Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Получение моноспецифических антисывороток к иммуноглобулинам тюленя и некоторые аспекты их применения



'•ОС^'О^ИТет САНЭПИДНАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ им. Г. Н. ГАБРИЧЕВСКОГО

На правах рукописи

НЕВЕРОВА Марина Сергеевна

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИСЫВОРОТОК К ИММУНОГЛОБУЛИНАМ ТЮЛЕНЯ И НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

14.00.36 — Аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

у/

Москва — 1992

Работа выполнена в Научно-произзодствснном центре „Гнд.юбиог" Главного управления медико-биологических и экстремальных проблем МЗ РФ и в .V» о с к о с с к о и НИИ эпидемиологии н ыик4 обнологпн ни. Г. Н. Габрпчезского Госкомитета Санэплднадзора Р Р.

Научный руководитель— кандидат медицинских наук В. А. АЛЕШКИН

Научный консультант— кандидат медицинских наук А. .11. СУХОРУКОЗ

Официальные оппотенты— доктор медицинских наук Г. И. ПОДОПРИГОРА кандидат биологических наук Т. Н. БАТАЛОВА

Ведущее учреждение— Институт иммунологии »МЗ РФ

Защита состоится . ' //¿/¿¿-^/^ 1992 г. в час, на заседании Специализированногэ совета К-Й84.18.02 Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г. Н. Габричевского по адресу; 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10. '

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке А1НИИЭМ им. Г. Н. Габричевского

Автореферат разослан . && - 0(С{.1992 г.

Учетный секретарь ~ Специализированного совета:

кандидат биологических наук О. В. КОТЕЛЬНИКОВА

r"; .'v.■ ;:»:'. л.". Л

6ИЫ«Й0 I сЛА jЯВМ-ут-ц-д |

ОБНАЯ ХАРАКТЕРИСГЛКА РАБОТЫ

Актуальность темы.Развитие медицинской биотехнологии, включающее фундаментальные теоретические исследования и масштабные практические разработки, создало основу крупного промышленного производства разнообразных биологически активных соединений, в частности, гомологичных и гетерологичных препаратов иммуномоду -ляторов белковой природы из различных видов биологического сырья. В эксперименте и клинической практике из тимусов различных наземных млекопитающих успешно применяются препараты тимозин (Gold-etein А., 1976 ), тимопозтин ( Goldstein G.,1975 ), тактивин (Арион В.Я.,1975), тимарин (¡Лорозов В.Г. и др.,1978), тимоптин (Скобельцына Е.С.и др.,1989), которые помогают корректировать нарушения иммунной системы.Установлено, что аминокислотная последовательность одинакова для действующей субстанции oCj- тимозина, полученного из ткани тимуса человека, крупного рогатого скота, свиньи, овцы. В то же время замечена видовая специфичность гуморальных тимических факторов наземных млекопитающих и при этом установлена более низкая иммуностимулирующая активность этих вв -щвств по сравнению с известным ткмозином из тимуса телят.

Широкое изучение биологически активных веществ гидробионтов позволило разработать технологии получения препаратов полипептидной природы из тимуса морских млекопитающих, в прошлом - нереализуемого продукта зверобойного промысла (Ермолин Г.Л. и др.,1982; Коротаев Г.К. и др.,1986).Клинические испытания показали перспективность использования новых препаратов из тимуса гренландского тюленя наряду или взамен аналогичных коммерческих препаратов из тимуса телят.

Предполагают, что молекулы иммуноглобулинов и тимусннх гормонов являются предиественниками иммунорегуляторных пептидов (Чипенс Г.И. и.др.,1987), а наличие v^ -последовательностей иммуноглобу линов на Т-супрессорных клетках тимуса доказано экспериментально ( Ргепасо М.,1981 ),Очевидно, что выявление гомологичных иммуно-глобулиновых детерминант позволит расширить критерии оценки иммуностимулирующей активности препаратов из тимуса млекопитающих, а также объяснить природу ана^илактогенных свойств, характерных для гетерологичных препаратов при внутривенном введении. Однако иммунная система тюленя мало изучена ( Cavagnolo Н., Vedro'a Н. ,1979 ), и ее исследование представляет самостоятельный интерес.

Ослабление иммунной системы под влиянием антропогенных факторов создает необходимость оценки уровня иммуноглобулинов тюленя

- г -

в целях контроля сырья и конечных продуктов медицинской биотехнологии, а также для успешного конструирования диагностических тест-систем и проведения вакцинации животных ( ОзгегЬеив А.л. еЬ в1. , 1989; вгрсЬеу Ы., 1989)-

Методы серологической систематики убедительно доказали монофи -летическую природу таксона ластоногих и выявили высшее 100% содержание УдШ- подгруппы вариабельности тяжелой цепи среди многих позвоночных ( Сарга У.Ю. еЧ а1. ,1973), что позволяет использовать^ тюленя в системах серологического типирования подгрупп Н-цепи млекопитающих, в частности, проводить анализ нормальных иммуноглобулинов, миеломных белков, иммунных и других антител, а также мембранных иммуноглобулинов лимфоцитов.

Очевидно, что указанные исследования требуют анализа иммунохи-мической природы изотипов иммуноглобулинов тюленя и, следовательно, диагностических реагентов для их определений - моноспецифических антисывороток. Сведений о коммерческом выпуске или экспериментальном производстве подобных антисывороток нет, хотя в литературе подчеркнута актуальность использования антител к сывороточным белкам ластоногих для решения прикладных и научных задач.

Цель и задачи научных исследований.Целью настоящего исследования явилась разработка методов получения новых препаратов - кроличьих моноспецифических антисывороток к иммуноглобулинам А, И тюленя раборИНив бгоеп1вп(11са для иммунохимического анализа в биотехнологии (контроль качества препаратов-иммуномодуляторов), ветеринарии (конструирование диагностических тест-систем), в научных исследованиях (иммунотаксономия, изучение структуры и функции Иммуноглобулинов человека и животных).

В задачи исследования входило:

1.Разработать методы получения иммунохимически чистых 1&А, из сыворотки тюленя, подобрать оптимальную схему фракционирования сыворотки.

2.Разработать методы получения моноспецифических антисывороток, не требующих адсорбции, используя принцип иммунизации иммунными комплексам

3.Апробировать полученные антисыворотки для качественной и количественной характеристики иммуноглобулинов тюленя.

4.Провести выявление и анализ антигенного родства сывороточных бед ков тюленя, человека и ряда лабораторных животных.

5.Изучить возможность использования полученных моноспецифических антисывороток для оценки иммунохимической чистоты иммуноактивных препаратов полипептцдной природы из тимуса тюленя. Научная новизна и практическая значимость.

1.B результате экспериментальных исследований впервые разработана технология лабораторного получения кроличьих моноспецифических антисывороток к иммуноглобулинам О, A, U тюленя:

-впервые разработана схема фракционирования сыворотки тюленя для выделения и очистки иммуноглобулинов G, А, И, позволяющая ввделить указанные иммуноглобулины из одной серии исходного сырья с помощью физико-химических методов, гельфильтрации, ионообменной хроматографии; -впервые получены моноспецифические антисыворотки к иммуноглобулинам в, А, М путем иммунизации очищенними iga, igi, тщ. -впервые разработаны методы получения не требующих адсорбции моноспецифических антисывороток к 1®А и IgH путем иммунизации нерастворимыми иммунными комплексами; -впервые получена кроличья антисыворотка к СЗ компоненту комплемента тюленя с помощью комплекса зимозан + СЗ тюленя, для приготовления которого использовано известное для наземных млекопитающих сродство СЗ компонента комплемента к полисахариду клеточной стенки дрожжей зимозану.

2.Для иммуноглобулинов морского животного - тюленя - обнаружены новые биологические свойства:

-показан характерный для наземных млекопитающих аффинитет к протамину,Ь -фенилаланину, протеину А клеточной стенки стафилококка;

-установлена гетерогенность структуры IgO тюленя и гомология обоих его субклассов clgGI и IgG2 человека по «Д -легким цепям; это объясняет возможность иммунной системы тюленя формировать антитела против Ulcroooooaoeae, Knterobaoterlaa«&*, МуооЪ&с teriaoeae, Pioornaviridae, ParaayxoTirldae} -обнаружена перекрестная реактивность Zga тюленя cigo человека, мыши, хомяка, собаки,IgAnwieím с ХвАсобаки,' кошки, IgM тюленя с IgJl человека, крупного рогатого скота, собаки, кошки, СЗ тюленя с СЗ собаки; это свидетельствует о тесной филогенетической связи инвариантных и гомологичных участков Н и L -цепей молекул иммуноглобулинов млекопитающих морского и наземного происхождения, слабо изменившихся в ходе эволюции; демонстрирующие перекрестную реактивность преципитаты дают

возможность получить моноспецифические антисиворотки к иммуноглобулинам указанных млекопитающих в эффективном способе иммунизации без выделения чистого антигена;

-выявлены неизвестные ранее серологически родственные тюленю белковые антигены различных видов млекопитающих (человека и ряда лабораторных животных) в -^¿¿j Д / зонах электрофорети-ческой подвижности:

3.Установлена серологическая активность препаратов иммуномодуляторов из тимуса тюленя за счет присутствия в них сывороточных белков, в том числе иммуноглобулинов, тюленя.

Препараты 1-5 фракций (получены по методу Goldstein A.L, 197?) образуют преципитаты с поливалентной антисывороткой к сывороточным белкам тюленя и с моноспецифическими антисыворотками к иммуноглобулинам тюленя в электрофоретических зонах подвижности альбумина, макро-, [!> - и Jf -глобулинов. Для препаратов 7 фракции преципитатов не обнаружено.Это объясняет природу анафилактогенных примесей и позволяет дифференцировать препараты иммуномодуляторов полипептид-иой природы по степени очистки.

Практическая значимость.

1.Составлена "Инструкция по изготовлению и контролю сывороток диагностических против IgG.leA.I^l тюленя преципитирующих сухих". Утверждена на секции Ученого совята "Мед. биотехнология" МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, протокол от 21 янв. 1992г.

2.Разработана "Лабораторная методика определения белков сыворотки тюленя, в том числе иммуноглобулинов G,A,k тюленя, в иммуноак-тивных препаратах полипептцдной природы", которая войдет в "Технологический регламент производства препарата Тимозин из отходов промысла гренландского тюленя" в качестве раздела "Контроль имму-нохимической чистоты готового препарата".Разрабатываемый регламент основан на методах, указанных в ВФС 42-1837-88 и ВФС 42-1838-88.

ь3.Моноспецифические антисыворотки к lgG,IgA,Igi тюленя и поливалентная антисыворотки к сывороточным белкам тюленя нашли применение в научных исследованиях Научно-исследовательской лаборатории биологически активных веществ гадробионгов:как реагенты контроля при выявлении гетерологичных белковых примесей в медицинских препаратах--иммуномодуляторах разной степени очистки из тимуса тюленя, для оценки перекрестных реакций сывороточных белков млекопитающих разных ввдов при разработке иммуноферментных методов определениями

ц -иммунопептадов из тимуса гренландского тюленя и с целью поиска новых источников биологически активных веществ медицинского назначения, а также для идентификации природы субстанции, проявляю-

щей сродство к опиатным рецепторам ( Гос. рог. № 01880004050 и » 01880004049 ).

Кроме того с помощью указанных моноспецифичэских антисывороток был определен уровень сывороточных иммуноглобулинов гренландского тюленя разного возраста для дополнительной характеристики белков крови морских млекопитающих северного региона (совместно с Лабораторией морфологии и экологии высших позвоночных Института эволюционной морфологии и экологии животных им. А.Н. Северцова).

Положения, выносимые на защиту: I.Этапы выделения и очистки 1еО, 1еА, тюленя с помощью осажде-

ния полиэтиленгликолем, гельфильтрации на Ультрагеле АсА-22 и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-тоэпале.

2. Изучение биологических свойств иммуноглобулинов тюленя в отношении бюспецифических лигаедов: протамина, жакалина, I-фенилаланнна, протеина А клеточной стенки стафилококка.

3.Способы получения антител к и СЗ компоненту комплемента иммунизацией нерастворимыми иммунными комплексами.

4.Использование моноспецифических антисывороток к тюленя для определения уровня сывороточных иммуноглобулинов тюленя и идентификации человека, а также 150,1еА,1£1 и СЗ компонента комплемента ряда лабораторных животных.

5.Использование моноспецифических антисывороток к 150,15*,тюленя для оценки чистоты препаратов полипептадной природы из тимуса тюленя.

Апробация работы. Диссертация апробирована 10 сентября 1992г. на заседании секции Ученого совета "¡кмунология и медицинская биотехнология" МНЮВ.М км. Г.Н. Габричевского.

Материалы диссертации представлялись на: Конференции молодых ученых НИЛ БАВГ 22.03.89., заседаниях Ученого совета НИЛ БАВГ 29.06.89. и 13.06.91., на Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества гидробионтов* во Владивостоке, ТИНРО, 1991.

Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Объем и структура диссертации .Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы включает 21? источников (50 отечественных и 167 иностранных авторов).Диссертация изложена на 175 страницах машинописного текста, включает 15 таблиц и 42 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

.Материалы и метопы. Для выделения очищенных иммуноглобулинов и получения антисыворотки к белкам сыворотки тюленя использовали сыворотку крови тюленя Р. groenlaadica (пул), взятую у детенышей 20-40 дией.В качестве продуцентов антисывороток использовали кроликов породы венский голубой.

При выделении иммуноглобулинов применяли методы фракционирования полиэтилонгликолем (ПЭГ, Ш5000), каприловой кислотой, сульфа -том аммония, голъфильтрация на сефадексе G -200, сефакриле S -300, Ультрагелэ АсА-22, ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-тоэпале (цел-лшозе), аффинной хроматографии на протамин-, протеин А-сафарозах, жакалинагароза, гидрофобной хроматографии на L -фенилаланинсефарозе.

Для оценки антигенов, антисывороток и получения преципитатов для иммунизации воспользовались методами иммуноэлектрофореза (ИЭФ) по Scheidegger I.I. (1965), линейного ИЭФ (Kroll J., 1968 ), ракетно-линейного ИЭФ (Kroll J., 1972 )(и перекрестного ИЭФ (Claro h.g.ii. & Freentaa i.a., 1968 ).

Для количественного определения иммуноглобулинов использован метод радиальной иммунодиффузии (РВД) по Uanohlnl g. (1965).

Для получения антисывороток воспользовались методом иммунизации очищенными антигенами и мотодом иммунизации иммунными комплексами.

Цикл иммунизации белковыми антигенами состоял из 3 внутри-мы -точных инъекций с интервалом 10 дней. На I инъекцию использовали 1мл смеси, состоящей из 1мг белка, растворенного в 0,5мл физиологического раствора, и 0,5мл полного адъюванта Фрейвда.

Цикл иммунизации преципитатами состоял из 3 внутримышечных инъекций с интервалом в 10 дней. На I инъекцию использовали смесь, состоящую из 2см полос преципитации, гомогенизированных в 0,5мл физраствора с 0,5мл полного адъюванта Фрейвда.

Цикл иммунизации антительным сорбентом на основе стафилококка, содержащего белок А, состоял из 3 внутримышечных инъекций с интервалом в 10 дней. На I инъекции вводили 1мл 10% взвеси антительного стафилококкового сорбента.

На 10 день после третьей иммунизации брали пробы и контролировали в ИЭФ. Если антисыворотка давала четкую сильную линию преципитации, кровь забирали большими порциями (60-70мл) повторно через I-2 дня.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I.Разработка методов получения иммунохимически чистых igo, igl, IgH из сыворотки тиленя.При выборе способа фракционирования сывороточных белков учитывали близость констант седиментации IgU (193) и igO (73) наземных и морских животных ( Купер Э., 1980 ), сходство зон электрофоретической подвижности аналогичных классов иммуно -глобулинов сыворотки тюленя и человека ( Засыпкин M.D., 1987 ), перекрестные реакции IgO и igM человека и тюленя ( собственные даннные рис.1 ).Это определило выбор методов исследования с позиций известных

методов фракционирования сыворотки человека. +

2

РисЛИммуноэлектрофореграмма сывороточных белков тюленя с помощью референс-антисывороток к 1«0 и Iglí человека. I - сыворотка человека, 2 - сыворотка тюленя.

I.I. С помощью физико-химических способов осаждения, гель фильтрации и ионообменной хроматографии разработали ряд методов выделе • ния и очистки иммуноглобулинов.

Получение 1еЫ . Фракционирование цельной сыворотки на сефадексе о -200 пли сефакриле 3 -300 дало нечеткие пики разделения, вероятно, вследствие высокого содержания липопротеинов и cL 0 - макроглобулинов ( Schumacher К.,1967, Брок И.,1979 )• Поэтому в дальнейшем для их удаления сыворотку перед фракционированием обрабатывали 2% ПЭГ с 10^ СаС12 или 13% хлороформом.

Первый метод выделения igM предусматривал обработку сыво-

ротки ПЭГ, что давало возможность получить глобулиновую фракцию, обогащенную 1вМ ( СЬвввЬго в., 1968 ), которую фракционировали на сефакриле з -300, а следы Л2-макроглобулина и альбумина удаляли затем в препаративном ИЭФ.

По второму методу фильтрация на жесткой матрице Ультрагеля АсА-22 позволила сразу получить чистый 1вМ . предпочтение отдали второму методу.

Получение 1®А .Результаты гельфильтрации или ионообменной хроматографии в стандартных условиях ( На -фосфатный буфер, рН8 в градиента 0,05-0,08-0,2М ) показали невозможность выделить 1еА без примесей.

По первому методу обработка сыворотки каприловой кислотой или 505? сульфатом аммония позволила получить 1&А с примесями альбумина, «I -макроглобулина, трансферрина, 1вО , церулоплазмина.Дальнейшее фракционирование на ДЭАЭ-тоэпале позволило получить 1еА , имевший следы грансферрина и .

По второму методу после обработки сыворотки 12% ПЭГ получили осадок, содержащий 1гА,1вО и оС2М • Макроглобулины удалили фракционированием на 3 -300. С помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-тоэпале при рН8 и 0,05М удалось выделить примесь , а при

0,2М - снять чистый

Третий метод исключал малоэффективную очистку на б -300. Наши исследования показали, что методом ионообменной хроматографии в измененных условиях можно из глобулиновой фракции получить чистый

. При этом первая элюция на ДЭАЭ-тоэпале при рН7 и 0,06М даот возможность в первом пике получить смесь од. и ^о , а вторая • элюция ( рК8 ) создает условия выделения следов ^ при 0,05М и чистого Iпри 0,2М. Предпочтение отдали третьему методу.

Получение . Первый метод вкючал элюцию цельной

сыворотки на ДЭАЭ-тоэпале в стандартных условиях ( На -фосфатный буфер, рН8, градиент 0,05-0,08-0,2М ). В результате получили при 0,05^ о с примесью трансферрина. Примась удаляли гельфильтрацией на 3 -300. Однако малая емкость колонки с сефакрилом заставила искать другой путь.

По второму методу обработка каприловой кислотой о последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-тоэпале на были достаточны для получения чистого . Только дальнейшая гельфильтрация на Б -300 помогла удалить примесь трансферрина из 1во .

Третий метод оказался простим и надежным. Глобулиновая фракция, осажденная 20Й1ЭГ ( Ро1аоп X., Рс^^ег О.ы., 1964 ), содержала

Рно.2. Схема фракционирования сыворотки тюленя для выделения и очистки Хео. ХеА, с помощью физико-химических методов, гель^шльтрации, ионообменной хроматографии.

Рис.3. Схема получения 1вИ,1еД.,1а01тшвня с помощью методов лигавдной хроматографии

небольшие примеси трансферрина и макроглобулинов, которые удалили на ДЭАЭ-тоэпалэ, причем чистый 1еО сняли в новых условиях - при рН7,6 и молярноети 0,02.

Оптимальные варианты методов объединены в схему (рис.2), рекомендованную для лабораторного полугения 1^0, 1еА, 1£М. 1.2. Для поиска новых условий выделения иммуноглобулинов и оценки некоторых их свойств использовали методы лигандной хромато -графам.Иммуноглобулины можно изолировать на основе их аффинитета к протамину, жакалину, Ь -фэнилаланину, протеину А клеточной санки стафилококка.

Известно свойство отрицательно заряженных зон целой молекулы (но не его субъединиц) наземных млекопитающих связываться о положительно заряженными группам протамина. Ноши опыты показали, что на протаминсефарозе можно получить из глобулийовой фракции небольшое количество чистого Х&Ц тюленя.

В отличие от строгого аффинитета 1вА1 человека к лектину хлебного дерева жакалину, для 1&А тюленя нами не отмечено сродство к нему.

Успешное выделение 1еА тюленя провели методом гидрофобной хроматографии. Подобно изотипу 1еА человека, иммуноглобулин А тюленя выделили при хроматографии глобулиновоД фракции на неполярной Ь -феналаланинсефзрозе во фракциях В,С, частично п ,Е.

С помощью протеин А-сефарозы удалось выделить Хг® и установить гетерогенность ого структуры, причем оба подкласса перекрестно реагировали с легкими цепями иммуноглобулина человека.

Отдельные этапы выделения иммуноглобулинов методами лигандной хроматографии представлены на рис.3.Выделенные пммунохимически чистые иммуноглобулины использовали в качестве антигенов для получения моноспецифических антисывороток.Контроль в ИЭФ показал, что антисыворотка к 1е0 была моноспецифической и выявляла два подкласса с сывороткой тюленя. Антисыворотки к 1&К и эда имели примеси и тробовали адсорбции.

2.Разработка методов получения моноспепиФяческих антисывороток путем иммунизации н'.г.г/ншгми комплоксзми .

2.1.Иммунизация преципитатами, полученными методом линейного ИЭФ с

использованием очищенных или частично очищенных антигенов ( х^,

1ва) и антисывороток к ним.

В линейном ИЗО преципитаты образуются при электрофоретическом

разделении антигена перпендикулярно полосе агарозного геля, содержащего специфическую антисыворотку.Идентификацию линий преципитации проводили с помощью ракетно-линейного '!ЭФ и перекрестного ИЭФ.

11аадсорбированная моноспецифическая к Iей антисыворотка давала 3 линии преципитации.Перед электрофоретическим разделением антигена в лунку внесли иммунохимически чистый (референс-антиген). Это обеспечило появление ракетного пика над лункой, который вливался своим основанием в идентифицируемую линию преципитации с антисывороткой к (рис.4а).Указанный преципитат использовали для иммунизации.

При отсутствии очищенного антигена идентифицировать линию преципитации можно методом двойного перекрестного ИЭФ. Для этого прово -дили электрофорез одновременно двух антигенов (сыворотки и очищенного контрольного ) в первом направлении, а затем ИЭФ указанных антигенов о исследуемой антисывороткой во втором направлении, перпендикулярном первому.Слияние идентичных полос преципитации примесного и контрольного Хвй позволяет считать единичный пик, обладаю -щий высокой анодной активностью, преципитатом выявляемого 1вА . В дальнейшем антисыворотку к 1вА с идентифицированными полосами преципитации использовали в качестве референс-антисыворотки.На рисунке 46 видно, что нижняя левая линия IвА референс-антисыворотки плавно вливается . в верхнюю правую линию исследуемой антисыворотки.Аналогично для примеси в референс- и исследуемой антисыворотках. Известно, что расстояние миграции антигена от старта пропорционально соотношению антиген-антитело.Поэтому преципитат исследуемой антисыворотки, хотя имеет меньшую концентрацию специфических антител, является иммунохимически более чистым, т.к. более удален от старта и не имеет специфически сорбированных примесиих белков.

Иммунизация хорошо отмытыми полосами преципитации позволила получить моноспецифические антисыворотки, не требующие адсорбции.

2.2.Иммунизация иммунным комплексом, полученным с помощью антительного сорбента, содержащего белок А

Другой нерастворимый иммунный комплекс получили путем адсорбции антигена на антительном сорбенте.Для приготовления иммунного комплекса.использовали аффинитет белка А стафилококка к ?0 фрагменту молекулы 1вО .Так, для получения моноспецифической антисыворотки к тюленя взвесь стафилококка, содержащего белок А, обрабатывали кроличьей антисывороткой против 1&. (рис.5).На белке А сорбировалась из антисыворотки —фракция, причем ее свободные -фрагменты могли реагировать в дальнейшем с 1еА из сыво-

1ва

сс2м

1в>(

о

а)

АГ

б)

Рис.4.Идентификация линий преципитации в ракетно-линейном

ИЭФ (а), в лилейном ИЭФ с помощью референс-антиснворотки (б).

Стафилококк, содержащий белок А

Антительннй сорбент

1>

О & ¡>

антитела кролика к

1вА тюленя >

>

1еА тюленя

- и

Антлтельный сорбент

К

"Сэндвич" для иммунизации

Рис.5.Схема получения антительного сорбента на основе стафилококка, содержащего белок А.

ротки тюленя.Иммунизация иммунным комплексом стафилококк/АТ к / /1еК позволила получить моноспецифическую антисыворотку к тюленя.

Для приготовления иммунных комплексов на основе стафилококкового сорбента не требуется чистый антиген, а необходимые количества специфической антисыворотки минимальны.Учитывая высокую специфичность сорбции антигена на антительном сорбенте, разработанный способ иммунизации позволяет проводить эффективную наработку больших количеств моноспецифических антисывороток.

2.3.Иммунизация комплексом зимозан+СЗ компонент комплемента для по- лучения антисывороткн к СЗ.

Антиснворотку к СЗ тюленя получали методом НйНег - ЕЪегЬагй (1968).Известно, что полисахарид клеточной стенки дрожжей зимозан способен активировать и связывать СЗ.Сначала зимозан активировали кипячением в физиологическом растворе ЗОмин.К охлажденному до 18°С осадку добавляли сыворотку тюленя (500мг зимозана:11мл сыворотки), инкубировали при 37°С, перемешивали, центрифугировали, осадок шестикратно о тишали барбиталовым буфером.

После трех иммунизаций антисыворотка дала слабые линии СЗ с примесями альбумина и макроглобулинов.Поело шести иммунизаций полученную антисыворотку проверили методом перекрестного ИЭФ со свежей тюленьей сывороткой и сывороткой, хранившейся длительное время при 4°С. Отштили, что активация СЗ сопровождается изменением его электрофо-ретической подвижности в -области и появлением второго пика с большей подвижностью.

В результате проведенных исследований получены 10 серий моноспецифических антисывороток (табл.1).

3.Использование моноспецифических антиенвороток для исследования сывороточных иммуноглобулинов тшеня.

Качественный и количественный контроль полученных моноспецифических антисывороток был выполнен с помощью реакций преципитации по Оухтерлони,вариантов ИЭФ, РИД.

Антисыворотки были использованы для определения уровня иммуноглобулинов у представителей Р. вгоеШашИса разного возраста3^.

Сыворотки были любезно предоставлены к.б.н. Глазовой Т.Н., ИЭМ32, им. А.Н.Северцова, Москва.

Табл.1. Характеристика кроличьих моноспеиитлческих преципитирушшх антисчвороток к иммуноглобулинам и СЗ компоненту комплемента сыворотки тюленя

М Специфач- Антиген для иммунизации и Характеристика

п/п ность способ его выделения антисыворотки

антисыво- титр,РИД объем.ш

ротки

I iea очищенный igG (2 метод) I 20 200

2 ico очищекшый iga (3 метод) I 20 200

3 IgA очищенный IgA (3 метод) I 18 200

4 IgA преципитат (ЛИЗФ) I IS 200

5 IgA комплекс "отафилококк/АТ к IgA /IgA I 12 200

6 igti очищенный IgM . (2 метод) I 10 200

7 IgM очищенный IgM (протамин) I 8 150

8 IgM преципитат (ЛИЭФ) I 10 2С0

9 iga комплекс "отафилококк/АТ к IgM /IgM I 8 200

ГО C3 комплекс "зимозан+СЗ" I 15 250

Зш чено, что уровень иммуноглобулинов тюленя колеблется в зависимости от возраста. У новорожденных уровень igG составляет 8-1056 от материнского, а у 20-40 дневных детенышей - приблизительно треть уровня igG взрослого животного. Указанное повышение концентрации иммуноглобулина объясняется синтезом собственного ig(j при контакте с микрофлорой окружающей реды.

Уровень IgA у молодых животных меняется незначительно и составляет приблизительно 10% от уровня IgA взрослого тюленя. Замеченные колебания концентрации иммуноглобулина в сыворотке взрослых особей объясняются особенностями ивдивпдульного развития.

Уровень IgM у де нышей составляет половину уровня взрослого животного, причем более 20$ материнского IgM детеныш получает при рождении. Уже к 5-6 месяцам уровень IgM достигает уровня взрослого животного.

В целом уровни и динамика изменения иммуноглобулинов О, А, М гренлавдского тюленя в возрасте до 10 лет сравнимы с аналогичными для других видов млекопитающих. Состояние иммунной системы чаще всего характеризуется уровнем иммуноглобулинов, отклонение которого от нормы может служить сигналом к проведению различных диагно -стических тестов.

4.Использование моноспецифических антисывороток к иммуноглобулинам и СЗ тюленя для изучения перекрестных реакций сывороточных белков тюленя, человека и ряда лабораторных животных

Изучение перекрестной реактивности сывороточных белков тюленя, человека, мыши, хомяка, собаки, кошки, крупного и мелкого рогатого скота, свиньи, лошади проводили методами ЮФ и двойной РОД.

С помощью моноспецифических антисывороток Klgd, IgA, IgM, СЗ тюленя и поливалентной антисыворотки к сывороточным белкам тюленя было установлено антигенное родство сывороточных белков указанных млекопитающих в электрофоретических зонах IgO, IgA, IgM, СЗ, гаптоглобулина, «¿g-макроглобулина и уВ-липопротеинов (см.табл.2)

Результаты показали, что моноспецифические антисыворотки к IgO,IgA,IgM,03 компоненту комплемента тюленя могут быть использованы для выявления IgO человека, мыши, хомяка, собаки, ig*. собаки, кошки, IgM человека, крупного рогатого скота, собаки, кошки, СЗ собаки.Шмунные комплексы (преципитаты) моноспецифических антисывороток с сывороточными белками указанных видов млекопитающих могут служить материалом для иммунизации с целью получения моноспецифических антисывороток к указанным белка»! без выделения и очистки антигена.

Кроме того, с помощью коммерческих моноспецифических анти-

сывороток к igO человека или Igo мыши возможны определение igo тюленя и получение антител к Igt» тюленя.

Поливалентная антисыворотка к сывороточным белкам тюленя предложена в качестве средства при исследовании систем кроветворения и ферментной активности протеаз (гаптоглобулин свиньи, лошади и -макроглобулин собаки, кошки, свиньи, лошади), транспорта в плазме водонерастворимых липидов ( ß -липопротеины изученных нами млекопитающих кроме хомяка и крупного рогатого скота).

5.Использование моноспецифических антисывороток к

тюленя для оценки иммунохимической чистюты иммуноактивных препаратов полипептидной природы из тимуса тюленя

В настоящее время существует ряд параметров, характеризующих качество иммуноактивных препаратов полипептиднои природы: аминокислотный состав, молекулярная масса, изоэлектрическая точка, активность в различных тест-системах. До сих пор остается спорным вопрос о связи биологической активности препаратов, степени их биохимической очистки и природы животного сырья (тимуса).

Нам представлялось целесообразным выяснить, обладают ли препараты тимусного происхождения серологической активностью. С помощью поливалентной сыворотки к сыворотчным белкам тюленя и поливалентной сыворотки к сывороточным белкам крупного рогатого скота провели иммуноэлектрофоретическое исследование отчественных очищенных ( Goldeteln A.L., 1972) препаратов из тимуса тюленяи.для сравнения коммерческих препаратов из тимуса крупного рогатог.о скота (ВФС 42-1837-88).Для всех препаратов 1-5 фракций характерно наличие преципитатав в зонах альбумина, сL, р и ^-глобулинов с антисыворотками к сывороточным белкам животного-продуцента тимуса. Более очищенные перспективные для внутривенного введения препараты 7 фракции таких преципитатов не образуют.

Испытания с моноспецифическими антисыворотками к иммуноглобулинам тюленя и СЗ подтвердили и уточнили эти данные (см. табл.3). Наличие преципитатов объяснили присутствием сывороточных белков, неденатурирующих в ходе экстракции, а также существованием последовательностей иммуноглобулинов на Т-супрессорных клетках тимуса.

Таким образом, показано, что с помощью соответствующих моьо-специфических и поливалентных антисывороток возможен не проводившийся ранее контроль иммунохимической чистоты препаратов тиыозина разной степени очистки.

Табл.2. Перекрестные реакции сывороточных белков тюленя

человека и ряда лабораторных животных

Сыворотка

Зонызлектрофоретической подвижности с антисыворотками тюленя

тем гкв сз о<1 ^

человек . + + +

мышь + +

хомяк +

собака + + + + + +

кошка + + +

кр. рог. скот т

мелк. рог. скот

свинья + + +

лошадь + + +

тюлень + + + + + + +

Табл.3. Данные КЗФ-контроля препаратов тимозина из тимуса тюленя

Фрак- Изготовитель,

ция год

тимо-

зина __•

Зоны олектрофоретической подвижности сывороточных белков тюленя 1вИ I&к Хвв СЗ альб. <К ^

'5 1Б0Х, Ташкент, комм.,91

5 НПО "Биолар" ,0лайне, коьо!., 88

5 НИЛ БАВГ, Москва,эксп., + 91

5м НИИ БАЗГ, Москва,эксп., 91

7 НШ БАВГ, Косква,эксп., 91

+• +

+ + +

Знак "+" соответствует реакции с образованием преципитатов, в остальных случаях - отсутствие преципитатов; 5м - пятая фракция, полученная по модифицированной методике; №0Х - институт биоорганической химии; кош, - коммерческий препарат; эксп. - экспериментальное производство.

+

+

+

+

+

ВЫВОДЫ

1.Впервые получены моноспецифические антисыворотки к иммуноглобулинам о, А, к гренландского тюленя для иммунохимического анализа в биотехнологии (контроль качества препаратов иммуномодуляторов), ветеринарии (конструирование диагностических тест-систем), научных исследованиях (иммунотаксономия, изучение структуры и функции иммуноглобулинов человека и животных).

2.Предложены две схемы фракционирования сывороточных иммуноглобулинов. Первая схема позволяет вцделить иммуноглобулины с помощью осаждения ПЭГ, гельфильтрации на Ультрагеле АсА-22 и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-тоэпале. Вторая схема предусматривает использование методов аффинной хроматографии на протаминсефарозе, протеин А-сефарозе, гвдрофобной хроматографии на Ь - фенилаланинсефа-розе.

3.Разработан новый способ получения моноспецифических антисывороток к иммуноглобулинам и .СЗ компоненту комплемента сыворотки тюленя, основанный на иммунизации нерастворимыми иммунными комплексами: преципитатами типа "иммуног лобулин+антиимму ног ло бу л ин 4, комплексом "зимозан + СЗ".

4.Разработан новый способ иммунизации иммунными комплексами на основе Ештительного стафилококкового сорбента типа "стафилококк/ /АТ к1&д. п и "стафшгококк/АТ К18ы

5.По результатам экспериментальных исследований разработана технология лабораторного получения кроличьих моноспецнфических актисы-вороток к иммуноглобулинам о, к, М тюленя, включающая сочетание методов иммунизации антигенами и нерастворимыми иммунными комплексами.

6.Показана возможность использования полученных моноспецифических антисывороток к иммуноглобулинам а, А, ы и СЗ компоненту комплемента сыворотки тюленя в реакциях преципитации (ИЭ5, РЭД) для качественной и количественной характеристики.иммуноглобулинов тюленя, а также идентификации IgG человека, мыши, хомяка, собаки,

собаки, кошки, человека, крупного рогатого скота,

собаки, кошки, СЗ собаки.

7.Моноспецифические антисыворотки к иммуноглобулинам тюленя могут быть использованы в качестве реагентов для оценки имыунохимичес-кой чистоты препаратов полипептцдной природы из тимуса тюленя.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1.Неверова М.С., Алешин В.А., Сухоруков A.M. Выявление и использование антигенного родства сывороточных белков тюленя, человека и ряда лабораторных животных. - М., - 12с, ил.-

F блиогр. II назв. - Деп. в ВИНИТИ 07.02.90., № 672-В.

2.Глазова Т.Н., Неверова М.С., Алешкин В.А., Сухоруков A.M. Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови гренландского тюленя // ДАН СССР, 1991. - T.3I8, № 5 - C.I256-I259.

3.Неверова М.С., Алешкин В.А., Овчарова Н.М. Моно- и полиспецифические антисыворотки к сывороточным белкам тюленя как инструмент тля решения некоторых научно-прикладных задач. Тезисы докладов Всесоюзного совещания //Биологически активные вещества гвдробионтов - новые лекартственные, лечебно-прифилактические и технические препараты . ТИНРО, Владивосток, 23-27 сент. 1991. - С.79-80.

4.Неверова М.С., Алешкин В.А., Овчарова Н.М. Разработка унифицированных методов выделения иммуноглобулинов тюленя и получение моноспецифических антисывороток к ним // Доклады ВАСХНИД, 1992. - № 2. - С.33-38.

Развитие медицинской биотехнологии, включающее фундаментальные теоретические исследования и масштабные практические разработки, создало основу крупного промышленного производства разнообразных биологически активных соединений, в частности, гомологичных и гетерологичных препаратов иммуномодулято-ров белковой природы из различных видов биологического сырья. В эксперименте и клинической практике из тимусов различных млекопитающих успешно применяются препараты тимозин, тимбпо-этин, тактивин, тимоптин, которые помогают корректировать нарушения имщунной системы. Установлено, что аминокислотная последовательность одинакова для действующей субстанции di -тимозина, полученного из ткани тимуса человека, крупного рогатого скота, свиньи, овцы. В то же время замечена видовая специфичность гуморальных тимических факторов наземных млеко-.питающих,. и при этом установлена более низкая дамуностщдули-рующая активность этих веществ по сравнению с известным тимо-зином из тимуса телят. Показана перспективность использования новых препаратов из тимуса гренландского тюленя (в прошлом -отхода зверобойного промысла) наряду или вместо аналогичных коммерческих препаратов из тимуса телят.

Предполагают, что молекулы иммуноглобулинов и тимусных гормонов являются предшественниками иммунорегуляторных пептидов, а наличие VH -последовательностей иммуноглобулинов на Т-супреесорных клетках тимуса доказано экспериментально. Очевидно , что выявление гомологичных иммуноглобулиновых детерминант позволит расширить критерии оценки имдаостимулирующей активности препаратов из тимуса млекопитающих, а также объяснить природу алафилактогенных свойств, характерных для гете— рологичных препаратов при внутривенном введении. Однако иммунная система морских млекопитающих, в частности тюленя, мало изучена, и ее исследование представляет самостоятельный интерес.

Ослабление иммунной системы под влиянием антропогенных факторов создает необходимость оценки уровня иммуноглобулинов тюленя в целях контроля сырья и конечных продуктов медицинской биотехнологии, а также для успешного конструирования диагностических тест-систем и проведения вакцинации животных.

Методы серологической систематики убедительно доказали монофилетическую природу таксона ластоногих и выявили высшее 100% содержание - подгруппы вариабельности тяжелой цепи среди многих позвоночных, что позволяет использовать IgG тюленя в системах серологического типироваяия подгрупп Й- цепи млекопитающих, в частности, проводить анализ нормальных иммуноглобулинов , миеломных белков, иммунных и других антител, a. также ме мбранных^ лшфоцит о в человека.

Очевидно, что указанные исследования требуют анализа им-мунохимической природы изотилов иьшуноглобулинов тюленя и, следовательно, диагностических реагентов для их определения -моноспецифических антисывороток. Сведений б коммерческом выпуске или экспериментальном производстве подобных антисывороток нет, хотя в литературе подчеркнута актуальность использования антител к сывороточным белкам ластоногих для решения прикладных и научных задач.

Целью настоящего исследования, выполненного в рамках Общегосударственной комплексной программы исследования и исполь-. зованш Мирового океана на 1986-1990 гг. и на период до 2QQQ г., явилась разработка методов получения новых препаратов - кроличьих моноспецифических антисывороток к иммуноглобулинам Q^ Д1 м тюленя Pagophilas gr-oenlandUc^ для иммунохимическо-го анализа в биотехнологии (контроль качества препаратов -иммуномодуляторов), ветеринарии (конструирование диагностических тест-систем), научных исследованиях (шмунотаксономия, изучение структуры и функции иммуноглобулинов человека и животных) .

В задачи исследования входило :

1. Разработать методы получения иммунохимически чистых TgG, IgАIgM из сыворотки тюленя, подобрать оптимальную- схему фракционирования сыворотки.

2. Разработать методы получения моноспецифических антисывороток, не требующих адсорбции, используя принцип ишуни-зации жшунными комплексами. .

3. Апробировать полученные антисыворотки для качественной и количественной характеристики иммуноглобулинов тюленя.

4. Провести выявление и анализ антигенного родства сывороточных белков тюленя, человека и ряда лабораторных животных.

5. Изучить возможности использования полученных моноспецифических антисывороток для оценки иммунохимической чистоты иммуноактивных препаратов полипептидной природы из тимуса тюленя.

В результате проведенных исследований впервые разработана технология лабораторного получения кроличьих моноспецифических антисывороток к иммуноглобулинам G, А, М тюленя, в которую включены новая схема получения иммуноглобулинов тюленя и новые эффективные способы иммунизации.

- 8

Получены новые данные о практической реализации аффинитета сывороточных белков тюленя к белку А стафилококка, про-тамину, jL-фенилаланину и полисахариду зимозану.

Выявленные ранее неизвестные серологически родственнные тюленю белковые антигены человека и ряда лабораторных животных в разных зонах электрофоретической подвижности представляют как теоретический интерес для молекулярной филогении, так и практическое значение при разработке не требующих адсорбции способов иммунизации иммунными комплексами.

Предложен новый способ контроля иммуноактивных препаратов полипептидной природы из тимуса тюленя с помощью антител к сывороточным белкам животного - продуцента тимуса.

- 9

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AT антитело

ЗЙ? - забуференный физиологический раствор

ЙЭФ - шшуноэлектрофорез

ЛИЭФ - линейный иммуноэлектрофоре з

ЛВП - липопротеины высокой плотности

ММ - молекулярная масса "

ОП - оптическая плотность

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РВД - радиальная иммунодиффузия

ЭФ - электрофорез

- 10

ВЫВОДЫ

1. Впервые получены кроличьи моноспецифические антисыворотки к иммуноглобулинам М тюленя fagophtlus; groBnlAhdic^ для иммунохимического анализа в биотехнологии (контроль качества препаратов-иммуномодуляторов), ветеринарии (конструирование диагностических тест-систем), научных исследованиях (иммуно-таксономия, изучение структуры и функции иммуноглобулинов человека и животных).

2. Предложены две схемы фракционирования сывороточных иммуноглобулинов. Первая схема позволяет выделить иммуноглобулины с помощью осаждения ПЭГ, гельфильтрации на Ультрагеле АсА-22 и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-тоэпале. Вторая схема предусматривает использование методов аффинной хроматографии на протаминсефарозе, протеин А-сефарозе, гидрофобной хроматографии на ^-фенилаланинсефарозе.

3. Разработан новый способ получения моноспецифических антисывороток к иммуноглобулинам и СЗ компоненту комплемента сыворотки тюленя, основанной на иммунизации нерастворимыми иммунными комплексами: преципитатами типа "иммуноглобулин + + антииммуноглобулин", комплексом "зимозан + СЗ".

4. Разработан новый способ иммунизации иммунными комплексами на основе антительного стафилококкового сорбента типа "стафилококк/АТ к IgA/JgAk " и "стафилококк/АТ к FgM/IgM"*

5. По результатам экспериментальных исследований разработана технология лабораторного получения кроличьих моноспецифических антисывороток к иммуноглобулинам Д тюленя,

- 150 включающая сочетание методов имь/унизации антигенами и. нерастворимыми иммунными комплексами.

6. Показана возможность использования полученных моноспецифических антисывороток к иммуноглобулинам G-, А > И и СЗ компоненту комплемента сыворотки тюленя в реакциях преципитации (ИЭФ, РИЛ) для качественной и количественной характеристики иммуноглобулинов тюленя, а также идентификации Г^б- человека, мыши, хомяка, собаки, Л^к собаки, кошки, Г^К человека, крупного рогатого скота, собаки, кошки, СЗ собаки.

7. Моноспецифические антиоыворотки к иммуноглобулинам тюленя могут быть использованы в качестве реагентов для оценки имдунохимической чистоты препаратов полипептидной природы из тимуса тюленя. г 151