Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Механизмы ноотропной активности гидразидов фосфорилированных карбоновых кислот

На правах рукописи Для служебного пользования

Экз. № 002>

СЕМИНА ИРИНА ИВАНОВНА

МЕХАНИЗМЫ НООТРОПНОЙ АКТИВНОСТИ ГИДРАЗИДОВ ФОСФОРИЛИРОВАННЫХ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ

14.00.25-фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Научный консультант:

чл.-корр. АН РТ, доктор медицинских наук,

профессор Р.С.Гараев

Казань - 2000

Работа выполнена в Казанском государственном медицинском университете

Научный консультант: доктор медицинских наук,

профессор P.C. Гараев Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

член-корр. РАМН

профессор Ю.Ф.Крылов доктор медицинских наук, профессор Г.Г.Незнамов

доктор медицинских наук, профессор И.Е. Зимакова

Ведущая организация: Московская медицинская академия им. И.М.Сечен Защита состоится " ьЬОСиЯ 2000 г.

в_час. на заседании диссертационного Совета Д 084.29.03 Казанского

сударственного медицинского университета по адресу: 420012, г. К аз; ул.Бутлерова, д. 49.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского госуда] венного медицинского университета (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д корп. Б).

Автореферат разослан 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук,

профессор А.У.Зиганшин

Актуальность проблемы. Проблема изыскания новых ноотропных ¡редств и изучения их механизма действия является одним из важнейших на-фавлений современной психофармакологии. Особую актуальность эта г.ро->лема приобретает в связи с трудностью лечения деменций нейродегенератив-юго происхождения, в том числе, болезни Альцгеймера, которая в настоящее фемя является одним из наиболее частых заболеваний у пожилых и престаре-гых (Р.ЗаипаегБ, 1993; С.И.Гаврилова, 1996).

Поскольку при деменциях ухудшаются функции практически всех ней-ютрансмиттерных систем, нарушается структура клеточных мембран и разры-;ается связь рецепторов с вторичными посредниками (ОЛУ.ЯеЬок е1 а1.,1993; }.)УтЬЫ, 1996), наибольшей эффективностью могут обладать средства, механизм действия которых направлен на разные звенья патологического процес-а. Поиск таких средств весьма перспективен среди неантихолинэстеразных Фосфорсодержащих соединений, которые в последние годы стали объектом фистального внимания как потенциальные средства, улучшающие функции юзга (Р.Х.Хафизьянова, 1995; В.И.Петров и соавт., 1996; Р.Ь.Огт^ет е1 а1., 996; В.У.РоИег е1 а!., 1996; ХАУаНств е1 а1., 1996).

С этих позиций интерес представляют гидразиды фосфорилированных арбоновых кислот, одним из представителей которых является фосфабензид, недренный в практическую медицину в качестве транквилизатра Г.Ф.Ржевская, 1976; И.В.Заиконникова и соавт., 1980), впоследствии было ыявлено его ноотропное действие (Р.Х.Хафизьянова 1991), а в клинике и ан-идепрессивный эффект (Н.А. Блюхерова, 1981). В результате дальнейшего зучения психотропной активности фосфорилацетогидразидов было обнару-сено новое соединение-2-хлорэтокси-пара-Ы-

иметиламинофенилфосфорилацетогидразид - КАПАХ, предварительные ре-ультаты исследования которого также показали, что он обладает комплексом ффектов: анксиолитическим, антидепрессивным и ноотропным. (И.И.Семина, 988). Многообразие психотропных эффектов фосфорилацетогидразидов ука-ывают на целесообразость и перспективность их изучения как потенциальных зедств, улучшающих функции мозга при деменциях нейродегенеративного роисхождения и других когнитивных расстройствах.

Цель работы Изучение механизма действия фосфорилацетогидразидов как □тенциальных лекарственных средств с ноотропной и антидепрессивной ак-

1ВН0СТЫ0.

Задачи исследования:

Изучить ноотропное и антидепрессивное действие хлорэтоксиарил- и фос-орилацетогидразидов в широком диапазоне доз на поведенческих моделях и зовести анализ его зависимости от химической структуры соединений.

Оценить способность наиболее перспективного соединения- 2-хлорэтокси-фа-Ы-диметиламинофенилфосфорилацетогидразида (КАПАХ) улучшать паять, оказывать антиамнестическое, нейропротекторное и антидепрессивное :йствие на различных моделях патологических состояний у животных в >авнении эталонными препаратами.

3. Исследовать механизмы действия фосфорилацетогидразидов, обуславли вающие их ноотропную и антидепрессивную активность:

а) изучить спектр аффинности КАПАХ и его ближайших аналогов к рецепто рам ЦНС.

б) изучить мембранотропное действие КАПАХ и аналогов - их антиоксидант ные, мембраностабилизирующие свойства и способность влияния на бислой ную организацию мембран из фосфатидилхолина

в) исследовать влияние КАПАХ на процессы синаптической передачи в холи нергическом синапсе.

г) изучить эффекты совместного применения КАПАХ и субстанции Р на пове денческих моделях у животных и на изолированном нервно-мышечном синап се.

8. Провести поиск веществ с ноотропными и антидепрессивными свойствами i новых рядах фосфорилацетогидразидов - гидразиниевых солях фосфорилаце тогидразидов и N-замещенных фосфорилацетатов аммония, установить зави симость структура-активность и изучить некоторые стороны механизма и: действия.

Научная новизна. На основании изучения аффинности фосфорилацето гидразидов к рецепторам NMDA, АМРА, каинатным, глициновым стрихнинне чувствительным NMDA-комплекса, МК-801, сигма! и сигма2, аденозиновым (А и А2), ГАМКа и ГАМКв, серотониновым (5-НТь 5-НТ2, 5-НТ3), мускариновыи (М) и Мг ), никотиновым, холецистокининовым (ССК в )> нейрокининовы* (NK|), опиоидным (к), установлено, что хлорэтоксиарилфосфорилацетогидра зиды обладают способностью связываться с глициновыми стрихниннечувстви тельными участками NMDA-рецепторного комплекса, проявляя свойства aro нистов этих участков, что является одним из механизмов их мнемотропны: эффектов. Показано, что КАПАХ и его ближайший аналог соединение II про являют аффинность к нейрокининовым (NK)¡ - рецепторам, лигандом для ко торых является нейропептид субстанция Р.

Впервые установлены молекулярные механизмы мембранолипотропны: свойств фосфорилацетогидразидов, которые заключаются в их способност] взаимодействовать с фосфатидилхолином в области полярных головок, обра зуя комплекс фосфатидилхолин-препарат, что приводит к изменению бислой ной организации клеточной мембраны и может лежать в основе ноотропной i антидепрессивной активности фосфорилацетогидразидов.

Установлено, что 2-хлорэтокси-пара-Ы

диметиламинофенилфосфорилацетогидразид - КАПАХ - в низких концентра циях проявляет холиносенсибилизирующее действие, увеличивая амплитуд; токов концевой пластинки в нервно-мышечном синапсе позвоночных, не про являя аффинности к никотиновому рецептору и не ингибируя ацетилхолинэ стеразу. Показано, что механизм холиносенсибилизирующего действи: КАПАХ может быть опосредован через нейрокининовые рецепторы.

Научно-практическая значимость. На основании анализа зависимосл ноотропной и антидепрессивной активности, а также механизма действия фос

фориацетогидразидов от их химической структуры были синтезированы новые ряды соединений - гидразиниевые соли фосфорилацетогидразидов и И-замсшенные фосфорилацетаты аммония, которые в экспериментах проявляют ноотропную и антидепрессивную активность.

На различных моделях патологических состояний у животных показано, что КАПАХ является эффективным средством коррекции нарушений памяти, обучения и развития депрессивно-подобных состояний.

Показано, что механизм действия КАПАХ и других фосфорилацетогидразидов направлен на различные патогенетические звенья, которые могут обуславливать развитие когнитивных нарушений при нейродегенеративных заболеваниях, а именно:

- улучшать глутаматергическую передачу через глициновые стрихнинне-чувствительные участки ММОА-рецепторов;

- усиливать взаимодействие с основным медиатором в дофаминергических и холинергических синапсах через нейрокининовые рецепторы подобно ней-ропептиду субстанции Р;

- восполнять дефицит моноаминов путем ингибирования МАО типа Б;

-модулировать активность встроенных белковых комплексов (рецепторов,

ферментов, каналов) путем изменения липидной организации клеточной мембраны;

- проявлять антиоксидантные и мембраностабшшзирующие свойства

По материалам изучения ноотропной и антидепрессивной активности фосфорилацетогидразидов получены патенты России (№2141961, 1999), США (№ 5,679,663, 1997), Австралии (№ 682020 ), Южной Африки (№94/1781), а также опубликованы заявки на патент в Европе (№ 94905204.7, 1994) , Японии (№ 95//518388, 1994), Канаде (№2180336, 1994).

Полученные результаты обосновывают перспективность дальнейшего развития нового направления разработки психотропных препаратов на основе фосфориацетогидразидов с оригинальным механизмом действия.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Фосфорилацетогидразиды обладают ноотропной активностью, улучшая процессы обучения, памяти и проявляя антигипоксические свойства; хлорэток-сиарилфосфорилацетогидразиды, наряду с ноотропной активностью, оказывают антидепрессивное действие.

2. 2-хлорэтокси-пара-1Ч-диметиламинофенилфосфорилацетогидразид (КАПАХ) обладает способностью улучшать память и обучение у нормальных животных и подвергнутых амнестическому воздействию; проявляет нейропро-текторную и антидепрессивную активность.

3. Хлорэтоксиарилфосфорилацетогидразиды обладают аффиинностью к глициновым стрихниннечувствительным участкам ИМОА-рецепторов, проявляя свойства частичных агонистов, играющие роль в механизме их мнемотроп-ного действия.

4. Фосфорилацетогидразиды обладают мембранолипотропными и антиок-сидантными свойствами, лежащими в основе их ноотропной активности.

5. МАО Б ингибирующие, серотонинопозитивные и мембранотропные свойства принимают участие в механизме реализации антидепрессивных свойств хлорэтоксиарилфосфорилацетогидразидов.

6. КАПАХ специфически связывается с нейрокининовыми (NK|) рецепторами, что может обуславливать мнемотропный эффект и улучшать процессы холинергической передачи в нервно-мышечном синапсе.

7. Гидразиниевые соли фосфорилацетогидразидов и N-замещенные фосфо-рилацетаты аммония обладают ноотропным и антидепрессивным действием, в механизме реализации которого лежат антиоксидантные, мембраностабилизи-рующие, МАО - ингибирующие и серотонинопозитивные эффекты.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзном симпозиуме молодых ученых по проблеме "Серотонин мозга, нервно-психические нарушения и их лекарственная коррекция (Донецк, 1990); I, II, III, VII Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", (Москва, 1992, 1995, 1996, 2000); 1-м съезде Российского научного общества фармакологов (Волгоград 1995); на XHIth и XIVth International Conference of Phoshorus Chemistry - ICPC (lerusalem, Israel, 1995, Cincinnati, USA, 1998); на 11-th International Symposium on Sulfactans in Solution. - (lerusalem, Israel, 1996); на Fourh International Nice/Springfield Symposium on Advancces in Alzheimer Therapy (Nice, France, 1996); Первой научно-практической конференции "Болезнь Альцгеймера: достижения в нейробиологии, диагностике и терапии (Москва, 1996); международной конференции "Фармация в XXI веке: инновации и традиции" (Санкт-Петербург, 1999); на 17th ISN/13th EST Neurochemistry Meeting (Berlin, Germany, 1999).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на^О страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 72 таблицами и 29 рисунками. Указатель литературы включает 391 источник, из них 102 отечественных и 289 иностраных.

Материал и методы исследования.

В работе использовано 3810 белых мышей, 578 крыс, 160 монгольских песчанок.

Объектом исследования явились фосфорсодержащие соединения, синтезированные на кафедре органической химии КГТУ под руководством ведущего научного сотрудника к. х. н. Р.И.Тарасовой.

Исследуемые вещества представляют собой три ряда соединений - фосфо-рилацетогидразиды, гидразиниевые соли фосфорилацетогидразидов и N -замещенные фосфорилацетаты аммония, общую структуру которых можно представить формулами 1,2, 3:

1. Фосфорнлацетогидразиды (хлорэтоксиарнл- и дифенилфосфорилацето-гидразиды)

p-chjcnhn^

r2

О О

X=(CH3)N; R=CICH2CH20; R'=Rj=H (I); Х=СН3; R=CICH2CH20; R'=R2=H (II); X=Ci; R=C!CH2CH20; R^R^H (III); X=(CH3)N; R=C1CH2CH20; R1 =H; R2= C(0)CH3 (IV); X-(CH3)N; R=C!CH2CH20; R= H; R2=CH(OH)CCl (V); X=(CH3)N; R=C1CH2CH20; R2=CH2C6H5 (VI); X=(CH3)N; R=CICH2CH20; R2=CH(CH3)2 (VII); X=(CH3)N;R=C1CH2CH20; R',R2=CHC6H4COOH (VIII); X=(CH3)N;R=CICH2CH20; R ',R2=CIIC6I14СООНШ2СН2СбН5 . (IX); X=(CHj)N; R=C1CH2CH20; R1, R2=CHC6H5 (X); X= (CH3)N; R=C1CH2CH20; R1, R2=C(CH3)COOH (XI); X= (CH3)N; R=OC2H5; R^RMÍ (XII); X= H; R= C6H5; R'=R2-H (XIII); X= (CHj)N; R=C1CH2CH20; R1, R2=H (HCl) (XIV); X= H; R= C6H5; R'=R2=H (HCL) (XV); X= H; R= C6H5; R'=R2=CHC6H5 (XVI); X= H; R= C6HS; R'=R2=CHCHC6H5 (XVII). Для выявления функционально-активных групп были использованы соединения: дифенилфосфо-рилуксусная кислота (XVIII); диэтигидразид (XIX); диэтиламид (XX); а также гидразиды, в химической структуре которых отсутствует атом фосфора (XXI и XXII).

2. Гидразнниевые соли фосфорилацетогидразндов

o'+nh3nh2 p-ch2cnhnh2

О О

Х= Н (Г-1); Х= С1 (Г-И); Х=СН3 (Г-Ш); Х= СН3 О(Г-П'); Х= F (Г-V); X=(CH3)2N (Г-VII)

3. N-замещенные фосфорнлацетаты аммония А. Фосфорнлацетаты

р chjcoo" +nhjr

О

R=CHCH(CH3)2COOC2H5 (A-I); R= CH(CH3) COOC2H5 (A-II); R= CH(CH3)C6H5 (А-Ш) Б. Ацетнлфосфииаты

о +nh3r Р - СН2 СОО" +У

О

y=NH3R, R=CH(CH3)COOC2Hs (A-IV); У= Н, R= СН(СН3)СООС2Н5 (A-V); У= Na, R=Na (А-VI)

Оценку ноотропных свойств соединений проводили на мышах в условиях моделях условной реакции пассивного избегания (УРПИ) и гипобарической гипоксии (Ковалев Г.В., 1990), антидепрессивной активности - на модели "поведенческое отчаяние" (Porsolt R.D., 1977; Русаков Д.Ю., Вальдман A.B., 1983) у мышей.

Углубленное изучение наиболее перспективного соединения КАПАХ (1 -100мг/кг) проводили с использованием следующих методов:

Выработку УРПИ на крысах, в том числе, старых (20-22 мес.), осуществляли по В.К. Федорову и соавт., 1972 с анализом влияния препарата на этапы формирования и консолидации информации (В.В.Виноградов и соавт., 1984); В.Г.Ковалев, 1990). Условный рефлекс активного избегания (УРАИ) вырабатывали у крыс в челночной камере (А.А.Крауклис, 1964). Через 24 часа после последнего обучения определяли содержание РНК и ДНК в коре головного мозга крыс согласно Р.Г. Цаневу, Г.О.Маркову, 1960, в модификации В.В.Галкина и Г.Д.Бердишева, 1968.

Антиамнестическую активность КАПАХ изучали с применением скопола-мина и гипоксии. Амнезию, вызванную однократным введением скополамина (0,5 мг/кг, в/б, за 30 мин. до обучения УРПИ) моделировали у монгольских песчанок. Моделирование амнестического синдрома (Ю.В.Буров и соавт., 1991), вызванного длительным введением скополамина (1 мг/кг в/б в течение 20 дней) осуществляли на крысах. КАПАХ применяли с лечебной целью в течение 10 дней в дозах 100-1 мг/кг. Как тест метод использовали УРПИ. Через 24 часа после последнего введения КАПАХ крыс забивали декапитацией, выделяли синаптосомы (Е. DeRobertis, 1973) и экстрагировали липиды (М.Кейтс, 1975). Разделение общих липидов и фосфолипидов проведено при помощи тонкослойной хроматографии на силикагеле с их последущим количественным определением (А.Н. Амбрамзян, 1978). Амнезию, вызванную нормобарической гипоксией (4 % 02 и 96 % N2 сразу после обучения в течение 40 с) моделировали у монгольских песчанок с использованием УРПИ как тест -метод.

Гипобарическую гипоксию у крыс моделировали в течение 30 минут в барокамере на "высоте" 8500 м (А.С.Лосев и соавт., 1986) с последующим определением в одной пробе сыворотки крови содержания глюкозы, общего белка, мочевины, креатинина, холестерина, триглицеридов, ß-липопротеидов, билирубина, сывороточного железа, мочевой кислоты, а также активности ферментов аланиновой и аспарагиновой трансаминаз, щелочной фосфатазы, креати-нинфосфокиназы, лактатдегидрогеназы. Измерение осуществляли на биохимическом анализаторе "Cobas mira plys" (Hoffman la-Roche) с использованием монотестов той же фирмы.

Острую перинатальную гипобарическую гипоксию у крыс осуществляли согласно методике, описанной М.Я.Майзелисом (1983). КАПАХ (10 мг/кг, п/к) вводили в раннем постнатальном периоде с 8-го по 20-й день жизни. В 2-х месячном возрасте у потомства изучали исследовательскую активность в "открытом поле", процессы обучения и памяти в условиях УРПИ, антидепрес-

сивную активность на модели "поведенческое отчаяние" (R.D.Porsolt et al., 1977) и активность МАО Б в коре головного мозга (А.И.Балаклеевский, 1976).

Гемическую гипоксию у мышей (Н.В.Кораблев и соавт., 1976) вызывали подкожным введением нитрита натрия (350 мг/кг). КАПАХ вводили за 40 минут до инъекции нитрита натрия, а также хронически в течение 7 дней.

Взаимодействие соединений с блокатором NMDA-рецепторов кетамином изучали в опытах на мышах на моделях УРПИ и гипоксии в барокамере. Кета-мин (10 мг/кг в/б вводили сразу же после обучения УРПИ и за 40 минут до помещения животных в барокамеру, исследуемые соединения - в дозах, составляющих 1/10 от ДЛ50 - за 30 минут до обучения УРПИ или до гипоксии.

Нейропротекгивное действие КАПАХ оценивали in vitro на культуре эмбриональных нейронов коры мозга крыс, подвергнутой инкубации в гипокси-ческой среде (J.-Y.Koh et а]., 1987; R.F.Regan et al., 1991).

Антидепрессивное действие КАПАХ изучали с применением методики "поведенческое отчаяние" у крыс (R.D.Porsolt et al., 1977) и "выученная беспомощность" у мышей (H.Anisman, 1979).

Изучение специфического связывания с рецепторами проводили радиоли-гандным методом на мембранных препаратах крыс (Sprague-Dawley OFA strain, Iffa Credo, Франция) и морских свинок (Dunkln-Hartley strain, Iffa-Credo, Франция). Была изучена аффинность к следующим рецепторам: NMDA (M.A.Sills, 1991), глициновым стрихнин-нечувствительным (B.M.Baron et al., 1991), МК-801 (RW. Ransom et al., 1988), AMPA (T.Honore et al., 1985), каинат-ным (S.Patel et al., 1990), сигма| (D.L. De-Haven-Hundkins, 1992), сигма2 (S.Heiiwell 1994), аденозиновым Ai (M.J. Lohse, 1984) и A2 (M.F.Javis et al., 1989), rAMKA(S.R.Snodgrass, 1978) и ГАМКВ (D.R.Hill et al., 1981), серотони-новым HT, (J.P.Bennett et a]., 1976), HT2 ( J.E.Leysen et al., 1982), HT3 (D.R.Nelson et al., 1989), мускариновым M| и M2 (F.DOrjie, 1991), никотиновым (P.Boksa et al., 1987), холецистокининовым (R.S.L.Chang et al., 1989), нейроки-ниновым NK| (M.H.Perrone et al., 1983), опиоидным к (J.A.Smith et al., 1989). Кроме того, было исследовано влияние КАПАХ и аналогов на активность кальциевых (LJ.Cruz et al., 1986), калиевых (J.Vazquez et al., 1990) и натриевых (R.B.Rogart, 1985; G.Brown, 1986) каналов.

Кривые ингибирования анализировали с помощью компьютерной программы EBDA (McPherson, Elsevier Biosoft, Cambrige, U.K.).

Мембраностабилизирующее действие КАПАХ и аналогов изучали на модели осмотического гемолиза эритроцитов, вызванного гипото-ничностыо среды (A.D. inglot et al., 1986).

О степени перекисного окисления липидов (ПОЛ) в ткани коры головного мозга крыс судили по реакции образования диеновых коньюгатов (И.Д.Стальная, 1977) и по накоплению малонового диапьдегида в реакции с тиобарбитуровой кислотой (И.Д.Стальиая и соавт., 1977)) в экспериментах in vitro. Соединения исследовали в концентрациях 10"4 - 10'7М.

Мембранолипотропные свойства КАПАХ и аналогов изучены методами 31Р-ЯМР-спектроскопии (J.Peuvot et al., 1995) электронно-парамагнитного резонанса (ЭПР) и колебательной инфракрасной (ИК)-спектроскопии.

Объектом для изучения мембранолипотропных свойств служили искусственные мембраны из фосфатидилхолина - одного из основных липидов плазматической мембраны. В работе был использован яичный фосфатидилхолин ("Биолек", Харьков, Украина).

ЯМР-спектры регистрировали на спектрометре MSL -400 (Bruker, Германия), ЭПР - на радиоспектрометре РЭ-1306, ИК-спектры липосом - на ИК-спектрометре модели М-80 ("Karl Zeiss Jena").

Влияние соединений (10"3-10'4 М) на активность МАО Б по субстрату бен-зиламин в коре головного мозга мышей изучали в экспериментах in vivo и in vitro (А.И.Балаклеевский, 1976).

Действие на центральные серотонинергические структуры оценивали по изменению числа "кивков" головой у мышей, вызванных введением 5-окситриптофана (300 мг/кг, в/б).

Изучение влияния КАПАХ и его хлористоводородной на процессы холи-нергической передачи проведено электрофизиологическим методом на нервно-мышечных препаратах портняжной и кожно-грудинной мышц лягушек, и m.soleus белых крыс. Препараты помещали в ванночку, через которую протекали стандартные физиологические растворы для теплокровных и холоднокровных. Измерение миниатюрных токов концевой пластинки (МТКП) осуществляли с помощью стандартной двухэлектродной методики фиксации мембранного потенциала. Анализ амплитуды и временных параметров сигналов производили с помощью оригинальной компьютерной программы при квантовании сигналов 10 мкс.

В экспериментах при сопоставлении эффектов субстанции Р и КАПАХ были использованы анализаторы: субстанция Р и Win 51,708 (RBI, Natick, MA, США). В качестве препаратов сравнения в фармакологических экспериментах использовали пирацетам (Sigma Chemical, США), мелипрамин (Венгрия), ниа-ламид (субстанция).

Полученные экспериментальные значения обработаны статистически с использованием t критерия Стьюдента и методом ANOVA, с использованием Dannett's теста.

Статистическую обработку результатов экспериментов на нервно-мышечном синапсе проводили, используя t- критерий Стьюдента для попарно связанных вариант в программе Microcal Origin 3.5.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изучение ноотропной и антидепрессивной активности фосфорилацстогидразидов

Результаты скрининга психотропной активности фосфорилацетогидрази-дов (1/10, 1/100 от ЛД50) и изучение зависимости структура - активность пока-

зали, что комплексом ноотропных и антидепрессивных эффектов обладают незамещенные хлорэтоксиарилфосфорилацетогидразиды (табл. 1).

Таблица 1. Ноотропная (мнемоттюпнсе действие и антигипоксический эффект) и антиде-прспрессивная активность фосфорилацетогндразидов и соединений сравнения в дозах, составляющих 1/100 от ЛД5р у мышей ___

Мнемотропное дей- Антигипокси Антидепрессив-

Соединение ствие (латентный ческое действие ное действие ЛД5а

период на модели (время жизни (время (мг/кг)

УРПИ, %) в барокамере, %) "замирания"%)

I (КАПАХ) 280* 131* 69* 960±35

II 245* 170* 73* 910+76

III 256* 106 61* 900+79

IV 199 136 90 3120+160

V 121 93 - 2980+134

VI 84 104 80* 5100+264

VII 89 110 101 4950±136

VIII 182 93 97 5110+190

IX 325* 108 90 5180+36

X 217* 139* 85 4960+210

XI 212* 111 93 5250+286

XII 155 113 105 1040±64

XIII 248* 126 91 315+24, m

XIV 380* 200* 67 945+24

XVI 92 - 102 5200+310

XVII 130 - 87 >5000

XVIII 77 125 125* 2650±215

XIX 166 - 85 5400+235

XX 92 - 86 5190+325

XXI 83 89 90 714+18

XXII 147 85 86 243+24

Пирацетам 186* 130 105

Мелипрамин - - 79*

Ниаламид - - 70*

Контроль 100 100 100

* - разница достоверна при Р < 0,05; # - литературные данные

Сравнение эффективности исследованных соединений с эталонными препаратами показало, что наиболее активные фосфорилацетогидразиды (I, II, III, IX, X, XIII) в дозах, составляющих 1/100 от ЛД50, превосходят по выраженности мнемотропного действия пирацетам (100 мг/кг), а их антидепрессивный эффект сопоставим с таковым у мелипрамина (10 мг/кг) и ниаламида (20 мг/кг).

По результатам скрининга ноотропной* и антидепрессивной активности выбрано наиболее перспективное соединение 2(2-хлорэтокси-пара-Ы-диметиламинофенилфосфорилацетогидразид - КАПАХ, которое было изучено более подробно.

* - данный фрагмент выполнен совместно с Н.А.Тихоновой

Изучение спектра фармакологической активности 2(хлорэтокси)-пара-N-диметиламинофенилфосфорилацетогидразида (КАПАХ)

Углубленное изучение ноотропных и антидепрессивных свойств КАПАХ показало, что препарат улучшает процессы обучения в норме в условиях моделей УРАИ и УРПИ у крыс и мышей, способствует улучшению мнестических эффектов у старых животных, проявляет антиамнестическое действие на модели "преждевременного старения" у крыс, вызванного длительным введением скополамина, нормализуя при этом и липидный состав синаптосом.

Наиболее ценной является способность КАПАХ проявлять активность на моделях, где амнезирующем агентом является гипоксия, поскольку именно гипоксия является одним из ведущих патогенетических факторов при нарушении интеллектуально-мнестических функций у человека (Г.В. Ковалев, 1990). Амнезия, выванная гипоксией у монгольских песчанок (рис.1), вызывает значительное нарушение памяти, которое выражается в виде ухудшения воспроизведения навыка в условиях УРПИ. КАПАХ, введенный до обучения, оказывает выраженное профилактическое действие в широком (1 - 100 мг/кг) диапазоне доз, максимальный эффект отмечен в дозе 1 мг/кг. Следует отметить и высокую активность на этой модели и других ближайших аналогов КАПАХ - соединений II и III (рис. 2).

Существенные нарушение мнестических процессов вызывает и перинатальная гипоксия, последствия которой отмечаются у потомства в половозрелом возрасте. Так, у животных, перенесших перинатальную гипоксию, значительно снижается способность к обучению в условиях УРПИ (рис.3), ухудшается соматический статус, что согласуется с литературными данными (С.С.Трофимов и соавт., 1993). Кроме того, нами установлено, что эти животные в большей степени предрасположены к развитию депрессивно-подобного сотояния. Так, на модели "поведенческое отчаяние" длительность периодов неподвижности животных, перенесших перинатальную гипоксию, увеличивалось на 58% (р< 0,05) по отношению к контролю (рис. 4).

Применение КАПАХ (10 мг/кг п/к) в раннем постнатальном периоде развития предупреждало дефицит обучения и памяти при тестировании половозрелых крыс в условиях модели УРПИ на 2, 7 и 30 дни после обучения, сокращало длительность периодов неподвижности на модели "поведенческое отчаяние" до уровня контрольных животных (рис. 3 и 4), а также предупреждало изменения соматического статуса животных.

Одним из возможных эффектов КАПАХ, лежащих в основе антиамнести-ческого действия при гипоксии, может быть его способность оказывать защитное действие на нейроны, предотвращая развитие вызванной гипоксией дегенерации. Для этого было исследовано нейропротекторное действие КАПАХ на культуре кортикальных эмбриональных нейронов крыс, подвергнутых гипок-сическому воздействию в экспериментах in vitro, где причиной гибели клеток является чрезмерный выброс глутамата и индуци рованное им высвобождение свободных радикалов. Поэтому в качестве препарата сравнения на этой модели был использован неконкурентный антагонист NMDA-рецепторов МК-801, ко-

торый препятствует взаимодействию глутамата с рецепторами и тем самым уменьшает вызванную гипоксией нейротоксичность (1.Ра1е1 е1 а1., 1990). Аналогично МК-801, хотя и уступая ему по выраженности действия, КАПАХ оказал защитное действие (рис.5), что может способствовать его антиамнестической активности при гипоксических нарушениях памяти.

Контроль) Контроль2 (гипоксия) КАПАХ ♦ гипоксия Пирацатам ♦ гипоксия

Рис. 1 Эффекты КАПАХ на модели амнезии, вызванной нормобарической гипоксией у монгольских песчанок в тесте УРПИ; * - разница достоверна по отношению к контролю 1 (р<0,05); '* • разница достоверна по отношению к контролю 2 (р<0,05)

Контроле Контроль2 II + Ш ♦ Пирацетам Соединение

(гипоксия) гмпоксмя гипоксия + гипоксия

Рис. 2 Эффекты аналогов КАПАХ (II и III) на модели амнезии, вызванной нормобарической гипоксией, у монгольских песчанок в тесте УРПИ; * - разница достоверна по отношению к контролю 1 (р<0,05); " • разница достоверна по отношению контролю 2 (р<0,05)

**

Ряс. 3 Влияние КАПАХ и* воспроизводство УРПИ у потомства, подвергнутого перинатальной

гипоксии

в • разница достоверна по отношению к группе контрольных животных при р <0,05 ** - разница достоверна по отношению к группе "гипоксических" животных при р <0,05

Интактные Гипоксия Гипоксня+КАПАХ Группа животных

Рис. 4 Влияние КАПАХ на время "зависания" на модели "поведенческое отчаяние" у крыс,

испытавших перинатальную гипоксию, * - разница достоверна (р<0,05) относительно контрольных крыс ; " • разница достоверна (р<0,05) относительно "гипоксических" крыс

КАПАХ (1 - 100 мг/кг) проявляет противогипоксические свойства и на стандартных моделях гипоксии - гипобарической и гемической гипоксии у мышей, причем следует отметить его более выраженный эффект при многократном применении. В отличие ,от КАПАХ, действие пирацетама при острой кислородной недостаточности проявляется в большей степени при однократном, чем при длительном применении. Изучение биохимических показателей крови крыс после длительного воздействия гипобарической гипоксии при профилактическом введении КАПАХ показало, что препарат предупреждает ги-перферментемию, снижает уровень холестерина и нормализует соотношение холестерин/триглицериды.

Рис. 5 Влияние КАПАХ на нейротоксическое действие гипоксии в эмбриональной культуре кортикальных нейронов мозга крыс, подвергнутой гипоксическому воздействию; * - разница достоверна по отношению к гипоксии (р<0,05)

Об особенностях антидепрессивного действия КАПАХ свидетельствуют результаты оценки его антидепрессивной активности на модели "выученной эеспомощности" (табл.2). Показатели поведения стрессированных животных, получавших инъекции КАПАХ, начали нормализовываться уже после трехдневного введения, тогда как мелипрамин уменьшал латентный период избегания только на 10 сутки. Способность корригировать поведение стрессированных животных обнаружена у КАПАХ и при его пероральном введении 'табл.2). Результаты данного эксперимента подтверждают наличие у КАПАХ штидепрессивной активности и позволяют предположить о возможности более Зыстрого наступления терапевтического эффекта в клинике, чем у мелипрами-га.

Таблица 2. Влияние КАПАХ на показатели реакции избегания у мышей на модели

'выученная беспомощность" при внутрибрюшинном и пероральном введении

% неизбеганий Латентный период % неизбеганий Латентный

от общего числа избеганий от общего чис- период избе-

Группы животных проо М ± m (с) ла проб ганий М ± ш (с)

3-х кратное введение 5- кратное введение

Сонтроль 1(интактные) 36.7 14,0 + 0,7 28,1 .11,7+ 1,1

(онтроль 2 (стрессиро-анные мыши) 68,8* 17,2+1,1 * 62,0* 15,7 ± 1,2*

САПАХ 10 мг/кгв/б 30,0 ** 12,9+1,1 *♦ 31,0 11,8 + 2,1

САПАХ 1 мг/кг в/б 20,0 •* 9,6 + 1,5 ** 7,5 ** 7,6 + 0,94**

1нрацетам 100 мг/кг 47,0 15,0 + 2,0 20,0 ** 10,2+1,8 **

Лелипрамин 10 мг/кг 43.0 13,5 + 1,8 29,0 11,8+1,5

'АПАХ 40 мг/кг per os 26,0 44 8,4 + 1,2 ** 8,3** 8,8 + 0,9 **

ГАПАХ 4 мг/кг per os 21,4 ** 9,8 + 0,7" 8,2 8,1+0,3 **

- разница достоверна (р < 0,05) относительно контроля 1; '* - разница достоверна (р < 0,05) относительно контроля 2

Сочетание у КАПАХ антиамнестической, нейропротекторной и антидепрессивной активности представляет интерес в перспективе лечения нарушений памяти, когнитивных расстройств и деменций различного происхождения, в том числе, нейродегенеративного, что является основанием для изучения егс механизма действия.

Изучение механизма ноотропного и антидепрессивного действия КАПАХ и аналогов

Исключительно важным в понимании молекулярных механизмов действия КАПАХ и его аналогов является изучение аффинности к рецепторам ЦНС. С этой целью было изучено специфическое связывание КАПАХ и его ближайших аналогов - соединений II и III с рецепторами NMDA, глициновыми стрихнин-нечувствительными, МК-801, АМРА, каинатными, сигма|, сигма2, аденозиновыми А) и А2, ГАМКЛ и ГАМКВ, серотониновыми 5-НТ! , 5-НТ2, 5-НТз, мускариновыми М| и М2, никотиновыми, холецистокининовыми, нейро-кининовыми NK| , опиоидными к.

Изучение КАПАХ и аналогов II и III к рецепторам возбуждающих аминокислот (ВАК) показало, что исследуемые соединения не проявляют аффинности к рецепторам АМРА, каинатным, МК-801 и NMDA, но специфически связываются с глициновыми стрихниннечувствительными участками NMDA - рецепторов (табл.3) и повышают связывание с рецепторами МК-801 их специфического лиганда. Результаты экспериментов выявили наличие аффинности к глициновым участкам и других фосфорилацетогидразидов - соединений IV, V, VI и VII (табл.3).

Анализ зависимости специфического связывания соединений от их химической структуры показал, что на аффинность оказывают влияние замещения и в фосфорильном и гидразидном фрагментах, что, вероятно связано с наличием двух узнающих (положительно и отрицательно заряженных) центров в рецепторе.

Таблица 3. Влияние некоторых гидразидов фосфорилированных карбоновых кислот на связывание 3Н-5,7-дихлоркинуреновой кислоты_

Соединение Ki(M) 1С50(М)

I 8,8 х 10"5 1,0 х Ю-4

II 8,8 х 10"5 1,0 х 10"4

III 1,0 х 10"5 1,2 х 10"4

IV >1,0x10° >1,0 х 10"4

V > 1,0 х №5 >1,0 х 10-4

VI 8,8x10"5 1,0 хЮ"4

VII 8,8 х 10'5 1,0 х 10"4

Донор Н-связн

I 1)~

,А~ t

Акцептор Н-связи

Донор Н-связи

А~ t

Акцептор Н-связи

X = (CH3)2N, R=H (I-КАПАХ) ; Х=СН3, R=II (II); X = CI, R= H (III); X= (CH3)2 N, R = C(Q)CH3 (IV)_

Ar = C6H5(V)

Ar= C6H4COO"+ NHjCH2C6Hs (VI) Ar = C6H4COOH(VII)

О

1 "N— СНАг

N

1 2

II

Рис. 6 Структурная формула КАПАХ (I), его аналогов (II-IV) и N-метилиденпроизводных; предполагаемые фармакофоры для взаимодействия с глициновыми стрихниннечувствитель-ными участками NMDA-рецептора

Так, замена диметиламинной (КАПАХ) или метальной (соединение II) групп, обладающих донорным характером, на акцепторный атом хлора в аналоге III приводило к повышению связывания. В то же время, замещенные гидразиды (соединения IV и V) проявляют менее выраженную аффинность к глициновым участкам, чем гидразоны (VI и VII) и незамещенные гидразиды.

Специфическое связывание фосфорилацетогидразидов с глициновыми стрихниннечувствительными рецепторами является одним из возможных механизмов улучшения ими когнитивных и мнестических функций. Глициновые участки оказывают модулирующее влияние на NMDA-рецепторы, функцио-

нальная активность которых играет ведущую роль в процессах обучения и памяти и развитии нейродегенеративных процессов (P.D.Leeson et al., 1993, 1994).

Анализ способности соединений повышать связывание с рецепторами МК-801 их специфического лиганда показал, что выраженность этого связывания прямо пропорциональна аффинности соединений к глициновым участкам: по мере снижения аффинности уменьшается и способность соединений к повышению связывания МК-801 с его лигандом. Этот эффект соединений может быть обусловлен их аффинностью к глициновым участкам, поскольку известно, глицин и частичные агонисты глициновых участков (НА-966) повышают связывание МК-801 с их участками (R.Sircar et al., 1989, P.D.Leeson et al., 1994). Полученные нами данные указывают на то, что фосфорилацетогидразиды могут являться частичными агонистами глициновых участков.

В настоящее время глициновые участки рассматривают как новую мишень для действия потенциальных лекарственных средств, но большинство имеющихся веществ, имея высокую аффинность in vitro, плохо проникают через ГЭБ (P.D.Leeson et al., 1994). Полученные данные позволяют рассматривать фосфорилацетогидразиды как новый класс химических веществ, проявляющих аффинность к глициновым стрихниннечувствительным участкам NMDA- ре-цепторов.КАПАХ и аналоги не проявляют аффинности к другим вышеперечисленным рецепторам, за исключением нейрокининовых NKi.

Согласно синапсо-мембранной гипотезе памяти, механизм ее формирования и нарушения при деменциях и когнитивных расстройствах в процессе старения определяется структурно-функциональными изменениями в мембране (Т. А. Воронина, С. Б. Середенин, 1998; Н. А. Авдулов, 1990; Е. Б. Бурлакова и соавт., 1985; JI. Л. Прилипко и соавт., 1987).

Результаты изучения мембранотропных эффектов фосфорилацетогидрази-дов показали, что препараты снижают интенсивность осмотического гемолиза эритроцитов, что предполагает наличие у них мембраностабилизирующей активности. Изучение зависимости этой активности от химической структуры соединений показало, что мембранозащитные свойства присущи хлорэтоксиа-рилфосфорилацетогидразидам, а для более выраженного их проявления необходимо наличие незамещенной гидразидной группы. Наибольшая активность на этой модели отмечена у незамещенного хлорэтоксиарилфосфорилацетогид-разида - КАПАХ.

Большинство фосфорилацетогидразидов обладают антиоксидантными свойствами, уменьшая концентрацию конечного продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ) малонового диальдегида (рис.7), не влияя на начальный этап ПОЛ - диеновую конъюгацию.

Анализ зависимости активности соединений от их химического строения показал, что для проявления антиоксидантных свойств обязательно присутствие гидразидной группы, поскольку отсутствие гидразидной группы в молекуле дифенилфосфорилуксусной кислоты (XVIII) приводит к исчезновению способности снижать концентрацию МДА, а замещенные гидразиды (IV) менее

эффективны, чем незамещенные (I, II) и гидразоны (VIII, IX, X, XI). Хлористоводородные соли КАПАХ (XIV) и фосфабензида (XV) более активны, чем исходные соединения. По-видимому, их тормозящий эффект обусловлен наличием в молекуле подвижного атома водорода, в результате чего он восстанавливает высокореактивные радикалы.

Сравнение фосфорилированных ацетогидразидов с их аналогами, не содержащими фосфора (XXI и XXII) показало необходимость присутствия атома фосфора для проявления антиоксидантных свойств.

140

i ii iii iv vi vil viii ix__х__xii

■ -4 а-5 П-6 О-7 ! Loe <М)

Рис. 7 Влияние фосфорилацетогидразидов на содержание МДА в гомогенате коры головного мозга крыс. Контрольное значение принято за 100%; 100 % МДА соответствует 85,22 мк/М; * - разница достоверна (р<0,05).

В основе защитного действия на мембрану веществ с мембранотропными свойствами может лежать их способность стабилизировать бислой мембраны за счет образования устойчивых комплексов между их молекулами и липидами мембраны (Д.А.Александровский и соавт., 1991). Мембранозащитные свойства, обусловленные непосредственным взаимодействием с липидами биомембран, отмечены и у ноотропов, в частности, пирацетама (ГРеиуо! е1 а1., 1995).

Мембранолипотропные свойства фосфорилацетогидразидов изучены на искусственных мембранах из фосфатидилхолина, одного из основных липидов внешней поверхности клеточной мембраны, методами 31Р-ЯМР-спектроскопии, электронно-парамагнитного резонанса (ЭПР) и инфракрасной колебательной (ИК) - спектроскопии. *

Результаты 31Р-ЯМР-спектроскопии показали, что исследуемые гидразиды взаимодействуют с мембранами из фосфатидилхолина, вызывая изменения ли-пидной организации, о которых свидетельствует появление узкого изотропного сигнала вблизи 0 м.д. (рис. 8 и 9).

Анализ зависимости структура-активность показал, что на проявление мембранолипотропной активности соединений оказывают влияния как замещения в фосфорильном фрагменте, так и в гидразидной группе. Так, замещенный гидразид (IV) не оказывает воздействия на структуру фосфатидилхолино-вых липосом, а замена фенильных радикалов в фосфорильном фрагменте на этильные (соединение XIX) или исключение атома фосфора из молекулы фосфорилацетогидразидов также приводит к исчезновению способности взаимодействовать с липидами мембраны.

Значительно более выраженное искажение бислойной организации вызывают соединения, образующие солевые структуры, о чем свидетельствуют ЯМР-спектры хлористоводородных солей КАПАХ, фосфабензида и соединения И(рис^). Интенсивность изотропного сигнала в этих спектрах возрастает, что, очевидно, связано с увеличением доли молекул фосфатидилхолина, непосредственно связанных с молекулами препаратов, что, по-видимому, обусловлено образованием дополнительных центров связывания с несущими как "+", так и "-" заряды молекулами фосфатидилхолина.

Препарат II, у которого диметиламиногруппа замещена на метильную, также вызывает сильное искажение бислоя модельных мембран, что может быть обусловлено его способностью образовывать солевую структуру.

При изучении механизма взаимодействия КАПАХ с мембранами методами ИК- и ЭПР, было установлено, что связывание его с фосфолипидом происходит только в области полярных головок, в зоне 5-го углеродного атома жирно-кислотных цепей липидных молекул путем образования водородной связи между карбонильной группой фосфатидилхолиновых липосом и гидразидным фрагментом КАПАХ, и его влияние уменьшается по направлению к хвосту углеводородной цепи. Следует отметить, что хлористоводородная соль КАПАХ взаимодействует с холиновым фрагментом фосфатидилхолина (Д.А.Файзуллин и соавт., 1999), чему способствует наличие анионной группы солевого фрагмента.

* - данный фрагмент работы сделан совместно с н.с.И.Г.Семиной

_)___I__I____

20 0 -20 мл.

V__

_I_1___

20 о -го м.д.

_[__I I

20 0 -20 ил

Рис. 8 3,Р-ЯМР спектры водной дисперсии яичного фосфати-днлхолина: (а) - контроль и поете добавления фосфорнлаце-хогидр азидов в мольном соотношении препа-рат/фосфатидилхолип 1 /1: (б) -1; (в) - II; (г) - IV; (д) - XIII,

Ряс. 9 "Р-ЯМР спектры водной дисперсии яичного фосфатн-днлхолина после добавления фосфорнлацетогндразидсв в мольной соотношения препарат/фосфатидилхояиа 1/1: (а) -XII; (б ) - XIX; (в) - XIV; (I) - XV; (д) ■ таорнстоводороЕнвя! соль соединения II.

Учитывая, что КАПАХ при введении в организм также способен к образованию солевой структуры с отрицательно заряженной фосфорильной группой, можно предположить аналогичный эффект при его введении in vivo.

Выявленная нами взаимосвязь между мембранолипотропными свойствами соединений и их психотропным действием (табл. 4) показывает, что комплексом всех психогоропных эффектов обладают незамещенные хлорэтоксиарил-фосфорилацетогидразиды (КАПАХ, соединения II, III), они же проявляют мем-бранотропную активность на всех исследованных моделях. Отсутствие антидепрессивного действия у незамещенных дифенилфосфорилацетогидразидов (фосфабензид, соединения XVI, XVII) можно объяснить их более глубокой ( в области 7-ого углеродного атома) локализацией в липидах (Н.Н.Вылегжанина и соавт., 1998). Антидепрессанты, как известно, имеют более поверхностную локализацию в липидном слое мембран (Н.А.Авдулов, 1990).

Следует отметить, что исключение атома фосфора из структуры фосфо-рилацетогидразидов приводит к потере мембранотропного действия на всех исследованных нами моделях, в том числе, и при взаимодействии с фосфати-дилхолином. Соответственно, бесфосфорные аналоги (XXI и XII) не обладают нейропротекторной, антидепрессивной и мнемотропной активностью (табл.4).

Учитывая, что мембранолипотропные свойства могут модулировать активность моноаминооксидазы и это в большей степени относится к МАО типа Б (Н.А.Авдулов, 1990), нами проведены эксперименты по изучению МАО Б ингибирующего действия фосфорилацетогидразидов. Результаты экспериментов показали, что фосфорилацетогидразиды обладают МАО Б ингибируюши-ми свойствами in vitro и in vivo и в большей степени эта активность присуща незамещенным гидразидам (табл.5). Следует отметить, что исключение атома фосфора из молекулы фосфорилацетогидразидов не приводит к исчезновению МАО Б ингибирующих свойств. Большинство исследованных соединений в дозах, составляющих 1/100 от ЛДз0, оказывают серотонинопозитивные свойства, усиливая эффекты предшественника серотонина 5-ОТФ, не проявляя при этом аффинности к серотониновым рецепторам 1, 2 и 3 подтипа. Серотонинопозитивные и МАО Б ингибирующие свойства могут принимать участие в ре-лизации механизма антидепрессивного действия фосфорилацетогидразидов. Кроме того, эти свойства могут иметь практическое значение при нейродегене-ративных заболеваниях, в частности, болезни Альцгеймера и Паркинсона.

Процессы памяти тесно связаны с холинергической системой и нарушения в холинергической передаче занимают одну из ключевых позиций в развитии деменций. Изучение влияния некоторых фосфорилацетогидразидов на холи-нергическую систему проведено на 2-х уровнях воздействия: на процессы холинергической передачи в синапсе (КАПАХ, его хлористоводородная соль и фосфабензид) и на связывание с мускариновыми и никотиновыми рецепторами мозга (КАПАХ, соединение II и III). Влияние КАПАХ, его хлористоводрод-ной соли и представителя дифенилфосфорилацетогидразидов фосфабензида на процессы синаптической холинергической передачи исследовано на нервно-мышечном синапсе позвоночных .

Таблица 4. Взаимосвязь мембранотропного действия фосфорилацетогидразидов с мнемо-тропной, антидепресснвнон и нейропротекторной активностью _

Мембранотропное действие и психотропная активность Незамещенные ХАФАГ Незамещенные ДФАГ Замещенные ХАФАГ Незамеще:!-;:ые гид-разиды, не содержащие фосфора

Взаимодействие с мембранами из фосфатидилхолииа + + 0 0

Снижение концентрации МДА in vitro + 0 0 0

Снижение интенсивности гемолиза эритроцитов in vitro + 0 0 0

Мнемотропное действие + 0 + 0

Нейропротекторное действие + + + 0

Антидепрессивное действие + + + 0

Примечание: + - наличие выраженного эффекта; + - наличие эффекта только в высоких дозах; 0 - отсутствие эффекта. ХАФАГ - хлорэтоксиарилфосфорилацетогидразиды; ДФАГ-дифенилфосфорилацетогидразиды;

Таблица 5 Антнмоноаминооксидазная активность фосфорилацетогидразидов в коре головного мозга крыс (in vitro) и мышей (in vivo)_

Соединение Торможение активности МАО (%)

in vitro (10'4 М) M + m in vivo

доза (мк/кг) M+m

Контроль 0 0

I 14,0 + 2,0 * 10 32,1 +4,6*

11 7,0 + 2,0

III 3,0 ±0,7

IV 0 30 5,0 + 1,2*

IX 0

XI 22,2 + 0,3 * 50 9,0 + 3,5*

XII 7,6 +1,9 10 24,6 + 0,3 *

XIII 30,4 + 2,1 » 3 17,7 + 4,0 *

XIV 19,8 + 0,2 * 10 4,1 +0,6

XV 11,4 + 3,0 *

XVI 9,9 + 0 *

XVIII 9,0 + 4,9 25 4,4 + 0,4

XIX 0 50 12,6 + 2,4 *

XX 45,7+ 1,7 * Т 50 14,6 + 3,0* Í

XXI 2,4 ± 0,4

XXII 8,6 + 0,8 *

Примечание: 100% контроль активности МАО в опытах in vitro составляет 192,4 мкМ/кг/час; in vivo - 314.2 мкМ/кг/час. Т - повышение активности МАО; * - разница достоверна по отношению к контролю при р<0,05

Выбор именно этого объекта был обусловлен тем, что нервно-мышечное соединение является одним из детально изученных, и относительная доступ-

ность этого синапса позволяет широко изучать влияние различных фармакологических агентов на процессы передачи в холинергическом синапсе (М.А.Каменская, 1996). Синаптические контакты, независимо от их месторасположения, (центральная или периферическая нервная система), имеют общие принципы функционирования, которые позволяют им обладать определенной степенью пластичности (M.D. Miyamoto, 1978).

Результаты экспериментов показали, что КАПАХ, как и его аналоги, не проявляют аффинности к мускариновым и никотиновым рецепторам (Kj > 10"4 M), но при исследовании влияния соединений на процессы в холинергическом синапсе были обнаружены весьма интересные эффекты*. Так, при действии КАПАХ на процессы генерации постсинаптических сигналов концевой пластинки нервно-мышечного синапса крысы в низких концентрациях (10'7- 10"8 М) наблюдалось увеличение амплитуды постсинаптических сигналов, что может быть расценено как наличие у КАПАХ холиносенсибилизирующего эффекта, тогда как в средних концентрациях препарат не влиял, а в высоких -снижал амплитуду токов концевой пластинки (рис.10). Наличие этого эффекта обнаружено и у хлористоводородной соли КАПАХ, которое проявляется в еще более низкой (10"9 М) концентрации и в большей степени. При этом КАПАХ и его соль не усиливают синтез ацетилхолина и не ингибируют синап-тическую ацетилхолинэстеразу. Следует отметить, что фосфабензид в низких концентрациях не оказывал влияния на амплитутуду миниатюрных токов концевой пластинки.

Эффекты КАПАХ и его соли на холинергические структуры напоминают таковые у нейропептида субстанции Р (CP). Известно, что CP способствует выделению первичных медиторов, в том числе, ацетилхолина и модулирует холинер-гическую передачу (D.Biegeret al., 1990; Costa et al., 1986). Усиливающее влияние вещества Р на сокращение поперчно-полосатой мускулатуры может быть обусловлено повышением чувствительности Н-холинорецептора постсинапти-ческой мембраны концевой пластинки (D.Bieger, 1990). В экспериментах на лягушках было отмечено усиление субстанцией Р постсинаптической потен-циации в низких концентрациях и ослабление эффекта при при увеличении концентрации в результате развития десенситизации (Р.А.Гиниатуллин и др.,1990).

Известно, что являясь лигандом нейрокининовых (NK| ) рецепторов, которые широко распространены в центральной и периферической нервной системе (S.Guard, S. Watson, 1991; I.Quartata, C.Maggi., 1997), CP в низких концентрациях модулирует высвобождение первичных медиаторов путем воздействия через эти рецепторы, а в высоких - оказывает непосредственное влияние на системы первичных медиаторов (C.Humpel, et al., 1991; I.Quartata, C.Maggi., 1997).

Учитывая, что КАПАХ также проявляет аффинность к NK| - рецепторам, мы предположили, что схожесть эффектов CP и препарата в нервно-мышечном синапсе может быть обусловлена их общей точкой приложения. * - данный фрагмент работы сделан совместно с с.н.с. Э.А.Бухараевой

Рис. 10 Влияние КАПАХ и его хлорястоводордной соля яа амплитуду миниатюрных токов (мТКП) нервно-мышечного синапса крысы А - хлористоводордная соль КАПАХ; В -КАПАХ

Рис. 11 Влияние КАПАХ (А) и субстанции Р (В) на изменение амплитуды мТКП в присутствии блокатора NKi рецепторов Wia-51,708. (А) Черные символы - ЮШАХ ; светлые - КАПАХ на фоне Win-51,708 (10 « М); (В) - Черные символы - субстанция Р; светлые - субстанция Р на фоне Win-Si,708.

Для проверки этой гипотезы нами проведены эксперименты по изучению влияния на процессы синаптической передачи СР и КАПАХ на фоне блокато-раЫК| - рецепторов Win-51,708.0кaзaлocь, что в присутствии >Мп-51,708 не наблюдалось возрастания амплитуды мТКП, вызываемого низкими концентрациями как СР, так и КАПАХ (рис.11). Уменьшение амплитуды сигналов при действии исследованных агентов в высоких концентрациях на фоне \Vin-51,708 было менее выражено, но не устранялось полностью. Таким образом, блокатор ЫК^рецепторов снимал холиносенсибилизирующее действие КАПАХ и СР, не влияя на эффекты, связанные с десенситизацией постсинаптической мембраны. Это согласуется с данными литературы о том, что только в низких концентрациях эффекты СР опосредуются через нейрокининовые рецепторы (С.Нишре1, ег а1., 1991).

Субстанция Р, обладая липофильными свойствами, при внутрибрюшин-ном введении может проникать через гемато-энцефалический барьер и оказывать влияние на этапы формирования и консолидации памяти, что коррелирует с изменением дофаминергической активности в мезолимбической области мозга. которая в низких дозах может быть результатом воздействия через ЫК| -рецепторы, в высоких - активацией дофаминергических нейронов, а в средних -отсутствовать в результате десенситизации (С.Нишре1, е1 а!., 1991; Д.НизЮп, Я. НаБепбМ, 1995).

Для выявления значения этого механизма в реализации ноотропного действия КАПАХ нами проведены две серии экспериментов.

1) Исследование КАПАХ в сверхмалых дозах (1 мкг/кг, 1нг/кг) на модели УРПИ и "поведенческое отчаяние" у мышей.

2) Эксперименты по совместному применению КАПАХ и СР в условиях УРПИ и "поведенческого отчаяния" у мышей.

Было установлено, что КАПАХ улучшает память и обучение в дозе 1 мкг/кг в условиях УРПИ. Аналогичный эффект оказывает СР (50нМ/кг), а совместное применение КАПАХ и СР на этой модели вызывает ухудшение мне-стического эффекта КАПАХ, которое значительно более выражено в высоких дозах (рис.12). СР значительно ухудшает и антидепрессивное действие КАПАХ (рис. 13).

Таким образом, результаты совместного применени КАПАХ и БР свидетельствуют об одних и тех же точках приложения в механизме их действия, которыми, вероятно, являются нейрокининовые (ИК,) рецепторы.

Связыванием с нейрокининовым рецепторами можно объяснить механизм действия КАПАХ в малых и сверхмалых дозах, причем воздействие на активный центр МК, -рецепторов усиливаются мембранолипотропными свойствами КАПАХ вследствие накопления его в липидах мембраны.

О важном значении мембранотропного действия в проявлении холиносен-сибилизирующего эффекта свидетельствует сопоставление эффектов КАПАХ и его хлористоводородной соли, у которой более выраженные мембранолипо-тропные свойства коррелируют с более сильным холиносенсибилизирующим эффектом.

С

3

Рис.12 Влияние КАПАХ и субстанции Р на процессы памяти и обучения у мышей а условиях

модели УРПИ;

* • разница достоверна по отношению к контролю (р<0,05)

з

Рис. 13 Влияние КАПАХ и субстанции Р на время замирания мышей на модели

"поведенческое отчаяние"; * - разница достоверна по отношению к контролю, принятому за 100 % (р<0,05)

Анализ зависимости аффинности к нейрокининовым (NKi ) рецепторам других аналогов КАПАХ показал, что замена диметиламиногруппы, обладающей доиорными свойствами в фенилыюм радикале КАПАХ на акцепторный 1том хлора (соединение III) приводит к потере аффинности к нейрокининовым рецепторам и неэффективности этого соединения в сверхмалых дозах. Следует зтметить, что тахикининовый фрагмент субстанции Р, который обуславливает :е взаимодействие с рецептором, также обладает донорными свойствами J.Huston, R. HasenÖhrl, 1995).

Установленное нами сходство эффектов субстанции Р и КАПАХ имеет важное значение. Сниженное в головном мозге при нейродегенеративных заболеваниях содержание нейропептидов диктует необходимость изыскания синтетических лигандов для рецепторов нейропептидов, устойчивых к действию протеаз (Я. Рге1с!еп§ег., 1989), и поиску такого типа средств внастоящее время уделяется большое внимание

Подводя итог вышесказанному, можно сделать заключение о механизме действия наиболее перспективного представителя хлорэтокарилфосфорилаце-тогидразидов - КАПАХ. Благодаря оригинальной химической структуре, в которой, кроме атома фосфора, присутствует несколько функционально-активных групп, каждая из которых имеет свою точку приложения, КАПАХ может оказывать влияние на разные звенья патологического процесса при де-менциях (рис. 14). Так, КАПАХ проявляет аффинность к нейрокининовым (ЫК) и глициновым стрихниннечувствительным участкам ЫМБА-рецепторов, ин-гибирует МАО типа Б. В основе механизмов действия КАПАХ лежат его мем-бранолипотропные свойства, которые, с одной стороны, могут оказывать неспецифическое воздействие на встроенные белковые комплексы, модулируя активность рецепторов, ферментов, каналов, с другой - обеспечивать стабилизацию мембраны и защиту клетки от патологических воздействий.

Поиск и изучение ноотропной и антидепрессивной активности в новых рядах производных гидразидов фосфорилированных карбоновых кислот.

Исследование ноотропной и антидепрессивной активности фосфорилацет-гидразидов. выяснения некоторых сторон механизма их реализации, а также изучение зависимости структура-активность позволили установить, что в проявлении их активности важное значение имеет структура и фосфорильного и гидразидного фрагментов. Для выявления функционального значения каждого из этих фрагментов были синтезированы два новых ряда соединений:

1) гидразиниевые соли фосфорилацетогидразидов - имеющие фосфориль-ный фрагмент, гидразидную и гидразиниевую группы;

2) Ы-замещенные фосфорилацетаты аммония - имеющие фосфорильный фрагмент, но не имеющие гидразидной группы.

Общие структурные формулы этих рядов соединений указаны в разделе "Материал и методы исследования".

Нами проведено изучение ноотропной и антидепрессивной активности этих соединений в дозах, составляющих 1/100 и 1/1000 от ЛД50, исследование некоторых сторон механизма действия и зависимости активности соединений от химической структуры.

В ряду гидразиниевых солей фосфорилацетогидразидов практически все соединения улучшают память и обучение в условиях УРПИ (табл. 6) и их активность сопоставима с таковой у КАПАХ. Исключение составляют соединение, в котором присутствует атом хлора в пара-положении арильного радикала (Г-Н) или отсутствует гидразидная группа (Г-VI). Антигипоксический эффект проявляют соединение Г-Н и Г-У, имеющие метильную группу или атом фтора

ШШГПШ 1ИГ1Л1Ии 1 гиппиг,

Ингибирование МАО, Б I

Взаимодействие с ГУ «* КАША-рецепторов

I

Взаимодействие4 с Ш^-рецепторами _! !

Мембранотропное действие

(взаимодействие с ФХ, антиоксидантные свойства) ч-

Неспецифическое воздействие на белковые комплексы

(ферменты, рецепторы, каналы)

Рис. 14 Механизм действия КАПАХ

в пара-положении арильного радикала фосфорильного фрагмента. Аналогичная зависимость отмечена и при изучении антидепрессивной активности соединений - наибольшую активность на моделях "поведенческое отчаяние" и "выученная беспомощность" у мышей проявляют соединения Г-Ш и Г-У (табл.6), которая превосходит таковую у КАПАХ.

Таблица 6. Ноотропная (мнемотропное действие и антигипоксический эффект) и антиде-препрессивная активность гидразиниевых солей фосфорилацетогидразидов в дозах, составляющих 1/100 и 1/1000 от ЛД5р у мышей___

Мнемотропное Антигипокси Антидепрессив-

Соединение действие (латент- ческое действие ное действие лд50

и дозы (мг/кг) ный (время жизни (время (мг/кг)

период на модели в барокамере, %) "замирания"% )

УРПИ, %)

Г-1 (7) 280* 86 89 655±24,3

Г-1 (0,7) 300* - 115

Г-Н (7) 173* 97 666+27,1

Г-Н (0,7) 178* - 69

Г-Ш (6) 287* 188* 59* 646,0+40,2

Г- III (0,6) 203* • 143* 66*

Г-IV (6) 245* 156 79 631 ±39,2

Г-IV (0,6) 195* - 104

T-V(5) 332* 180* 50* 531+39,3

Г-V (0,5) 146 150* 71*

Г-Vl (7) 232 - 87 735+23,8

Г-VI (0,7) 151 - 73*

Г-VII (7) 167 92 86 712+13,5

Г-VH (0,7) 298* - 101

КАПАХ (10) 280* 131* 69* 960+35

КАПАХ (1) 179* 127 67*

Фосфабензид (3) 248* 126 91 315+24,8

Фосфабензид (0,3) 109 101 96

*- разница достоверна при Р<0,05

В механизме ноотропного действия гидразиниевых солей имеет значение наличие у них антиоксиданиных и мембраностабилизирующих свойств, которые оценивались по их способности уменьшать содержание малонового диаль-дегида в гомогенате коры головного мозга крыс и снижать интенсивность гемолиза эритроцитов (табл.7). По выраженности этих эффектов гидразиниевые соли сопоставимы с хлорэтоксиарилфосфорилацетогидразидами (производные КАПАХ) и превосходят дифенилфосфорилацетогидразиды (производные фос-фабензида).

Подобно исходным фосфорилацетогидразидам, их гидразиниевые соли обладают МАО Б-ингибирующими свойствами. Установлено, что способность угнетать МАО зависит от замещений в арильном радикале фосфорильного фрагмента, в результате которых происходит изменение электроно-донорных свойств соединений. Так, соединение Г-П, имеюшее в составе арильного ради-

кала акцепторный атом хлора, теряет способность угнетать МАО Б (табл.7). Следует отметить, что наличие метоксильной группы в пара-положении ариль-ного радикала (Г-1У) приводит, напротив, к повышению активности фермента. Соединения, обладающие наиболее выраженной антидепрессивной активностью (Г-Ш и Г-У), в дозе 1/100 от ЛД50 проявляют серотонинопозитивные свойства, увеличивая число кивков, вызванных 5-ОТФ, которые сопровождались тремором всего тела, что свидетельствует о их более выраженном серо-тонинопозитивном влиянии по сравнению с исходными фосфорилацетогидра-зидами.

Таблица 7 Антиоксидантные, мембраностабилизирующие и МАО Б ингибирующие свойства гидразиниевых солей фосфорилацетогидразидов in vitro_

Соединение Снижение содержания МДА (10^-10"7 М) Снижение интенсивности гемолиза эриттро-цитов (10"3- 1<У8М) Торможение активности МАО Б (10"4 М) %

Г-1 + + 17,4*

Г-Н + + 1,1

Г-Ш +++ ++ 17,2*

r-iv + ++ 54*Т

r-v ++ + 10,8*

Г-VI -Н-+ + -

Г-VII ++ ++-Н- -

КАПАХ ++ +-Н-+ 14,0*

Фосфабензид + 0 30,4*

Примечание: + - наличие достоверной активности соединения в одной из концентраций; ++ - в двух; +++ - в трех, ++++ - в четырех; 0 - отсутствие эффекта во всех концентрациях; * - разница достоверна при р<0,05.

На основании проведенных исследований в ряду гидразиниевых солей фосфорилацетогидразидов выделены наиболее активные соединения - Г-Н и Г-V, которые обладают комплексом ноотропной и антидепрессивной активности и по ряду тестов превосходят КАПАХ. Эти соединения проявляют мембраностабилизирующие, антиоксидантные, серотонинопозитивные и МАО- Б ингибирующие свойства, которые могут участвовать в реализации механизма их психотропной активности.

В ряду N-замещенных фосфорилацетатов аммония (табл.8) способностью улучшать процессы памяти и обучения в условиях УРПИ у мышей обладало пишь соединение A-I, которое удлиняло латентный период захода в темный отсек в дозах 1/100, 1/1000 от ЛД50 , но его активность не превосходила таковую у КАПАХ. Ни одно из производных N-замещенных фосфорилацетатов аммония, в отличие от фосфорилацетогидразидов и их гидразиниевых солей, не проявило антигипоксической активности на модели гипобарической гипоксии. <\нтидепресслвную активность на модели "поведенческое отчаяние" проявили |>осфорилацетаты A-I и A-III, у них же отмечен и эффект на модели

"выученная беспомощность" , который в дозе составляющей 1/100 от ЛД« также как у КАПАХ, развивается после трехкратного применения.

Таким образом, Ы-замещенные фосфорилацетаты аммония обладают менее выраженной психотропной активностью по сравнению с хлорэтоксиарилфос-форилацетогидразидами и гидразиниевыми солями фосфорилацетогидразидов, что, вероятно, отчасти, объясняется отсутствием в их структуре гидразидного фрагмента.

Таблица 8. Ноотропная (мнемотропное действие и антигипоксический эффект) и антиде-препрессивная активность Ы-замсщснных фосфорилацетатов аммония в дозах, составляющих 1/100 от ЛД$р у мышей____

Соединение и дозы (мг/кг) Мнемотропное действие (латентный период на модели УРПИ, %) Антигипокси ческое действие (время жизни в барокамере, %) Антидепрессивное действие (время "замирания"% ) ЛД5о (мг/кг)

A-I (50) 234* 96 68* 4500±213

А-1(5) 166* 104 78*

A-1I (50) 93 106 106 5136+154

A-III (7) 132 118 52* 687+28

A-IV (50) 106 93 103 5327+215

A-V (50) 91 101 101 5118+254

A-VI (30) 88 105 95 5289+189

КАПАХ (10) 280* 131* 69* 960+35

Фосфабензид (3) 248* 126 91 315+24,8

*- разница достоверна при Р<0,05

Отсутствие гидразидной группы, по-видимому, определяет и меньшую способность N-замещенных фосфорилацетатов аммония по сравнению с хлорэток-сиарилфосфорилацетогидразидами и гидразиниевыми солями фосфорилацетогидразидов снижать содержание малонового диальдегида в гомогенате коры головного мозга крыс(табл.9). Антиоксидантную активность проявили только дифенилфосфорилацетаты (A-I и A-II), содержащие карбэтоксильный радикал в катионной части молекулы. Для дифенилфосфинатов характерно и наличие мембраностабилизирующего действия.

Отсутствие гидразидного фрагмента существенно не повлияло на МАО Б ингибирующую активность соединений - способность угнетать МАО Б in vitro у N-замещенных фосфорилацетатов аммония сопоставима с таковой у фосфорилацетогидразидов и их гидразиниевых солей. МАО Б ингибирующая активность этих соединений зависит от природы катионной части молекулы и от структуры фосфорильного фрагмента.

Таблица 9 Антиоксидантные, мембраностабилизирующие и МАО Б ингибирукмцие свойст-

ва М-замещенных фосфорилацетатов аммония ¡п у^о

Соединение Снижение содержания МДА(10"4-10'7М) Снижение интенсивности гемолиза эриттпо-цитов (10'3- 10"8М) Торможение активности МАО Б (¡О"4М) %

А-1 +-Н-+ +++. 0

А-И +++ + 3.1

А-Ш 0 ++ 55*

А-1У 0 0 13*

А-У + 0 15,6*

А-У1 0 0 7,2

КАПАХ ++ ++++ 14,0*

Фосфабензид + 0 30,4*

Примечание: + - наличие достоверной активности соединения в одной из концентраций; ++ - в двух; +++ - в трех, ++++ - в четырех; 0 - отсутствие эффекта во всех концентрациях; * - разница достоверна при р<0,05.

Обобщая результаты настоящей работы по изучению ноотропной и антидепрессивной активности в рядах соединений, можно сделать заключение о том, что по степени выраженности антидепрессивного действия эти ряды располагаются следующим образом: хлорэтоксиарилфосфорилацетогидразиды = гидразиниевые соли фосфорилацетогидразидов > И-замещенные фосфорилаце-гаты аммония > днфенилфосфорилацетогидразиды.

/ОСН2СН2С1 О" +МН3 ЫН2

АгРч = АгРч > АгРСН2С00"+ЫН3К > РЬ2Р~Х

II X II X II II

ООО о

где Х=СН2С(0)ЫНЫН2

Примерно одинаковая выраженность антидепрессивного действия в рядах {лорэтоксиарилфосфорилацетогидразидов и гидразиниевых солей гидразидов {юсфорилуксусной кислоты определяется аналогией их конечных продуктов "идролитических превращений. Являясь лабильным радикалом хлорэтокси-"руппа, при введении в организм, легко гидролизуется, (Т.Э.Мастрюкова и со-шт., 1988) в результате чего образуется анионный фосфорильный фрагмент, шалогичный таковому гидразиниевых солей.

На схеме это можно представить следующим образом:

/ОСНгСНгС! /0"

Аг Р -> АгР

|| СН2С(0)ЫНЫН2 || СН2С(0) МЖНг

О О

лорэтоксиарилфосфорил- Гидразиниевые соли фосфорил-

ацетогидразиды ацетогидразидов

Дифенилфосфорилацетогидразиды, имеющие стабильные фенильные ра дикалы, не способны к образованию солевых структур по фосфорильном; фрагменту.

Таким образом, для создания соединений, сочетающих ноотропные и ан тидепрессивные свойства, перспективным является целенаправленный синте новых рядов фосфорорганических соединений, имеющих лабильные радикал! и способных к образованию солевых структур с отрицательно заряженньн фосфорильным фрагментом.

ВЫВОДЫ

1. Фосфорилацетогидразиды обладают ноотропной активностью, улуч шая процессы обучения и памяти и проявляя антигипоксические свойств; хлорэтоксиарилфосфорилацетогидразиды, наряду с ноотропной активностьк оказывают антидепрессивное действие.

2.2-хлорэтокси-пара-М-диметиламинофенилфосфорилацетогидразид (КАПАХ) обладает способностью улучшать память и обучение у нормальны животных и с выраженными нарушениями высших функций мозга; проявляв нейропротекторную и антигипоксическую активность, имея преимущества пе ред пирацетамом.

3. Антидепрессивное действие КАПАХ (1-10 мг/кг) развивается после 3-дневного применения, раньше, чем у мелипрамина (10 мг/кг) и пирацетам (100 мг/кг).

4. Фосфорилацетогидразиды обладают аффинностью к глициновьи стрихниннечувствительным рецепторам NMDA-иoнoфopнoгo комплекса, прс являя свойства частичных агонистов этих участков.

5. Фосфорилацетогидразиды проявляют мембранотропные и антиоксг дантные свойства, которые могут обуславливать их мнемотропную, нейропрс текторную и антидепрессивную активность.

6. Молекулярные механизмы мембранотропной активности фосфорит ацетогидразидов обусловлены их способностью изменять бислойную оргаш зацию мембран из фосфатидилхолина, взаимодействуя в области полярных гс ловок фосфолипида.

7. Серотонинопозитивные и МАО Б ингибирующие свойства фосфори; ацетогидразидов являются одним из компонентов их антидепрессивного дейст вия.

8. Способность КАПАХ специфически связываться с нейрокининовым ЫК, рецепторами может обуславливать его мнемотропные эффекты и улу1 шать процессы синаптической передачи в холинергическом синапсе.

9. Новые ряды фосфорилацетогидразидов - их гидразиниевые соли и > замещенные фосфорилацетаты аммония обладают ноотропной и антидепрес сивной активностью, в механизме реализации которых лежат мембранотро: ные, антиоксидантные, серотонинопозитивные и МАО Б ингибирующие сво{ ства.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Перспективен синтез новых соединений - солей фосфорилацетогидра-зидов как потенциальных средств с психотропной активностью.

2. Целесообразно дальнейшее фармакологическое изучение фосфорил-ацетогидразидов и гидразиниевых солей фосфорилацетогидразидов как потенциальных средств с ноотропной активностью, обладающих оригинальным механизмом действия.

3. Рекомендуется завершение доклинических исследований КАПАХ с целью внедрения его в практическую медицину

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. (С-Дифенилфосфинил)ацетилгидразон кротонового альдегида, обладающий нейротропной активностью /Заиконникова И.В., Семина И.И., Москва В.В.,и др. //А.С.№ 1215338 от 5.11. 1986 г.

2. 1-(гидрокси)-2,2,2-трихлорэтилгидразид дифенилфосфинилуксусной кислоты /Семина И.И., Заиконникова И.В., Тарасова Р.И. и др.//А.С.1215339 от 1 ноября 1985 г..

3. Тарасова Р.И., Яфарова И.С., Семина И.И., Заиконникова И.В. Разработка путей синтеза и изучение фармакологической активности аналогов и производных лекарственного препарата фосеназид //Тезисы докладов Международной конференции по химии фосфора, г.Таллинн, 1989 г. С.39

4. Тарасова Р.И., Москва В.В., Семина И.И.. Заиконникова И.В. Синтез и фармакологическая активность аналогов и производных нового психотропного препарата фосфабензид // Тезисы докладов межреспубликанской научно-практической конференции "Синтез, фармакология новых психотропных средств", Волгоград, 1989,-С.48.

5. Средства, обладающие ноотропной, антидепрессивной и транквилизирующей активностью, принадлежащие к новым классам химических соединений Бараев,P.C., Студенцова И.А., Зимакова И.Е., Хафизьянова Р.Х., Байчурнна А.З. Семина И.И. и др.. // Материалы I Российского национального конгресса 'Человек и лекарство", Москва, 1992 г. - С. 368.

5. Байчурина А.З., Семина И.И. К вопросу об участии серотонинергических структур в реализации антидепрессивного эффекта на модели "выученная беспомощность" //Тезисы Всесоюзного симпозиума молодых ученых по проблеме 'Серотонин мозга, нервно-психические нарушения и их лекарственная коррекция, Донецк, 1990.-С.9.

7. Семина И.И. Изучение безвредности нового психотропного препарата № 41 7 Тезисы докладов научной конференции "Экологические проблемы фармако-югии и токсикологии, Казань, 1990. - С.49.

3. Семина И.И., Тарасова Р.И., Сырнева Л.П., Заиконникова И.В. Синтез и ней-ютропная активность дифенилфосфорилацетогидразонов Хим.-фарм.журн., , 1991. - №5. С.22-24.

). Семина И.И., Байчурина А.З., Гараев P.C. Основные механизмы ноотропной нстивности гидразидов фосфорилированных карбоновых кислот //

"Фундаментальные исследования как основа создания лекарственных средств". Сб. тезисов 1-ого съезда Российского научного общества фармакологов. М.1995, С.381

10. Tarasova R., Semina I., Voskresenskaya О., Bukharaeva E., Pavlov V. The first nootrops among non-anticholinesterase compound. Study of structure-neurotropic activity elationships of nitrogen-containing phosphorylacetic acid derivatives // XIII th Inernational Conference of Phosohorus Chemistry - ICPC, Ierusalem, July, 1995, P.387.

11. Семина И.И., Байчурина А.З. Противоневротическое действие новых препаратов с антидепрессивной активостью // Тезисы Мат.Н Российского нац. конгресса "Человек и лекарство", Москва,1995, С.13.

12. Литвиненко А.В., Семина И.И., Воскресенская О.В., Гараев Р.С., Тарасоыва Р.И. Синтез, свойства и биологическая активность бис-дифенил-фосфинилацетилгидразида и его комплекса с железом // Каз. мед.журнал - 1995 -;№3. -С.193-196.

13. Семина И.И., Байчурина Н.А., Байчурина А.З., Тарасова Р.И., Гараев Р.С. Эффективность и механизмы действия фосфорорганического неантихолиесте-разного препарата амфазида на экспериментальной модели болезни Альцгей-мера // Тезисы Мат.Ш Российского нац. конгресса "Человек и лекарство", Москва, 1996, С.13

14. Tarasova R., Semina I.,Voskresenskaya О., Bukharaeva E., Pavlov V. The first nootrops among non-anticholinesterase compound. Study of structure-neurotropic activity relationships of nitrogen-containing phosphorylacetic acid derivatives // Phosphorus, Sulfur et Silicon. - 1996, - V.109-110. - P.373-376.

15. Semina I.G., Semina I.I., Vulegzhanina V., Tarasova R.I., Pavlov V.A. Model lipid membranes as objects of pharmaceutical effect // 11-th International Symposium on Sulfactans in Solution. - Ierusalem, Israel. -June, 9-13,1996.- P.310.

16. Semina I., Baychourina N., Bukharaeva E., Tarasova R., Garaev R., Nikolskiy E., Pavlov V. Perspectives of using non-anticholinesterase organophosphorus compound (CAPAH) in Alzheimer' disease // Fourh International Nice/Springfield Symposium on Advancces in Alzheimer Therapy. April, 10-14,1996.

17. Семина И.И., Байчурина А.З., Гараев Р.С. Изучение противоневротического действия гидразида О-Р-хлорэтил-пара-N-диметиламинофенилфосфинилуксусной кислоты (амфазида) // Бюлл.эксп.биол. и мед, 1996. -№ 4. - С. 423-425

18. Семина И.И, Байчурина А.З, Гараев Р.С. Особенности антидепрессивного эффекта гидразида О-Р-хлорэтил-пара-N-диметиламинофенилфосфинилуксусной кислоты (амфазида) // Бюлл.эксп.биол. и мед, 1996. -Т.121,№ 5.- С. 538-540.

19. Байчурина А.З, Семина И.И, Гараев Р.С. Влияние на центральные дофами-нергические структуры представителей гидразидов фосфорилированных кар-боновых кислот и диазиридинов //Бюлл.эксп.биол. и мед, 1996. -Т.21,№ 6. - С. 648-651.

!0. Семина И.И., Байчурина H.A., Байчурина A.3., Тарасова Р.И., Гараев P.C. 1овый класс ноотропов - для лечения болезни Альцгеймера // Первая научно-фактическая конференция: "Болезнь Альцгеймера: достижения в нейрсбиоло-ии, диагностике и терапии". -Москва, 1996. -С.31.

II. Ржевская Г.Ф., Заиконникова И.В., Семина И.И., Гараев P.C. Особенноси пектра психотропной активности фосфабензида в больших и малых дозах // Ж тезисов докладов Российской конференции "Фармакология и токсикология юсфорорганических соединений и других билогически активных веществ". -'азань, 1996. -С. 105.

2. Семина И.И., Байчурина А.З.,.Салахутдинова Л., Шиловская Е., Тарасова '.И., Гараев P.C. Антидепрессивное действие гидразида 2-(гидрокси)хлорэтил-ара-Ы-диметиламинофенилфосфинилуксусной кислоты - капах (САРАН) // 'б.тезисов докладов Российской конференции "Фармакология и токсикология юсфорорганических соединений и других билогически активных веществ". -Казань, 1996. -С.121.

3. Семина И.И., Байчурина H.A., Тарасова Р.И., Байчурина А.З., Гараев P.C. [оотропная активность производных гидразидов фосфорилированных карбо-овых кислот // Сб.тезисов докладов Российской конференции "Фармакология токсикология фосфорорганических соединений и других билогически актовых веществ". -Казань, 1996. -С. 105.

4. Бухараева Э.А., Никольский Е.Е., Семина И.И. Тарасова Р.И. Влияние фос-абензида и капах на процессы синаптической передачи в нервно-мышечном шапсе П Сб.тезисов докладов Российской конференции "Фармакология и ток-оология фосфорорганических соединений и других билогически активных ;ществ". -Казань, 1996. -С.27.

5. Хазиахметова В., Зиганшина J1.E., Семина И.И., :Байчурина H.A., Гараев С. Изучение флоготропной активности препарата капах (САРАН) //

6.тезисов докладов Российской конференции "Фармакология и токсикология осфорорганических соединений и других билогически активных веществ". -азань, 1996. -С. 140.

>. Семина И.Г., Семина И.И., Байчурина H.A., Тарасова Р.И. Гараев P.C. ембранотропное действие гидразида 2(хлорэтокси)-пара-М-шетиламинофенилфосфинилуксусной кислоты // Бюлл. эксперимен.биол.и 2Д,- 1998. -Т. 126,№8,- С. 175-177.

'. Тихонова H.A., Семина И.И., Гараев P.C. Эффекты КАПАХ на модели ам-:стического синдрома у крыс И Тезисы пленарных докладов и стендовых со-¡щений V Всероссийской школы молодых ученых "Актуальные проблемы :йробиологишо -Казань, 1998, С.65-66.

Шиловская Е.В., Семина И.И., Гараев P.C. Нарушения функций мозга при ^действии перинатальной гипоксии у крыс и их коррекция препаратом ШАХ II Тезисы пленарных докладов и стендовых сообщений V Всероссий-ой школы молодых ученых "Актуальные проблемы нейробиологиию -□ань, 1998, С.72-73.

29. Semina I.G., Semina 1.1., Tarosova R.I., Azancheev N.M., Ilasov A.V., Pavlov V.A. Study of CAPAH membranetropic action on the artifical biomembranes // XIV International Conference on Phosphorus Chemistry, Cincinnati, USA, 1998, P.267.

30. Tarasova R., Voskresenskaya O., Semina I., Pavlov V., Moskva V., Litvinov I. Synthesis and some reactions of Phosphorylated carboxylic acid hydrazides - a novel class of Memory Enhancers and neuroprotectors // XIV International Conference on Phosphorus Chemistry, Cincinnati, USA, 1998, P 268

31. Semina I., Shilovskaya E., Tarasova R., Pavlov V., Tikhonova N., Garaev R., Baychourina A. Mechanism of action of Phosphorylacetic acid hydrazides as memory enhancers and neuroprotectors // XIV International Conference on Phosphorus Chemistry, Cincinnati, USA, 1998, LF4-6.

32. Bukharaeva E., Nikolskiy E., Semina I., Tarasova R., Baychourina A. Effects of some phosphorylacetic acid hydrazides on periferal cholinergic neurotransmission // XIV International Conference on Phosphorus Chemistry, Cincinnati, USA, 1998 -P 239

33. Тарасова Р.И., Воскресенская О., Семина И.И. Синтез и свойства биологически активных N-замещенных фосфорилацетатов аммония // Журн. общ. хим.,

1998, Т.68, вып.8. - С. 1275-1279.

34. Ларина M.JI., Петрова М.А., Семина И.И., Тарасова Р.И., Сидуллина С.А., Саматова Н.А. Спектральные характеристики препарата "САРАН", обладающего ноотропным и антидепрессивным действием // Тезисы докладов Международной конференции "Фармация в XXI веке: инновации и традиции" - Санк-Петербург, 1999.- С.239.

35. Ларина М.Л., Литвиенко А.В., Петрова М.А., Семина И.И., Тарасова Р.И. Биологически активные азотосодержащие производные фосфорилуксусной кислоты. //Тезисы докладов Международной конференции "Фармация в XXI веке: инновации и традиции" - Санк-Петербург, 1999,- С.239-240

36. Семина И.И., Тихонова Н.А., Байчурина А.З., Тарасова Р.С., Павлов В.А., Шиловская Е.В., Гараев Р.С. Нейропротективное действие КАПАХ, представителя нового класса ноотропов - неантихолинестеразных фосфорорганических соединений // Вестник РАМН. - 1999. - №3. - С. 32-36

37. Semina I., Baichourina A., Bukharaeva Е., Schilovskaya Е., Nikolsky Е. The mechanism of action of CAPAH on cholinergic neurotransmission. Effect similar to substance P? //J. ofNeurochemistiy. - 1999. - V.73. - S31.

38. Semina I., Baichourina A., Bukharaeva E., Nikolskiy E., Tarasova R. Memory Enchancing effects of CAPAH. Original Mechanisms of Action on Cholinergic Neurotransmission. A promise for Alzheimer's disease. // J. Neurochemistry. -

1999.-V.73 - S32.

39. Ким H., Семина И., Бухараева Э. Сопоставление эффектов КАПАХ и субстанции Р в нервно-мышечном синапсе // Тезисы пленарных докладов и стендовых сообщений VI Всероссийской школы молодых ученых "Актуальные проблемы нейробиологиию -Казань, 1999. - С.74

40. Шиловская Е.В., Семина И.И., Байчурина А.З. Изучение эффектов КАПАХ и субстанции Р при их совместном применении в экспериментах in vivo