Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Получение иммунохимических реагентов для определения компонентов С3, С4, С5 комплемента человека и некоторые аспекты их клинического применения

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КСШТЕТ САНЗПИДНАДЗОРА РФ МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЯ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ им. Г.Н.ГАБРИЧЕВСКОГО

На правах рукописи

МАТВЕЕВСКАЯ НАТАЛИЯ СЕРГЕЕВНА '

ПОЛУЧЕНИЕ- ИШУНОХИШЧЕСКИХ РЕАГЕНТОВ'ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ СЗ, С4, С5 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА И НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ИХ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ.

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата

. .. биологических наук . - .

Москва - 1995

Работа выполнена в лаборатории медицинской биотехнологии Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского ГК санзпиднадзора РФ.

Научные руководители -

Официальные оппоненты -

доктор биологических наук, профессор В.А. Алешкин; доктор биологических наук профессор Л.В. Козлов, доктор медицинских наук, профессор Б.В. Пинепш; кандидат биологических наук Т.П. Егорова.

Ведущее учреждение - Российский Государственный

Медицинский Университет Ш РФ.

Зацита диссертации состоится г. в

часов на заседании специализированного совета (К -Ц6-01.02) Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.' Габричевского ГК санзпиднадзора РФ по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, ю.

" - • ■ -

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского ГК санзпиднадзора РФ.

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь уи шрТвщисимто сов ета

кандидат наук О. в,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Многочисленные клинические и экспериментальные исследования последнего десятилетия свидетельствуют о важной" роли-системы комплемента (CK) в инициации и регуляции защитных реакций организма. Являясь частью иммунной системы, комплемент участвует в осуществлении иммунного надзора за собственными клзгками организма, в ответе на внешнюю агрессия, в реакциях воспаления и з клиренсе иммунных комплексов (Pesce and Dosecum, 1933; Gresman and Volanakis, 1986; Rother and Rother, 1985; Egwang and Befus, 1984; Lambris,- 1988; Gordon and Hostetter, 1985; Morgan et al., 1985; Cooper and Nemerow, 1S89; Becnerer et al., 1989). Работы последних лет указывают на конкретное участие CK в развитии патологических изменений 1 при всех заболеваниях, ..связанных с активацией CK (Whaley, 1989; West, 1989).

Ключевую роль играет компонент СЗ, участвухяцлй в активации CK как по классическому пути, так и по альтернативному как часть трежмолекулярного фермента - С5-коквертазы. Компонент СЗ комплемента и его фрагменты, образующиеся в результате активации CK, реагируют с рядом сывороточных белков, мембранных-рецепторов, низкомолегсулярных соединений;" чужеродйых' белков, вы-' зывая различные биологические эффекты, объединяемые термином "воспаление" (Weiler, 1987, Lambris.1988). Это целый комплекс ответов организма, вклотающий анафилактические реации, участие простатландинов, интерлейкинов, интерферонов, системы свертывания крови, галшновой системы и т.д. (Weiler, 1987; Lambris, .. 1988). Полифункциональность СЗ обусловливает его наибольшую концентрацию в плазие крови по сравнению с другими компонентами комплемента, его концентрация сравнима с концентрацией иммуноглобулинов классов А и М. Вследствие этого количественный дефицит компонента СЗ и его гиперпродукция и входят в перечень причин развития аутоиммунных и опухолеродных процессов (Weiler, 1987).

Кроме ко:лгонента СЗ представляют значительный интерес гомологичные ему компоненты С4 и С5. Компонент С4 является составной частью^ СЗ- и С5-конвертэз классического пути, а с

активации С5 начинает формироваться мембраноатадаиций комплекс. Фрагменты всех трех белкоз, образующиеся при протеолити-ческом расщеплении в результате активации, обладают анафилак-тогенвыми свойствами. Ряд фрагментов СЗ и С4 имеют рецепторы на поверхности шмунокомпетентных клеток, участвуя в клеточной кооперации, олсонизации и т.д. (Janatova et al., 1989; Robbins-et al., _ 1987). Как и компонент СЗ, С4 явлгется.. белком острой фазы (Whicher and Dieppe, 1985).

Ряд тяжелых' инфекционных заболеваний обусловлен дефицитами - наследственными и приобретенными - указанных колшоаен-, tob CK. К этим заболеваниям относятся рекуррентные инфекции , вызываемые Streptococcus pneumoniae, Haemophilus-influenzae, Neisseria meningitis,$-hemolytic streptococci, а такг.е бруцед-. лез, токсоплазмоз (Gordon and Hotetter, 1S86; Frank, 1987). Широко распространенные аутоиммунные патологии также связаны с наследственными « приобретенными дефицитами компонентов С4, СЗ и С5. Сюда относятся: системная красная волчанка и СКВ-подобные синдромы, гломерулонефриты, ревматоидный, артрит, васкулиты и др. (Frank, 1987).

Терапия, направленная на контроль и коррекцию CK, несомненно, является перспективной. Кроме того, мониторинг отдельных компонентов CK позволяет осуществлять подбор дозы ряда препаратов, применяемых при лечении и оказывание' влияние на статус комплемента при ревматоидном артрите, инсулинзависимом сахарном диабете, системной красной "волчанки, атеросклерозе (Whaley, 1989, West, 1989; Whicher, 1978; Козлов, 1993,.1094).

Среди методов определения компонентов комплемента имиу-нохимические наиболее аопулярны в силу их высокой специфичности, относительной простоты в постановке и- учете результатов. Определение уровней кошонентов комплемента является рутинной процедурой в клинических иммунологических лабораториях sa . рубежом. Современная отечественная лабораторная практика распо-... латает иммунохвмическтш'наборами (ыоноспевдфичесгааш- .антисы- г воротками и белковыми стандартами) для определения компонентов Clq, С1инг й СЗ , а также .набором .реагентов для определения' гемолитической активности компонентов Clq, С1, С2, СЗ, С4, С5 и факторов В и D (Козлов, 1982; Козлов, 1985). Однако, например, для решения ряда задач клинической комплементологии (оценки комплементарного статуса больных) и в зксперименталь-

- з -

ных научных разработках шеется потребность в иммунохимических реагентах для определения количеств компонентов СЗ, С4 и С5.

В связи с вышесказанным, ЦЕЛЬЮ НАСТОЯЩЕЙ РАБОТЫ являлось выделение иммунохимически чистых компонентов комплемента -- СЗ, С4 и С5 как антигенов, получение моноспецифических антисыворо-•ток к ним и использование наборов иммунохимических реагентов' для определения концентраций указании белков в сыворотке крови при некоторых заболеваниях.

Источником антигенов для получения антисывороток был помимо дорогостоящей плазмы крови бросовый осадок IV-1, являющийся отходом промышленного получения альбумина и Иммуноглобулинов спиртовым методом Кона (Kistler and FTiedli, 1980). Использование балластных белковых фракции как источника сырья оправдано для десятков белков крови, которые наряду с широко применяющимися альбумином и иммуноглобулинами могли бы также использоваться как диагностические и лечебные средства в силу присущей им биологической активности (ингибиторы протеиназ, галтоглобкн, орозомукоид, травсферрга, церулошазмин, С-реак-тизный белок, белок S, карбоксилептидаза В и многие другие) (Drohan and William, 1938, Inoue, 1989). Применение бросового осадка IV-1 для выделения-3-х компонентов комплемента является частью исследований, направленных" на разработку безотходной технологи]? в производстве.препаратов крови,' проводимых в.лабог ратории медицинской биотехнологии МНИИЕМ им. Г.Н.Габричевского, что позволит более рационально использовать такое ценное биологическое сырье, каким является кровь человека.

ДЛЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ПОСТАВЛЕННОЙ ЦЕЛИ НЕОБХОДИМО БЫЛО РЕШИТЬ СВДУЩИЕ ЗАДАЧИ:

1) разработать схемы выделения иммунохимически чистых компонентов комплемента: СЗ, С4, С5 из плазмы крови человека и из бросового осадка IV-1 по Кону;

2) провести тшунохимический анализ компонентов комплемента, выделенных из различных источников сырья;

3) разработать методы получения моноспецифических антисывороток к выделенным компонентам комплемента и создать наборы иммунохимических реагентов для количественного и качественного ана-. лиза компонентов СЗ, С4, С5;

4) использовать полученные иммунохимические реагенты для характеристики комплементарного статуса при ревматоидном артрите и

• атеросклерозе.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ:

- предложена оригинальные способы выделения и очистки компонентов СЗ, С4, С5*кз плазмы крови человека и из бросового осадка 1У-1, получаемого при производстве препаратов крови спиртовым, фракционированием по методу Кона;

- получены новые иммунохимические реагенты для качественной и количественной характеристики компонентов СЗ, С4, С5 в сыворотках крови и других биологических жидкостях человека (синовиальной жидкости, бронхо-альвеолярном секрете и др.): полик-лопальные шноспецифические кроличьи антисыворотки и стандартные сыворотки крови;

- определены уровни компонентов СЗ, • С4, С5 в сыворотках кроЕИ здоровых доноров России;

- показана возможность использования компонентов СЗ, С4, С5 как системы мониторинга при ангиосклерозе сетчатки глаза.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ:

- показана возмскшость осуществления принвдпов безотходной технологии на некоторых этапах производства препаратов крови;

■ - подучено положительное решение по заявке на патент "Способ выделения СЗ компонента комплемента" (М 5045791/14 (018006) ог

• 30.08.9а-,) " " ' ' 1 ' ' ' ■

- оформлены заявки на получение патентов и получены приоритетные справки на "Способ выделения С4 компонента комплемента" (Ы 94025651 от 25.07.94г.) ' и "Способ выделения С5 компонента комплемента" ( N 94025626 ог 25.07.94г.);

- разработаны способы получения ковьк мовоспецифических антисы-. вороток к компонентам СЗ, С4 и С5, пригодных для количественного и качественного анализа указанных компонентов комплемента в клинической практике и научно-исследовательской работе; проводится оформление НТД на "Антисыворогки диагностические против компонентов С4 и С5 , сухие, предшитирующие".

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИЙ. Работа изложена наЩ страницах машинописи, включает страниц текста, 11 таблиц и 18 рисунков и состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка- литературы, . включая ?? отечественных и 223. иностранных литературных источника.

АПРОБАЦИЯ работы проведена на заседании ■ секции Ученого -Совета ШИШ им. Т.Н. Габричевского "Иммунология и медицине-

- 5 -

кая биотехнология" в феврале 1995 г.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. "

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы, и метода.

Компоненты СЗ, С4 и С5 выделяли из плазмы и сыворотки крови здоровых доноров и из бросового осадка IV-1, получаемого при фракционирована крови спиртовым методом Кона в производстве альбумина.

Антисыворотки к компонентам СЗ, С4, С5 получали путем - иьаунизации кроликов очищенными антигенами.

Уровни компонентов комплемента определяли в сыворотках крови 50 больных (27 мужчин и 23 женщин ) ангиосклерозом сетчатки, возраст бскьных варьировал от 49 до 86 лет; 19 больных ревматоидным артритом (5 мужчин, и 14 женщин), в возрасте от 28 до 63 лет. В сыворотках крови 28 больных ангиосклерозом сет-. чатки определена также гемолитическая активность компонентов СЗ, С4, С5. 4 - -

В качестве контроля были обследованы сыворотки крови здоровых доноров (61 образец, из них - 32 мужчины и 29 женщин), в возрасте от 18 до 53 лет.

Концентрирование белковых растворов проводили на установке фирмы. "Amicon" - (Нидерланды) через мембраны РМ-ЗО при -4° С. Осадки, образующиеся в процессе выделения компонентов СЗ, С4, С5 из плазмы и бросовой фракции IY-1, отделяли центрифугированием при 6000 об./мин и 20000 об./мин, -4*С.-

Осаждение белков из плазмы крови и балластного осадка IV-1 проводили с помощью полизтиленгликоля (ПЭГ) 4000 (4Z и 16% - вес/объем). Отделение компонентов комплемента от других белков плазмы проводили с помощь» ионообменной хроматографии . на DEAE-Toyopearl 650М (фирмы "Toyo Soda", -Япония). Очистку компонентов СЗ и С4 завёршали переосаждением 162 ПЗГ либо концентрированием на ульграфижьтрациояной ячейке "Amicon" (Нидерланды) и гель-фильтрацией на Sephacxyi S-200 ("Pharmacia", Швеция). Разделение пула С5/СЗ после ионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl 650М проводили на CM-Sephadex ("Pharmacia", Швеция), полученный препарат компонента С5 кон-

центрировали и дополнительно очищали гель-фильтрацией на 5ерЬасгу1 3-200 ("РЬатгас1а", Швеция).

Приготовление имыуносорбенгов с помсицыо глутарового ди-альдегида и сорбцию антисывороток проводили как описано Остер-маном (1983).

Определение концентрации белка в осадке IV-! и очищенных препаратах белков проводили по методу Лоури, на-различных стадиях выделения и очистки белков пользовались спектрофотометри-ческим способом (при 280 нм).

Для характеристики сырья, выделенных белков и полученных антисывороток к компонентам СЗ, С4, С5 пользовались методами преципитации в геле по Оухтерлони, тмувозлекгрофорезом (ИЭ2) по Грабару и Уильямсу, слитно-ракетного ИЭ5 (СИЭ5) (Фримель, 1987). В качестве референс-препаратов использовали коммерческие моноспец^шческие антисыворотки к компонентам СЗ, С4, С5 производства-фирмы "ВеЬгШ^егке" (Германия) и стандартную плазму крови человека (Горьковский НИИЭД.

Концентрации исследуемых когшонентов ксмплемента в сыворотках крови больных определяли методом простой радиальной к/-мунодиффузия (ГОД) (Мапс1п1, 1965) с использованием собственных моноспецк^ических антисывороток, а также стандартных сывороток крови человека с известным содержанием исследуемых компонентов комплемента фирьда "ВеЬг1г®»егке" (Германия). Программа для обсчета полученных по РИД результатов на персональном компьютере разработана Л. В. Козловым. Гемслигическуз активность компонентов СЗ, С4, С5 в сыворотке крови больных определяли по стандартной историке,, предложенной Л.В.. Козловым с соавт. (1982, 1985). Статистическую обработку результатов проводили с - использованием I-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ -ШУЕЙОВАНЮ!

1. Выделение кошонентов С4, С5 из нормальной сыворотки или плазмы крови человека.

Компоненты СЗ, С4, С5, в цалом, довольно близки по физико-химическим свойствам, хотя и различайся но некоторым параметрам. Это оказывается иногда очень полезным, т.к. при ис-• пользовании сбнчаах методов очистки (осаждение; ИОХ, диализ, гель-ф;ш>грзцзя и др.) они содержатся в одних и тех жэ фракци-

ях, что позволяет до определенной стадии выделать названные белки вместе, что заметно сокращает процедуру очистки.

Суммарные данные по схеме очистки компонентов СЗ, С4, С5 из нормальной сыворотки иди плазмы крови с выходом белка на каддой стадии представлены в таблице-1.

Таблица 1. Суммарные данные по очистке компонентов СЗ, С4, С5 из сыворотки крози человека.

Стадия объем А 280 антиген, антиген ШКОД степень

ил един. мг/мл, РИД МГ' 2 очистки

по Манчини

Компонент СЗ

1. сыворотка 200 10200 1.588 318 100 1

2. пост-4£ПЭГсу- 194 1.572 305 36

пернатант 1.847

3. П0СТ-16ГОЭГ 150 277 87

осадок

4. пост-ДЗАЗ-СЗ- 140 1.271 178 56

фракции

5. пост-ЗеЬр.Б 95 120 1.291 124 39 33

200 С3(4 пор-

ции)

Компонент С4 4 •

1. сыворотка 200 10200 0.398 80 IX 1 ,

2. пост-42ЛЗГсу- 194 0.376 73 91

пенатаит' * *

3. пост-16ХПЗГ 150 0.425 64 80

осадок

4. пост-ДЭАЭ-С4- 100 0.460 46 58-

фракции

5. пост-БерЬ.Б 54 35 0.462 25 31 91.6

200 С4(4 пор-

ции)

Компонент С5

1. сыворотка 200 10200 0.328 66 100 1

2. пост-42ШГсу- 194 0.278 54 82

пернатант

3. пост-}6ГПЗГ мл л ЛТ^ 150 0.303 • 46 га

4. осадок пост-ДЭАЭ-С5/ 100 0.220 22 34

СЗ-фракции

5. пост-КМ-С5 90 0.177 16 24

фракции

6. посг-БерЬ.Б 24 16.4 0.5 ■ 12 18 •112.3

200 С5(2 пор^ V

ции) -Ч

Апробированная нами схема выделения компонентов СЗ, . С4, С5 из сыворотки вюютает предварительное центрифугирование сы-

воротки с цель» отделения от остатков фибрина и липидов и ли-попротеидов крови и обработку Ка2-ЗДТА для свявьшания двухвалентных ионов кальция и магния. Стадия осаждения Clq, С1 и C4bp 42-ным ПЭГ 4000 и последующее осаждение полученного су-пернатанта 162-ным ЮГ 4000 совпадают с описанными в литературе (Kistler and Friedli, 1S80) и собственными^данными, согласно которым в осадок выпадает до 80-87% СЗ, С4 и> 69Z С5 от начального сывороточного уровня, при этом подавляющее количество относительно низкомолекулярных белков сыворотки остается в су-пернатанте. По методу Лоури выявлено также, что в 16% ПЭГ-осадке остается около 30Х от начального плазменного белка. Кроме того, как видно из данных таблицы 1, -на этой стадии достигается частичное концентрирование всех выделяемых компонентов комплемента.

' Следующая стадия - стадия разделения компонентов СЗ, С4 и частично С5 - ионообменная хроматография на DEAE-Toyopearl 650 М, для злвции связавшихся с анионообменником белков использовали линейный градиент NaCl 0-0.3 М.■

Компонент С4 хорошо отделяется or компонентов СЗ и С5, а также от других белков плазмы, злюируясь в конце градиента NaCl при ионной силе около 0.3 Ы UaCl.

Графики злшрования компонентов СЗ и С5, напротив, пересекаются: коыпонент ■ С5 злюируегся при ионной силе около 0.145-0.16 М NaCl, а СЗ - при ионной силе около 0.15-0.18 М NaCl, максимум при 0.17 М. Для дальнейшей очистки компонента СЗ такое перекрывание особого значения не имеет, т.к. в этом случае мы не объединяли фракции с примесью компонента С5, а объединяли только фракщш без С5.

Пуд С5/СЗ-содержащих фракций после хроматографии на DEAE-Toyopearl 650 М, отдиализованный против буфера с низкой ионной силой, подвергали . катюнообменной хроматографии на CM-Sephadex, при этом компонент СЗ практически не связывался с сорбентом, а компонент С5 актировался линейным градиентом NaCl в виде одиночного пика.

СЗ-, С4-, С5-содержащие фракщш имели в виде примесей альбумин, иммуноглобулины и некоторые другие неидентифвдмро-ванные белки. Заключительной стадией очистки каждого из названных белков была гель-фильтрация на Sephacryl S-200. Идентификацию компонентов комплемента во фракциях проводили иммуно-

химически методами иммунопреципитации в геле либо слитно-ракетного И35. Очищенные белки, проанализированные методом ИЭ5, сконцентрированные до концентрации - не менее 1 мг/мл (РИД по Манчшш) хранили при -?ОвС в течение нескольких месяцев.

Итак, выход компонентов комплемента по предложенной нами схеме очистки составил: СЗ - 39%, С4 - 312, С5 - 182 (табл. 1).

2. Выделение компонентов СЗ, С4, С5 из бросового осадка IV-1 промышленного получения альбумина по методу Кона. Как бндо сказано выше, плазма или сыворотка крови"является традиционным видом сырья при выделении отдельных белков гсрови. Однако, при промышленном получении белковых препаратов из сыворотки крови человека достаточно болышя часть общего белка попадает в; балластные фракции, которые в дальнейшем просто выбрасываются. ' *

В лаборатории медицинской биотехнологии МНИЛЭМ им. Г.Н.Габричевского по заданию НТС МЗ РОХСР проводятся серии разработок безотходной технологии в производстве препаратов крови, которые продолжается и в настоящее время. В рамках этой работы мы предлагаем использовать балластную фракцию - осадок IV-1 -для выделения еце 3-х белков - компонентов СЗ, С4, С5 как антигенов, пригодных для получения соответствующих моноспецифичес-кйх'антисывороток. '

Kistler and Friedli (1980) при характеристике названного . осадка указывают на присутствие в нем компонентов комплемента. Пронедеякш нами иммунохимический анализ осадка IV-1 подтвердил, что компоненты СЗ, С4 и С5 выявляются в этой фракции. Уровень компонентов комплемента в различных сериях осадка IV-1, определенный методом РИД по Манчини, составляет: компонента СЗ - 0.7-1.5 мг/мл, компонента С4 - 0.15-0.32 мг/мл, компонента С5 - 0.05-0.12 мг/мл.

Осадок IV-1 содержит 18-25Z этанола. Осадок измельчали и растворяли в фосфатной буфере высокой ионной силы для лучшей экстракции белков и диссоциации белок-белковых комплексов при постоянном перемешивании на магнитной мешалке и выветривании этанола под вентилятором в течение суток, до исчезновения хат • рактерного запаха. Готовили 20£-ную взвесь осадка IY-1 в буфере (по Curling, 1980).

Супернатант, полученный после, центрифугирования и диали-

- 10 -•

за, подвергали фракционировании ПЭГ 4000 до насыщения 16Х. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при 10000 ^ об./мин, растворяли в рабочем буфере и в дальнейшем подвергали последовательно хроматографическим процедурам по схеме, приве-' денной для выделения компонентов СЗ, С-4 и С5 из нормальной сыворотки крови человека, но с небольшими изменениями: при хроматографии на ОЕАЕ-Тоуореаг1 650 М использовали более пологий градиент N301 - до 0.4 М - для более полного снятия связавшихся с анионообменником белков.

Компонент СЗ, подвергаясь, по-видимому, неспецифшескому и специфическому расщеплению в процессе фракционирования сыворотки крови по Кону, что подтверждается нашая- данными, имеет более широкий лик зжшрования. Это объясняется тем, что разные фрагменты компонента СЗ (СЗЬ, СЗМ, СЗс) элюируются с анионо-обменника при несколько отличающихся значениях ионной силы.

Дальнейшие процедуры выделения компонентов С4 и С5 из осадка IV-1 совпадали с таковыми из нормальной сыворотки. Суммарные данные по выделению названных компонентов комплемента из осадка IV-1 приведены в таблице 2.

■ Выделенные белки концентрировали до 0.5-1 мг/мл и контролировали методом ИМ к РИД с использование^ антисыворотки против всех белков плазш крови человека и моноспецифических антисывороток против коюганентог СЗ, С4, С5 . Выход,компонентов . комплемента при получении их из осадка IV-1 сравним с выходом при получении их из нормальной сыворотки (табл. 1 и 2).

3. Иммувохимический анализ компонентов комплемента, ■

выделенных из различных видов сырья.-Компоненты СЗ, С4, СЗ;-полученные из нормальной сыворотки крови, а тзкасё из бросозого осадка IV-1 исследовали методом ИЭФ (рис. 1, 2 ).

Образцы препарата компонента СЗ, выделенные из нормальной сыворотки, при взаимодействии с моноспецифической антисывороткой к СЗ компоненту комплемента, формировали, характерную полосу преципитации в Д-зоне злекгрофореграммы. Об иммунохшшчес-кой чистоте препарата говорит тот факт, , что реакция преципитации с антисывороткой ко всем белкам крови человека также выявляла единственную полосу в ¿-зоне. -о

Исследования препарата компонента СЗ, выделенного из

- и -

осадка IV-!, методами ИЭ6 и ПИЗЕ ( рис.2 и 3 ) также выявляет наличие 1 полосы преципитации, растянутой на^-^-зоны, что доказывает наличие фрагментов компонента СЗ в осадке IV-1, имеющих общие антигенные детерминанты с СЗ - СЗЬ, СЗМ, СЗс.

Рис.1. Анализ компонентов СЗ, С4 и С5, выделенных из сыворотки и осадка 1У-1 по Кону, методом И3£. В лунках: 1 -стандартная плазма крови, 2 - компонент С4, 3 - компонент СЗ, 4 - компонент С5; в бороздах: а - антисыворотка ко всем белкам плазмы" крови человека, б - антисыворотка к компоненту С4, в -антисывортка к компоненту СЗ, г - антисыворотка к компоненту С5.

- а

5

.02

о 3

о 3

о Ч

а, г

Рис.2. Анализ компонента СЗ, выделенного из осадка IV-! по Кону, методом ИЭВ. В лунках: 1 - стандартная плазма крови, 2 - осадок IV—1 по Кону, 3 - компонент СЗ; в бороздах: а - антисыворотка ко всем белкам плазмы крови, б - антисыворотка к компоненту СЗ. '

+ .____ =з - О.

4 4"

о Я

о 3

<г

а 5

Анализ препаратов компонентов С4 и С5, полученных как из нормальной сыворотки, так и-из осадка IV-1 .методом ИЭВ с соответствующими моноспецифическими ангисыворртками и с антисывороткой ко всем белкам плазмы крови выявляет единственные по-

лосы преципитации в характерной Д-зоне злектрофореграммы (рис. 1). "

Рис.3. Анализ компонента СЗ, выделенного из осадка IV-! по Кону, методом перекрестного ИЭЗ?. А - антисыворотка к компоненту СЗ, Б - компонент СЗ.

Л

Таблица 2. Результаты выделения компонентов СЗ, С4, С5 из осадка IV-! да Кону.

Стадия объем /ЛК А 280 антиген, мгЛш.РВД по Манчин антиген мг выход г степень очиепц

Компонент СЗ У

1.202-ный р-р осадка IV-1 2.посг-1б2ШГ осадок 3. пост-ДЭАЗ-СЗ фракции 4. порт-БерЬ. Б200. СЗ (4 порции) 200 160 7600 1.148 1.169 230 187 100 81 1

110 96. 72 1.027 0.771 113 74. 49 32 . 34

.. Компонент С4

1.20Х-ный р-р осадка IV-! 2.псст-16И13Г осадок 3.пост-ДЭАЭ-С4 фракции 4. пост-5ерЬ.5200 С4 (2 порции) 200 160 7600 0.24 0.238 48 38 * 100 80 1

80 36 , 19.7 0.288 0.388 ' 23 14 47 30 112.8

Компонент С5

1.202-ньш р-р осадка 1У-1 2.пост-16П13Г осадок • 3.пост-ДЗАЭ-С5/СЗ фракции 4. пост-СМ-5ерЬ.С5 •фракции 5. пост-БерЬ.Б200 С5 (2 пооции) 200 160 7600 0.084 0.075 17 12 100 65 I

70 0.077 5.4 32

60 0.06 3.6 21

. 24 4.5 0.083 2 12 1987

-.13 -

4.Получение моноспецифических антисывороток к компонентам СЗ, С4, С5. - "

Компоненты СЗ, С4,. С5, выделенные из нормальной сыворотки и из бросового осадка IY-1, были использованы для иммунизации кроликов. Дикл иммунизации состоял, как правило, из трех внутримышечных инъекции с интервалом в 10 дней.

Сыворотку крови кроликов, иммунизированных очищенными белками, исследовали методаш И35 и преципитации в геле по Оухтерлони с использованием моноспецифических антисывороток производства фирмы "Behring" (Германия) и стандартной плазмы крови человека (ГНИЙЕМ) в качестве референс-препаратов. Примесные антитела сорбировали на твердых белковых сорбентах, полученных с помощью глутарового диальдегида из различных фракций при выделении компонентов комплемента, - не содержащих исследуемые белки.

Полученные моноспецифические антисыворотки были проанализированы на идентичность соответствующим коммерческим антй-сывороткам метод ом. преципитации в геле по Оухтерлони.

Ис© полученных антисывороток показал, что каждая антиры-воротка образует одну, линии преципитации со стандартной плазмой крови человека, причем зона линий преципитации каждой из ' * антисывороток с соответствующим 'антигеном соответствует данным ' литературы. . •

Титр антисывороток, определенный методом РИД по Манчини, составил: 1:12 - 1:25 для компонента СЗ, 1:10 - 1:35 для компонента С4 и 1:5 - 1:12 для компонента С5.

5. Оценка уровней компонентов СЗ, С4, С5 в' популяции здоровых доноров России. До настоящего времени в современной отечественной научной литературе отсутствуют данные по содержанию многих белков сыворотки крови человека, в том числе и компонентов CK. Данные зарубежных авторов о нормальных сывороточных концентрациях компонентов комплемента неоднозначны, и иногда весьма различны. Так, по данным Porter and Reíd (1979) и Lachman (1979) средние концентрации компонентов комплемента в сыворотке крови составляют : для конпонёнта СЗ - 1500 мкг/мл, для компонента С4 - 450 мкг/ ил, для компонента- С5 - 75 мкг/мл. Диапазон колебаний нормальных сывороточных концентраций компонентов комп-

лемента, представленных Schur (1985), составляет для СЗ - 9101960 мкг/мл, а для С4 - 260 - 830 ккг/мл, что вполне согласуется с данными, приведенным выпе. В то же время диапазон колебаний нормальной сывороточной концентрации компонента С5 по. Schur (1986) составляет 110-230 мкг/мл, т.е. средняя концентрация компонента С5 по Porter (1979) и Lachman (197S) оказывается в 1.5 раза ниже нижней границы нормы, приводимой Schur (1985).

Учитывая вышесказанное, а также в связи с тем, что европейские нормы в силу ряда генетических, географических, экологических -и социально-экономических факторов отличаются от таковых для России, мы исследовали диапазон колебаний концентраций компонентов CK - СЗ, Р4.С5 - и определили их средние значения в популяции здоровых доноров России.

В сыворотках 61 здорового донора, из них - 32 мужчины и 29 хенадш, в возрасте от 18 до 53 лет определены уровни компонентов СЗ, . С4 и CS методом РИД'с, использованием собственных моноспецифических антисывороток . и белкового стандарта фирмы "Behringvrerke" с известным содержанием указанных белков. Полученные " данные представлены в таблице 3. Таблица 3. Средние значения уровней компонентов СЗ, С4, С5 здоровых доноров.

величина/компонент СЗ С4 С5

среднее значение, г/л, п-61 1 1.581 0.395 0.339

максимум, г/л 2.515 0.737 0.691

минимум, г/л 0.839 0.176 0.175

станд. отклонение 0.361 0.137 0.101

После разбивки всей группы доноров по. подгруппам по возрастам обнаружено, что максимальные концентрации всех 3-х исследованных белков имели место у лиц до 20-летнего возраста. Некоторый подъем концентраций С4 в С5 после 50 лег отражает, по-видимому, гормональную перестройку организма в климактерическом периоде .

Не выявлено достоверных различий в концентрациях компонентов СЗ, С4, С5 у мужчин и женщин .

Учитывая'то, что возрастная структура и распределение по полу случайно выбранной нами группы здоровых доноров соответствовали таковым в популяции взрослого населения России, опре-,

деленные нами средние значения компонента. СЗ - 1.531+0.351 г/л, компонента С4 0.395+0.137 г/л и компонента С5 -0.339+0.101 г/л - были приняты за нормальные. . Пул исследованных донорских сывороток использовали для приготовления стандарта с известным содержанием компонентов СЗ, С4 и С5.

6. Определение компонентов СЗ, С4, С5 у больных., ревматоидным артритом..

Для оценки клинического значения компонентов СЗ, С4, С5 при ревматоидном артрите было проведено определение концентраций 3-х названных компонентов в сыворотках, крови больных РА. Диагностика, заболевания.варьировала от. нескольких, месяцев до 36 лет. Активность заболевания 2-й. и'3-й степени наблюдалась' у. 78% больных, 5QZ больньк.имели 3 и 4 стадии, боле'зни и у.912.продлялись в той или иной степени функциональные нарушения опорно-двигательного аппарата. Больные получали различную терапию: нестероидную противовоспалительную, коргикостероидную, иммунс-супрессорную, а также на фоне 3-х груш вышеперечисленных препаратов тиоловые производные (купренид), хинолиновые (делагил, плаквенил) и антибиотики. Группа состояла из 19 больных. Данные приведены в таблице 4.

Таблица 4. Содержание компонентов СЗ; С4, С5 .

в сыворотках крови больных ревматоидным артритом.

Группа Содержание компонентов, мг/мл

СЗ С4 С5

Больные (п-19) 2.036 " ' 0.725" "" 0.455

станд. отклонение 0.714 0.396 0.233 ~

Норма (п-61) 1.581 0.395 0.339 .

станд. отклонение 0-.361 0.137 0.101

Больные', X от нормы ' 129 184 134

Отличие от нормы Р< 0.001 0.001. • 0.003.

Следует также отметить более значительное увеличение, концентрации С4 - до 134% от нормы, при. том что выявленные максимальные уровни компонентов СЗ и С5 составляют 129%. и 134% от-нормы.- Возможно, значительное повышение уровня С4 подчеркивает связь патогенеза РА и генетических характеристик С4 как маркера предрасположенности к РА. '

Полученные данные свидетельствуют о достоверном повыше-

нии содержания этих компонентов комплемента в сыворотке больных РА , что согласуется с данными, полученными ранее о повышении активности этих комлоаентоз в крови больных" ревматоидным артритом (Л.В. Козлов, 1994)..

Учитывая значимость СК в патогенезе аутоиммунных заболеваний и анализируя полученные нами данные и данные литературы, становятся ясными важность и необходимость' определения комплементарного статуса (как количественных, так и функциональных показателей его) на более ранних этапах мониторинга больного РА - уже при первичном обследовании в поликлинике до назначения терапии. Я наконец, наиболее ценную информацию можно получить в динамике при обследовании одних и тех же больньзс.

■ ' I .у• ■'

7. Изучение статуса комплемента и его изменений- при-, терапии атеросклеротических . поражений сетчатки глаза.

Изучение состояния СК при атеросклерозе является предметом исследований многих авторов, но определение статуса комплемента, некоторых его важнейших белков, в том числе компонентов СЗ, С4 к С5, к его -изменений под воздействием проводимой лекарственной терапии не описано.

Проведены исследования активности и содержания компонентов СЗ, С4, С5 у 25 больных- ангиосклерозоы сетчатки (12 мужчин и 13 .женщин). Все обследованные _ больные бшш_разбиты на 2 .. группы. Первая группа - 15 больных, из них - 7 мужчин и 8 женщин, средний Бозрасг 65+12 лет (от 49 до 85 лег). Вторая группа - 10 больннх, из ких - 5 мужчин, 5 женщин, средний возраст 60+8 лет (от 51 до 70 лет). .

Группы сформированы по клиническим характеристикам.-" пер- ■ вая груша представлена больными с обширными, грубыми атероск-лерогическими изменениями на глазном дне, а вторая - больными с начальными проявлениями ангиосклероза на глазном дне.

Полученные данные приведены в таблице 5. Как следует из данных, приведенных ; в таблице 5, "в первой груше достоверно повышена активность компонентов СЗ, С4, С5 , содержание компонентов СЗ к С4 и удельная активность компонентов СЗ и С5 по сравнении с нормой. Во'второй группе активность компонентов СЗ, С4, (й как в норме, достоверно повышено содержание компонентов СЗ и С4 и снижена удельная активность компонентов СЗ, С4, С5.

Таблица 5. Содержание и гемолитическая активность компонентов СЗ, С4 и С5 у двух групп больных ангиосклерозом.

Группа ■ Функц. -активность тем.ед./мл Концентрация мг/мл Уд. активность гем.еД./ мг

СЗ С4 С5 СЗ С4 С5 СЗ С4 С5

1 группа п-15 ст. откл. 162 141 162 118 65 118 2.204 1.666 0:328 0.404 0.477 0.105 73 146 * 528 46 115 341

2 группа п-10 ст.откл. 58 "58 45 13 29 17 2.342 1.169 0.376 0.309 0.553 0.093 25 65 129 6 51 67

р< 0.02 .0.001 0.006 н.д. н.д. н.д. 0.004 0.05 0:002

Норма -К ст. откл. 60 62 '77 33 41 51 1.581 0.395 0.339 0.361 0.137 0.101 38 157 227. 23 117 165

1 гр.- N Р< t . t t 0.001 0.001 0.001 t » 0.001 0.001 Н.Д. t t 0.001 н.д. 0.001

2 гр.- N Р< * н.д. н.д. 0.05 f t 0.001 0.001 н.д. i \ í 0.09 0.02 0.07

Таким образом, иовиекннй уровень СЗ и С4 характеризует заболевание (адгиосклероз сетчатки), однако, тяжесть поражения определяется активностью СЗ,'" С4 и С5, т.е. тяжелое заболевание характеризуется повышении "оборотом" этих компонентов в' организме, что может быть обусловлено одновременным наличием повышенного биосинтеза, и гиперкагаболизма.

Полученные данные позволяют высказать предположение о том, что лечение ангиосклероза сетчатки глаза целесообразно проводить с использованием средств воздействия на СК, как это делается*, например, при ревматоидном артрите, где комплемент также проявляет свою патогенетическую роль (Л.В. Козлов, 1994). •

Нами были подобраны 2 группы больных после проведения курса лечения, ангиопротекторами. Первая группа состояла из 9 человек (5 мужчин и 4 женщин) в возрасте от 60 до 85 лет. Больные проходили курс лечения никотиновой кислотой.

Поскольку, как будет показано далее, на статус комплемента оказывала существенное влияние терапия никотиновой кислотой, для сравнительной характеристики связи содержания компонентов и тяжести заболевания была отобрана группа, не получавшая терапии никотиновой кислотой. Эта, вторая,.группа боль-

ных, получавших различные ангиопротекторы (аскоругин, трентал, пиридоксин, диакарб и др.) либо не получавших терапии, состояла из 16 человек (10 мужчин и б женщин) в возрасте от 53 до 86 лет.

У пациентов обеих групп были определены концентрации компонентов СЗ, С4 и С5. Результаты представлены в таблице 6. Таблица 6. Влияние терапии никотиновой кислотой на состояние системы комплемента больных ангиосклерозсм.

Группа Концентрация компонентов, мгЛи

- СЗ С4 С5

Без никотиновой кислоты, п-16 станд. отклонение отличие от N. Р< 1.856 " 0.641 0.03 ' 0.714 0.449 0.001 0.363 0.171 н.Д.

Терапия никотиновой кислотой, п-9 станд. отклонение отличие от N. Р< 1.560 0.395 и.д. 0.689 0.228 0.001 0.383 0.119 Н.Д.

Норма (Ю, п-51 станд. отклонение 1.581 0.361 0.395 0.137 0.339 0.101

Как" видно из таблицу 6, . терапия никотиновой . кислотой оказывает существенное влияние на состояние СК. У больных, получавших лечение никотиновой кислотой, ш наблюдали нормализацию уройня компонента CÓ. ' Концентрация компонентов С4 и С5 не изменялась после лечения. ,

В связи с вышесказанным интересно было посмотреть, как изменяется содержание и'гемолитическая активность компонентов СЗ, С4, С5 в динамике у больных - до и после терапии никотиновой кислотой. Исследование проведено у 3-х пациентов, результаты представлены на, рисунке 4.

Как видно на рисунке 4, после лечения наблюдается снижение как концентраций компонентов комплемента, так и их гемолитической активности. В настоящее время трудно отдифференцировать, влияет ли терапия никотиновой кислотой па саму систему комплемента и снижение активности и концентраций компонентов СЗ, С4, С5 комплемента обусловливает терапевтический эффект иле снижение активности комплемента определяется улучшением состояния больного под влиянием терапии. Для этого необходимо проделать специальные исследования in vivo и in vitro по кау-

ченко влияния самой никотиновой кислоты на СК как такоБуп и на еэ биосинтез. Однако, быстрота изменения комплементарного статуса больного после начала терзпии скорее всего свидетельствует о прямом воздействии никотиновой кислоты на систему комплемента и каскад реакций системы.

Рисунок 4.' Динамика содержания и гемолитической активности ¡компонентов СЗ, С4 и С5 у больных ангиосклерозом до (я) и после (и) терапии никотиновой кислотой. _

' Активность, геыед.

Содержание, кг/мл

Практическое значение определения уровней компонентов комплемента и их активностей в сыворотке больных ангиосклерозом сетчатки глаза представляется следующим: х 1) появляется возможность обосновать назначение препаратов, .обладающих.юя/уномоду .пирующей,активностью», способных воздействовать на систему комплемента, угнетая ее активность;

2) определение концентраций и активностей компонентов до и после курса лечения может помочь в оценке эффективности'проведенной терапии;

3) снижение уровней и активностей компонентов пра терапии никотиновой кислотой позволяет считать её применение весьма целесообразным яри выборе курса лечения склеротической макуло-дистрофии.

?

ВЫВОДЫ

1. Предложены оригинальные - схемы выделения, компонентов СЗ, С4 и С5 из сыворотки (или плазмы)- крови- человека.

2.'-Показана возможность осуществления принципа безотходной технологии в производстве препаратов'крови по методу Кона путем создания технологической схемы фракционирования балластного осадка IV-! для получения компонентов СЗ, С4 и С5 компле-

- 20 -

мента человека в виде иммунохимически чистых антигенов.

3. Получены моноспецифические антисыворотки к компонентам СЗ, С4 и С5 комплемента человека путем иммунизации чистыми антигенами. '

4. Определены нормальные уровни компонентов СЗ, С4, С5 комплемента в популяции здоровых доноров России.

5. Показано достоверное повышение концентраций компонентов СЗ, С4, С5 в сыворотке крови больных ревматоидным артритом.

6. Показатели комплементарного статуса в сыворотке крови больных ангиосклерозом сетчатки глаза - концентрации компонентов СЗ, С4, С5 и их гемолитическая.активность - являются чувствительными критериями активности аутоиммунного процесса и адекватности терапевтических мероприятий.

РАБОТЫ, 0ПУБЛИК03АННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Матвеевская Н.С., Алешгаш.В.А. "Способ выделения СЗ компонента' комплемента" (положительное решение N 5045791/14 (018006) от 30. 08. 93г.)

2. Матвеевская Н.С., Алешкин В.А. "Способ выделения С4 компонента комплемента" (приоритетная справка N 94025651 от 25.07.94г)

3. Мазвеевкая Н.С., Алешккн В.А. "Способ выделения С5 компот нента комплемента" (приоритетная справка N 94025526 от 25.07. 94г.);

4. N.S. Matveevskaya, V.A. Alyoshkin . Isolatoin of СЗ component and its C3b submit from' IV-1 fraction by Cohn's fractionation of human blood plasma //Bio-Chromatography and Bio-engineering, V-th Symposium of the European Society for Bio-Chrcratography, Nancy, France - May 17-19, 1994, P40, abstracts.

5. Matveevskaya . N.S., Alyoshkin V.A. Complement system (CS) state in acute phase rheumatoid arthritis (RA) // International Journal of iimninorehabilitation, 1994, N.l, supplement, p.229-230. Abstracts of the I international congress on immunorehabilitation. .

6. N.S. Matveevskaya, V.A. Alyoshkin, W.N. Rozina. Isolation of C3 complement component and its C3d subunit from IV-1 fraction of Cohn's fractionation of human plasma // Journal of

Chromatography В:. Biomedical applications, (1994), in press.

Материалы диссертации додолены на 5-м Симпозиуме Европейских сбцесгв . биохромагографии в Нанси (Франция) "Bio-Chromatography and Bio-Engineering" (1994 г.), конференции молодых ученых МНИИЭМ им. Г.Н.4 Габричевского "Актуальные проблемы эпидемиологии, диагностики и клиники инфекционных заболеваний" (Москва, 1991 г.).

\