) С по оси абсцисс - величина га ПКП, по оси ординат - степень угнетеьля ш ПКП в 530. Можно было думать, что чем больше освобождается из нервных око-

%

Рис. 1.

ичаний квантов медиатора, тем сильнее пресинаптическое действие ХМ. Однако, эта гипотеза не нашла подтверждения в опытах на "магнпевих" препаратах, где несмотря на то, что исходный ш ПКП был снижен до единиц квантов, сохранялось такое же угнетающее действие ХМ, что и в "рассеченных" мышцах (п=37).

Для выяснения причины разной чувствительности синапсов к ХМ били проведены специальные эксперименты. В ванночку- гДе Е растворе с пониженным ГСа2+]0 помещался "рассеченный" нервно-мышечный препарат, добавляли КХ и находили синапсы, в которых миметик вызывал

лидо очень значительное, либо очень слабое угнетение m ПКП. Затем этот раствор меняли на раствор, не содержащий КX, с увеличенным до 13 ммоль/л содержанием Са2+ и определяли степень роста m ПКП. Оказалось, что синапсы, характеризующиеся высокой пресинаптической хо-линочувствительностью, были способны в этих условиях генерировать ПКП с квантовым составом в 500-650 квантов, в то время как в синапсах, слабо реагировавших на КХ, при высоком значении iCa2+]Q т ПКП возрастал не более, чем до 150-200 квантов.

Учитывая, что в литературе описана связь величины и ПКП с морфологическим особенностями синапсов [Kuno, Turkams, Weakly, 1Э73), было проведено морфологическое и гистохимическое исследование синапсов, по-разному реагировавших на ХМ.

Исследование показало, что синапсы, в которых КХ вызывал значительное Сболее 30%) снижение m ПКП, характеризуются значительно большей степенью ветвления терминалей (фазово-контрастная микроскопия нативных препаратов) и большей площадью постсинаптической мембраны, о чем судили после выявления активности АХЭ тиохолиновым методом [Пирс, 19623.

Детальное изучение пресинаптической чувствительности отдельных синапсов m.axtensor digUorun longus крысы к АХ и КХ также позволило установить, что синапсы, способные к развитию высокого ш ПКП, обладают большей пресинаптической чувствительностью к ХМ.

Таким образом, во всех исследованных нервно-мышечных препаратах АХ и КХ оказывали угнетающее действие на вызванное освобождение медиатора, но выраженность этого эффекта была обусловлена исходными морфо-функциональными характеристиками данного синапса. Каков же механизм этого пресинаптического действия?

1.2. Является ли пресинаптическое действие ХМ на вызванное освобождение медиатора результатом прямого влияния на нервные окончания или связано с активацией постсинаптической мембраны?

Вопрос о том, является ли пресинаптический эффект АХ и его аналогов резузя>татом прямого влияния ка нервные окончания, представляет особую важность, поскольку его решение определяет стратегию дальнейших исследований. В литературе обсуждался вопрос о том, что ХМ могут модифицировать секрецию медиатора за счет метаболических или ионных сдвигов в области нервных терминалей,.возникающих в ре-

- и -

зультате активации постсинаптической мембраны [Fritz, Gardner-Med-win, 1975; Katz, 1977]. В качестве посредника такого эффекта часто рассматриваются ионы калия [Katz, 1977; Miyamoto, 1978].

Для выяснения возможного участия К+ в развитии пресинаптичес-ких эффектов были проведены эксперименты по изучению влияния КХ на вызванное освобождение медиатора при фиксации мембранного потенциала С МП) мышечного волокна на уровне, превышавшем потенциал равновесия для ионов калия (ЕрК+). Эксперименты, выполненные на "магниевых" препаратах, показали, что степень снижения квантового состава токов концевой пластинки Cm ТКГО как в синапсах портняжной мышцы лягушки, так и в синапсах длинного разгибателя пальцев крысы достоверно не отличалась от той, что наблюдалась в режиме измерения потенциалов, то есть в условиях, когда имел место выход К+ из деполяризованного в синаптической области мышечного волокна. Для исключения возможного пресинаптического действия К+, выходящего из соседних мышечных волокон, на портняжной мыкце лягушки были проведены аналогичные эксперименты с фиксацией МП, но в которьг: ХМ подводили к династической зоне исследуемого мышечного волокна через микропипетку. И в этом случае имело место угнетающее пресинаптическое действие КХ на m ПКП.

Таким образом, ионы К+, выходящие из иг.и'пюго волокна при его деполяризации, не являются причиной снижения ш ПКП в присутствии холиномиметических агентов. Значит ли это, что пресинаптическое действие ХМ не может быть вторичным, опосредованным через постсинап-тические механизмы?

По-видимому нет, так как в результате изменения проницаемости постсинаптической мембраны имеет место выход из мышечного волокна не только К+, но и различных метаболитов, также способных оказывать влияние на m ПКП ГМатюшкин, 1975, 19801.

Один из подходов, позволивших решить этот вопрос, заключается в сопоставлении кривых доза-эффект для пре- и псстсинаптическнх эффектов, вызываемых ХМ. На портняжной мышце лягушки С рис. 2) и данном разгибателе пальцев крысы были проведены эксперименты с КХ в диапазоне концентраций 1-Ю"7 - 1-10-® моль/л.

Из приведенных данных следует, что снижение m ПКП в препаратах происходило при действии ХМ в концентрациях, еще не оказывающих какого-либо постсиналтического эффекта. Таким образом, пресинаптичес-кий эффект КХ не связан с активацией концевой пластинки, а есть результат прямого действия ХМ на двигательные нервные окончания.

Учитывая высокую чувствительность терминалей к ХМ Со чем свидетельствует эффективность ХМ в низкиу концентрациях), есть все основания думать, что пресинаптический эффект ХМ реализуется через ПАР. Несомненно, интерес представляет изучение природы зтих рецепторов, выяснение молекулярных механизмов, которые запускаются при их активации и ведут в конечном счете к снижению квантового выброса медиатора. Логика исследований, направленных на решение этих вопросов, в

НХЖп

60

60 -

40 -

0 Л

М0"

I

МО-6 Рис. 2.

и

тПНП

мо-

Н-

значительной степени будет зависеть от установления фармакологических свойств пресинаптических рецепторов, в частности от принадлежности их к Н- или М-типам.

1.3. Изучение фармакологических свойств пресинаптических холи-норецепторов, контролирующих вызванное освобождение медиатора.

Поскольку АХ и КХ являются холиномиметиками, способными активировать как мускариновые, так и никотиновые ХР, то их пресинаптичес-кое действие могло быть связано с активацией рецепторов обоих типов. Если модуляция вызванной секреции достигается путем активации МХР, то специфические мускариновые агенты также должны быть эффективны, а мускариновые литикк должны предотвращать влияние .АХ и КХ. Для проверки гипотезы о реализации влияния АХ и КХ через рецепторы

кускаринового типа изучали влияние на и ШШ следуюцих мускариаовых агентов: метилфуркетида С1 • 10~8 - 1-Ю^оль/л), оксотраморина (5-•10"° - 5-10"6моль/л), ».'©тахолина С5-10"8 - 5-10"6моль/л), мускари-на (1-Ю-7 - 1-Ю'^оль/я), F-2268CL) (1-Ю-8 - б-КГ^оль/л), F--226BCD) С1 -10~7 - 1-10~Люль/л). Эксперименты показали, что ни один из использованных агентов не вызывал изменения m ШШ ни в синапса:; лягушки, ни в синапсах крысы. Из этого следует, что зффэкты АХ и КХ на п ПКП ке связаны с наличием у этих агентов мускариноми-метических свойств. В пользу этого заключения свидетельствуют и эксперименты , в которых э<ь™?ктн АХ н КХ на п ПКП пытались устранить мускариновыми холинолитиками - атропином и скополампиом. Ни атропин С1-10"8 - 5-10' Аюль/л), ни скополамин С1-10"8 - 2,5-10~^,оль/л) не оказывали какого-либо влияния на пресинаптический эффект КХ С5-10"6 моль/л) ни в синапсах и.sartorius лягушки, ни в синапсах га.extensor digitorum longus крысы. Таким образом, логично думать, что влияние АХ и КХ на и ПКП как в синапсах холоднокровных, так к в синапсах теплокровных осуществляется через никотиновые пресинантическне ХР. Если зто ттродполкгенис егграгедлипо, то сисцкйячсскко Н-ХМ долган снижать m ГЕП. Бкло исследовано влияние таких агентов, как никотин С 5 • 10 "' - 6-10"5ьюль/л) суберилдихолин (140 - 5-10 ~^.<.аяь/д), те-тракеталашший (5-10-6- 5-10"^оль/л), холин (1-Ю-6 - 3-10"3 моль/л). Исследования показали, что все эти Н-ХМ приводили к снижению ш ПКП.

Перед нами возник вопрос, с каким НХР (мышечного волокна или вегетативных ганглиев) имеют сходство" изучаемые на;.м ПАР холоднокровных и теплокровных. Исследование преспнаптического действия КХ в присутствии ганглиолитюсов Сбензогексоний и ИЭМ-1119) - и блокатора НХ? мышечных волокон Cd-тубокураршО выявило значительно большую эффективность d-тубокурарина. Ганглаолитики сникали пресинаптическое действие КХ в синапсах лягушки и крысы лишь при использовании в дозах, уменьшающих постсинаптическую чувствительность. Напротив, "за-шитающее" действие d-тубокурарина отмечалось уже в концентрации 1-•10~8 г/мл, при которой никакого преспнаптического эффекта еае не отмечалось.

Для выяснения характера взаимоотношений между КХ и d-тубокура-рином в отношении их влияния на m ШШ строили кривые концентрация-эффект в интактных и кураризированных (5-10мольлл) портняжных мышцах лягушки.

Из рис.3 следует, что болограмма концентрация-эффект для КХ

под влиянием <1-тус5окурарина (рис.3, б) сменилась в сторону больших концентраций,но оставалась параллельной первой болограмме (рис.3,а).

Рис. 3.

Такое расположение кривых концентрация-эффект обычно имеет место при конкурентных взаимоотношениях между антагонистом и агонистом [Комиссаров, 1969].

Таким образом, мы получили основания считать, что снижение m ПКП в синапсах и холоднокровных, и теплокровных реализуется через пресинаптичеокие НХР,' фармакологические свойства которых близки к свойствам ХР концевой пластинки.

Г. 4. Является ли снижение m ПКП под влиянием холиномиметиков результатом активации или десенситизации пресинаптических холинорецепторов?

При изучении действия КХ на фоне d-тубокурарина мы столкнулись с явлением, которое уже было описано в литературе [Hubbard, Wilson, Miyamoto, 1959; Glavinovi , 1979] и заключается в том, что d-тубоку-рарин, также как и Н-ХМ, вызывал снижение ш ПКП. В рамках концепции о модуляции секреции через ПАР это экспериментальный факт, требующий к себе пристального внимания. Действительно, не просто представить, как вещества и активирующие, и инактивирующие НХР вызывают один и тот гэ эффект - снижение га ПКП. В 1974 г. G. Kölle высказал

соображение, что угнетающий эффект ХМ - результат десеиситизации

пресинаптических ХР, в то время как активация рецепторов приводит к облегчению освобождения. Для проверки гипотезы, что уменьшение m ПКП есть результат десенситизации ПАР, были проведены эксперименты с быстрым и кратковременным подведением холиноми: '.этиков - АХ и КХ -через микропипетку к нервному окончанию в синапсах лягушки (п=27) и крысы (п=13) под визуальным контролем. Ни в одном из экспериментов мы не наблюдали хотя бы кратковременного увеличения m ПКП. Эти данные дают основание считать, что уменьшение m ПКП под действием ХМ -результат активации ХР, а не десенситизации.

Однако это заключение не снимает вопроса о том, почему же и антагонист, и агонист оказывают однонаправленное влияние на m ПКП?

Более детальное сопоставление влияния d-тубокурарина и ХМ на m ПКП выявило существенные различия. Оказалось, что в отличие от ми-метиков d-тубокурарин не оказывал влияния на m ПКП при редком раздражении нерва. Так, в "магниевых" препаратах лягушки достоверное снижение m ПКП отмечалось только при ритмическом раздражении нерва с частотой свыше 10 а в "рассеченных" - при частоте бо-

лее 6 имп-с~*. В "рассеченных" препаратах m. digitorum longus и m. sol eus крысы уменьшение m ПКП происходило лишь спустя 10 тн от начала раздражения нерва с частотой 5 имп-с~\ Снижение m ПКП под действием d-тубокурарина в синапсах как холоднокровных, так и теплокровных было тем значительнее, чем нише был исходный квантовый выброс медиатора и частота стимуляции. Эти данные подтверждают результаты исследований на мышце лягушки [Григорьев, Данилов, Скляров, 198Ô1 и укладываются в представление о наличии у d-тубокурарина так называемого "гешгеолиний-подобного" эффекта, заключающегося, по-видимому, в нарушении процесса синтеза АХ из-за уменг-шения эффективности обратного захвата холина з нервное окончание [Martin, 1969; Hemsworth, 1971].

Таким образом, причина того, что холиномиметики и холинолитики оказывают однонаправленное действие на секрецию медиатора С снижение ш ПКП) заключается в том, что они воздействуют на разные процессы, происходящие в нервной окончании: ХМ нарушают заключительные стадии освобождения, и этот эффект, реализуемый -юрез ПАР, блокируется d-тубокурарином, з то время как сам d-тубокурарин снижает m ПКП не за счет блокады этих рецепторов, а путем вмешательства в процессы синтеза и мобилизации медиатора.

: Изучение пресинаптического действия АХ и КХ в синапсах лягушки

[Никольский, 1974) и крысы [Полетаев, Никольский, 1973] в условиях высокочастотной длительной активности, позволило выявить и у этих агентов способность нарушать процессы синтеза и мобилизации квантов медиатора, что проявлялось в углублении и ускорении развития процесса снижения m ПКП в ритмическом ряду, замедлении процесса восстановления m ПКП после прекращения стимуляции. При этом данные эффекты не только не устранялись d-тубокурариноы, но даже потенциировались им. Таким образом, АХ и его аналогам присущ еде один способ модуляции квантового освобождения медиатора, не опосредованный через ПАР.

1.5. Механизм опосредованного через ПАР действия холиномнмети-ков на га ПКП.

Таким образом, в нервно-мышечных синапсах холоднокровных и теплокровных ПАР контролируют снижение ш ПКП, обнаруживаемое при редком раздражении нерва. Какие же процессы, следующие за активацией ПАР приводят к снижению выброса медиатора? Известно, что величина m ПКП прямопропорциональна запасу квантов медиатора, доступного для освобождения Сп) и вероятности освобождения каждого кванта CP) [Katz, Miledi, 1965; Johnson, Wernig, 1971]. Проведенные нами расчеты показали, что под влиянием ХМ происходит снижение преимущественно параметра Р. С современных позиций [Wernig, 1976; Зефиров, Столов, 1983, 1984] за этим стоит уменьшение средней вероятности активации чаждой активной зоны нервного, окончания, что может быть связано с уменьшением входа Са2+ в терминалы Известно, что при раздражении нерва входит в нервное окончание через потенциалозависимые кальциевые каналы терминалей, открывающиеся при их деполяризации ПД IKatz, Miledi, 1969, 1970].

Можно было думать, что анализ амплитудно-временных характеристик ПД нервного окончания в присутствии ХМ даст определенную информацию о механизме снижения т ПКП. ПД регистрировали внеклеточно с помощью стеклянных микроэлектродов, заполненных раствором Рингера и подводимых под визуальным контролем к различным участкам нервного окончания. Исследовали влияние АХ С1-10-4 моль/л) на ПД в терминальных и проксимальных отделах нервного окончания Сэти исследования были выполнены в 1990 г. совместно с А. Л. 'Зефировым и Д. М. Шакирьяно-вой). Эксперименты показали, что ПД, отводимые в центральном и дис-тальнэм отделах, под действием АХ не изменялись (рис.4, А, а, б), а в проксимальном отделе отмечалось достоверное увеличение Сотмечено

стрелкой) третьей фазы ДД - фазы, отражавшей интенсивность выходящего калиевого тока Срис. 4, Б, а, б). Следовательно, в проксимальных отделах терминали под влиянием АХ происходит открытие дополнительных калиевых каналов, приводящее к ускорению релоляризацин постсина-птической мембраны и, соответственно, ускорению спада кальциевого тока, что приводит к снижению входа Са2+ и т ГОШ.

aV А

V. J

б

/ч

I 2МС

Рис. 4.

Таким образом, один из механизмов действия ХМ на ш ПКП, опосредованный через ПАР, связан с их способностью уменьшать вход Са2+ в нервное окончание за счет влияния на временные характеристики ПД.

1.6. Исследование пресинаптического действия КХ на ш ПКП после перезки двигательного нерва, аппликации к нерву колхицина и иммобилизации конечности.

Наиболее вероятно, что ПАР образуются в перикарионе мотонейронов, транспортируются по аксону на периферию и встраиваются в мембрану нервных окончаний. Для проверки этой гипотезы мы изучили гсре-синаптичэское действие КХ па предварительно денервированном нервно-мышечном препарате [Никольский, Гинкатуллин, 1984]. Известно, что статическая передача в скелетных мышцах холоднокровных сохраняется несколько суток после перерезки нерва [Birks, Katz, Miledi, i960]. Если пресинаптические ХР действительно транспортируются в

нервное окончание аксональным транспортом и срок их "жизни" в пре-синаптической мембране невелик, то после пересечения нерва следовало бы ожидать исчезновения или снижения эффекта КХ на m ПКП.

Эксперименты показали, что портняжная мышца, выделенная у оперированных животных, способна отвечать сокращением на непрямое раздражение даже спустя 6 суток после перерезки нерва. Изучение синап-тической передачи в таких мышцах позволило установить, что на 4 сутки после оперативного вмешательства синаптическая передача в них не изменялась по сравнению с контролем, однако аппликация КХ С5-10"6 моль/л) не приводила к уменьшению m ПКП, вызывая такую же деполяризацию постсинаптической мембраны, как и в контроле. Аналогичные результат« были получены в опытах на m. extensor digitorum longus крысы [Никольский, Выскочил, 1990] после предварительной обработки нерва колхицином, который, как известно, блокирует быстрый аксональ-ный транспорт [Warnick, Albuquerque, Guth, 1977; Волков, 1989]. Так, на 6 сутки после обработки нерва алкалоидом в "рассеченном" препарате мы не наблюдали снижения m ПКП под действием КХ.

Эти данные свидетельствуют в пользу представления о том, что НХР, контролирующие вызванное освобождение АХ, транспортируются к пресинапти зской мембране посредством быстрого аксонального транспорта и время их функционирования ограничивается несколькими сутками.

В экспериментах на m. extensor digitorum longus крыс с иммобилизованной в течение 1 месяца С при помощи металлической шины или гипсовой повязки) конечностью также было выявлено значительное уменьшение чувствительности нервных терминалей к ХМ. Так,, доза КХ, необходимая для снижения m ПКП на 35%, с 7,0-Ю-6 моль/л увеличивалась до 1-10 моль/л.

В опытах, выполненных на "иммобилизованных" крысах in vivo, было установлено, что для создания надежной релаксации мышц сукцинил-холином концентрацию миорелаксанта приходилось увеличивать в 1,3 раза по сравнению с необходимой для блокирования синаптической передачи у контрольных животных. Поскольку постсинаптическая чувствительность мышц иммобилизованной конечности к медиатору существенно не падает, полученные данные свидетельствуют о том, что снижение m ПКП вносит вклад в развитие ыионеврального блока, вызываемого ХМ.

2. УЧАСТИЕ ПРЕСИНАПТИЧЕСКИХ ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ В РЕГУЛЯЦИИ СПОНТАННОГО КВАНТОВОГО ОСВОБОЖДЕНИЯ МЕДИАТОРА.

2.1. Эксперименты на холоднокровных.

2.1.1. Влияние М, Н-холиномиметических агентов АХ и КХ.

Исходные значения средней амплитуды и частоты МПКП С Г МПКП) в т. БаКог!^ лягушки составили, соответственно, 0,4610,09 мВ и 1,3± ±0,4 нмп-с-1. АХ в концентрации 7,5-10 "5 моль/л через 20 шш действия снижал амплитуду и Г МПКП, соответственно, на 36,4*7,9% и 44,2± ±5,6% Стаб. 1). Закон распределения межимпульсных интервалов при этом не изменялся ССтрунский, Никольский, 1990]. Снижение Г МПКП начиналось одновременно с деполяризацией постсинаптической мембраны, которая достигала максимального уровня к 15 мин действия АХ (рис. 5, А). МП к этому моменту снижался на 18,2*3,8% (рис.5. А, 1), а в течение последующих 15 - 20 шш постепенно возвращался к исходному значению из-за развития десенситизации (Магазаник, Никольский, 1979]. Снижение Г МПКП сохранялось без изменения на протяжении всего времени (30 мин) присутствия АХ в ванночке (рис. 5, А, 3). КХ так же снижал / МПКП (рис. 5, Б, 3; таб.1).

Ю 02 №

06 10

йб

15 30 45 60 75 мнн 15 30 45 60 75

2

к ж

Рис. 5.

Таким образом, в синапсах лягушки М-, Н-ХМ угнетают спонтанную квантовую секрецию медиатора. Поскольку существует представление, что пресинаптическое действие реализуется через МХР [Duncan, Publi-cove,r, 19791, то в следующей серии экспериментов мы изучали влияние на МПКП веществ, обладающих способностью избирательно активировать и блокировать МХР.

2.1.2. Влияние мускариновых ХМ и ХЛ.

Мускариновые агонисты метилфурметид. оксотреморин и метахолин в диапазоне концентраций 5-Ю-7 - 5-10~~ моль/л на протяжении 60 мин действия не оказывали влияния ни на амплитуду, ни на Г МПКП (таб. 1). Не удалось обнаружить пресинаптическое действие и у одного из самых активных из известных М-ХМ - препарата F-2268. Учитывая, что МХР обладают стереоспецифичностью, были проведены эксперименты по исследованию влияния L- и D-форм этого соединения. Однако и сте-реоизомеры оказались неэффективными даже при использовании их в высоких концентрациях (таб. 13.

Не приводила к модификации квантовой секреции АХ и попытка бло-\ кировать предполагаемые пресинаптические МХР атропином: на протяжении 50 мин f МПКП не менялась (таб. 1). КХ (5-Ю-6 моль/л), введенный в раствор после 20 мин обработки мышцы атропином, вызывал такое же угнетение f МПКП, как и в контроле (таб. 1).'

Анализируя результаты экспериментов cjМ-холиноактивными соединениями, можно прийти к однозначному выводу о том, что пресинаптическое действие АХ и КХ не связано с их МХМ-активностью и нет оснований говорить о существовании на двигательных нервных окончаниях лягушки МХР, контролирующих спонтанную секрецию квантов медиатора. Исходя из этого, дальнейшее исследование было направлено на изучение влияния на МПКП агонистов никотинового типа.

2.1.3. Влияние никотиновых агонистов.

Было исследовано влияние на МПКП следующих агентов: никотина, тетраметиламмония, суберилдихолина. Все эти агенты, так же как КХ и АХ, наряду с постсинаптическим действием снижали f МПКП (таб. 13. Однако проведенные эксперименты выявили разную чувствительность пре-и постсинаптических рецепторов к различным Н-ХМ: суберилдихолин и никотин, оказывая более выраженный по сравнению с КХ постсинаптичес-

кий эффект, характеризовались меньшим пресшгаптическим действием.

Таким образом, Н-ХМ, так же как АХ и КХ, угнетают спонтанную секреции медиатора. Из этого естественным было предположить, что и в синапсах лягушки пресинаптическое действие ХМ реализуется через НХР, как это было показано для вызванной секреции у холоднокровных и теплокровных. В таком случае следовало ожидать, что с!-тубокурарин будет препятствовать развита» пресинаптического эффекта Н-ХМ.

2.1.4. Влияние КХ на МПКЛ в присутствии Н-холинояктачйских агентов.

Экспериментально была подобрана концентрация б-туЗокурарина С4,5-10"^ моль/л), в присутствии которой вызываемое им снижение амплитуды МПКЛ позволяло регистрировать их без потерь и после добавления КХ. В этой концентрации сам тубокурарин на протяжении часа не изменял Г МПКЛ, уменьшая амплитуду на 43,743,5% (п=Й. Р<0,05-. КХ в присутствии блокатора оказывал такое же угнетающее действие на Г МПКЛ, как и в контроле (таб. 1). На рис. 6, А видно, что концентрационная зависимость снижения Г МПКЛ под действием КХ на фоне б-тубо-курарина не отличалась от подобной зависимости, полученной в отсутствии литика. В то ге время постсинаптичэское действие мимотика при обработке препарата тубокурарином сикалось, о чем свидетельствует параллельный сдвиг кривой доза-эффект Срис. 6, 5), характеризующий конкурентное взаимодействие между КХ и тубокурарином, свойственное НХР концевой пластинки [Комиссаров, 1969].

Блокаторы НХР вегетативных ганглиев - бензогексоний и препарат ИЭМ-1119, сами по себе не оказывая какого-либо влияния на { МПКЛ, ко препятствовали развитая преезшаптичеехого действия КХ (таб. 1).

Таким образом, проведенной фармакологический анализ показал, что структуры, опосредующие угнетающее пресинаптическое действие ХМ на МПКП в синапсах лягушки, отличаются по своим свойствам от известных НХР двигательной систем! и вегетативных ганглиев высших позвоночных. Следовательно, моено заключить, что контроль вызванного и спонтанного освобождения АХ в синапсах холоднокровных реализуется разными механизмами. Одним из подходов к пониманию сущности этих отличий может быть анализ процессов, следующих за активацией ПАР. В этом плане преаде всего важным представлялось решить вопрос о том, управляют ли ПАР у лягушки проницаемостью пресинаптической мембраны для Са2+.

- 22 -Таблица 1.

Влияние ХМ- и ХЛ-агентов на МПКП и МП мышечного волокна лягушки.

Холиноактивный агент Концентрация Сммоль/л) МПС К) Амплитуда МПКПШ Частота МПКПС'/.) п

Ацетилхолин 7,5-10~5 81,6*3,8 64,3*5,1 55,8*5,6 6

Карбахолин [ ЮЛ 5,0-Ю"6 91,2*2,5 78,6*8,7 52,4*7,6 16

Никотин 5,0-Ю"6 89,8*2,4 49,9*4,5 79,7*7,3 5

Тетраметиламмоний 5,0-Ю"5 90,7*2,4 56,0*9,7 75,5*3,2 6

Суберилдихолин 1,0-10"6 78,6*3,1 48,2*9,9 78,3*7,0 5

Метахолин 5,0-10"5. 99,3*4,3* 95,6*4,6* 94,3*4,5* 6

Оксотреморин 5,0-Ю"5 100,1*1,8* 97,0*5,4* 98,5*6,9* 5

Метилфурметид 5,0-Ю"5 100,3*3,1* 98,6*3,9* 97,3*5,6* 7

Г-2268 СЬ) 5,0-Ю"6 98,7*3,2* 96,5*3,4* 103,1*5,0* 4

Г-2268 т 5,0-Ю"6 102,1*3,0й 95,4*4,1* 100,3*4,6* 7

Атропин . А] б.О-Ю"6 97,912,8* 96,8*3,7* 95,5*4,1* 9

с!-тубокурарин [б-ТЮ 4,5-10 104,1*3,8* 56,7*3,5* 97,1*3,1* 7 .

Бензогексоний [Б] 1,0-Ю'5 95,1*5,1* 75,3*8,3 95,7*5,1* 4

ИЭМ-1119 4,0-Ю"5 98,7*4,7* 70,1*6,5 97,1*3,9* 5

А С5-10"6 М) + КХ 5,0-Ю"6 90,3*3,2 80,2:15,2 57,4*5,6 5

б-ТК С4,5-10"7 М) + КХ 5,0-10"® 95,1*1,7 88,1*4,7 56,5*7,0 9

Б (МО"5 М) +. КХ 5,0-Ю"6 93,8*9,6 81,8*5,1 54,9*4,7 8

ИЭМ-1119С4-10"5М) + КХ 5,0-10"® 90,0*3,0 75,4*5,7 55,1*3,2 8

Величины МП, амплитуда МПКП и ? МПКП выражены в %% по отношению к исходным значениям, принятым за 100%. Звездочкой отмечены значения, достоверно не отличающиеся от контрольных (Р>0,05).

100-1

%

60-

20

100

5

•logM

80J

Ч-1

a

Рис. 6.

6

-1—

5

■log M

t-»

2.1.5. Пресинаптическое действие KX при изменении ионного состава среды.

Одним из факторов, определявших уровень спонтанной квантовой секреции медиатора, является концентрация ионизированного кальция в нервном окончании [Са2+]i [Landau, 1969; Katz, Miledi, 1969]. Величина CCa2+]i определяется как интенсивностью входа Са2+ в терминаль, так и активностью кальциевых буферных систем СKatz, Miledi, 1969; Cohen, Van der Kloot, 19853. Было высказано предположение [Duncan, Publicover, 19791, что угнетающее действие ХМ связано с их способностью уменьшать проницаемость пресинаптической мембраны для Са2+. Для проверки справедливости этого представления нами было проведено изучение зависимости пресинаптического действия КХ на f МПКП при изменении tCa2+l0. Результаты приведены на рис. 7, где по оси ординат нат слева - f МПКП Симп-с-1 ), а справа - отношение f МПКП черес 20 мин действия КХ к исходной; по оси абсцисс - кондентрация Ca в растворе (¡.«оль/л). Анализ полученных данных показывает, что, с одной стороны, по мере увеличения 1Са2+]„ пресинаптическиП эффект КХ возрастает, а с другой - он имеет место и в среде, не содержащей Ca (эксперименты без Са2+ с ЭГТА). Последний факт свидетельствует о том, что угнетение f МПКП не определяется блокадой кальциевой проницаемости пресинаптической мембраны. 3 пользу такого вывода свадете-

I-

6

Рис. 7.

2+

льствувт и данные, . полученные в экспериментах с блокадой Са -каналов ионами марганца и магния. После инкубации мышц в растворе Ринге-ра с или Мд2+ пресинаптическое действие ХМ на МПКП сохранялось в полной мере. Для более глубокого понимания механизма влияния КХ на f МПКП необходимо было установить, связано ли усиление преспнаптического эффекта ХМ по мере увеличения ССа^+10 (рис. 7) с ростом внутриклеточного содержания кальция . tCa^+lj_ или обусловлено тем, что Сай+ модулирует пресинаптическое действие ХМ снаружи, не проникая в цитоплазму. Для решения этого вопроса пресинаптическое действие КХ изучали в условиях, способствующих росту 1Са2+]^.

Одним из способов увеличения ICa^+3i является деполяризация нервных окончаний избытком К+, приводящая к открыванию потенциалозави-симых кальциевых каналов tkatz, Miledi, 1969; Kim, Sanders, 19791. На рис. 8 приведены данные по изучению зависимости пресинаптическо-го действия КХ на ШШ при возрастании tK+}Q от 0,5 до 12,0 ммоль/л. По оси ординат слева - f МПКП Симп-с""* ),а справа - отношение f МПКП через 20 мин действия КХ к исходной; по оси абсцисс - концентрация К+ в растворе Сммоль/л). Из рисунка следует, что пресинаптический эффект КХ от tK+]Q не зависит. Поскольку увеличение СК ]Q сопровождалось ростом Со чем свидетельствовало возрастание f МПКП), нет оснований думать, что угнетакже влияние КХ на спонтанную секрецию реализуется через [Са^+]г

!

г--1-1-1 i i ...

0 2.5 5 7.5 Ю 12 fV

Рис. 8.

Подтверждением этому выводу явились результаты опытов с изучением возможного участия системы циклических нуклеотидов в реализации пресинаптического действия ХМ. Известно, что добавление к раствору Рингера дибутирильных производных цАМФ и цГМФ увеличивает Г МПКП за счет увеличения [Са2+3. Аналогично действует и теофиллин, который, блокируя фосфодиэстеразу, так же приводит к накопление в цитоплазме? циклических нуклеотидов и росту [Goldberg, S)ri-

der, 1669; Greengard, 1979].

В наших экспериментах инкубация нервно-мышечных препаратов в среде с дибутирильныш! производными цАМФ и цГМФ С1-10" - 5-10 ~6 моль/л) или теофиллином С1-10"4 - 1-10~® моль/л) сопровождалась ростом f МПКП, соответственно, не 185,3*5,4, 176,3±6,7 и 194,3*9,2%. Добавление к среде КХ (5-10"® моль/л) вызывало такое же снижение f МПКП, что и в контроле.

Таким образом, принимая во внимание, что пресинаптический эффект КХ не изменяется при существенной вариации значений [Са2+]i как за счет блокирования входа Са2+ через каналы, так и за счет извлечения его из внутриклеточных хранилищ, можно думать, что не КХ

влияет на метаболизм Саг+, а сам Са2+, находясь в окружающем растворе, модулирует эффективность взаимодействия ЮЛ с пресинаптической мишенью. Какая же структура может выполнять роль такой мишени? Поскольку синаптические рецепторы кроме ионных каналов могут быть сопряжены с ферментными системами (Vetulani, 19881, важным представлялось исследовать действие ХМ при изменении активности ферементов, связанных с синаптической функцией.

2.1.6. Исследование роли синаптической холинестеразы в осуществлении пресинаптического действия ХМ.

С. J.Duncan и S. J.Publicover С1979) привели данные, позволяющие думать, что роль ПАР, реализующего влияние ХМ на f МПКП может выполнять синаптическая холинестераза СХЭ). Для проверки справедливости этой гипотезы нами было проведено изучение пресинаптического влияния ХМ в условиях ингибирования ХЭ. В качестве ингибиторов использовали необратимый ФОИ армии С1-10"5 моль/л, инкубация 30 мин с последующей отмывкой) и обратимый - прозерин С3-10"® моль/л), блокирующие как специфическую, так и неспецифическую ХЭ.

Изучение эффекта КХ С5-10"® моль/л) начинали после того, как амплитудно-временные характеристики МПКП после ингибирования ХЭ стабилизировались. Эксперименты показали, что предварительная обработка мышц ингибиторами ХЭ не повлияла на пресянаптическое действие КХ: f МПКП в препаратах, обработанных армином и прозерином, к 20 мин действия ХМ снижалась, соответственно, на 40,1*5,1% Сп=7) и 39,2*6,1% Сп=8), что не отличается от эффектов при интактной ХЭ СР>0,1).

Таким образом гипотеза C.J.Duncan и S.J.Publicover С1979) экс-периметально не была подтверждена, и мы можем заключить, что синаптическая ХЭ не выполняет функции ПАР.

2.1.7. Исследование участия Na+, К+- АТФазы мембраны нервных окончаний в пресинаптических эффектах ХМ.

К числу биохимических систем клетки, участвующих в осуществлении синаптической функции, принадлежит Na+, К+- АТФаза, роль которой заключается не только в поддержании концентрационного градиента На+ и К+ [Thomas, 1972; Лишко, 1972], но и в регуляции процесса секреции медиатора [Vizi, 1978; Глебов, Крыжановский, 1978]. Если к этому учесть, что ХМ способны изменять активность Na+,K+- АТФазы

[В1оисЬа, Те1з1пдег, УуикоёП, 1979; Платонова, Посконова, Родионов, 19861 и описано сходство строения каталитической субъединицы Иа+,К+-- АТФазы и НХР [Е1шап, НеПЬгопп, Jbгgensen, 1982], то вполне можно было предположить, что эта ферментная система в синапсах холоднокровных способна выступать в роли пресинаптического рецептора, контролирующего спонтанную квантовую секрецию медиатора. Для проверки справедливости данной гипотезы исследовгян пресинаптпческое действие КХ в условиях инактивации Ма+, К+- АТФазы двумя способами - при действии оуабаина и путем удаления из раствора К+, а также анализировали характер взаимодействия КХ и оуабаина {Никольский, Бухарае-ва, Бадрутдинов, 19893.

Оуабаин в течение первых 60 мин не изменял Г МПКП. Затем она экспоненциально возрастала . Наличие длительного латентного периода действия оуабаина на Г МПКП позволило исследовать эффект КХ при ин-гибировании натрий-калиевого насоса. В концентрации 3,5-10"^ моль/л оубаин уменьшал пресинаптический эффект КХ С5-10"6 моль/лЗ: средняя Г МПКП в присутствии оуабаина снижалась на 2б,6±5,3% (п=4; Р<0,053, тогда как в контрольных условиях она уменьшалась на 56,1±7,2% (п=23; Р<0,05). В концентрации 5-10"° моль/л оуабаин полностью устранял действие КХ на Г МПКП. Способность оуабаина блокировать пресинаптический эффект КХ исчезала после 20 мин отмывания ингибитора. С целью установления характера взаимодействия оуабаина и ХМ зависимость величины пресинаптического действия КХ от его концентрации в контроле и в присутствии оуабаина представлена в координатах Лайнуивера-Бер-ка и приведена на рис. 9, где 1 - зависимость доза-зффект в контроле, 2 - в присутствии оуабаина. По оси абсцисс - обратная величина концентрации КХ, по оси ординат - обратная величича эффекта. Ана-

1

"55

Рис. 9.

лиз по методу наименьших квадратов показал, что экспериментальные данные аппроксимировались двумя прямыми, различающимися по углу наклона и пересекающимися в точке, лежащей на оси абсцисс. Такое расположение графиков, характерное для некчнкурентного антагонизма между агентами [Диксон, Уэбб, 1966], свидетельствует о том, что оуабаин и КХ связываются разк .ми центрами Na+, АТФазы. Естественным было ожидать, что инактивация Na+, К+- АТФазы путем удаления из раствора К+ так же должна препятствовать развитию пресинаптического действия КХ.Однако добавление КХ (5-10~6 моль/л) через 30 мин после удаления К+ вызывало пресинаптическое действие, не отличающееся от контрольного, несмотря на то, что Na+, К+- АТФаза была инактивирована, о чем свидетельствовал рост f МПКП, совпадающий по динамике и величине с наблюдаемым в оуабаине.

Таким образом можно заключить, что в механизме действия КХ на спонтанную секрецию квантов медиатора имеется оуабаин-чувствитель-ное звено, непосредственно не связанное с активностью натрий-калиевого насоса.

2.1.8. Температурная зависимость эффектов ХМ на f МПКП.

Поскольку проведенные исследования не выявили участия в реализации действия ХМ на спонтанную секрецию квантов медиатора у холоднокровных ионных каналов, ХЭ, Na+, К+- АТФазы и системы циклических нуклеотидов, то можно было надеяться,¿что приблизиться к пониманию данного пресинаптического эффекта можно, изучив температурную зависимость действия КХ на f МПКП. Эксперименты, проведенные в диапазоне температур от 5 до 30°С [Струнский, Никольский, Борисовер, 1990] показали, что под действием КХ (5-10~6 моль/л) f МПКП при всех значениях температуры снижалась в среднем на 49,4±2,2У., то есть не зависела от температуры. Не было выявлено зависимости от температуры в диапазоне от 10 до 25°С и для действия КХ в концентрации 1-10~5 моль/л. Однако в концентрации 6-10 ~7моль/л при 8,5°С КХ снижал f МПКП на 38,1±4,7%, а при 30°С - лишь на 16,3±3,2%. В концентрации 3-Ю"7моль/л при 6°С эффект составил 28,8±2,1Х, а при 26° С он отсутствовал.

Та::им образом в насыщающих концентрациях пресинаптическое действие КХ не зависело от температуры, а в ненасыщающих, близких к пороговым - зависело, но только не увеличивалось с ростом температуры, как ото свойственно физиологическим процессам, а уменьшалось.

Если в механизме действия ХМ на f МПКП участвуют ионные каналы или ферментные системы, то необходимо допустить, что их обычная температурная зависимость Сускорение процесса с ростом температуры) точно компенсируется противодействующим процессом, имеющим обратную температурную зависимость. Анализ такой возможности в математической модели показал, что она маловероятна. Из результатов моделирования следует, что столь своеобразная температурная зависимость эффектов КХ в разных концентрациях на Г МПКП может быть достаточно просто объяснена, если принять, что на начальном этапе действия КХ связывается с участком пресинаптической мембраны посредством физической адсорбции, а последующие стадии изучаемого механизма не зависят от температуры, то есть, что наблюдаемая температурная зависимость пресинаптического действия КХ полностью определяется температурной зависимостью адсорбции его молекул на мембране нервного окончания. Важно, что такая трактовка молекулярного механизма действия ХМ исключает участие в этих процессах температуро-зависимых канальных и ферментных систем, что вполне согласуется с приведенными выше данными. Учитывая, что четвертичные аммониевые основания, к которым относятся АХ и КХ, не проникают через мембраны [Putney, Askari, 1980], а также принимая во внимание весьма узкий интервал между пороговой и насыщающими концентрациями ХМ, свидетельствующий как об относительно небольшом числе центров связывания ХМ с нервным окончанием, так и об их высоком сродстве, можно думать, что в основе изучаемого пресинаптического эффекта лежит непосредственная модификация ХМ пресинаптической мембраны, состоящая, например, в.изменении поверхностных электрических зарядов мембраны в области активных зон.

2.2. Эксперименты на теплокровных.

2.2.1. Влияние М, Н-холиномиметических агентов на МПКП в растворе Рингера-Кребса нормального ионного состава при комнатной температуре.

АХ (5-10"6- 7,5-10-5 моль/л) и КХ С5-10"6- 5-Ю""5 моль/л) при

действии на нервно-мышечные препараты крысы и человека оказывали влияние на постсинаптическую мембрану, выражающееся в ее деполяризации и снижении амплитуды МПКП. Вместе с тем, при анализе f МПКП достоверных свидетельств пресинаптического действия ХМ получено но

было [Никольский, 1982, 1984]. Так, если в m.soleus и в ш.extensor digitorum longus крысы f МПКП в исходном состоянии была, соответственно, 0,83±0,12 (п=23) и 0,96±0,10 Сп=16), а в m. thyreohyoideus человека 1,21*0,17 Сп=14) имп-с , то в присутствии АХС5-10"5 моль/л) f МПКП составляла, соответственно, 0,89*0,12 Сп=19; Р>0,1), 0,99*0,13 Cn=6; Р>0.05Э и 1,36±0,18 Сп=8; Р>0,1) имп-с , а при действии КХ С1-10 ~S моль/л) - 0,92±0,15 (п=10; Р>0,1), 1,08±0,11 Сп=7; Р>0,1) и 1,34*0,12 Сп=6; Р>0,1) имп-с"1.

Однако в отдельных синапсах имело место возрастание f МПКП на 5 - 23%. Анализ исходного состояния квантовой секреции в этих синапсах показал, что f МПКП была повышенной. Поскольку одним из важных факторов, определяющих f МПКП, является величина МП нервных окончаний, то это наблюдение было воспринято нами как подтверждение справедливости гипотезы [Katz, 1978; Miyamoto, Volle, 1974] о том, что выраженность пресинаптического действия ХМ может определяться уровнем поляризации нервных окончаний. Для детальной проверки этой гипотезы необходимо было провести изучение влияния ХМ на f МПКП при разных уровнях МП нервных окончаний. Так как из-за малых размеров нервных терминалей непосредственная регистрация МП, а тем более фиксация его на определенном уровне не возможны, то для изменения поляризации использовали широко применяемый прием - вариирование содержания в среде К+ от 2 до 15 ммоль/л с приблизительной оценкой величины МП по уравнению Нернста [Kim, Sanders, 1979].

2.2.2. Влияние М, Н-холиномиметических веществ на частоту МПКП при разном содержании ионов калия в растворе Рингера-Кребса.

Для изучения зависимости эффекта КХ от [К+]0было поставлено 36 экспериментов на m.soleus крысы (по 6 для каждой концентрации К+Э [Никольский, 1984]. Результаты исследований приведены на рис. 10. Видно Срис. 10, А), что в экспериментах с [К+]0 до 7,5 ммоль/л КХ не изменял f МПКП, а при увеличении [K+3Q свыше 7,5 ммоль/л - оказывал облегчающее действие, усиливающееся по мере возрастания исходной деполяризации нервных окончаний. Объяснение этому явлению было наш найдено при детальном изучении зависимости f МПКП от МП нервных окончаний. Увеличение С К+3 0 приводило к нелинейному росту f МПКП Срис. 10, А, б). Построение зависимости f МПКП от [К+]0 в полулогарифмическом масштабе показало, что связь спонтанного освобождения с

Рис. 10.

содержанием калия аппроксимируется двумя экспонентами Срис. 10, Б).

Пег гая экспонента, описывающая изменение освобождения медиатора в диапазоне 2-5 ммоль/л [K+]Q, характеризовалась меньшим значением постоянной роста к, чем вторая, отражающая зависимость f МЖП от [K+]Q в интервале концентраций 5-15 ммоль/л. Анализируя зависимость f МПКП от МП можно увидеть, что при МП нервных окончаний крысы около - 90 мВ ([К+]0= 2,0 ммоль/л) деполяризация даже на 10 мВ не давала реального прироста f МПКП, в то время как при исходном уровне МП около - 52 мВ C[K+]Q= 12,5 ммоль/л) f МПКП существенно возрастала при деполяризации нервного окончания всего на 1 мВ. Поскольку ХМ присуща способность деполяризовать двигательные нервные окончания, о чем говорят факты снижения под их действием порога раздражения терминалей [Hubbard, Schmidt, Yokota. 19(35), генераций антидромно распротраняющихся ПД [Werner, 1960; Randi , Strsughan. 19691, то становится понятным, что при высоком исходном МП агонисты не оказывают заметного влияния на секрецию квантов медиатора, в то время как при пониженном МП Сувеличение [K+]Q) та же самая небольшая деполяризация приводит к облегчению выброса медиатора.

Нами были проведены расчеты, показавшие [Никольский, 1974], что для прироста f МПКП на 407. С что имеет место при действии КХ в концентрации1 -10 "5 моль/л при [К I = 12,5 ммоль/л) достаточно деполяризовать нервные окончания всего на 2 мВ. Таким образом, полученные

результаты показали, что облегчающее действие КХ на спонтанную секрецию связано со способностью ХМ деполяризовать нервные окончания. Однако открытым остается вопрос о том, является ли это действие прямым, то есть реализуемым за счет непосредственной активации агонис-тами ПАР, или же развивается вторично, за счет постсинаптического действия ХМ. Для ответа на этот вопрос были проведены эксперименты по изучению влияния КХ на спонтанную квантовую секрецию медиатора при фиксации МП мышечного волокна на уровне ЕрК+.

2.2.3. Влияние карбахолина на спонтанную секрецию квантов медиатора при фиксации МП концевой пластинки на уровне калиевого равновесного потенциала.

Эксперименты были проведены на т. зо1еиз крысы, находящейся в растворе Рингера-Кребса с увеличенным до 13 ммоль/л содержанием К+ (Никольский, 19823. Расчеты показали, что при этом значении £К+10 ЕрК+ составляет около - 70 мВ. В наших экспериментах для надежности . фиксацию МП осуществляли на уровне - 100 мВ. Исходная амплитуда МТКП при этом составила в среднем 10,2*0,3 нА, а частота - 11,2±1,0 имп-с~* . Под действием КХ (1-Ю-5 моль/л) амплитуда МТКП снижалась на 40,2%, а Т МТКП увеличивалась до 19,8±1,4 имп-с"1 , то есть на 178,4%. Таким образом, предотвращение выхода К+ из мышечного волокна при активации постсинаптической мембраны не препятствует . усилению спонтанного освобождения медиатора поддействием КХ. Аналогичные результаты были получены и в том случае, когда КХ подводился непосредственно к терминальным разветвлениям аксона одного мышечного волокна через через микропипетку, что позволяло предотвратить деполяризацию соседних мышечных волокон с последующим выходом из них К+.

Таким образом можно заключить, что пресинаптическое действие АХ и его аналогов на спонтанное квантовое освобождение медиатора в синапсах теплокровных есть результат их прямого деполяризующего влияния на двигательные нервные окончания.

Для более глубокого понимания механизма пресинаптического действия холиномиметических агентов на Г МПКП прежде всего представлялось необходимым изучить фармакологические свойства рецепторов, его опосредующих.

2.2.4. Влияние на МПКП М-холиномиметических соединений и попытка устранить пресинантическое действие АХ и КХ мускаринолитиками.

Эксперименты были проведены на m.soleus крысы, находящейся в среде с увеличенным до 13 ммоль/л содержанием К+. Было исследовано влияние метилфурметида С1-10"7 - 1-Ю-0 моль/л), оксотреморина (1-10~7 - 1 -10 моль/л), метахолина С1-10-7 -3,5-10"° моль/л), муска-рина С1-10"7 - 3,5-Ю"6 моль/л) и L- и D-форм препарата F-2268 Clio-5 - 5-10"^ моль/л). Проведенные исследования показали, что пи одно из использованных веществ не оказывало влияния ни на пост-, ни на пресинаптические структуры: амплитуда МПКП, их частота и МП мышечного волокна оставались неизменными дажз при длительном Сдо 60 мин) контакте вещества с нервно-мышечным препаратом.

Предварительная инкубация мышцы в растворе с М-холинолитиком -атропином С1-10"8 - 1-10~® моль/л) или скополамином (1-Ю-7 - 5-Ю-6 моль/л) не оказывала влияния на выраженность действия АХ и КХ. Так АХ С5-10моль/л) тс 20 шш действия в растворе с 1К+ )0 12,5 ммоль/л увеличивал f МПКП на 29,3°/., а КХ С1 -10~5 молъ/л) - на 41,8%, что не отличается от контрольных данных (Р>0,1).

Вместе с тем нельзя не отметить, что при инкубации нервно-мышечного препарата в растворе с атропином С1-10"6- 7,5-10 моль/л) свыше 70 мин в большинстве синапсов наблюдалось прогрессирующее увеличение f МПКП, в некоторых синапсах она достигала значений, превышающих 100 имп-с .

Учитывая, что атропин, наряду с М-холинолитическими свойствами обладает способностью ингибировать Na+, К+ - АТФазу нервной ткани [Dloucha, Teisinger, Vyskoiil, 1979], было выдвинуто предположение, что наблюдаемый эффект атропина на f МПКП обусловлен его "оуабаин-подобным" действием, а не блокадой гипотетических пресинаптических МХР. Это предположение нашло экспериментальное подтверждение в наших биохимических исследованиях по определению активности Na+, К+ -АТФазы в гомогенатах седалищного нерва крысы.

Суммируя результаты экспериментов с М-холиноактивныыи соедине- -ниями, можно заключить, что на двигательных нервных окончаниях теплокровных отсутствуют МХР, контролирующие спонтанную квантовую секрецию медиатора.

Естественным было думать, что эффекты АХ и КХ опосредованы НХР.

2.2.5. Влияние Н-холиномиметических агентов на частоту МПКП.

На ш. soleus и m. extensor digitorum longus крысы и т. thyreohyo-ideus человека было изучено влияние на спонтанную секрецию медиатора холиномиметиков, обладающих избирательной НХМ-активностью - никотина С1-10"6 - 1-Ю-5 моль/л), суберилдихолина С5-10"7 - 7,5-10"® моль/л), тетраметиламмония С1-10"6- 1-10"5 моль/л). Все исследованные препараты аналогично КХ и АХ не влияли на секрецию медиатора при нормальном ионном составе среды и оказывали облегчающее действие на МПКП при увеличении [K+]Q. Этот эффект проявлялся при использовании агонистов в дозах, вызывающих деполяризацию постсинаптической мембраны, и возрастал при увеличении концентрации ХМ. Наличие положительной корреляции между выраженностью пре- и постсинаптического действия НХМ дало основание думать об общности фармакологических свойств пре- и постсинаптических НХР. Если это так, то специфический блокатор НХР постсинаптической мембраны - d-тубокурарин должен столь же эффективно снимать влияние ХМ на секрецию медиатора, как он это делает по отношению к постсинаптической мембране.

2.2.6. Влияние d-тубокурарина на пресинаптическое действие КХ.

Прежде чем приступить к исследованию влияния КХ на фоне кураре, предварительно изучали влияние самого холинолитика на f МПКП. Наличие у d-тубокурарина выраженного литического действия позволило исследовать его пресинаптический эффект для концентрации не более 7,5-10~7 г/мл. В диапазоне концентраций 1-10"7 - 7,5-10~7 г/мл d-ту-бокурарин не влиял на f МПКП, то есть не оказывал заметного пресина-птического действия на спонтанную секрецию.

В присутствии d-тубокурарина С 2,5 -10 ~7 моль/л) чувствительность нервных окончаний к КХ (1-10 моль/л) значительно снижалась. Так, если в интактном препарате f МПКП возрастала до 148,5'/., то в курари-зированном - только до 112,3% СР<0,05).

Для выяснения характера взаимоотношений между КХ и d-тубокура-рином строили кривую зависимости пресинаптического эффекта от дозы в интактных и предварительно обработанных d-тубокурарином нервно-мы-шечннх препаратах. Эксперименты показали, что под влиянием d-тубокурарина болограмма концентрация-эффект для КХ смещалась в сторону

больших концентраций, но оставалась параллельной первой болограмме,

полученной на препаратах, не обработанных с-тубокурарином. Аналогичное смещение зависимости доза-эффект имело место и для постсинап-тического действия КХ. Подобное расположение кривых концентрация-эффект свидетельствует о конкурентно-антагонистических взаимоотношениях между КХ и d-тубокурарипом как на мембране нервных окончаний, так и на постсинаптической мембране [Комиссаров, 1969].

Таким образом, облегчающее пресинаптическов действие АХ и его аналогов па спонтанную квантовую секрецию медиатора в синапсах теплокровных обусловлено активацией НХР, расположенных на двигательных нервных окончаниях и по своим свойствам сходных с ХР концевой пластинки.

Каким же образом активация этих рецепторов приводит к облегчению квантового освобождения АХ?

2.2.7. Роль Са2+ в пресинаптическом эффекте ХМ.

Учитывая зависимость f МПКП от содержания в цитоплазме нервных окончаний Ca2+ [Landau, 1969; Katz, Miledi, 1969] можно думать, что активация ПАР приводит к росту Са2+-пронпцаемости пресинаптической мембраны. Это предположение нашло подтверждение в установлении того факта, что при нахождении нервно-мышечного препарата в растворе без Са.с+ ХМ не вызывали увеличения f МПКП. Представляло интерес выяснить, изменяется ли в результате активации ПАР число открытых -каналов или же меняется кинетика работы одиночного канала. Определенную информацию на этот счет можно было получить при изучении зависимости f МПКП от [Ca2+]Q в присутствии ХМ и без них. Проведенное исследование показало, что степень прироста f МПКП под влиянием КХ при разных значениях [Са2+30 постоянна, то есть КХ не изменяет характера зависимости f МПКП от кальция. Это дает основания полагать, что под действием КХ происходит увеличение числа открытых Ca ''"-каналов, а не изменение кинетики отдельного канала, что согласуется с представлением о способности ХМ деполяризовать пресинаптическую мембрану, так как следствием деполяризации и является открытие дополнительных Са2+~каналов. Проведенный далее анализ показал, что пре-синаптическое действие ХМ полностью сохраняется в присутствии бло-катора Иа+-каналов - тетродотоксина СТТХ), но эффективно устраняется блокатором Са2+-каналов - Мп2+. Из всего сказанного следует, что после взаимодействия ХМ с ПАР открываются каналы, нечувствительные

к ТТХ (возможно, сходные с хемовозбудимыми каналами концевой пластинки), происходит деполяризация терминали и открытие дополнительных потенциалозавиоимых Са2+-каналов нервного окончания, в результате чего усиливается спонтанная квантовая секреция медиатора.

2.2.8. Изменение направленности пресинаптического действия ХМ при повышении температуры среды.

Выявление своеобразной температурной зависимости пресинаптического действия ХМ на Г МПКП у холоднокровных [Струнский, Никольский, Борисовер, 1990] делает целесообразной оценку указанной зависимости и в синапсах теплокровных. Особый интерес представляло изучить пре-синаптическое действие ХМ на спонтанную секрецию медиатора при температуре, близкой к физиологической. Для оценки температурной зависимости изучали влияние КХ С110 —^ моль/л) в среде с увеличенным до 13 ммоль/л содержанием К+ при 15,0±0,5 и 25,0*0,5° С. При 15° С к 20 мин действия КХ Г МПКП увеличивалась на 21,3*6,5% (п=7; Р<0,05). При 25° С к 20 мин Г МПКП возрастала на 39,1*5,7*/. (п=6; Р<0,05). Таким образом, при увеличении температуры эффект КХ возрастал с (15 - 25° ") = 1,8, что свидетельствует об участии в механизме пресинаптического действия КХ у теплокровных температурозависимых процессов и подтверждает справедливость представления об участии в этих процессах ионных каналов.

Принципиально важные данные были получены нами при изучении пресинаптического действия КХ (1-10 ~5 моль/л) в нормальной ионной среде при температуре 38,0*0,5° С (соответствующей температуре теплового ядра крысы). В этих условиях КХ оказывал угнетающее действие на спонтанное освобождение квантов медиатора. Так к 16 мин действия КХ Г МПКП уменьшалась на 37,8*6,0% (п=8; Р<0,05). Этот эффект наблюдался в очень узком температурном диапазоне: он отсутствовал при 33,0*0,5, 35,0*0,5 , 36,0*0,^ С; при температуре 37,0* ±0,5° С в двух экспериментах эффект также не был зарегистрирован, а в трох других - Г МПКП уменьшалась в присутствии КХ, соответственно, на 16,7, 23,3 и 41,9%. Это позволяет температуру 37,0° С рассматривать как пороговую для возникновения угнетающего действия КХ на Г МПКП и дает основание полагать, что угнетающий эффект ХМ проявляется лишь при температуре, близкой к физиологической.

Не менее важным представляется и установление факта, что б-ту-бокурарин при 38° С не устранял угнетающее действие КХ иа Г МПКП.

Это может свидетельствовать od общности молекулярных механизмов эффекта угнетения спонтанной секреции квантов медиатора в синапсах теплокровных и холоднокровных.

3. ИССЛЕДОВАНИЕ УЧАСТИЯ ПРЕСИНАПТИЧЕСКИХ ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ В РЕГУЛЯЦИИ НЕКВАНТОВОГО ОСВОБОВДЕНИЯ АЦЕТИЛХОЛША. МЕХАНИЗМ НЕКВАНТОВОЙ СЕКРЕЦИИ.

Известно, что в состоянии покоя АХ в нервно-мышечном синапсе выделяется не только в виде квантованных порций, состоящих из нескольких тысяч молекул ÍFatt, Katz, 1950, 1951; Kuffler, Yoshikami, 1975], но и неквантовым путем - в виде отдельных молекул tKalz, Mi-ledi, 1977; Vyskoáil, liles, 1977]. Установлено, что неквантовое освобождение обеспечивает выход в синаптическую щель почтя 97% АХ в покое [Katz, Miledi, 1977; Vysko&Ll, Nikclsky, Edwards, 19831. Согласно имеющимся представлениям [Katz, Miledi, 1977], в основе механизма неквантового освобождения лежит утечка АХ из цитоплазмы в си-наптическую щель по градиенту концентрации через пресинаптичеслу» мембрану. Поскольку нами была установлена способность АХ и err аналогов модулировать спонтанную секрецию квантов медиатора как за счет активации ПАР, так и путем нерецепторной модификации свойств пресинаптической мембраны, представляло интерес изучить возможность ХМ изменять интенсивность неквантового освобождения АХ.

Эти исследования были начаты в 1981 г. в Институте физиологии АН ЧСФР совместно с Ф. Выскочилом и С. Тучеком, а затем продолжены в Казанском медицинском институте совместно с В.Л.Ворониным и Т.И.Оранской.

Так как интенсивность неквантового выхода АХ значительно выше в синапсах теплокровных, чем холоднокровных [Katz, Miledi, 1977; Vyskoiil, liles, 1977; Vyskoiil, Nikolsky, Edwards, 1983], то все

исследования были проведены на диафрагмальной мышце белых мышей. '.!н-тенсивность неквантового освобождения АХ оценивали электрофизиологическим методом по величине Н-эффекта (Katz, Miledi, 1977]. а также радиоэнзиматическмм методом [Dolezal, Tuiek, 19831. Радиознзиматиче-ский метод использовали при изучении влияния на неквантовую секрецию Н-ХМ, поскольку они обладают выраженным постсинаптическкм действием, исключающим использование Н-эффекта в качестве показателя интенсивности неквантового освобождения АХ.

3.1. Радиоэнзиматичеокое исследование влияния КХ на неквантовое освобождение медиатора.

Изолированную диафрагму мыши инкубировали в определенном объеме оксигенируемого раствора Рингера-Кребса при 37° С в течение часа, а затем определ'ли содержание в этом растворе АХ по методу A.M. Goldberg и R.Е.McCaman (1973) в модификации V. Dolezal и S.Tuiek (1983), основанному на превращении АХ в [ эгР]-фосфорилхолин при участии АХЭ и СзгР)-АТФ с последующим измерением радиоактивности.

Контрольные эксперименты показали, что количество выделенного АХ составляло 4,67*0,11 пмоль-г"1 -час"1 . Известно, что значительная часть медиатора выделяется не из нервных окончания, а из мышечной ткани [Mitchell, Silver, 1963], где АХ синтезируется при участии карнитичацетилтрансферазы СТибек, 1982]. Специально проведенные измерения на предварительно денервированной половине диафрагмальной мышцы показали, что из мышечных волокон, лишенных нервных окончаний, выделяется 2,17*0,20 пмоль-г1 -час"1 АХ (п=6). Таким образом, доля АХ выделенного из нервных окончаний, составила около 2,5 пмоль-г1 • час"1. Расчеты показали, что при средней частоте МПКП 1,31*0,2 имп-с"1 вклад АХ, освобожденного квантовым путем, в общее количество не превышает 4%.

В результате инкубации нервно-мышечных препаратов с сохраненной иннервацией и предварительно денервированных в среде с КХ Clio моль/л) в обоих случаях было выявлен;? уменьшение выхода АХ в инкубационную среду. Так, из денервированной диафрагмы освобождалось 1,73±0,11 пмоль-г"1 -час-1 (п=6), а из мышц с сохраненной иннервацией - 3,25*0,29 пмоль-г"1 -час"1 (п=7). Таким образом, под влиянием М, Н-холиномиметика КХ происходило уменьшение неквантового выхода АХ С 1,52 пмоль-г1 -час1 ).

Попытка снять влияние КХ на неквантовое освобождение медиатора d-тубокурарином (1-10 ~7 г/мл) успехом не увенчалась. Холинолитик, сам по себе слегка уменьшая неквантовое освождение АХ (на 9,1*0,4/0, не только не блокировал пресинаптическое действие КХ, но даже несколько потенциировал его.

На основании проведенных экспериментов можно было заключить, что влияние КХ на неквантовую секрецию реализуется либо через рецепторы мускаринового типа, либо посредством какого-либо норецептор-ного механизма.

3.2. Электрофизиологическое исследование влияния мускариновых

агонистов на неквантовую секреции АХ.

Исследовали интенсивность неквантового освобождения АХ в присутствии М-ХМ метилфурметида, оксотреморина и препарата Г-2268 СЬ и 0). Мерой интенсивности неквантовой секреции был Н-эффект - гиперполяризация постсинаптической мембраны мышечного волокна с ьнгиби-рованной АХЭ, развивающаяся после блокады АХ-рецепторов ¿-тубокура-рснои С^г. МИссИ, 1977]. Результаты экспериментов приведены в таб. 2. Из таблицы следует, что ни один из использовавшихся М-ХМ не

Величина мембранного потенциала синаптической области мышечного волокна и Н-эффект в присутствии М-холиномиметических агентов.

Таблица 2.

Величина МП СмВ) в синапт.зоне

Агонист Концентр, п

Сммоль/л)

до действия б-ТК

после действия <ЬТК

р-2268 СО)

Оксотреморин

Г-2268 СЬ)

Контроль-

Мети лфурметид 1-10

МО"7 40 78,2±0,8

5-Ю"7 36 80,1*0,7

1-Ю"6 50 77.3*0.4

7,5-Ю"6 46 79, 0±0,9

1-Ю"7 30 81,210,4

МО"6 31 80,5*1,2

1-Ю"5 44 75,9*0,9

1-Ю"7 36 79, 8±0,6

1-Ю"6 40 75,3*0,7

5-Ю"6 54 78,1*0,4

1-Ю"7 20 77,8*0,7

5-10 "б 36 83,4*1,2

1-Ю"5 53 80,0*0,8

136 78,1*0,6

84,2*1,0 83,5*0,7 85,8*0,7

ез,1*1,1

85,0*0,4 87,2±0,6 86,3*0,5 82,4*0,4 66,2±0,6 80,4*0,6 83,810,3 83,7*0,7 89,5*0,8 86,4*1,2

6.1

5.3

5.7

5.8 6,0 6,0 5,8 6,5

6.4 5,1 5,7

5.0

6.1 6,4

оказывал влияния на величину Н-эффекта, что можно расценить как свидетельство отсутствия на двигательных нервных окончаниях теплокровных мускзриновых рецепторов, контролирующих неквантовую секрецию медиатора.

Таким образом, ХМ способны снижать интенсивность неквантового освобождения АХ посредством механизма, не связанного с вовлечением пресинаптическкх ХР. В этой связи уместно вспомнить, что Н-ХМ оказывают влияние на квантчуп секрецию АХ не только через рецепто-рный механизм, контролирующий выброс квантов медиатора, но и через его синтез.

3.3. Механизм неквантового освобождения АХ.

3.3.1. Температурная зависимость процесса неквантовой секреции.

Исследование механизма неквантового освобождения АХ мы начали с изучения температурной зависимости процесса, сопоставляя ее с температурной зависимостью спонтанного квантового освобождения [Никольский, Воронин, 1986]. Эксперименты, проведенные в диапазоне температур 10 - 35°С показали, что спонтанный квантовый выход АХ по мере возрастания температуры усиливается. В температурной зависимости неквантового освобождения ¿ыло отмечено два относительных максимума: при 20 и 35°С. При температуре ниже 10°С неквантовый выход АХ отсутствовал. Был проведен-расчет эффективной энергии активации (Ер процессов квантового и неквантового освобождения АХ. С этой целью для обоих процессов строили график Аррениуса, приведенный на рис. 11, где на нижней оси абсцисс - величина, обратная абсолютной температуре, а на верхней - соответствующие значения температуры ь градусах Цельсия. По осям ординат - Г МПКП Ссправа) и величина Н-эффекта Сслева). Поскольку Г МПКП, представленная в полулогарифмическом масштабе, линейно зависела от температуры во всем исследованном температурном диапазоне, значение Еа для всего интервала температур составило 57,0 кДж/моль С13,6 ккал/моль). Энергия активации, характеризующая неквантовую секрецию, рассчитанная для линейных участков температурной зависимости Н-эффагста, в диапазоне 12,5 - 20°С составила 45,5 кДж/мсль С10,8 ккал/моль), а в диапазоне 25 - 30°С - 38,2 кДж/моль С9,2 ккал/моль).

40

30

20

10

0°С

ЮН

-3,0

аэ 5

32 - 33 34 35 36 1/Т Ю-4

Рис. 11.

Таким образом, зависимость неквантового освобождения АХ от температуры значительно сложнее, чем квантового. По-видимому, неквантовый выход АХ в синаптическую щель определяется несколькими последовательно-параллельными процессами. Хотя эти данные не выявляют конкретный молекулярный механизм процесса неквантовой секреции, однако позволяют высказать на этот счет некоторые соображения. Анализ характера полученной зависимости и значение Еа* близкое к таковому для квантового спонтанного освобождения, дают основание думать, что механизм неквантовой секреции не может быть сведен к процессу диффузии молекул передатчика через открытые ионные каналы. Согласно имеющимся данным (Frankenhauser, Moore, 1963], величина Q1Q для транспорта ионов через мембрану нерва равна примерно 1,2, что соответствует высота энергетического барьера не более 3 ккал/моль. Полученные в нашем исследовании значения Еа*процесса неквантовой секреции АХ свидетельствуют не в пользу "канальной" гипотезы.

C.Edwards и соавт. (1985, 1987) высказали идею, что переносчиком молекул АХ из цитоплазмы нервной '.ерминали во внешнюю среду мо-

3.3.2. Исследование роли различных транспортных систем мембраны нервной терминала в неквантовом освобождении АХ.

жет быть система транспорта АХ мембраны синаптических везикул, которая встраивается в пресинаптическую мембрану при экзоцитозе. Однако результаты изучения температурной зависимости спонтанной секреции медиатора, изложенные выше, заставляют усомниться в справедливости предлагаемой гипотезы, поскольку не наблюдалось прямой связи между возрастающей гри увеличении температуры f МПКП и величиной Н-эффекта Сем. рис.12). Это противоречие заставило нас изучить состояние неквантовой секреции при изменении f МПКП другими способами. Так, исследование зависимости Н-зффекта от содержания Са2+ и К+ в среде [Vyskoii1, Nikolsky, Edwards, 19831 также не выявило прямой связи между процессами спонтанной квантовой и неквантовой секреции: повышение f МПКП при увеличении tCa2+]Q или [K+]Q сопровождалось угнетением неквантового освобождения. Особенно отчетливо разобщенность процессов экзоцитоза и неквантовой секреции была выявлена в экспериментах с сахарозой и эритрозином tVyskoiil, Nikolsky, 19901, в которых указанные агенты, вызывая мощное Св десятки раз) увеличение f МПКП, ке меняли Н-эффект. На основании этих данных участие системы транспорта АХ в синаптические везикулы в процессе неквантового освобождения может быть отвергнуто.

Несомненный интерес представляло изучение участия в механизме некваотового освобождения АХ На+,К+-АТФазы мембраны нервных окончаний. Это обусловлено тем, что Ка+,К+-АТФаза, создавая градиент ионов Na, обеспечивает тем самым энергией многие транспортные процессы [Лишко, 1972). С другой стороны, ложно »было предполагать, что На+,К+-Ш>аэа сама может выполнять роль транспортного механизма для АХ, Были проведены эксперименты, где исследовалась величина Н-эффе-кта при изменении активности На+,К+-АТФазы. Установлено, что блокирование Na+,K+-AT4>a3ii изъятием ионов К из раствора, ванадатом С1-10"4 моль/л) к оуабаином С 5-10 моль/л) приводило к постепенному угнетению неквантовой секреции с полным ее прекращением через 1 час инкубации. Активация Ка+,К+-АТФазы инсулином (200 ЕД/мл) и норадре-налином (1 -10 моль/л) не меняла интенсивность неквантового освобождения. Эти данные свидетельствуют о том, что На+,К+-АТФаза неявляется непосредственным переносчиком АХ. в неквантовой форме и участвует в его транспорте, возможно, за счет энергообеспечения других транспортных систем.

Известна тесная связь системы захвата холина высокого сродства ССЗХВС) с Na ,К -АТФазой мембраны нервных терминалей iSimon, Kuhar, 1976], что и побудило нас. исследовать возможность участия СЭХВС' в

процессе неквантового освобождения АХ. Блокаду СЗХВС проводи™ двумя способами: специфическим ингибитором гемихолинием-3 [Marchbanks, 19583 и изъятием из среды Na+ с заменой на Li+ С Vaca, Pilar, 1979]. Как первый, так и второй способ блокады СЗХВС в течение нескольких минут полностью прекращали неквантогое освобождение АХ. Активация СЗХВС добавлением холина в среду в сочетании с низкочастотной стимуляцией нерва (3 иш-с1 3 сопровождалась усилением неквантовой секреции [Никольский, Воронин, Оранская, 1990]. Поскольку прекращение неквантового освобождения ЛХ Б препаратах, обработанных гемихолинием-3, наступало задолго до истощения запасов цитоплазматического АХ, а усиление неквантовой секреции при стимуляции СЗХВС развивалось очень быстро, то можно думать, что СЗХВС принимает непосредственное участие в переносе АХ в неквантовой форме.

3.4. Влияние АХ неквантового происхождения на функциональное состояние постсинапти'.'еской мембраны.

Известно, что в интактном нервно-мышечном препарате теплокровны). ИП мышечного волокна в синаптической зоне на несколько мР выше, чем во внесиналтической [Vyskoöil, 1974]. Нами было предположено, что эта гиперполяризация связана с АХ [VyskoSil, Nikolsky, Edwards, 1933], который, как известно, в низких концентрациях способен активировать Ма+,К+-АТФазу [Dloucha, Teisinger, Vyskoíil, 1979]. Учитывая, что в покое неквантовым путем освобождается основное количество медиатора, можно было предположить, что указанная тперпо-ляризация обусловлена воздействием на постсинаптическую мембрану АХ неквантового происхождения. Для проверки этой гипотезы исследовали МП мышечного волокна в синаптической и внесинаптической зонах после перерезки двигательного нерва, поскольку ранее нами было показано, что децентрализация нервных терминалей приводит к полному прекращению неквантовой секреции уже через 4 часа, в то время как квантовая секреция еще не меняется [Никольский, Воронин, Оранская, 1985 а]. Эксперименты показали, что динамика исчезновения гиперполяризации синаптической зоны мышечного волокна совпадает с постепенным угнетением неквантовой секреции АХ. При реиннервации мышцы гиперполяризация области концевой пластинки восстанавливалась паралельно с неквантовой секрецией АХ [Никольский, Воронин, Оранская, 1985 dl. Добавление АХ (5Ю~® моль/л, что соответствует концентрации, создаваемой неквантовым выходом [Vyskoíil, Nikolsky, Edwards, 198333 в

ванночку с денервированной мышцей приводило к быстрому восстановлению гиперполяриэации в синаптической зоне. Эти данные свидетельствуют о том, что АХ, выделяемый неквантовым путем, при интактной АХЭ гиперполяризует область концевой пластинки мышечного волокна за счет активации мембранной Ка+,К+-АТФазы.

В нервно-мышечном препарате после инактивации АХЭ в области концевой пластинки развивается стойкая деполяризация величиной в 5 -- б мВ. Мы предположили, что эта деполяризация способна вызвать инактивацию натриевых каналов околосинаптической области и внести вклад в развитие мионеврального блока. Для проверки такой возможности в изолированном френико-диафрагмальном препарате крысы,- где после ингйбирования АХЭ в ряде синапсов возникал полный блок проведения возбуждения, с помощью второго микроэлектрода гиперполяризова-. ли мышечное волокно. В 16 из 52 исследованных волокон наблюдалось восстановление способности электрогенной мембраны генерировать ПД. Эти эксперименты свидетельствуют в пользу представления об участии неквантовой секреции АХ в развитии нарушения синаптической передачи при отравлении ингибиторами АХЭ.

Однако дальнейшие эксперименты показали, что вклад неквантового освобождения в развитие блока синаптического проведения не ограничивается описанным механизмом. Выяснилось, что в результате длительного взаимодействия постсинаптической мембраны мышечного волокна с АХ неквантового происхождения чувствительность • ХР концевой пластинки к медиатору падает вследствие десенситизации [Гиниатул-лин, Оранская, Воронин, Никольский, 1990].

Все вышеизложенное свидетельствует о том, что АХ, выделяющийся из нервных окончаний в неквантовой форме, является одним из факторов, регулирующих величину МП мышечного волокна. Кроме того, он способен принимать участие в развитии блока нервно-мышечной передачи в условиях ингибирования АХЭ.

4. ИССЛЕДОВАНИЕ УЧАСТИЯ ЭНДОГЕННОГО АХ В РЕГУЛЯЦИИ ПРОЦЕССА ВЫЗВАННОГО ОСВОБОЖДЕНИЯ МЕДИАТОРА. •

Приведенные выше результаты показывают, что экзогенный АХ и его аналоги способны оказывать воздействие на все формы освобождения медиатора из двигательных нервных окончаний. При этом чувствительность терминалей к ХМ оказалась достаточно высокой, о чем свидетельствует эффективность этих агентов в низких концентрациях. Это

обстоятельство позволяет думать, что и эндогенный АХ, выделяющийся как в ходе ритмической активности, так и в покое, может оказывать

модулирующее воздействие на нейросекрецию [Kölle, 1S62; Полетаев, 1974; Lendger, 1977; Starke, 1935]. Однако, несмотря на распространенность такого представления, прямые экспериментальные факты в его подтверждение до настоящего времени отсутствуют.

Для решения вопроса о возможности модуляции синаптической передачи эндогенным АХ прежде всего бьгло необходимо оценить скорость удаления его из синаптической щели.

4.1. Исследование кинетики удаления из синаптической щьли АХ, освобожденного в ходе предшествующей активности.

Эксперименты были выполнены на "рассеченном" нервно-мышечном препарате лягушки в условиях фиксации МП. Для оценки скорости удаления медиатора из синаптической щели был использован феномен пост-синаптической потенциации, заключающийся в зависимом от содержания АХ в синаптической щели замедлении скорости спада тока концевой пластинки.

Было установлено, что при парном раздражении, благодаря развитию постсинаптической потенциации, второй ток концевой пластинчи спадал медленнее, чем первый [Магазаник, Никольский, Гиниатуллин, 1983; Magazanik, Nikolsky, Giniatullin, 1983].

В нервно-мышечных препаратах с интактной АХЭ наличие АХ в синаптической щели, определяемое по постсинаптической потенциации, выявлялось в течение десятков миллисекунд. Ингибирование АХЭ приводило к значительному замедлению скорости удаления АХ Сдо десятков секунд).

Результаты этих опытов свидетельствуют, что даже в условиях одиночного раздражения в синаптической щели в течение продолжительного времени поддерживается достаточно высокое содержание эндогенного АХ, связанного как с ХР постсинаптической мембраны, так, возможно, и ПАР.

4.Н. Исследование участия эндогенного \У. в модуляции освобождения медиатора в синапсах, образованных двумя аксонами.

Изучение участия эндогенного АХ в модуляции нейросекреции бы-

ло проведено на ш.sartorius лягушки с использованием синапсов, расположенных в одном районе мышечного волокна и образованных двумя аксонами [Magazanlk, Vyskoéii, 1973; Фросин, Никольский, Воронин, 19783. В электрофизиологических исследованиях активность таких синапсов проявляется в генерации ПКП, амплитуда которых при плавном вариировашш интенсивности раздражения скачкообразно меняется за счет разной возбудимости аксонов, участвующих в их образовании (Фросин, Никольский, Воронин, 1978]. Мы полагали, что, раздельно активируя аксоны, зоны иннервации которых перекрываются, можно получить возможность при раздражении одного из них использовать выходящие из терминали кванты медиатора в качестве источника эндогенного АХ, а, раздражая второй и рассчитывая m ПКП, наблюдать предполагаемые влияния эндогенного АХ на квантовую секрецию.

Эксперименты на "рассеченном" препарате m.sartorius с близко расположенными синапсами, характеризующимися высоким m ПКП, показали, что раздражение одного аксона приводит к уменьшению m ПКП во втором синапсе. По мере снижения m ПКП в первом синапсе добавлением в ванночку Мд2+ угнетение m ПКП во втором становилось менее выраженным и при и ПКП меньше 150 квантов не регистрировалось. D-тубокура-рарин в концентрации 2-Ю"*7 моль/л полностью блокировал влияние первого синапса на второй даже при высоком m ПКП.

Аналогичные данные были получены при фиксации МП синаптической зоны на уровне, превышающем ЕрК+ С-120 мВ).

Таким образом, описанные в литературе^ C.Miyamoto, 1978] и приведенные нами в предыдущих главах эффекты экзогенного АХ и других Н-ХМ являются не просто фармакологическими феноменами, а могут рассматриваться как физиологические механизмы регуляции синаптического проведения возбуждения.

Установление факта влияния терминалей одного аксона на нервные окончания другого позволяют думать, что аналогичные функциональные взаимоотношения могут иметь место и между терминальными разветвлениями одного аксона, а, возможно, и между отдельными активными зонами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что в нервно-мышечных синапсах холоднокровных и теплокровных животных АХ выполняет не только роль передатчика возбуждения, ко и свою вторую, регуляторную функ-

ктго. Эта функция на пресинэптнческом уровне заключается в контроле функционального состояния двигательных нервных окончаний, включая регуляцию всех форм секреции медиатора. Реализация этих регулятор-ных влияний обеспечивается рядом механизмов, среди которых самым чувствительным и бистро реагирующим является активация ПАР. Этот механизм представляет особый интерес по той причине, что он контролирует вызванное освобождение медиатора - процесс, обеспечивающим одну из основных синаптических функций - проведение нервных импульсов к мышце. Реализуется этот регуляторный механизм путем возбуждения ХР никотинового типа, расположенных на нервных окончаниях и связанных с ионными каналами. Активация таких рецепторов вызывает изменение амплитудно-временных характеристик потенциала действия нервных окончаний и снижает вход ионов кальция в цитоплазму, в результате чего происходит уменьшение и ПКП. Таким образом, активация 1АР эндогенным АХ приводит к угнетению выброса последующих порций медиатора по принципу отрицательной обратной связи. Каков смысл такого вида регуляции? Ответ на этот вопрос дают, по-видийсму, полученные нами данные о том, что глубина этой отрицательной обратной связи определяется состоянием объекта регулирования - секреторного аппарата нервного окончания: степень снижения: ш ПКП под влиянием АХ и других ХМ больше в тех синапсах, которые характеризуются более висо-ким квантовым выбросом. Такое дифференцированное ограничение освобождения медиатора может обеспечить оптимальный уровень секреции, при котором, с одной стороны, возникающий ПКП превышает величину критической деполяризации электрогенной мембраны ¡отечного вояокна, а с другой - нервные окончания предохраняются от "нерациональной" траты АХ, АХЭ - от блокирования избытком субстрата [Михельсон, Зеймаль, 19763, система захвата холина - от угнетения высокими концентрациями АХ [Уататига, 1973], а ХР концевой пластинкч - от десенситизации [Каи, ТЬез1еГГ, 1957; Магазашпс, 1970]. Можно думать, что особенно велика роль ПАР на некоторых стадиях онтогенеза, когда имеет" место функциональная недостаточность АХЭ СМадагагик е1 а1. , 1934].

В синапсах теплокровных, включая человека, наряду с НХР, контролирующими вызванную секрецию, существуют НХР, активация которых в условиях предварительной деполяризации нервного окончания приводит к возрастанию Г МПКП вследствие открытия кальциевых каналов. Наличие у ХМ способности увеличивать Г МПКП лишь в искусственных условиях, позволяет думать, что функция этих ПАР заключается не в модуляции спонтанной секреции квантов, а в регуляции поступления каль-

ция в нервное окончание в состоянии покоя. Активация таких ХР эндогенным АХ как квантового, так и неквантового происхождения, может приводить к поступления в нервные окончания ионов кальция, которые необходимы не только для обеспечения квантовой секреции, но и для реализации многих других процессов, включая синтез АХ [Wieland, 1983; TuSek, 1983].

Дополнительным свидетельством в пользу физиологического значения пресинаптических ХР является существование механизмов, обеспечивающих их крайне низкую способность к развитию десенситизации. Это свойство ПАР представляется очень важным, если учесть, что они постоянно испытывают на себе действие эндогенного АХ.

Наличие таких недесеыситизируемых ХР, делающих нервное окончание более чувствительным к АХ, чем постсинаптическая мембрана, и . способных угнетать вызванное квантовое освобождение медиатора, дает основание считать, что нарушение синаптлческой передачи, возникающее при введении в организм ХМ, обусловлено не только десенситиза-цией постсинаптической мембраны или снижением возбудимости электрогенной мембраны мышечного волокна, но и уменьшением освобождения медиатора. В пользу сказанного свидетельствует установленный нами факт, что снижение пресинаптической чувствительности к АХ, развивающееся у животных в результате длительной иммобилизации конечности, требует введения в организм увеличенных доз деполяризующих миорела-ксантов для достижения расслабления скелетной мускулатуры.

АХ может изменять функциональное состояние нервных окончаний не только через пресинаптический рецепторный механизм, но и другими, нерецепторными способам!. Один из них был нами описан для синапсов лягушки, где в условиях нормальной ионной среды АХ и другие Н-ХМ угнетали спонтанную квантовую секрецию. Механизм этого феномена оказался необычным: эффект не устранялся холинолитшсгми, не зависел от состг_ва ионной среды и температуры. Удалось установить, что первой стадией этого процесса является адсорбция молекул ХМ на мембране нервього окончания с последующим развитием ее температуронезависи-шл: превращений, приводящих в конечном итоге к уменьшению вероятности освобождения квантов медиатора из нервных окончаний.

Еще один путь, посредством которого АХ и его аналога могут сказывать влияние на эффективность синаптической передачи возбуждения - это влияние на синтез медиатора и мобилизацию его квантов. Этот механизм пресииаптического действия ХМ также не обусловлен активацией ПАР. Скорее всего, он связан со способностью АХ и других

ХМ угнетать систему захвата холина с высоким сродством [ 1'агасига, 1973; Simon, Mittag, Kuhar, 19761.

По-видимому, по этой же причине происходит угнетение в присутствие ХМ неквантового освобождения - процесса, в основе которого, как показали Фаши данные, лежит активный перенос молекул АХ череэ пресинаптическую мембрану с помощью переносчика, наиболее вероятным "претендентом" на роль которого представляется система захвата холина с высоким сродством. Поскольку увеличение содержания АХ в цитоплазме нервных окончаний выше определенного уровня тормозит его синтез [Jenden, Jope, Weller, 1S761, то активное выдеяенче АХ в неквантовой форме можно рассматривать как один из механизмов регуляции синтеза медиатора. Несомненно, что детальное изучение модуляции холиномиметиками неквантового освобождения расширит наши представления о физиологическом значении ацетилхолиновой обратной связи в нервно-мышечном синапсе.

Таким образом, на основании проведенного исследования можно сформулировать концепции, согласно которой в даогоконтуркой системе химической саморегуляции синаптической функции существенная роль принадлежит АХ, который по принципу отрицательной обратной связ.;, используя механизмы как рецепторного, так и нерецепторного воздействия на нервную терминаль, осуществляет регуляции всех форм освобождения медиатора.

ВЫВОДЫ

1. АХ и его экзогенные аналоги в нервно-мышечных синапсах холоднокровных и теплокровных в концентрациях, не активирующих пост-синаптическую мембрану, оказывают влияние на вызванное освобождение медиатора, котороэ проявляется уже при низкочастотном раздражении нерва и заключается в снижении m ШШ. Этот эффект зависит от исходного функционального состояния синапса: он более выражен в синапсах, способных к генерации ПКП с высоким ш. При высокочастотной стимуляции проявляется способность ХМ угнетать процессы синтеза и мобилизации медиатора-

2. Изучение механизма пресинаптического действия ХМ на m ПКП , обеспечивающего его снижение при редком раздражении, показало, что оно реализуется через ПАР, относящиеся к никотиновым ХР, о чем свидетельствуют следующие факты:

- аналогичное действие оказывали специфические Н-ХМ Сникотин,

суберилдихолин, тетраметиламыоний, холин) и не вызывали М-ХМ Сме-тилфурметид, оксотреморин, метахолип, мускарин, Г-2268):

- влияние АХ и КХ устранялось низкими дозами с!-тубокурарина, в то время как атропин и скополамин были неэффективны. Взаимоотношения между КХ и б-тубокурарином на нервном окончании носили характер конкурентного антагонизма.

Активация ПАР за счет изменения калиевой проницаемости преси-наптической мембраны приводит к укорочению ПД в проксимальных отделах нервных окончаний вследствие усиления выходящего калиевого тока. Результатом последнего является снижение входа Са2+ в терминаль и угнетение ш ПКП.

3. Влияние М-ХМ на мобилизацию и синтез медиатора проявляется в ускорении и углублении процесса снижения т ПКП при высокочастотном раздражении нерва и замедлении восстановления и ПКП после прекращения стимуляции. Эти эффекты не обусловлены ПАР, так как не устраняются ни никотиновыми, ни мускариновыми холинолитиками. Тубоку-рарин, сам обладающий аналогичным эффектом, потенциировал влияние КХ на синтез и мобилизацию медиатора.

4. Аппликация колхицина на двигательный нерв мышцы крысы приводит к исчезновению чувствительности нервных окончаний к ХМ. Аналогичное изменение пресинаптической чувствительности было обнаружено и в нервно-мышечных синапсах лягушки на 4 сутки после высокой перерезки двигательного нерва. Эти данные позволяют считать, что ПАР образуются в перикарионе мотонейронов,? а затем транспортируются быстрым аксональным током к терминалям, где встраиваются в пресина-птическую мембрану.

Длительная иммобилизация конечности крысы также приводит к снижению чувствительности нервных окончаний к ХМ.

5. Пресинаптическое действие АХ и КХ на спонтанную квантовую секрецию в синапсах лягушки проявляется в снижении Г МПКП без нарушения независимости освобождения квантов. Такой же эффект вызывают никотин, тетраметиламмоний и суберилдихолин. Мускариновые агонисты (метахолин, оксотреморин, метилфурметид, Р-22е8) не эффективны. Влияние АХ и КХ, а также специфических Н-ХМ не устраняется б-тубо-курарином и препаратом ГОМ-1119.

6. Влияние Н-ХМ на Т МПКП у холоднокровных не обусловлено активацией ПАР, связанных с ионными каналами или ферментными системами, а является следствием непосредственной модификации ими физико-химических свойств пресикантической мембраны:

- пресинаптическое действие ХМ не изменяется при вариации в широких пределах содержания в среде К+, !1а+, С1~, эффект развивается в бескальциевой среде, сохраняется после блокирования. АХЭ, фос-фодиэстеразы и Ма+,К+-АТФазы (эксперименты с изъятием К+);

- пресинаптический эффект ХМ при концентрациях, близких к пороговым, увеличивается при понижении температуры, а в насыщающих концентрациях является температуронезависимым;

- начальной стадией процесса, ведущего к угнетению Г МПКП под действием ХМ является физическая адсорбция (типа Лэнгмюра) его молекул на пресинаптической мембране.

7. Влияние.АХ и КХ на спонтанную квантовую секрецию медиатора у теплокровных существенно зависит от температуры. При комнатной температуре (18 - 22°СЗ и при нормальном ионном составе среды ни Н-, ни М-ХМ не оказывают влияния на Г МПКП. При деполяризации нервных окончаний, вызываемой избытком К+, И приводят к росту Г МПКП, обусловленному возбуждением ПАР никотинового типа. Активаци:; этих рецепторе*, ведет к открытию ионных каналов, не блокируемых тгтродо-токсином, дополнительному снижению потенциала покоя нервных окончаний и возрастанию кальциевой проницаемости пресинаптической мембраны.

При температуре 38°С, соответствующей температуре теплового ядра крысы, и нормальном ионном составе среды, КХ вызывает угнетение Г МПКП, не блокируемое «З-тубокурарином и развивающееся, по-видимому, по механизму, аналогичному таковому у холоднокровных.

8. Основным механизмом, обеспечивающим выход Ау в синаптичес-кую щель из нервного окончания в состоянии покоя является неквантовое освобождение, представляющее собой активный транспортный процесс, характеризующийся сложной температурной зависимостью с двумя относительными максимумами при 20 и 35°С и энергией активации около 40 кДж/моль. Максимальный выход АХ в "неквантовой" форме обеспечивается при физиологических концентрациях Ма+, К+, Саг+. Добавление в инкубационную среду КХ приводит к снижению интенсивности неквантового освобождения. Этот эффект не связан с активацией ПАР. так как не устраняется ни М-, ни Н-холинолитиками. Холиномиметики мус-каринового ряда (метилфурметид, оксотреморин, Г-2268) не оказывают влияния на неквантовое освобождение АХ.

9. Процесс неквантового освобождения АХ тесно связан с системой захвата холина высокого сродства: при наличии холина в физиологической концентрации неквантовое освобождение регистрируется в те-

чение нескольких часов, а в его отсутствии угнетается. Специфический блокатор этой транспортной системы - гемихолиний - быстро угнетает неквантовое освобождение. Активация системы захвата холина низкочастотным раздражением нерва усиливает неквантовую секрецию.

10. АХ, выделяющийся в неквантовой форме, участвует в контроле величины мембранного потенциала мышечного волокна в области концевой пластинки и рецепторшгх свойств постсинаптической мембраны.

При активной АХЭ некаантовая секреция участвует в обеспечении гиперполярпзации постсинаптической мембраны за счет активации На+,К+-насоса:

- воздействия, угнетающие неквантовое освобождение С изменение ионной среды и рН раствора, гемихолиний, оуабаин, денервация) сни-магт гиперполяризацию концевой пластинки;

- на ранни:, сроках реиннервации мышцы, на стадии установления анатомической связи нервного волокна с мышечным, происходит параллельное восстановление неквантового освобождения и гиперполяризации концевой пластинки;

- добавление в раствор, омывающий денершированную мышцу, АХ в концентрации, соответствующей неквантовому выходу, при интактной АХЭ ведет к развитию гяперполяризации концевой пластинки.

При ингибированной АХЭ неквантовая секреция АХ может вносить вклад в развитие мионезрального блока:

- за счет развития стойкой деполяризации кошевой пластинки;

- за счет перехода части ХР в десенситизнрованное состояние вследствие длительного контакта с медиатором.

11. Угнетение вызванного освобождения медиатора развивается при действии на нервное окончание не только экзогенных ХМ,' но и синап-тического ЛХ. В мышечных волокнах с близко расположенными синапсами, образованными двумя разными аксонами, раздражение одного аксона приводит к угнетению квантового выброса из пресинаптических окончаний другого. Эффект сохраняется и при фиксации мембранного потенциала волокна ка уровне калиевого равновесного потенциала. По мере снижения квантового выброса пед действием влияние первого синапса на второй становится менее выраженным. Тубокурарин блокирует влияние одного аксона на другой.

Дополнительным подтверждением возможности участия эндогенного АХ в модуляции нейросекреции является феномен постсинаптической по-тенциацки С которая обнаруживается в синапсе с интактной АХЭ в течение десятков миллисекунд после выброса медиатора на одиночное разд-

ранение, а при ингибированной АХЭ - в течение десятков секунд), свидетельствующий о невысокой скорости удаления АХ из синаптической

щели.

12. АХ и его экзогенные аналоги в мионевральных синапсах холоднокровных и теплокровных оказывают влияние на процессы как кьанто-вого Сспонтанного и вызванного), так и неквантового освобождения медиатора, используя для реализации эффектов как ПАР, так к нереце-пторные механизмы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Полетаев Г.И., Никольский Е.Е. Уменьшение вероятности освобождения медиатора, как одна из причин блокирования нервно-мышечной передачи при длительном редком раздражении двигательного нерва скелетной мышцы // Физиологическая роль медиаторов: Тез. докл. Всесоюз. симпоз. - Казань, 1972. - С. 183-184.

2. Никольский Е.Е., Полетаев Г.И., Улумбеков Э.Г. О роли ци-топлазматических микротрубочек в освобождении квантов ацетилхолина // Физиол. «урн. СССР,- 1972. - т.59, № 4.- С.571-577.

3. Никольский]Е. Е. О различном функциональном состоянии мионевральных синапсов в волокнах портняжной мышцы лягушки // Матер. VI Поволжской конф. физиол., биохим., фармакол. и морфол.- Чебоксары, 1973.- С. 51-52.

4. Никольский Е. Е.. Механизм ыионеврального блока при непрямом низкочастотном раздражении скелетной мышцы и участие ацетилхолина в процессе саморегуляции в.синапсе // Диссертация кандидатская.-Казань, 1974.- 115 с.

5. Волкова И.Н., Никольский Е.Е., Полетаев Г.И. Блокирование потенциалов действия и сокращений скелетной мышцы лягушки путем поперечного рассечения мышечных волокон // Физиол. журн. СССР,-1975,- т. 61, W 9.- С. 1433-1438.

6. Никольский Е.Е., Полетаев Г. И. Чувствительность постсинап-тической мембраны к ацетилхолину при блокировании передачи возбуждения с нерва на скелетную мышцу в условиях длительного редкого раздражения // Нейрофизиология.- 1975.- т.7, №5,- С.550-556.

7. Волкова И. Н., Никольский Е.Е., Полетаев Г. И., Хамитов Х.С. 0 пресиналтическом эффекте ацетилхолина // Тезисы докл. XII съезда Всесоюз. физиол. общ-ва им.И. П.Павлова. - Тбилиси: Наука, 1975. - т. 1.-С. 176-177.

8. Волкова И.Н., Зефиров А.Л., Никольский Е.Е., Полетаев Г.И.

Различная вероятность освобождения кванта медиатора как проявление функциональной неоднородности нервно-мышечных синапсов в те-танической мышце лягушки // Тезисы докл. Всесоюз. конфер. "Физиология и биохимия медиаторных процессов" - Москва, 1976,- С. 30-31.

9. Волкова И.Н. . Никольский Е.Е., Полетаев Г. И., Хамитов Х.С. Некоторые механизмы регуляции процесса освобождения квантов аце-тилхолина из двигательных нервных окончаний // Тезисы докл. Всесоюз. конфер. "Физиология и биохимия медиаторных процессов"- Москва, 1976.-С. 31-32,

10. Волкова И.Н., Зефиров А.Л., Никольский Е.Е., Полетаев Г.И.. Функциональная неоднородность синаптьческих приборов портняжной мышцы лягушки /V Физиол. журн. СССР.- 1976.-т.62, N 3. - С.406-413.

11. Никольский Е.Е., Полетаев Г.И. Исследование механизма блокирования передачи возбуждения с нерва ка скелетную мышцу при непрямом редком раздражении // Нейрофизиология.- 1977.-т.9, № 1.-С. 78-85.

12. Фросин В.И. , Никольский Е.Е., Воронин В.А. 0 полиаксо-нальной иннервации фазных мышечных волокон лягушки ' // Физиол. журн. СССР.- 1978.- т.64, W.6.- С.741-746. i

13. Полетаев Г. И., Никольский Е. Е., Гинйатуллин Р. А. Влияние холина на функцию нейросекреторного аппарата мионеврального синапса холоднокровных // Матер. V Всесоюз. совет, по проблеме гисто-гематических барьеров.- Москва: Медицина, 1978.- С.346-347.

14. Никольский Е.Е., Гнниатуялин Р.А. Прекращение пресинапти-ческого действия карбахолияа тубокурарином // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 1979.- т.87, № 2,- С. 171-174.

15. Волкова И.Н., Никольский Е.Е., Гиниатуллин P.A. Пре- и постсинаптические компоненты в действии карбахолияа на нервно-мышечный препарат // Нейромедиаторы в норме я патологии: Тез. докл. Всесоюз. сикпоз.- Казань, 1379.- С.76-77.

16. Волкова И.Н., Зефиров А.Л., Никольский Е.Е., Полетаев Г.И., Хамитов Х.С. Особенности функциональной организации синаптических аппаратов фазной мышцы лягушки // Тез. докл. XIV съезда Всесоюзно-, го физиологического общ-ва им.И.П.Павлова.- Алма-Ата: Наука, 1979. - с.82-83. '■.•

17. Магазаник Л.Г., Никольский Е.Е. Пре- и постсинаптическое действие холиномиметика СсубехолинаЭ в условиях фиксации потенциала ка постсинаптической мембране /< Докл. АН СССР. 1979.- т. 149, Н 6.- С. 1488-1491.

18. Волкова И.Н., Гиниатуллин Р.А., Никольский Е.Е., Полетаев Г. И. Механизм декураризирушего действия холина // Физиология и биохимия медиаторных процессов: Тез. докл. III Всесоюз. конфер.

- Москва: Наука, 1980.- С. 49-50.

19. Магазаник Л. Г., Никольский Е. Е. Пресинаптическое действие холиномиметиков // Физиология и биохимия медиаторных процессов: Тез. докл. III Всесоюз. конфер.- Москва: Наука, 1980.- С.162.

20. Волкова И.Н., Никольский Е.Е., Гиниатуллин Р. А. Связано ли пресинаптическое действие карбахолина с активацией постсинап-тической мембраны? // Билл, эксперим. биологии и медицины.- 1981.

- т. 31, К 4.- C.393-3SS.

21. Magazanik L.G. , Nikolsky Е.Е., Vyskocil F. Effect of the desensitization-potentiation agent SKF-525A on frog end-plate currents // Europ. J. Pharmacol.- 1982.- v.80, N 1,- P.115-119.

£2. Никольский Е.Е. Влияние карбахолина на миниатюрные потенциалы и токи концевой пластинки скелетной мышцы крысы // Нейрофизиология." 1982.- т. 14, №2,- С. 185-188.

23. Никольский Е. Е., Гиниатуллин Р. А. Механизм действия кар-бахо>гика на спонтанное освобождение медиатора из моторных нервных окончаний // Тез.-докл. I Всесоюз. биофизического съезда. - Москва: Наука, 1972.- т. 2.- С. 106.

24. Воронин В.А., Никольский Е.Е., Выскочил Ф. Влияние температуры и ионов калия на неквантовое освобождение медиатора из двигательных нервных окончаний // Тез. докл. I Всесоюз. биофизического съезда. - Москва, 1982.- т. 2.- С. 108.

25. Vyskoiil F., Nikolsky Е.Е., Edwards С. An analysis of the mechanisms controlling and underlying the nonquantal release of' acetylcholine at the mouse neuromuscular junction // Neuroscience.

- 1983.- v. 9, N 2.- P. 429-435.

26. Hikolsky E. E,, Vyskoiil F. Non-guantal release of acetylcholine in the muscle. 1. Effect of Ca^+ and K+ concentration // Physiol. Bohemoslovaca. - 1983.- V.30, N 6.- P.545-546.

27. Магаэаняк Л.Г., Никольский Е.Е., Гиниатуллин Р.А. Зависимость скорости спада токов концевой пластинки от величины квантового. состава и предшествующей синаптической активности // Докл. АН СССР.- 1983,- т.271, «3.- С.489-492.

28. Никольский Е. Е., Струнский Е. Г. Автоматизация процесса замены растворов в физиологическом эксперименте // Физиол. журн. СССР.- 1983.-т.69. № 9.-С. 1258-1259.

29. Волкова И. Н., Ахтямова Д. А.,- Воронин В. А., Гиниатуллйн Р. А., Зефиров А. Л., Никольский Е. Е. Регуляция освобождения медиатора в нервно-мышечном синапсе // Тез. докл. XIV съезда Всесоюз. фиэиол. общ-ва им. И.П.Павлова. - Баку: Наука, 1983.- т.1.- С.53.

30. Никольский Е.Е. Влияние карбахолина на спонтанное освобождение медиатора из двигательных нервных окончаний в зависимости от концентрации внеклеточного калия // Нейрофизиология.- 1984. - Т. 16. №4.- С. 470-475.

31. Magazanik L.G.. Fedorov V.V., Giniatullin R.A., Nikolsky E. E., Snetkov V. A. Functional role of Cholinesterase In different types of neuromuscular junction // Cholinesterases. - Berlin - New Jork: Walter de Gruyter, 1984,- P. 229-242.

32. Magazanik L.G., Nikolsky E.E., Giniatullin R.A. End-plate currents evoked by paired stimuli in frog muscle fibres // Pfltigers Arch. - 1984. - v. 401, N 1. - P. 185-192.

33. Никольский E. E., Гиниатуллин P.A. ■ Пресиналтическое действие карбахолина на нервно-мышечный препарат лягушки после перерезки двигательного нерва // Докл. АН СССР.- 1984.- т.284, № 8,-С.250-252.

34. волкова И. Н., Бухараева Э. А., Гиниатуллин Р. А., Никольский Е.Е. Механизм действия карбахолина на спонтанную секрецию квантов медиатора из двигательных нервных окончаний лягушки // Физиология медиаторов. Периферический синапс: Тез. докл. Всесоюз. симпоз.-Казань, 1984.- С. 126-129.

35. Воронин В.А:, Никольский Е.Е. Исследование температурной зависимости неквантового освобождения ацетилхолина // Физиология медиаторов. Периферический синапс: Тез. докл. Всесоюз. симпоз. -Казань, 1984.- С. 57-58.

36. Оранская Т. И., Воронин В. А., Никольский Е.Е. Соотношение квантового и неквантового освобождения ацетилхолина из двигательных нервных окончаний на ранних сроках после анатомической денер-вации // физиология медиаторов. Периферический синапс: Тез. докл. Всесоюз. симпоз.- Казань, 1984.- С.176-177.

37. Никольский Е.Е.. Воронин В.А., Оранская Т.И. Динамика изменений спонтанной квантовой и неквантовой секреции ацетилхолина из двигательных нервных окончаний после перерезки нерва // Докл. АН СССР.- 1985.-т.281, fí 3.- С.762-764.

38. Никольский Е. Е., Воронин В. А., Оранская Т. И. Восстановление спонтанной квантовой и неквантовой секреции медиатора из дви-

гательных нервных окончаний в ходе реиннервации диафрагмальной мышцы мыши // Докл, АН СССР.- 1985. - т.285, № 1.- С.246-249.

39. Воронин В.А., Никольский Е.Е. Значение ионов кальция для процесса неквантовой секреции ацетилхолина из двигательных нервных окончаний мыши // Докл. АН СССР,- 1985.- т.285, К 4.- С. 10191021.

40. Бухараева Э.А., Никольский Е.Е., Гиниатуллин Р.А. Оуабаин

снимает угнетающее действие карбахолина на спонтанное квантовое освобождение медиатора в нервно-мышечном соединении лягушки // Физиология и биохимия медиаторных процессов: Тез. докл. IV Всесо-ш. конфзр..- Москва,. 1985.- С.55-50.

41. Никольский Е. Е., Воронин В.А. Температурная зависимость процессов спонтанного квантового и неквантового освобождения медиатора из двигательных нервных окончаний мши // Нейрофизиология. - 1986.- т. 18, №3.- С. 361-367.

42. Полетаев Г.,И., Макаров В. А., Никольский Е, Е. Использование управляющих ЭВМ в электрофизиологических исследованиях // Казанский медицинский журнал.- 1986.- т.67, № 1.- С.56-59.

43. Khanitov Kh. S., Nikolsky E. E. , Bukharaeva E. A., Giniitul-lin R. A. Effects of cholinergic drugs on spontaneous quantal transmitter release at the frog neuromuscular junction // Molecular basis of neural function / Ed. by S. Tueek, S.Stupek, F.Stastny, J. Krivanek - Prague: ESN, 1986,- P. 142.

44. Бухараева Э.А., Никольский E.E., Гиниатуллин P.А. Влияние холинергических соединений на спонтанное квантовое освобождение медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки // Нейрофизиология.-1986.- т. 18,.. № 5.- С.586-593.

. 45. Гиниатуллин Р. А., Бальцер С. К., Никольский Е.Е., Магаза-ник Л.Г. Исследование постсинаптической потенциации и десенсити-зации. в шоневральном синапсе лягушки, вызванных ритмической стимуляцией двигательного нерва // Нейрофизиология.- 1986.- т.18, R 5.- С.645-054.

46. Магаэаяик Л. Г., Снетков В. А., Нигматуллин Н. Р., Николь-Е.Е. Математическое моделирование факторов, определяющих временной ход миниатюрных постсинаптических токов в мышцах лягушки // Докл. АН СССР,- 1986.- Т.289, № 3.- С.733-737.

47. Гиниатуллин Р.А., Бальцер С.К., Никольский Е.Е., Магаза-ник Л. Г. Исследование постсинаптической потенциадии и десенсити-зации в мионевральном синапсе лягушки, вызванных ритмической ста-

муляцией двигательного нерва // Тез. докл. Всесоюз. конфер. по нейронаукам. - Киев, 1986.- С.74-75.

48. Нигматуллин Н. Р., Магазаник Л. Г., Снетков В. А., Никольский Е.Е. Применение метода математического моделирования для анализа факторов, определяющих временной ход миниатюрных постси-наптических токов в фазных волокнах лягушки // Тез. докл. Всесоюз. конфер. по нейронаукам.- Киев, 1986.- С. 100-101.

49. Никольский Е.Е., Бухараева Э.А. Особенности пресинапти-ческого действия холиномиметических агентов в синапсах холоднокровных и теплокровных // Тез. докл. Всесоюз. конфер. по нейронаукам. - Киев, 1986.- С. 101-102.

50. Никольский Е. Е., Бухараева Э.А. Мускариновые агонисты не изменяют процесс спонтанной квантовой секреции медиатора из двигательных нервных окончаний лягушки // Бюлл. эксперим. биологии и медицины.- 1987.-т.97, №2.- С. 183-185.

51. Валидов А. И., Никольский Е.Е., Струнский Е.Г. Устройство для подачи микроинструыента.- Авторское свидетельство СССР N 1303379 // Бюлл. открытий и изобретений.- 1987, № 14,- С.70.

52. Никольский Е.Е., Гиниатуллин P.A., Бальцер С,К., Бухараева Э.А., Воронин В. А., Оранская Т. И. Пре- и постсинаптические эффекты медиатора, накапливающегося в ходе ритмической- активности холинергического синапса // Тез. докл. XV съезда Всесоюз. физиологического общества им. И. П. Павлова.-Кишинев:: Наука, .1987.- С. 208 - 209. . , ;

53. Гиниатуллин P.A., Шабунова И. А., Никольский Е.Е., Бухараева Э.А. Дипироксим как блокатор ионных каналов, активируемых ацетилхолином, в скелете эй мышце крысы // Бюлл. эксперим. биологии и медицины.- 1987.- т.97, W6.- С.690-692.

54. Никольский Е. Е., Струнский Е.Г. Микроманипулятор для вле-ктрофизиологических исследований // Физиол. журн. СССР.- 1988.-т.74, № 4.- С.601-603.

55. Гиниатуллин P.A., Шабунова И.А., Никольский Е.Е., Бухараева Э.А. Реактивирующее и холиномиметическое действие дипироксиыа в мионевральном синапсе теплокровных // Нейрофизиология.- 1988.-т.20, К 3.- С.351-357.

56. Нигматуллин Н.Р., Снетков В.А., Никольский Е.Е., Магазаник Л. Г. Анализ модели миниатюрного тока концевой пластинки // Нейрофизиология.- 1988.- т.20, № 3.- С.390-398.

57. Снетков В. А., Нигматуллин Н. Р., Никольский Е. Е., Магаза-

ник Л. Г. Моделирование действия ¿локаторов ионных каналов на постсинаптические токи // Нейрофизгология.- 1989,- т.21, f{ 4,- С. 476-484.

58. Никольский Е. Е., Бухараева Э. А., Бадрутдинов Л.Р. Влияние карбахолина на спонтанную квантовую секрецию медиатора из двигательных нервных окончаний лягушки в присутствии оуабаина и в бескалиевой среде // Нейрофизиология, - 1989.- т. 21, Г{ 4,- С. 558-561.

59. Струнский E.H., Никольский Е.Е. Статистический анализ изменения спонтанной квантовой секреции медиатора в присутствии карбахолина в нервно-мышечном синапсе крнсн // Нейрофизиология. -1989.- т. 21, № 4.- С. 561-564.

60. Giniatullin R.A., Khamitov Kh.S., Khazipov R. , Magazanlk L.G., Nikolsky E.E., Snetkov V.A., Vyskoeil F. Development of de-sens'tizatlon during repetative end-plate activity and single end-plate currents in frog muscle // J. Physiol. - 1989.- v,412, May. - P. 113-122.

61. Giniatullin R.A., Nikolsky E.E. , Magazanlk L.G., Vyskoeil F. Uesensitisation during repetative and single quantal release of acetylcholine in frog muscle // Physiol. Bohemoslovaca. - :C89. -v. 38, H 4,- f-. 380-381.

62. Гиниатуллин P.A., Нигматуллин H.P., Никольский E.E. Анализ действия дипироксима на ионные каналы холинорецептора: модификация или быстрый блок канала ? // Тез. докл. Всесоюз. симпоз. "Одиночные ионные каналы в биомембранах". - Пуаино-на-Оке, 1989,-С. 75.

63. Гиниатуллин Р. А., Оранская Т. И., Воронин В. А., Никольский Е.Е. • Влияние неквантового ацетилхолина на миниатюрные токи концевой пластинки мыши // Нейрофизиология. - 1990.- т.22, ff 4. -С. 507-513.

64. Воронин В.А., Оранская Т.И., Никольский Е.Е. Связь неквантового освобождения ацетилхолина из двигательных нервных окончаний с системой захвата холина высокого сродства // Физиология и биохимия медиаторных процессов: Тез. докл. V Всесоюзной кокфер. - Москва: Наука, 1990.- С. 63.

66. Струнский Е.Г., Никольский Е.Е., Борисовер М.Д. Температурная зависимость эффектов карбахолина на спонтанное квантовое освобождение медиатора у холоднокровных // Физиология и биохимия медиаторных процессов: Тез. докл. V Всесоюзной конфер. - Москва: