Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Постлучевые эффекты в стенке аорты

^ -л

На правах рукописи

ШИШКО Тамара Тимофеевна

ПОСТЛУЧЕВЫЕ ЭФФЕКТЫ В СТЕНКЕ АОРТЫ

14.00.23 - Гистология, цитология, эмбриология 03.00.С1 - Радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1996

РаОота выполнена в Отделе морфологии (зав.отд.-засл.деятел науки Рф,д.м.н.,проф. В.А.Отеллин) Научно-исследовательского инс тптута экспериментальной медицины РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук Р.П.Степанов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,проф. А.И.Неворотин доктор медицинских наук А.С.Ягунов

Ведущая организация: Санкт-Петербургская медицинская педи атрическая академия.

Защита состоится «Ж». ............ .1996 года

"4.0." часов на заседании диссертационного совета Д.001.23.03 пр Научно-исследовательском институте экспериментальной медицин РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова,12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Ин ститута экспериментальной медицины по адресу: 197376, Санкт-Пе тербург, ул. Акад. Павлова, дом 12.

Автореферат разослан .......1996 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ь. С. Петро!

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Общепризнано, что в реакции организма на радиационное воздействие важная роль принадлежит сосудистой системе. Обнаруженные в этих случаях нарушения общей, регионарной и/или местной тканевой гемодинамики являются одной из главных причин возникновения тканевых отеков, атрофии, некрозов, геморрагии, - нередко доминирующих в клинике радиационных поражений и предопределяющих их исход [Гуськова А.К, Байсоголов Г.Д.,1971; Travis E.L. et al.,1976; Aleksandrow S.N.,1982; Воробьев Е.И., Степанов P.П.,1985-, Бардычев М.С. и др. ,1985; Law М. Р. ,1936,1930; Hopewell J.W.¡1986, 1994; Miot E.et а1.,1995]. Однако в этой области лучевой патологии до сих пор остаются принципиальные вопросы, не получившие определенного решения с позиций теоретической радиобиологии, что препятствует успешной разработке профилактики и лечебных рекомендаций, удовлетворяющих запросам радиационной медицины. В частности, пока еще нет достаточной ясности в понимании механизмов участия кровеносных сосудов в тканевых изменениях, вызванных облучением. Не установлено, в какой степени последние обусловлены нарушением регуляции сосудистых функций, а в какой -зависят от поражения структур самой стенки сосудов, причем о характере и динамике постлучевых процессов, развертывающихся в этих структурах, собрана весьма фрагментарная, противоречивая и, нередко, малоубедительная информация.

В наибольшей степени эти замечания относятся к положению в том разделе радиационной ангиологии, который связан с изучением крупных кровеносных сосудов. Эти объекты, в отличие от структур микроциркуляторного звена сосудистого русла, существенного интереса к себе не привлекали, так как признаки их лучевого повреждения обнаруживали нерегулярно, главным образом в отдаленные сроки и обычно после воздействия больших доз ионизирующих излучений [Тихонов К.Б.,1963; Hackenzellner Н.А.,1954; Cottier Н.,1966; Никифорова Е. Н. , Чередеева Е.А.,1970; Berdjis Ch.C.,1971; Hopewell J.W. et al.,19931. Сложилось мнение о незначительной их радиочувствительности, подкрепленное сведениями о низком урорне спонтанной пролиферативной активности клеточных популяций, находящихся в их составе, в полном согласии с известным "правилом Бергонье и Трибондо".

Натопилось, том не менее, немало клинических и экспериментальных наблюдений, опровергающих такие выводы. Так, указывают на возможность появления в крупных сосудах после облучения очагов некрояа, атероматоза, фиброза,. тромбоза, аневризм, изъязвлений.

- г -

сужения прсвета, нарушения тонуса и искажения ответа на фармакологические препараты [Тихонов К.Б.,1962,1980; Upadhaya B.R.et al ,1072; Lamberts H.,1977; Балмуханов С.Б., Канафьянов Г.С. ,1981; Tirmerman S.R., Gerber Q.В.,1981; Aarnoudse M,1981; Söhnet a]. 1993-, Wiedermann J.G.et al.1994; Sumin M.V.,19941. Обнаружена способность тканей в стенке кровеносных сосудов суммировать и длительно хранить лучевое повреждение, медленно его репарировать [Жданова Н.В.,1968; Степанов Р.П.,1975-1991], что вообще характерно для всех мачообновляющихся тканей [Стрелин Г.С. и сотр.,1965-1979], и что позволяет сомневаться в справедливости заключения об их радиорезистентности, свидетельствуя о своеобразии реакции на лучевое воздействие [Стрелин Г.С.,1978].

Биологическая организация тканей, относящихся к разряду ма-лообновляющихся, определяет ряд особенностей их адаптации к неблагоприятным условиям, нагрузкам, компенсации структурного и функционального ущерба, в основе которых лежат процессы, осуществляющиеся преимущественно или исключительно на внутриклеточном уровне [Саркисов Д.С.,1961-1971]. В связи с этим следует поставить вопрос об изучении специфики постлучевых изменений тканей сосудистой стенки в более широком, общебиологическом плане, обращая особое внимание на закономерности развития внутриклеточных процессов повреждения, его компенсации и репарации. Структуры стенки магистральных сосудов как раз и являются одним из объектов, чрезвычайно удобных для изучения подобных процессов, а радиационный фактор, воздействующий на них, служит уникальным по своим возможностям инструментом, обеспечивающим это исследование.

Целью настоящей работы явилось морфологическое изучение характера и динамики постлучевых изменений в структурах стенки аорты и выяснение возможностей их направленной модификации.

Задачи исследования:

1. Дать феноменологическую характеристику изменений в структурам стенки аорты крыс в разные сроки после радиационного воздействия.

2. Проанализировать динамику постлучевых изменений глацкомы-шечных клеток. коллагеноЕых и эластических элементов в стенке аорты.

3. Изучить влияние повышенной гемодинамической нагрузки на структуры сосудистой стенки, измененные радиационным воздействием.

4. Установить особенности развития Енутриглеточых изменений

в тканях стенки аорты в отдаленные сроки после облучения на фене-введения рибоксина ^лечебного препарата, стимулятора восстановительных процессов).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые проведен комплексный ультраструктурный анализ динамики деструктивных и репаративных изменений в клеточных элементах и строме стенки аорты после облучения е широком диапазоне доз. На примере клеточых популяций миоцитов и эндо-телиоцитов аорты получены новые доказательства специфики лучевого повреждения в медленно обновляющихся тканях, с характерным длительным и стойким его сохранением, наличием "скрытых" компонентов. Выявлены новые•сведения о возможности реализации "скрытого" повреждения в явной форме при дополнительной функциональной нагрузке. Установлено, что эффективность механизмов внутриклеточной репарации в миоцитах и эндотелисцитах стенки аорты снижается пропорционально увеличению дозы облучения, но сохраняется в полной мере при повреждении малыми дозами, когда стимулируется их гиперкомпенсаторная активность. Показана принципиальная возможность с помощью препарата /рибоксин/, влияющего на нуклротидннй обмен, стимуляции внутриклеточных репарационных процессов в этих тканях, измененных лучевым воздействием; определен дозовый уровень повреждения, ограничивающего эффективность применения этого препарата. Впервые установлена дозовая и временная зависимость постлучевого утолщения интимы аорты и выявлен риск усиления этого эффекта при дополнительной гемодинамической нагрузке. Обнаружены ранее неизвестные закономерности численных и размерных изменений колла-геновых фибрилл в строме средней оболочки аорты при старении, гемодинамической нагрузке и облучении.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Настоящее морфологическое исследование относится к числу фундаментальных и представляет интерес для разработки основополагающих представлений в области радиационной ангиологии и радиобиологии медленно обновляющихся клеточных систем. Оно связано с поиском постлучевнх изменений клеток и стромы стенки аорты, позволяющих приблизиться к пониманию механизмов развития там радиоиндуцированного склероза, обнаружением риска повышенной гемодинамической нагрузки, отягощающей проявления лучевой сосудистой патологии, получением результатов, свидетельствующих о длительном стойком сохранении лучевого повреждения в структурах сосудистой стенки и отражающих общие закономерности реализации в этих условиях процессов внутриклеточной репарации, с установленной возможностью их эффективной фэрмаколо-

гической поддержки. Эта информация может явиться основой для соз-даниг методов лечения, предупреждающих формирование тяжел;« лучевых поражений кровеносных сосудов.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИШЕ НА ЗАЩИТУ.

1. После облучения в широком диапазоне доз в стенке аорты развиваются патологические процессы нескольких типов, отличающиеся характером и динамикой изменений.

2. Возможность.прогрессии первичного парциального повреждения миоцитов, а также динамика изменений коллагеновых и эластических элементов стенки аорты зависят от степени повреждения механизмов внутриклеточной репарации миоцитов и их функциональной активности.

3. Гемодиначическая нагрузка усиливает патологические процессы в стенке аорты не только е ближайшие, но и в отдаленные сроки после облучения.

4. Препзрат рибоксин увеличивает эффективность внутриклеточных репарационных процессов в структурах стенки аорты, измененных радиационным воздействием.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были доложены на Всесоюзной конференции: "Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевом поранении" (Ленинград, 1992), на XI Всесоюзном съезде АГЭ (Смоленск,1992), на Научной конференции "Критерии и методы оценки жизнеспособности тканей в раневом процессе" (BMA, С-Петербург, 1993). Работа апробирована на научном заседании отдела морфологии НИИЭМ РАМН (1995).

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов н списга цитируемой литеоатуры. Рггбота изложена на страницах машинописного текста, содержит рисунков. Список литературы сютчает источников ( отечественных и иностранных).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование, проведенное на 250 беспородных белых крысах-самцах с исходной массой 150-200гр, состоит из трех разделов:

I раздел посЕЛщен поиску и дифференциальной характеристике

изменений (с анализом их временной динамики и дозовой зависимости) клеточных и стромальных элементов стенки аорты в ближайшие (1-48 час), отдаленные (4-30 сут) и поздние (3-15 мес) сроки после общего (0,5; 2,25; 4,5 Гр) или локального (область сердца, 9; 30-, 48; 100 Гр) рентгеновского облучения.

Исследована также динамика включения 353-метионина в миоци-ты средней оболочки аорты на протяжении 1-12 час после внутрибрю-шинного введения (доза:0,5 мкКи/г) непосредственно или через 1-30 сут после общего облучения в дозе 4,5 Гр. Гистоавтографы готовили с помощью жидкой фотоэмульсии типа "Р"(по Грачевой Н.Д.,1960). Подсчитывали количество треков над равными по площади участками стандартных по толщине срезов средней оболочки аорты.

II раздел. Изучался характер модификаций постлучевых структурных изменений в стенке аорты при дополнительной гемодинамичес-кой нагрузке, которую создавали путем стенозирования аорты в под-диафрагмальном отделе на 2/3 ее сечения по методу Beznak. Операцию производили после общего (4,5 Гр) или локального (9 и 30 Гр) облучения в различные сроки (непосредственно после облучения, через 4 сут, 1, 3, 6, 12 мес). Микроскопический анализ ткани осуществлялся на 21-23 и 40-43 сут после операции. Контролем служили облученные неоперированные и ложно-оперированные животные.

III раздел. Выяснялась принципиальная возможность ослабления постлучевых альтеративных эффектов в стенке аорты через 14, 20 к 30 сут и 1, 3, 4, 6 и 12 мес после курса введения рибоксина (ежедневное введение препарата в дозе 60 мг/кг в течение 10 сут) сразу же после локального облучения в дозах 14, 20 и 40 Гр.

Облучение производили на аппарате РУМ-17 в стандартном режиме; мощность дозы 0,77-0,9 Гр/мин. Для локального облучения области сердца использовали тубус без насадок (F=45mm, d=2cM) с расчетом поглощенной дозы в центре зоны прохождения грудной аорты. Сегменты грудной аорты фиксировали смесь» альдегидов по Кар-ноескому на коллидиновом буфере (ph 7,4), дополнительно фиксировали 1% раствором тетроксида осмия и заключали в аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали уранил-ацетатом vi цитратом ськнца, просматривали На микроскопе JEM-1008.

Помимо обзорного анализа изменений структур всех трех слоев стенки аорты, особое внимание уделялось изучению миоцитов средней оболочки, где определяли размеры и/ или численные параметры ряда органоидов (митохондрий, комплекса Гольджи, мембран гранулярного эндоплазматического ретикулума, лизосом, фагосом, а также парии-

альный объем ядра, занятого эу- или гетерохроматином. Подсчитывали также количество поврежденных миоцитов, толщину осноеы интимы (субэндотслиапыгый ее слой), толщину эластических мембран (среднее КЕЗДратическое), максимальную толщину миоцитов в области ядра, ширину промежутков между эластическими мембранами, а также толщину коллагеновых фибрилл. Подсчеты осуществляли на экране микроскопа, а измерения - с помощью полуавтоматического анализатора изображении МОР-ЗО (Австрия) при проекции стандартных элект-ронограмм-негативов (первичное увеличение*10Э00) через фотоувеличитель (дополнительное увеличение*17) на экран анализатора. Часть результатов представлена в виде средних значений величин со статистическим сравнением вариантов опыта по t-критерию Стьюдента, часть - в виде вариационных распределений со статистическим сравнением по критерию хи-квадрат.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1.Характеристика постлучевых изменений в структурах стенки аорты

У животных, подвергавшихся воздействию ионизирующих излучений, в стенке аорты обнаруживается ряд более или менее заметных изменений - |{ачественных и количественных, связанных с проявлением (крайне неравномерным топографически и асинхронным) частичной альтерации различных тканевых структур и их преобразованиями репарационного, и компенсаторного характера.

В интиме аорты пострадиационные процессы развертываются не только в эндотелиальной выстилке, но затрагивают также и компоненты субэндотелиапьного слоя.

Электронно-микроскопическое изучение аортального эндотелия уточняет гистологические наблюдения (Шевченко H.A.,1957, Hacken-neilner,1964, Никифорова E.H. и Чередеева Е.А., 1963) о возможности его лучевого повреждения. Подтверждаются также данные о том, что эти изменения, вероятно, не есть проявление какого-то универсального процесса деструкции и гибели клеток (Степанов Р.П.,1976), а отражают динамику нескольких принципиально различных по своему механизму явлений клеточной патологии, помимо апоп-тога, признаки которого также обнаружены в этом исследовании после облучения. В числе таких вариантов пострадиационной патологии аортального эндотелия удается отметить признаки цитолиза, клеточного отека, частичного некроза клеток с глыбчатым респадсм ци-тоструктур в ограниченных участ1*ач цитоплазмы, изолированное повреждение и разрушение части митохондрий или отдельных участков

цитомембрач в клетках, где не возникает каких-либо иных заметши структурных дефектов. У здоровых интактных крыс на протяжении 1-30 мес их жизни подобные альтерации в •■эндотелии аорты или отсутствуют или являются (как, например, дефекты митоходрий или начальные стадии клеточного отека) весьма редкой находкой. Уже в первые часы после облучения в широком диапазоне дог признаки повреждения удается обнаружить в немногих отдельных клетках эндотелия. Для ранних сроков после облучения в этих случаях вообще более характерно возникновение цитолитических изменений, причем после общего воздействия чаще встречаются такие варианты клеточной патологии, как повреждение части митохондрий, а после локального (особенно после облучения в больших дозах) - мембранные дефекты и зоны глыбчатого распада структур в цитоплазме.

Все отмеченные варианты цитопатологии представлены, как правило, дефектами небольших участков цитоплазмы, единичных или немногих органелл и не затрагивают ядро, по крайней мере на начальных этапах процесса. Их можно отнести к разряду повреждений потенциально репарабельных. Легко поврежденные клетки сохраняют обычные контакты с соседними э ндотелиоцитами. Лишь в случаях далеко зашедшего повреждения эти связи лабилизиругатся и, изредка, прерываются. Клетки с проявлениями глубокой альтерации, обнаруживаются редко при любых вариантах облучения, но более регулярно после облучения в больших дозах и в более, отдаленные сроки, когда вообще частота повреждений любой степени и типа в эндотелии поддерживается на высоком уровне без заметной тенденции к исчезновению вплоть до 13 мес после воздействия. Все это указывает на некоторое выравнивание альтеративной реакции в эндотелии в отдаленные сроки после облучения в широком диапазоне доз. Редкость находок тяжело поврежденных эндотелйоцитов после облучения и выявляемое нами их исчезновение у выжиеших животных через 30 сут после локального облучения в дозах 48-100 Гр, вероятно, можно объяснить быстротой десквамации этих клеток, достигающих стадии глубокой деструкции после длительной прогрессии первичного повреждения. Отсутствие значительных нарушений непрерывности выстилки при элиминации гибнущих клеток, предположително, определяется немедленным компенсаторным распластыванием соседних клеток, перекрывающих зону дефекта с восстановлением межклеточных контактов. В этих случаях ( при явном отсутствии признаков митотической активности) растет и неравномерность выстилки по толщине. Появляются участки чрезмерно истонченные, представленные широко распластанными кпет-

ками.

Значительная часть клеток выстилки, • где после облучения не заметно 1саких-либо деструктивных изменении или признаков повышенной гидратации цитоплазматического матрикса, привлекает внимание накоплением жидкости в канальцах эндоплазматической сети, элементах комплекса Гольджи, с большим или меньшим их расширением, а та-ле образованием вакуолей и пузнреобразных структур. Этот эффект можно рассматривать как проявление активней защитной реакции клеток на избыточное поступление жидкости, которое само по себе, вероятно, является следствием радиационного изменения функционирования плазмолемми.

Дополнительным индикатором масштабов пострадиационной поврежденное™ эндотелия может служить также постепенное и значительное увеличение там числа фагосом, что характеризует одновременно и возможости механизмов внутриклеточой репарации эндотелио-цитоб (сегрегация и ликвидация дефектных компонентов цитоплазмы) и, отчасти интенсивность фагоцитоза экстраклеточного материала. В максимальной степени эта реакция проявляется после облучения в диапазоне умереных доз (локальное - 9-30 Гр; общее - 2,25 Гр) и в отдаленные сроки после воздейстия, что свидетельстует о важности сохранения или восстановления эффективности тех механизмов фагоцитоза и репарации, которые зависят от »информационной подвижности цитомембран, при условии их достаточной стимуляции. Эти процессы слабо активизируются при незначительном повреждении (малые дозы) и частично подавляются - при массивном (большие дозы).

С этим эффектом коррелирует появление в аортальном эндотелии значительного количества липидных глобул, что, вероятно, связано с захватом их из кровотока, а не с метаболической недостаточностью зндотелиоцитов, так как наиболее выражено в отдаленные сроки после общего облучения и обнаруживается в цитоплазме неповрежденных клеток.

Сходные дозоЕые и временные закономерности характерны и для изменений численности в эндотелии аорты лизосомоподобных плотных телец. Процесс увеличения их количества на длительное время задерживается после облучения в больших дозах, но после облучения в умеренных и малых дозах быстро прогрессирует, что прямо коррелирует со степенью активности комплекса Гольджи.

После более слабого радиационного воздействия (общее. 0,[}-2,25 Гр; локальное, 9-30 Гр) в неповрежденных и пи мало поврежденных дндотелиацигах стимулируется функционал! иг* активность

(везикулярный транспорт) и, по-видимому, репарационные процесса, что сопровождается усилением метаболической активности (укрупнение ядра и ядрышка; увеличение числа свободных рибосом, числа и размеров митохондрий, рост и расширение канальцев гранулярной эн-доплааматической сети, где накапливается плотное вещество). После облучения в больших дозах эти преобразования первоначально задерживаются в той или иной степени, и начинают проявляться только в отдаленные сроки и в немногих клетках.

У облученных животных в эндотелии аорты постепенно растет количество телец Вайбеля-Палада. Этот эффект наиболее значителен при воздействии больших доз радиации и достигает максимального выражения через 10-30 сут.

Наиболее заметным последствием облучения является утолщение субэндотелиального слоя интимы.

У контрольных крыс в грудном отделе аорты эндотелий расположен прямо на внутренней эластической мембране, отделяясь от нее лишь тонким слсем аморфного электронно-прозрачного вещества, в который погружена сетчатая структура, состоящая ив более плотных фибриллоподобных образований. С возрастом этот слой утолщается, там появляются редкие эластические и коллагеновые элементы, мигрирующие клетки.

По данным морфометркческого анализа небольшое достоверное утолщение этого слоя происходит после общего облучения в дозах не ниже 4,5 Гр - первоначально (4-10 сут) за счет равномерного отечного набухания аморфного материала, а в отдаленные сроки (через 1-12 мес) - в результате менее равномерного и более интенсивного, чем у контрольных одноЕозрастных животных, воспроизводства субстанций, организованных в виде обычной сетчатой структуры. В очагах более выраженного утолщения субэндотелиального слоя формируются толстые пучки коллагеновых фибрилл, многочисленные эластические элементы, появляются макрофаги, часто имеющие признаки дегенерации, и гладкомышечные клетки.

После локального облучения субэндотелиальный слой утолщается более значительно и очень неравномерно (30 Гр и выше), что связано с отеком сетчатой основы и накоплением аморфного электронно-плотного вещества (первые 1-10 сут). В более отдаленные сроки признаки отека обнаруживаются только в очагах более резкого утолщения интимы, а общий равномерный рост толщины слоя связан с формированием сетчатой основы, накоплением эластических и коллагеновых структур и клеток (нейтрофиллы, макрофаги, миоциты). Эти

процессы прогрессируют со Бременем. По мере утолщения интимы эн-дотелиоциты продолжают сохранять контакт с поверхностью внутренней эластической мембраны, образуя длинные, иногда ачастомозирую-щие между собой цитоплазматические отростки. Над очагами чрезмерного утолщения интимы эндотелий сохраняет свою непрерывность.

В средней оболочке аорты обнаруживается ряд взаимосвязанных пострадиационных изменений в компонентах стромы и миоцитах.

По данным морфометрии, средняя толщина миоцитов после локального облучения (30-100 Гр) сначала (1-10 сут) достоверно уменьшается, с последующим постепенным возвратом к исходным значениям. После общего облучения стойкая тенденция к уменьшению толщины миоцитов проявляется лишь при дозах порядка 4,5 Гр; при облучении в меньших дозах эта реакция кратковременна, менее отчетлива и в поздние сроки (3-12 мес) сменяется другим эффектом -утолщением, что отчасти связано с гипертрофией части клеток, отчасти, возможно, с их гипертонусом, тогда как истончение может быть отражением потери тонуса и прогрессии атрофических процессов. Эти предположения подтверждаются аЕторадиографически данными (рис.1) о первоначальном угнетении после облучения белковых синтезов в этих клетках, сменяющимся периодом более интенсивого накопления аминокислотной метки в белках средней оболочки (как следствие репарационной реакции и, вероятно, активизации формирования структур стромы).

Возможность падения тонуса миоцитов сразу же после облучения подтверждается также данными об уменьшении расстояния между эластическими мембранами. Рост значений этого показателя (особенно после облучения в меньших дозах), указывает на восстановление тонической активности миоцитов аорты. Снижение тонуса миоцитов, согласно изменениям этого показателя, наиболее значительно после локального облучения в дозах 48-100 Гр.

Коллагеновые структуры средней оболочки у контрольных животных представлены небольшими пучками фибрилл варьирующей толщины (рис 2), что свидетельствует и о продукции нескольких тип в коллагена, и об определенной динамике их изнашивания и обновления. Возрастные изменения толщины фибрилл сопровождаются их истончением. После локального облучения происходит накопление утол-щеничх фибрилл. Эта реакция отличается стойкостью, и сменяется тенденцией к постепенному- частичному восстановлению исходной к:зр-тинм. ЯфФект зависит от дозы, причем при дозах высокого порядка о?; ,-!!.глп'\!)ы!о -задерживается. ддя общего с'.лучоиим И.П Гр) ча-

<г>

кМ си

Й-

£ §

30

<0

о

i 2 А

бремя после введения ^Б-мегионина (час)

Рис 1. Динамика включения ЗЗв-нетионина в белки структур средней оболочки стенки аорты ь различные сроки после общего облучения в дозе 4,5 Гр (а-непосреДственно после облучения, б-через 1 сут, в-через б сут, г-череэ 10 сут, д-через 30 сут). По оси абсцисс: количество треков на единицу площади тканевого среза. По оси ординат-время после введения метки (час).

толщина сри <5рил л /нм/

Рис 2. Распределение коллагеновых фибрилл по толщине в средней оболочке грудной аорты интактных крыс в возрасте 3е не-дель(1), 3 мес(2) , 12 мес(З), 30 ме)с(4).

средней оболочке грудной аорты после локального облучен» п дозе 9 Гр, через 3 нес(1) и 13 кес(2); в дозе 30 Гр че реэ 10 сут(З) и 3 мес(4)#' в дозе 100 Гр, через 1 суг(5) 10 сут(б) и 1 нес(7) и после общего облучения в дозе 4, гр, чорпз 2 сут(8) и через 9 нес(9).

рактерно постепенное накопление в строме аорты истонченных фибрилл (в большей степени, чем при старении)(рис.3). Подобные изменения свидетельствуют о высокой чувствительности процессов обновления и изнашивания коллагенового комплекса в строме сосудистой стенки к радиационному воздействию.

Изменяются и средние значения толщины эластических мембран. После облучения в меньших дозах они в основном утолщаются, что сопоставимо с накоплением в стенке аорты и мелких элементов эластики. Стойкое истончение мембран более выражено после облучения в больших дозах и коррелирует с растяжением стенки сосуда (падение тонуса миоцитов), и в какой-то степени, с "расщеплением" этих структур и процессами эластолиза.

Эти стромальные изменения определенно связаны с состоянием миоциотов. По данным гисторадиографии, там изменяется интенсивность белковых синтезов (рис 1). Уже в первые часы после облучения часть этих клеток обнаруживает признаки явного повреждения. Однако преобладает (даже после воздействия больших доз радиации) появление незначительных, условно репарабельных, вутриклеточных дефектов: участков миелиноподобной дегенерации мембран, повреждения единичных или немногих митохондрий, ограниченных зон лизиса или глыбчатого распада цитоплагматических структур, начальных стадий отечного набухания матрикса цитоплазмы. Картины более глубокого повреждения и гибели миоцитов (в том числе апоптотического типа) в этих случаях встречаются редко и преимущественно после воздейстия радиации в больших дозах.

В первые сутки после общего облучения в дозе 0,5 Гр содержание в ткани легко поврежденных миоцитов достигает 1,05 ± 0,72%, и в дальнейшем сохраняется на уровне 2,5-4,8% (из них клеток с тяжелыми повреждениями - 0,02-0,17%). Сходная картина наблюдается и после общего облучения в дозах 2,25-4,5 Гр (0,8-1,5% поврежденных клеток в перЕые сутки и колебания в их содержании в течение 12-15 мес на уровне 3-15%, из них тяжело поврежденных 0,09-0,41%). В первые 1-2 сут после локального облучения количество поврежденных миоцитов колеблется от 1,5-2,5% (9 Гр) до '37,5% (100 Гр); через 10-30 сут уровень поврежденности этой клеточной системы остается высоким, но уже мало зависит от дозы и без малейшей тенденции к уменьшению в более отдаленные сроки. У выжиеших животных через 30 сут после локального облучения в дозе 48-100 Гр тяжело поврежденные миоциты встречаются реже, но обнаруживаются участки ткани с признаками депопуляции, содержащие ос-

локальное оЬлучение

9гРЖр шгР тгР \ * 9 •

ощее сюлуцение

0,5ГР А 4,5Гр А

операция после оЬлучения о

9Гр®30Гр®

I 1

4QC

бремя

à 6 io 80 30 с у г

после

t*1 G О.

облучения

рнс'ц. изменения площади ненбран канальцев гранулярной эндоплаэ-матической сети в миоцитах стенки аорты пасле облучения и при генодинанической Нагрузке после операции стеНоэирова-ния аорты (на 22 сут) у облученных и необлученных крыс

татки клеточного детрита. Эти данные указывают на то, что в медленно обновляющихся популяциях миоцитов стенки аорты после.облучения создаются условия, обусловливающие накопление повреждений и создающие неблагополучный фон для функционирования ткани. Способствует этому и очевидная медленная.динамика первичных изменений, хотя вероятна их частичная репарация. Вполне возможно и появление повреждений вторичного характера вследствие длительного сохранения скрытого неблагополучия миоцитов после облучения.

О неблагополучии миоцитов после облучения свидетельствуют и косвенные данные о снижении их тонической активности и, отчасти, изменения, указывающие на стойкое нарушение процессов обновления компонентов стромы.

После облучения в 20-30Х миоцитов, не имеющих явного повреждения, появляются аутофагосомы, свидетельствующие о наличии там репарируемых дефектов; но после облучения в больших дозах эти процессы репарационного характера значительно подавляются.

Растет в миоцитах и количество лизосомоподобных плотных телец, коррелирующее с признаками увеличения активности комплекса Гольджи (при больших дозах эта реакция частично угнетается).

Вместе с тем, после облучения значительная часть сохранившихся (или репарировавоих) миоцитов претерпевает трансформацию, характерную для компенсаторной гипертрофии. При этом укрупняется клетка и ее ядро, гипертрофируется ядрышко, причем объем гетерох-роматина растет более значительно, ч^ч обгем эухроматиновой части ядра (особенно после облучения в больших дозах; при гипертрофии необлученных миоцитов это соотношение сохраняет постоянство). Увеличивается содержание свободных рибосом и протяженость (канальцев гранулярной сети (рис.4), где нередко заметно накопление электрснноплотного вещества. Эти процессы сопровождаются увеличением численности и/или размеров митохондрий с ростом общей их объемной массы. Популяционные масштабы этих изменений и степень их выраженности зависят от дозы и сроков наблюдения: облучение в больших дозах заметно угнетает эти процессы, воздействие малых и умеренных до? радиации способствует их гиперстимуляции.

2. Постлучевнп нзмекеиия в условиях гемодинамической нагрузки У необлученннх животных хроническая гемодинамическая перегрузка стимулирует в стенке аорты ряд специфических преобразований (к 21-23 сут), усиливающихся со временем (к 40-43 сут). Растет гол-'Лнз субэндотелиального слоя интимы в результате умеренного на-

копления материала ретикулярной основы и, местами, небольшого ее отечного набуханич, значительного увеличения количества мелких эластических структур и, в гораздо меньшей мере, коллагеновых. Появляются там в большом количестве малодифференцированные миоци-ты, макрофаги и клетки лимфоидного ряда (последние всегда с признаками дегенерации и разрушения). Эндотелиальная выстилка на значительном протяжении представлена истонченными клетками, среди которых располагаются утолщенные, гипертрофированные и митотичес-ки делящиеся элементы. В эндотелиоцитах, не имеющих каких-либо структурных дефектов, еаметно укрупняется ядро и ядрышко, увеличивается протяженность гранулярной эндоплазматической сети, количество митохондрий, свободных рибосом, микровезикул и телец Вай-беля-Палада (до 45 на срезе отдельных клеток).

Признаки выраженной гипертрофии обнаруживаются в большинстве миоцитов средней оболочки, особенно во внутренних и центральных ее слоях. В укрупненных миоцитах первоначально резко растет относительный объем межфибриллярных участков цитоплазмы, где образуются скопления мелких митохондрий, увеличивается содержание свободных рибосом, количество элементов комплекса Гольджи, лизо-сомоподобных телец и липидных глобул, канальцев гранулярной сети (которые расширены, содержат плотное вещество). От 0,4 до 2% миоцитов в этих условиях имеют незначительные структурные дефекты, обычно связанные с повреждением единичных митохондрий.

У облученных животных характер этих преобразований, стимулированных гемодинамической нагрузкой после операции сужения аорты, существенно искажается. В свою очередь, значительно изменяются в этих случаях масштабы и динамика процессов, обусловленных самим радиационным воздействием. Так, после облучения нагрузка приводит к более резкому и очень неравномерному утолщению интимы не только за счет накопления субстанций ретикулярной основы интимы в субэндоТелиальном пространстве, но, преимущественно, в результате образования обширных очагов отека, появления большого количества мигрирующих клеток крови и миоцитов, накопления пучков коллагеновых фибрилл; новообразование эластических структур здесь в значительной степени подавляется. Эффект усиления этих изменений аналогичен увеличению дозы облучения, пропорционален росту дозы предшествующего облучения, и выражен тем значительнее, чем более отдалена операция от момента облучения, и заметен даже после локального облучения в дозе 9 Гр, когда эти процессы бег стимулирующего действия нагрузки вообще не проявляются.

- 1

7 -

<О

н

0,6

^

о к.

0) ог <'

5С

О 45 К

О 35 §

§

5 23

.{5

к

V I

РИС

.йМЙШЛ

1

2 3 4 5 6

т/т

7 8

9 10

Количество киоцитов (%) с проявлениями незначительного (светлые столбики или тяжелого (заштрихованные столбики) повреждения в грудной аорте у крыс -необлученных, после операции сгенозирования аорты (1); -неоперированных, через 1 нес после облучения в яоэе 9 Гр (2) или 30 Гр(5)г -оперированных непосредственно (3) или через 1 нес (4) после облучения в дозе 9 Гр; -оперированных через 1 нес после облучения в дозе 30 Гр(б); -леченых рибоксином после облучения в дозе 20 Гр(8) или в дозе 40 Гр(Ю); -не получавших рибоксина после облучения в дозе 20 Гр(7) или в доле 40 Гр(9)

в средней оболочке грудной аорты у облученных в дозе 30 Гр неоперированных крыс(З), а также после операции стено-зировання аорты у Необлученных крыс через 22 сут(1) и через 42 сут(2) или у облученных крыс, после локального облучения в дозе 30 Гр(4) или общего облучения в дозе 4,5 Гр через 10 сут(5) и через 1 иес(б)

В периоде нагрузки у облученных животных существенно растет частота повреждений в популяциях эндотелиоцитов и миоцитов (рис 5), в том числе увеличивается появление тяжело поврежденных и гибнущих клеток. Нагрузка в более отдаленные сроки после облучения усиливает этот эффект.

Напротив, репарационные и компенсаторные процессы в эндотелии и миоцитах (в том числе приводящие к гипертрофии клеток), при нагрузке у облученных животных реализуются в меньшей степени, чем при каждом из этих воздействий в отдельности, что указывает на определенную ущербность этих внутриклеточных механизмов, обусловленную лучевым повреждением (рис 4) и пропорциональную величине дозы.

Изменения толщины коллагеновых фибрилл в стенке аорты в этих случаях аналогичны тем, что наблюдаются при увеличении дозы облучения (рис 6).

3. Модификация постлучевых изменений в структурах стенки аорты с помощью рибоксина.

Выявлена принципиальная возможность использовать препарат рибоксин, уже хорошо зарекомендовавший себя в клинической кардиологии (Комаров Ф.И. и др.,1979), для вмешательства в эффекты, индуцированные в структурах стенки аорты облучением и связанные с их повреждением, гибелью или репарацией. У животных, получавших рибоксин с целью профилактики лучевых повреждений, в отдаленные сроки действительно сокращается количество тяжело поврежденных или гибнущих клеток в эндотелии или популяциях миоцитов (рис 5). Вместе с тем, количество клеток с незначительными, потенциально репарабельными повреждениями изменялось мало по сравнению с теми случаями, когда лечение не проводилось; несмотря на лечение рибоксином, интенсивность их появления длительно поддерживалась на высоком уровне. Это свидетельствует о том, что прием препарата не препятствует развитию в облученном организме каких-то фундаментальных патогенных факторов, длительно способствующих возникновению повреждений в малообновляющихся тканях, подобных гладкомышеч-ной ткани стенки аорты. Клетки таких тканей репарируют лучевое Повреждение медленно (Стрелян Г.С.,1975; Степанов Р.П., 1982), что, по-видимому, и обусловливает эффект его накопления в популя-. ции со временем. Но рибоксин явно ограничивает прогрессию повреждения, останавливает на начальных стадиях, препятствует достижению необратимого состояния, ведущего к гибели клеток. Можно полагать, что в этом случае стимулируются механизмы внутриклеточной

репарации, а потенциальные возможности этих механизмов , нарушенные облучением, в достаточной степени восстанавливаются. Справедливость подобного предположения подтверждается и наблюдениями, указывающими на то, что у леченых рибоксином животных растет частота содержания фагосом и лизосом в миоцитах, как свидетельство активиэаци процессов сегрегации и ликвидации первичного ограниченного внутриклеточного повреждения. У облученных животных эта реакция частично подавляется (пропорционально дозе ). Рибоксин способствует также усилению метаболической активности клеток, что, в частности, сопровождается гипертрофией аппарата белкового синтеза и имеет очевидное отношение к обеспечению репарационных процессов.

Эффективность стимуляции внутриклеточной репарации, учитывая эти критерии, заметно уменьшается с увеличением дозы. Так, при локальном облучении в дозе 40 Гр, заметного положительного влияния рибоксина на постлучевые процессы в миоцитах, не обнаружено.

Проведенное исследование подтверждает на примере тканей стенки аорты общие закономерности, характерные для лучевого повреждения медленно обновляющихся клеточных систем ССтрелин Г.С. и сотр., 1965-19781, и демонстрирует новые доказательства того, что в изученных тканях,; подобно эндотелию капилляров и мышечной ткани миокарда [Степанов Р.П.,1970-1985], после облучения растет и длительно поддерживается высокий уровень спонтанного проявления повреждения, что напоминает особый радиационный эффект, замеченный впервые после облучения простейших [Бычковская И.Б., 1970], наряду со "скрытой" недостаточностью, которую удается обнаружить лишь при дополнительной функциональной нагрузке, стимулнруюшей процессы внутриклеточного обновления. Гемодинамическая нагрузка после облучения является фактором риска для сосудистой стенки, так как увеличивает масштабы и степень повреждения.

Выявленное в работе разнообразие проявлений цитопатологии в тканях аорты опровергает мнение о неспецифическом, универсальном, стандартном характере лучевого повреждения клеток [Токин И.В., 1974]. Нами показано, что частичное лучевое повреждение эндотели-оцитов и миоцитов может репарировать или ведет их к гибели, а общий структурный или функциональный ущерб ткани компенсируется гипертрофией сохранившихся клеток, что свойственно тканям подобного типа [Саркисов Д.С., Втюрин В.В., 1967; Кауфман 0.Я.,1979]. Эти процессы обеспечивают восполнение или гиперпродукцию органелл об-

щего и специального назначения и сопровождаются активизацией белковых синтезов. Возможность реализации этих внутриклеточных механизмов становится ограниченной при увеличении дозы облучения, но при действии малых доз полностью сохраняется, причем слабое повреждение играет роль сверхэффективного их стимулятора, чем, возможно, и объясняется сущность парадоксального эффекта "гормээиса" - постлучевого усиления тканевого обмена и клеточной активности [Кузин A.M., 19703.

Радиационное повреждение клеток в стенке аорты влияет на их участие в образовании и обновлении стромальных структур. Стойкие изменения толщины коллагеновых фибрилл в стенке аорты после локального облучения напоминает те, что обнаружены в легочной ткани [Дубровская В.Ф., Степанов Р.П., Шишко Т.Т., 1992] и, очевидно, связаны с задержкой процессов их изнашивания и обновления. Продолжительная гемодинамическая нагрузка вызывает такой же эффект, а ее комбинация с облучением в умеренных дозах его тормозит так же , как и облучение в больших дозах, что, предположительно указывает на ускорение процессов их изнашивания (разрушения). Накопление тонких фибрилл в процессе старения и, в большей мере, при общем облучении, вероятно, свидетельствует об искажении самого процесса формирования коллагенового комплекса.

ВЫВОДЫ:

1. Воздействие ионизирующих излучений (общее - 0,5-4,5 Гр, локальное - 9-100 Гр) приводит к частичному повреждению популяций эндотелиоцитов и миоцитов стенки аорты у крыс. Эффект регистрируется уже в первые сутки после облучения и проявляется стойким повышением уровня содержания клеток с различными структурными дефектами и гибнущих, без заметной тенденции к снижению частоты их возникновения в течение Есей последующей жизни облученных животных, а также развитием процессов "скрытой" недостаточности, обнаруживаемых с помощью метода дополнительных нагрузок.

2. Популяционные потери мышечной ткани в стенке аорты после облучения растут медленно и без пролиферативного восполнения; образующийся структурный и функционалъый ущерб ткани компенсируется гиперэктиЕНсстью и гипертрофией сохраняющихся и репарировавших клеток.

3. Ликвидация и репарация внутриклеточного повреждения миоцитов, их компенсаторная гипертрофия и участие в морфообравова-

тельных процессах в строме стенки аорты, обеспечиваются интенсификацией белковых .синтезов и сопровождаются восполнением, гиперпродукцией и/или гипертрофией органоидов общего и специального назначения. Эта реакция в существенной степени подавляется при облучении в больших дозах и гиперстимулируется облучением в относительно малых и умеренных дозах.

4. Воздействие ионизирующих излучений вызывает утолщение интимы аорты в результате неравномерного накопления в субэндоте-лиальном пространстве коллагеновых и эластических структур, мигрирующих клеток, а также аморфных компонентов, формирующих сетчатую основу и подвергающихся отечному набуханию после облучения в больших дозах. Эффект прямо зависит от величины дозы, усиливается со временем после облучения и при дополнительной гемодинамической нагрузке.

5. В формировании и обновлении коллагеновых фибрилл в средней оболочке аорты разные миоциты участвуют несинхронно и с неодинаковой степенью интенсивности. Локальное облучение в широком диапазоне доз выбывает длительно сохраняющийся эффект утолщения коллагеновых фибрилл, коррелирующий с общим их накоплением в стенке аорты. Увеличение дозы радиации и сочетание облучения с гемодинамической нагрузкой угнетают развитие этих изменений. Общее облучение в субЛетальных дозах приводит к накоплению в строме средней оболочки истонченных коллагеновых фибрилл.

6. Гемодинамическая перегрузка усиливает в стенке аорты патологические процессы, инициированные лучевым воздействием, являясь фактором риска на протяжении длительного времени после облучения.

7. Установлена принципиальная возможность уменьшения тяжести отдаленных лучевых повреждений в стенке аорты и стимуляции там репарационных процессов с помощью препарата рибоксина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Степанов Р.П., Шшко Т.Т. Радиоиндуцированные процессы в структурах стенки магистральных сосудов. //Сб.научн.трудов 11НИРРИ "Вопросы экспериментальной и клинической рентгенорадиологии", Л.,1991, с.99-101.

2. Степанов Р.П., Шишко Т.Т. Репарационные и адаптационные возможности сосудистых структур после облучения в условиях функциональной перегрузки.//Тез.докл.Всерос.конф."Восстановительные и

компенсаторные процессы в облученном организме", Л., 1992, с.108.

3. Дубровская В.Ф., Степанов Р.П., Шишко Т.Т. Сравнительное изучение изменений структурных параметров коллагеновых волокон при естественном старении и формировании лучевого пневмосклероза (количественное исследование), //Архив патологии, 1992, т.54, N11, с.16-20.

4. Степанов Р.П., Шишко Т.Т. Внутриклеточная репарация, ее возможности и ограничения в тканях с медленным обновлением клеточного состава //Тэа.докл.Х1 съезда ВНО АГЭ,Полтава, 1992,с.232.

5. Степанов Р.П., Шишко Т.Т. Реакция мышечной ткани сосудистой стенки на воздействие ионизирующих излучений в относительно малых дозах //Тез.докл.Всерос.конф. "Восстановительные и компенсаторные процессы в облученном организме, Л.,1992,с.131.

6. Вартанян Л.П., Горнаева Г.Ф., Дубровская В.Ф., Степанов Р.П., Шишко Т.Т. Профилактика лучевого поражения сердца с помощью рибоксина //Тез.докл.Всерос.конф."Восстановительные и компенсаторные процессы в облученном организме".Л.,1992,с.27.

• 7. Степанов Р.П., Шишко Т.Т. Оценка репарационных резервов клеток, тяжести и обратимости их повреждения //Тез.докл.На-учн.конф. "Критерии и методы оценки жизнеспособности ткани в раневом процессе". С.-П., 1993, с.43.

Тип- 99.ru/,- fo. „¡„J- 9С--