Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Механизм ауторегуляции спонтанной квантовой секреции медиатора в нервно-мышечных синапсах

, . . . .■ .лЛ

министерство здравоохранения рсфср казанский ордена трудового красного знамени государственный

МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ имени С.В.КУРАПЮВА

На правах рукописи

СТРУНСКИИ Евгений Григорьевич

УЖ 612.815

МЕХАНИЗМ АУТОРЕГУЛЯЦИИ СПОНТАННОЙ КВАНТОВОЙ СЕКРЕЦИИ МЕДИАТОРА В НЕРВЮ-МШЕЧНЫХ СИНАПСАХ

14.00.17 - нормальная физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Казань 1990

Работа выполнена в Казанском государственном медицинском, институте имени С. В.Курашова.

Научный руководитель - кандидат медицинских наук,

доцент Е.Е.Никольский

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук,

профессор В.Б.Долго-Сабуров; (

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Т.М.Драбкина

Ведущее учреждение - Институт эволюционной физиологии и биохимии имени И.М.Сеченова

$ О

Защита состоится " 9,0- 1990 г. в У._часов

на заседании специализированного теоретического Ученого Совета Д 084.29.03 Казанского ордена Трудового Красного Знамени государственного медицинского института имени С. В.Курашова С 4Е0012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49 а ).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института С ул. Бутлерова 49 б 5.

Автореферат разослан »/£ " МЛ^ууКА 1990 г.

Ученый секретарь специализированного теоретического Совета, кандидат медицинских наук

Р.X.Ахметзянов

Л ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Важной задачей современной синаптоло-квляется изучение механизмов регуляции и саморегуляции синап-Ькой активности [ Матюшкин, 1980; Полетаев, 1974; Kalsner,

1985 ]. Это связано с тем, что такие знания расширяют представления о функционировании синаптических структур, а также углубляют понимание механизмов воздействия на синапс различных эндогенных и экзогенных факторов. Один из путей регуляции и саморегуляции си-наптической функции может быть связан с активацией ауторецепторов, расположенных на нервном окончании (НО), из которого происходит . освобождение медиатора [ Starke, 1981; Timmermans, 1987 ]. Существование такого механизма показано для вызванной секреции в различных синапсах, в том числе и в мионевральных синапсах теплокровных и холоднокровных С Никольский, Гиниатуллин, 1979; Bierkampfer et al.,

1986 ], а также для спонтанной квантовой секреции у теплокровных в условиях предварительной деполяризации НО [ Miyamoto. Volle, 1974 ]. В этих случаях пресинаптические рецепторы подобны по своим фармакологическим и физиологическим свойствам постсинаптическим холино-рецепторам [ Никольский, Гиниатуллин, 1979; Bierkämpfer et al., 1986 ]. В то же время нельзя считать твердо установленной рецеп-торную природу опосредования влияния ацетилхолина САХ) и его аналогов на спонтанную квантовую секрецию медиатора в нервно-мышечных синапсах холоднокровных, поскольку это влияние не зависит от мембранного потенциала БО и не устраняется известными холиноли-тиками [ Бухараева и соавт., 1986 1. Остается невыясненным какие клеточные системы принимают участие в реализации действия холино-миметиков С ХМ) на"спонтанное выделение медиатора у холоднокровных,

а также неизвестны процессы, которые это действие обусловливают. В отличие от холоднокровных, где влияние ХМ на спонтанную нейросек-рецию имеет угнетающий характер и наблюдается в нормальной ионной среде Г Duncan, Publicover, 1979; Бухараева и соавт., 1986 ], в мионевральных синапсах теплокровных это влияние имеет противоположную направленность и наблюдается лишь в условиях предварительной деполяризации НО, например, при повышении содержания внеклеточного калия, а в нормальной ионной среде отсутствует [ Никольский, 1984 ]. Причины, обусловливающие разницу в направленности и условиях возникновения эффектов ХМ на спонтанную секрецию медиатора в нервно-мышечных синапсах холоднокровных и теплокровных остаются неизвестными. Детальное исследование механизма действия ХМ на спонтанную квантовую секрецию передатчика у холоднокровных наряду с проведе-

-г -

ниек сравнительно-физиологического изучения этого действия у теплокровных и холоднокровных дает возможность подойти к установлена обоих закономерностей и особенностей влияния медиатора на процесс освобождения для разных форм нейросекреции у различных представителей позвоночных. Кроме того, это позволяет углубить знания механизмов действия лекарственных и токсических веществ, имеющих местом приложения двигательные НО.

Цель и основные задачи исследования. Цель работы состояла в изучении механизма ауторегуляции спонтанной квантовой секреции медиатора в нервно-мышечных синапсах холоднокровных и теплокровных животных.

Исходя из этого, ставились следующие задачи:

1. Изучить зависимость влияния ХМ на интенсивность спонтанного квантового освобождения медиатора из двигательных нервных окончаний лягушки от химической структуры и концентрации этих веществ.

2. Выяснить, связано ли пресинаптическое действие ХМ в нервно-мышечных синапсах лягушки с изменением проницаемости мембраны нервного окончания для ионов натрия и хлора.

3. Исследовать температурную зависимость пресинаптичёских эффёк-тов ХМ у лягушки и крысы.

4. Установить с помощью математического моделирования количественные характеристики механизма пресинаптического действия кар-бахолина СКХ) в нервно-мышечных синапсах лягушки и определить их зависимость от температуры и концентрации холиномиметика.

5. Проверить, используя статистический анализ миниатюрных потенциалов концевой пластинки СМПКЮ во времени, сопровождается ли пресинаптическое действие ХМ в мионевральных синапсах лягушки и крысы существенным изменением механизма освобождения квантов медиатора из нервного окончания.

Научная новизна. В результате проведенных исследований установлено, что величина влияния ХМ на интенсивность спонтанной квантовой секреции медиатора у холоднокровных зависит от степени структурных отличий этих веществ от молекулы АХ, а для КХ достигается насыщаемость эффекта на уровне достаточно низких его концентраций. Показано, что ионы натрия и хлора не принимают непосредственного участия в пресинаптическом действии КХ у амфибий. В концентрациях, близких к пороговым, это действие КХ усиливается при повышении температуры, а в насыщающих концентрациях в интервале от 5 до 30°С от температуры не зависит. На основании концентрационной зависимое-

та пресинаптического эффекта КХ найдено количественное соответствие этого эффекта классической оккупационной теории действия физиологически активных веществ. Получены свидетельства того, что начальной стадией механизма пресинаптического действия ХМ у амфибий является физическая адсорбция типа Лэнгмюра, а последующие этапы этого механизма не имеют значительной температурной зависимости. При этом места фиксации ХМ на пресинаптической мембране идентичны между собой по связывающим свойствам и в их функционировании отсутствует кооперативность. Впервые'обнаружено угнетающее действие ХМ на спонтанное освобождение медиатора из двигательных НО теплокровных в условиях нормальной ионной среды при физиологических температурах. Этот факт свидетельствует о возможности саморегуляции спонтанного квантового выделения медиатора у теплокровных по типу отрицательной обратной связи. Показана неизменность исходного закона' распределения МПКП во времени при наличии влияния КХ на интенсивность спонтанной квантовой секреции медиатора в нервно-мышечных синапсах лягушки и крысы. Получены данные, свидетельствующие о том, что угнетающее действие на спонтанное освобождение медиатора у хо-холоднокровных со стороны ХМ не связано с известными рецепторными механизмами, а вызывается непосредственной модификацией ими активных зон НО в результате прямого мембранотропного влияния, причем это действие не связано с уменьшением числа активных зон, а обусловлено снижением интенсивности работы прежнего числа функционировавших зон.

Положения, выносимые на защиту.

1. Саморегуляция спонтанного квантового освобождения медиатора в

в нервно-мышечных синапсах теплокровных способна осуществляться по принципу отрицательной обратной связи.

2. У холоднокровных влияние холиномиметиков на спонтанную квантовую секрецию медиатора реализуется не через работу ионных каналов и ферментных систем, а обусловлено модификацией ими участков пресинаптической мембраны, имеющих отношение к процессу выброса передатчика.

Научно-практическая ценность. Полученные данные об однонаправленном угнетающем влиянии ХМ на нейросекрецию у холоднокровных и теплокровных в условиях, близких к физиологическим, служат дополнительным свидетельством возможности пресинаптической саморегуляции работы синаптического аппарата за счет образования отрицательных обратных связей. Температурная независимость пресинаптического дей-

ствия ХМ у амфибий мохет представлять интерес для тех разделов адаптационной физиологии, где изучается механизмы компенсаторной приспособляемости зктотермных животных к различным температурным условиям их существования. Предложенное объяснение пресинаптических эффектов ХМ в нервно-мышечных синапсах холоднокровных расширяет представления о механизмах действия физиологически активных веществ на синаптическую передачу возбуждения, что имеет значение для интерпретации физиологических и фармакологических исследований.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на XV съезде Всесоюзного физиологического общества им. И. П. Павлова С Кишинев, 1987), Конференции молодых ученых КГМИ (Казань, 1988), на заседании Татарского отделения Всесоюзного физиологического общества им. И.П. Павлова СКазань, 1989), на совместных заседаниях кафедр нормальной физиологии и медицинской и биологической физики КГМИ СКазань, 1990).

Реализация результатов исследования. Материалы проведенных исследований включены в лекционный курс по медицинской и биологической физике для студентов Казанского мединститута. Разработанные в ходе исследований программа для измерения и статистического анализа импульсных потоков, микроманипулятор и устройство для переключения протока жидкостей используются при проведении экспериментов по изучению нервно-мышечного синапса. По материалам диссертации опубликованы три статьи в центральной печати, получено одно авторское свидетельство СССР на изобретение, семь рационализаторских предложений.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методики исследования, результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов, указателя литературы, приложения. Перечень цитируемой литературы включает 203 источника, из них 143 - иностранных авторов. Работа иллюстрирована И рисунками и 7 таблицами.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводились на изолированных препаратах портняжной мышцы лягушек Rana temporaria и камбаловидной мышце белых крыс. Через ванночку с препаратом непрерывно протекал со 'скоростью 5 мл/мин раствор Рингера, нормальный состав которого для холоднокровных содержал С в миллимолях на 1 литр раствора): NaCl - 113.0,

КС1 - 2.5, СаС12- 1.8, №2НР04- 2.8, МаН£р04- 0.025, а для теплокровных - ИаС1 - 118.0, КС1 - 5.0, СаС12~ 3.0, ИгН^^ 1.0, ЫаНСОд- 24.0, глюкоза - 17.0. рН=7.2 - 7.4. Раствор Рингера для теплокровных аэрировался в течении 1 часа до эксперимента газовой смесью, содержащей 95% кислорода и углекислого газа, а в опытах, проводимых при температурах выше 25°С, осуществлялась дополнительная аэрация раствора этой же смесью непосредственно перед подачей его к препарату. Температура растворов поддерживалась на постоянном уровне с помощью ультратермостата и контролировалась с точностью до 0.1 °С в экспериментальной ванночке электронным термометром. Синаптические потенциалы-отводились внутриклеточно е использованием стандартной микроэлектродной техники. Измерялись амплитуда МПКП и межимпульсный интервал времени кегяу ними пороговым методом, а также потенциал покоя мышечного волокна в синаптической зоне. Для измерений и дальнейшей статистической обработки экспериментальных данных применялся измерительно-вычислительный комплекс на базе ЭВМ СМ-1403, включающий аппаратуру в системе КАМАК. Критерием верно выбранного порога, выставлявшегося в диалоговом режиме с экрана дисплея, служила симметричность гистограмм амплитуд МПКП. Обработке подвергались лишь стационарные импульсные потоки, что оценивалось по величине и-ста-тистики [ Кокс, Льюис, 1969 ]. Массивы амплитуд.МПКП и межимпульсных интервалов до 1000 элементов каждый записывались в накопитель на магнитных дисках для дальнейшего статистического анализа, включавшего определение параметров случайного импульсного потока МПКП Сего частоты, средних значений межимпульсных интервалов и амплитуд, коэффициентов вариации амплитуд и межимпульсных интервалов, коэффициентов автокорреляции межимпульсных интервалов с запаздыванием до 100), а также проверку статистических гипотез о законе распределения МПКП во времени. Для проверки статистических гипотез о пу-ассоновости потоков МПКП использовались критерий у^ . статистика Шермана С Кокс, Льюис, 1969 3. </* -критерий [ Володин, 1966 ], строились гистограммы межимпульсных интервалов. При сравнении значимости различий средних двух совокупностей применялся критерий Стью-дента, а при большем числе совокупностей - процедура однофакторного дисперсионного анализа. Для суждения о правомерности линейной зависимости между исследуемыми величинами и определения ее параметров использовались методы линейного регрессионного анализа [ Поллард, 1982 ]. При проверке различных статистических гипотез использовался 5'/ уровень значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка критериев рецепторного действия применительно

к влияние ХМ на спонтанную квантовую секрецию медиатора в нервно-мышечных синапсах холоднокровных

Поскольку структурная специфичность, высокая концентрационная чувствительность и насыщаемость являются одними из признаков рецепторного механизма действия физиологически активных веществ на клеточную активность [ Комиссаров, 1986, Сиа1геса5аз, 1975 ], была проведена оценка этих признаков для изучения механизма пресинаптических эффектов ХМ у холоднокровных. Изучение концентрационной чувствительности и насыщаемости пресинаптического действия ХМ в нервно-мышечных синапсах лягушки производилось при определении концентрационной зависимости пресинаптических эффектов КХ, негид-ролизуемого аналога ацетилхолина при 20°С. Эта зависимость исследовалась в диапазоне концентраций КХ от 1-10 ~7 до 1-Ю"5 моль/л. При концентрациях нихе 2.5-10~7 моль/л КХ не вызывал достоверного снижения частоты МПКП Сп=11), что позволяет рассматривать эту концентрацию как пороговую для действия КХ на интенсивность спонтанной

-Я -А —Ц

секреции. В концентрациях 3.5-Ю^3 г 5-Ю^3 , 7.5-10 ° и 1-Ю 3 моль/л КХ уменьшал частоту МПКП примерно на 50% от исходной. Дисперсионный анализ для величин пресинаптических эффектов КХ в этих концентрациях показал, что соответствующие эффекты значимо между собой не различаются. Это говорит о достижении насыщения для пресинаптического действия КХ в концентрациях выше 3.5-10"6 моль/л.

Структурная зависимость исследуемых эффектов проверялась при изучении пресинаптического влияния АХ и ряда соединений Спропио-нилхолина, бутирилхолина, КХ, бензоилхолина, триметилпентиламмо-ния, тетрабутиламмония, хлористого аммония), имеющих одновременно определенные черты сходства и различия в строении функциональных групп по сравнению с молекулой естественного медиатора. Для возможности .сопоставления с другими веществами эффекты соединений, подвергавшихся гидролизу САХ, пропионилхолин, бутирилхолин), изучались не только в условиях интактной, но и ингибированной с помощью арыина в концентрации 1-Ю-5 моль/л ацетилхолинэстеразы. Все соединения, кроме хлористого аммония, оказались спосбными угнетать спонтанную квантовую секрецию, а также снижать мембранный потенциал покоя мышечного волокна и уменьшать амплитуду МПКП, т.е. обладали

как пре-, так и постсинаптическим действием, однако в различной степени в зависимости от структурных отличий от молекулы АХ. Замена метильной группы в сложноэфирной части молекулы АХ на объемный фенильный радикал (бензоилхолшО приводила к значительному снижение силы пресинаптического действия. Однако увеличение длины алкильных заместителей без изменения в разветвленности в той же части'молекулы АХ Спропионилхолин, бутирилхолин) к заметному изменение пре-синатического эффекта не вели. Изостеричный к молекуле ацетилхолина КХ также характеризовался сходной величиной активности. Исключение из молекулы медиатора сложноэфирной группы с заменой ее на алкиль-ный заместитель с той же длиной цепи Спентилтриметиламмоний) влекло за собой значительное ослабление пресинаптического действия. Исследование хлористого аммония и тетрабутиламмония выявило с их стороны пренебрежимо малую пресинаптическув активность. Тем не менее известно, что представитель этого же ряда соединений тетраметиламмо-ний, изостеричный катионному концу АХ заметно уменьшает частоту МПКП [ Бухараева и соавт., 1986 ]. Таким образом, пресинаптический эффект ХМ оказался довольно чувствительным к структурным изменениям в молекуле АХ, что свидетельствует о структурной специфичности механизма, его опосредующего по отношению к молекуле медиатора. Существование наряду с этим физиологического эффекта, оказываемого непосредственно на НО [ Бухараева, 1988 ], в виде угнетения спонтанной секреции со стороны самого медиатора и его ближайших аналогов, а также достаточно высокой концентрационной чувствительности и насыщаемости указывают на сходство изучаемых механизмов у холодно-холоднокровных с рецепторными механизмами.

Исследование роли ионов натрия и хлора в реализации пресинаптического действия ХМ в синапсах лягушки

Учитывая возможную связь пресинаптических рецепторов, как и многих других рецепторов, с ионными каналами С Уе1и1ап1, 1988 }, было целесообразным изучить вопрос о том, не сопровождается ли преси-наптическое действие ХМ у холоднокровных изменением проницаемости мембраны НО для физиологически значимых в синапсах ионов, в частности, ионов натрия и хлора. Эти ионы были выбраны для исследования в связи с тем, что ранее было показано отсутствие определяющей роли в изучаемых эффектах у холоднокровных внеклеточных ионов кальция и калия [ Бухараева, 1988 ]. При исследовании роли ионов натрия хлористый натрий на 2/3 замещался на сахарозу для сохранения изоосмо-

тичности, а при исследовании роли ионов хлора хлористый натрий полностью заменялся либо на сульфат, либо на нитрат, либо на бромид натрия. КХ в концентрации 540~® моль/л при всех указанных ионных заменах снижал частоту МПКП на величины, достоверно не отличающиеся от той, которая имела место в условиях нормальной ионной среды, т.е. примерно на 50% Сп=6 в каждой серии). Результаты, полученные для ионов натрия и хлора, с учетом отсутствия определяющей роли внеклеточных ионов кальция и калия в пресинаптических эффектах ХМ у холоднокровных свидетельствуют о том, что изменение ионной проницаемости мембраны НО с участием ионных каналов существенного значения в реализации исследуемых эффектов не имеет.

Температурная зависимость эффектов ХМ на спонтанное

квантовое освобождение медиатора у холоднокровных

Кроме ионных каналов, синаптические рецепторы могут быть сопряжены с ферментными системами [ Уе1и1аги, 1988 ]. Поэтому было предпринято изучение самого факта участия таких систем в действии ХМ на спонтанное квантовое освобождение медиатора у холоднокровных. Для этого было использовано такое неспецифическое средство воздействия на физиологические процессы, как температура, т.к. интенсивность ферментативных процессов весьма сильно от нее зависит [ Диксон, Уэбб, 1966 ]. Снижение частоты МПКП карбахолином в концентрации 5-Ю-® моль/л в диапазоне от 5 до 30° С, оцениваемое через каждые 5°С, оказалось независящим от температуры С в каждой серии 6-8 опытов) и равнялось в среднем 49.412.2%. Не было выявлено зависимости от температуры в диапазоне от 10 до 25°С и для действия КХ в концентрации МО"5 моль/л (4 температурных значения по 6 опытов в каждой серии). Частота МПКП уменьшалась при э,том в среднем на 53.4±1.9%. В то же время-изучение эффекта КХ в концентрации 6-10 моль/л при 8.5 °С показало уменьшение частоты МПКП на 38.1±4.7%, а при 30 °С снижение частоты МПКП в этой концентрации составило 16.3±3.2%. При использовании КХ в концентрации 3-Ю-7 моль/л при 6°С эффект составлял 28.8±2.1%, а при 26°С он практически отсутствовал. Таким образом, в насыщающих концентрациях пресинаптическое действие КХ не зависело от температуры, а в ненасыщающих, близких к пороговым, - не только не увеличивалось с ростом температуры, как это обычно свойственно физиологическим процессам, но даже уменьшалось.

Полученные данные о влиянии температуры на пресинаптические эф-

фекты КХ могут быть объяснены либо тем, что процессы с заметной температурной зависимостью, в том числе ферментативные и канальные, вовсе не принимают участия в изучаемых механизмах, либо принимают, но температурная зависимость, обычно им свойственная, компенсируется обратной температурной зависимостью сопряженных с ними процессов, т.е. таких процессов, интенсивность которых с ростом температуры уменьшается, а при ее снижении - возрастает. Такое возможно для исследуемых механизмов, если обычная температурная зависимость ферментативных или канальных процессов компенсируется противодействующим изменением сродства КХ к участку его связывания на преси-наптической мембране подобно тому, как это имеет место для некоторых ферментативных реакций, изученных адаптационой биохимией [ Хо-чачка, Сомеро, 1988 ]. Однако в этом случае константа сродства КХ к местам его связывания на пресинаптической мембране должна зависеть не только от температуры, но и от концентрации, т.к. в экспериментах выявляется различная температурная зависимость пресинаптических эффектов КХ при разных его концентрациях. Полученные в эксперименте данные о температурной зависимости пресинаптических эффектов КХ могут быть объяснены также, если предположить, что на начальном этапе действия КХ связывается с участками пресинаптической мембраны путем адсорбции физического типа, а последующие стадии изучаемого механизма не зависят от температуры, т.е. что наблюдаемая температурная зависимость пресинаптического действия КХ целиком определяется температурной зависимостью адсорбции его молекул на мембране НО. Это хорошо согласуется с экспериментальными данными, т.к. величина физической адсорбции веществ с понижением температуры увеличивается С Адамсон, 1979 3. Эта особенность проявляется при ненасыщающих концентрациях КХ, когда на мембране НО еще имеется резерв доступных миметику мест связывания и дополнительная их оккупация при снижении температуры ведет к усилению эффекта. В насыщающих концентрациях при снижении температуры это не сказывается на эффекте, т.к. все центры связывания КХ, доступные ему, уже заняты.

Количественная модель механизма пресинаптического действия ХМ в нервно-мышечных синапсах холоднокровных

На основе классической оккупационной теории действия физиологически активных веществ была построена количественная модель механизма пресинаптического действия КХ в мионевральных синапсах лягушки. Исследование этой модели позволило, в частности, определить

температурную и концентрационную зависимость константы сродства КХ к местам его связывания на мембране нервной терминали, что необходимо для оценки вышеприведенных альтернативных объяснений наблюдаемой в эксперименте температурной зависимости действия КХ на интенсивность спонтанной квантовой секреции медиатора у холоднокровных. При построении модели допускалась линейная зависимость между величиной эффекта КХ на частоту МПКП и долей занятых им центров связывания на пресинаптической мембране:

т*

где Г0- частота МПКП в контроле, Г«, - частота МПКП при действии КХ в условиях равновесия, X -доля занятых КХ центров связывания, сА -внутренняя активность. Представляя долю занятых КХ мест связывания в виде уравнения Кларка С Михельсон, Зеймаль, 1970 ], аналогичного уравнению адсорбции Лэнгмюра, и проводя преобразование уравнения (1), подобное преобразованию Лайнуивера-Берка, имеем

СО кс. С А

CD со

fe't<

где С - концентрация КХ, Кс~ его константа сродства к центрам связывания на мембране НО. Было показано, что для концентрационных зависимостей пресинаптического действия КХ при 10 и 20°С уравнение С2) достоверно может рассматриваться как линейное с независимой переменной 1/С и зависимой to/Cf^-f^p. С одной стороны это свидетельствует о соответствии пресинаптических эффектов КХ у холод-холоднокровных положениям классической оккупационной теории действия физиологически активных веществ, из чего, в частности, вытекает, что Кс не зависит от концентрации КХ и при его связывании отсутствует кооперативность, а также то, что центры фиксации КХ на мембране НО идентичны между собой по связывающим свойствам [ Williams, Enna, 1986 ].. С другой стороны это позволило определить Кс и А. При 10°С эти параметры составляли соответственно С2.86± ±1.63)-106 л/моль и 0.93±0.24, а при 20°С - С1.79±1.23М06 л/моль и 1.05±0.59, т.е. с учетом разбросов они не зависели от температуры. В связи с независимостью константы сродства КХ к центрам его связывания от температуры и концентрации объяснение температурной зависимости пресинаптического влияния КХ у холодно-

кровных, предусиатривовшее при этом участив температурозависимых процессов, в том числе ферментативных и канальных, представляется маловероятным. Поэтому альтернативное ему объяснение принято к рассмотрению. Справедливость положения об отсутствии кооперативнос-ти пресинаптических мест связывания ЮС была дополнительно проверена определением коэффициента Хилла, который при 20°С оказался равным 0.84±0.07, т.е. был весьма близок к 1.

Механизм влияния ХМ на спонтанную нейросекрецию в мионевральных синапсах холоднокровных

Поскольку действие ХМ на спонтанное квантовое освобождение медиатора у холоднокровных не устранялось различными холинолитиками С Бухараева и сотр., 1986 3, а также в связи с тем, что при развитии этого действия в ходе проведенного исследования не было выявлено участия ионных каналов и ферментов, следует признать, что изучаемые эффекты, по-видимому, не опосредуются известными рецеп-торными механизмами. Важнейшая роль ионов кальция в регуляции интенсивности нейросекреции [ Rahamimoff et al., 1980 J делает весьма существенным рассмотрение связи между исследуемым действием ХМ у холоднокровных и уровнем этих ионов в нервной терминали. Известно, что влияние ХМ на спонтанное квантовое освобождение медиатора у холоднокровных не обусловлено изменением входа ионов кальция в НО [ Бухараева, 1988 ]. Кроме того, полученные в настоящем исследовании данные о независимости пресинаптических эффектов ХМ от темепе-. ратуры и концентрации внеклеточного натрия свидетельствуют, что изучаемое действие ХМ не определяется и внутриклеточной концентрацией ионов кальция, т.к. указанные условия сопровождаются изменением содержания внутриклеточного кальция [ Duncan, Stathanj, 1977 J. 0 том же говорит и изучение влияния КХ на интенсивность спонтанного освобождения медиатора при разных исходных частотах МПКП Сот 0.3 до 4.5 имп/сек) и при различных концентрациях внеклеточных ионов калия (2.5 и 10 мг-ион/л), т.к. при этом не было зафиксировано различий в пресинаптическом действии КХ, хотя в данных, условиях концентрация ионов кальция в НО также изменяется t Duncan, Statham, 1977; Cooke, Qustel, 1973 ]. Известный факт одинакового по напрвленности и близкого по величине действия ХМ на вызванную и спонтанную секрецию медиатора у холоднокровных С Никольский, Гиниатуллин, 1979; Бухараева, 19883 дает основание думать, что ХМ воздействуют на звенья, общие для обоих механизмов нейросекреции. Такими звеньями могут быть

заключительные стадии зкзоцитоза синаптических везикул, в которых участвует мембрана НО. На решающую роль пресинаптической мембраны в исследуемых эффектах указывает и то, что четвертичные аммониевые основания, к которым относятся ХМ, в низких дозах не проникают через мембрану нервной клетки [ Putney, Askari Г 1980 ]. Эти обстоятельства, а также малые действующие концентрации и специфичность эффектов, позволили объяснить угнетающее пресинаптическое влияние ХМ у холоднокровных непосредственным воздействием этих веществ на структуры мембраны нервной терминали, ответственные за реализацию заключительных стадий зкзоцитоза синаптических везикул, т.е. на структуры активных зон пресинаптической мембраны. Весьма узкий диапазон между пороговыми и насыщающими концентрациями для пресинап-тического действия КХ, выявленный в ходе настоящего исследования, свидетельствует как об относительно небольшом числе таких структур на НО, так и об их высокой чувствительности к ХМ. Учитывая,(Что ХМ являются органическими ионами, а также то, что их пресинаптические эффекты не имеют значительной температурной зависимости, мембрано-тропное действие этих веществ, скорее всего, имеет физическую, а не биохимическую природу и может состоять, например, в модификации поверхностных электрических зарядов структур активных зон, влияющих на экзоцитоз синаптических везикул.

Действие ХМ на спонтанную квантовую секрецию медиатора в нервно-мышечных синапсах теплокровных в зависимости от температуры

Температурный коэффициент Q1qC15-25°C) для облегчающего действия КХ в концентрации моль/л на интенсивность-спонтанного освобождения медиатора в мионевральных синапсах крысы при повышенном до 13 ммоль/л содержании хлористого калия во внеклеточной среде оказался равным 1,8. Это указывает на присутствие в механизме пресинаптического действия ХМ в условиях предварительной деполяризации НО у теплокровных Св отличии от холоднокровных) температура- -зависимых процессов и не противоречит представлениям об участии, при этом канальных Н-рецепторных систем■[ Miyamoto, Volle, 1974 ]. Изучение пресинаптического действия КХ в нормальной ионной среде в концентрации 1-Ю"5 моль/л при температуре 38.0±0.5°С выявило угнетение спонтанной квантовой секреции в мионевральных синапсах крысы. К 16 мин протока КХ частота МПКП уменьшалась в этих условиях на 37.8*6.0% (n=6, Р<0.05). Установлено, что в нормальной ионной среде

при температурах ниже 3Т°С угнетающий эффект КХ у крысы не возникает. Торможение ХМ спонтанной квантовой секреции медиатора у теплокровных в условиях, весьма близких к физиологическим, свидетельствует о возможности ауторегуляции этой формы нейросекреции по принципу отрицательной обратной связи.

Статистический анализ изменения спонтанной квантой секреции медиатора в присутствии КХ в нервно-мышечных соединениях лягушки и крысы

Известно, что закон распределения МПКП во времени отражает определенные стороны механизма освобождения квантов медиатора из НО, в'частности, степень"зависисмости выброса.квантов [ Van der Kloo! et al. , 1975 3. Б связи с этим для выяснения возможности изменения механизма освобождения медиатора из НО под влиянием-холиномиметиков производилось изучение закона распределения МПКП во времени в условиях, которые сопровождались изменением интенсивности спонтанной секреции под действием аналогов ацетилхолина. При нормальной ионной среде в нервно-мышечных соединениях лягушки при 20°С и в синапсах крысы при 38°С все использованные статистические критерии указали, что как в контроле, так и в присутствии КХ закон распределения МПКП во времени соответствовал распределению Пуассона. В синапсах крысы в среде с повышенным содержанием ионов калия в двух экспериментах из 6 наблюдалась аналогичная картина, в остальных опытах закон распределения также не изменялся в присутствии КХ, однако, при этом имело место отклонение в сторону биномиального распределения. Коэффициенты автокорреляции не выявили значимой взаимозависимости изучаемых случайных событий ни в контроле, ни при действии КХ. Тот факт, что закон распределения МПКП во времени не модифицировался свидетельствует о том, что пресинаптическое действие ХМ не сопровождается существенным изменением механизма освобождения квантов медиатора из НО, в частности, не нарушается независимость выброса квантов медиатора. При изменении интенсивности спонтанной секреции под влиянием КХ профили гистограмм межимпульсных интервалов времени между МПКП всегда оставались неизменными. Это указывает на то, что изменение частоты МПКП происходило не за счет изменения числа активных зон НО, а за счет изменения интенсивности работы прежнего числа зон. Ибо при изменении числа активных зон, каждая из которых имеет отличную от других вероятность выброса медиатора £ Зефиров, Столов,1985 j, форма гистограммы межимпульсных интервалов, отража-

иная интенсивность работы всех зон в совокупности, должна была бы измениться.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что влияние АХ и его аналогов на спонтанное квантовое освобождение медиатора у холоднокровных не опосредуется известными рецепторными механизмами, включавшими в себя ионные каналы и ферменты, а обусловлено,непосредственным воздействием ХМ на структуры активных зон НО, имеющих отношение к экзоцитозу синаптических везикул. Выявленная температурная независимость пресинаптического действия ХМ у холоднокровных может обеспечить постоянство уровня регулирования квантовой секреции медиатора в различных температурных условиях существования этих животных. Для теплокровных при их физиологических температурах и в нормальной ионной среде было установлено угнетение спонтанной секреции медиатора под действием аналогов АХ, что совпадает по направленности с действием этих веществ на вызванную секрецию у теплокровных [ Bierkampfer et al., 1986 ], а также на вызванную [ Никольский, Гиниатуллин, 1979 ] и спонтанную [ Duncan, Publicover, 1979 3 секрецию у холоднокровных. Это свидетельствует о существовании общих черт в пресинаптическом действии ХМ у различных животных, а также указывает на возможность пресинаптической ауторегуляции освобождения медиатора в мионевральных синапсах позвоночных по принципу отрицательной обратной "связи.

ВЫВОДЫ

1. В мионевральных синапсах амфибий участки пресинаптической мембраны, опосредующие отрицательную обратную связь при саморегуляции спонтанной квантовой секреции медиатора, характеризуются структурной специфичностью по отношению к ацетилхолину, достаточно высокой концентрационной чувствительностью и насыщаемостью.

2. Модуляция холиномиметиками спонтанного квантового выделения медиатора в нервно-мышечных синапсах амфибий непосредственно не .связана с изменением проницаемости нервной терминали для ионов натрия и хлора.

3. Эффект карбахолина на спонтанное освобождение медиатора у амфибий в концентрациях близких к пороговым увеличивается при понижении температуры, а в насыщающих концентрациях в диапазоне от 5 до 30°С от нее не зависит.

4. Начальной стадией механизма саморегуляции спонтанного кван-

тового освобождения передатчика у амфибий является физическая адсорбция типа Лэнгмюра, а последующие этапы этого механизма в интервале от 5 до 30°С не зависят от'температуры.

5. Центры фиксации карбахолина на пресинаптической мембране холоднокровных идентичны между собой по связываюцим свойствам и в их функционировании отсутствует кооперативность.

6. Изучение закона распределения миниатюрных потенциалов концевой пластинки во времени показывает, что изменение уровня спонтанной квантовой секреции медиатора в нервно-мышечных синапсах лягушки и крысы в присутствии холиномиметиков не сопровождается нарушением независимости освобождения квантов передатчика из нервного окончания.

7. В нервно-мышечных соединениях теплокровных в условиях нормальной ионной среды при физиологических температурах действие карбахолина на спонтанное освобождение медиатора имеет угнетающий

. характер, при понижении температуры это действие исчезает.

- 16-

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Валидов А.И., Никольский Е.Е., Струнский Е.Г. Устройство для подачи микроинструмента. Авторское свидетельство СССР № 1303379 // Бюлл. изобретений. - 1987, № 14. - С. 70.

2. Никольский Е.Е., Струнский Е.Г. Автоматизация процесса замены растворов в физиологическом эксперименте // Физиол. журн. СССР им. И.М.Сеченова.- 1983,- т.69, №9,- С. 1256-1259.

3. Никольский Е.Е., Струнский Е.Г. Микроманипулятор для электрофизиологических исследований // Физиол. журн. СССР им. И. М. Сеченова." 1988.- т.74, № 4.- С.601-603.

4. Струнский Е. Г., Никольский Е.Е. Статистический анализ изменения спонтанной квантовой секреции медиатора в присутствии кар-бахолина в нервно-мышечном синапсе крысы // Нейрофизиология.-1989.- т. 21, № 4.- С. 561-564.