Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Поликлональные антитела как реагенты для иммуноанализа: Получение, характеристика, применение

Т6 од

' ' '-'1:8 (9.%' На правах рукописи

РАТНЕР Галнна Моисеевна

ПОЛНКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА КАК РЕАГЕНТЫ ДЛЯ НММУНОАНАЛИЗА: ПОЛУЧЕНИЕ. ХАРАКТЕРИСТИКА, ПРИМЕНЕНИЕ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Томск 1956

Работа выполнена в Томском ордена Трудового Красного Знамени научнс-исследовательском институте вакцин и сывороток НПО "Вирион" Минздравмедпрома РФ

Научные консультанты: член-корреспондент АН ВШ, доктор мед. наук, профессор П.В.Федоров

академик РАМН, доктор мед. наук, профессор Р.С.Карпов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, член Нью-йоркской академии наук В.А.Алешкин доктор химических наук, профессор Б.Б.Дзантиев доктор медицинских наук В.Н.Мигунов

Ведущая организация - Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича

Защита состоится " 33 "среуаил 1996 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 001.3801 при Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова Академии медицинских наук РФ по адресу: 103054. Москва, пер. Мечникова, д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова Академии медицинских наук РФ.

Автореферат разослан " ^ " М 199^г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медициною« наук

Н.Г.Кудрявцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Развитие и расширение арсенала методов исследования является непременным условием прогресса любой науки. Иммунология в этом отношении занимает особое место, поскольку иммунологические методы, в основе которых лежит ви-сокоспецифичное взаимодействие антител с антигенами, нашли •,и-рокое распространение не только в различных областях медицины, но и в тех научных и прикладных исследованиях, где требуется индикация любых биоорганических субстанция (вирусов, бактерии, клеток, белков, гормонов, лекзрств и других биологически активных вещестЕ], т.е. в молекулярной биологии, вирусологии, биоорганической химии, микробиологической, лекарственной и пищевой промышленности, сельском хозяйстве и многих других смежных отраслях.

Последние десятилетия стали периодом бурного развития принципиально новых аналитических систем, которые постепенно приходят на смену рутинным трудоемким, малопроизводительным и недостаточно чувствительным иммунологическим методам, основанным на феноменах агглютинации, преципитации, связывания комплемента и т.п. Современные иммунохимические методы также основаны на специфическом связывании антигенов антителами, но. кроме того, они предполагают применение специальных маркеров, которые позволяют регистрировать минимальные количества образовавшихся в результате реакции иммунных комплексов с высокой чувствительностью. Наиболее успешно в качестве маркеров используются радиоактивные изотопы, ферменты, флуоресцирующие красители, спин-активные соединения. В' зависимости от применяемой метки данные методы делятся на радиоиммунные (РИА), имму-ноферментные (ИФА), поляризации флуоресценции и др. Их явные преимущества заключаются не только в высокой чувствительности и уникальной специфичности, но и в применении инструментального учета результатов, что существенно повышает точность анализа и обуславливает возможность его автоматизации для проведения массовых исследований, а так».а в сранительной простоте и экспрессности методов (Т.Чард. 1981; А.С.Аметов, 1982; Ь.М.Гав-рилова, 1982; Б.Б.Дзантиев, A.M. Егоров. 1982; Р.В.Петров, И. В. Березин, 1982; А.М.Егоров. 1983, 1988; Кэрстак. 1985; С.А.Еремин, 1989; Н.С.Старовойтов, Е.В.Чуфарова, 1995 и др.).

Ключевыми реагентами любой системы иммунологического ана-

- г -

лиза являются антитела, качество которых, их специфичность, активность и аффинность, во многом предопределяет основные аналитические параметры методов, особенно таких высокочувствительных. как РИА, ИФА и т.п. (А.Г.Резников, 1980: Т.Чард. 1981; A.C. Munro. 1981: Б.Б.Дзантиев. А.М.Егоров. 1982; Н.В.Ливень. 1986 и др.).

В настоящее время при разработке различных диагностических наборов в качестве реагентных антител используются как по-ликлональные антчсыворотки, полученные путем иммунизации животных-продуцентов (или выделенные из них имм^.юглобулиновые фракции и аффинные антитела), так и моноклональные антитела (МКАТ), являющиеся продуктом гибридомной технологии. И те. и другие имею" свои преимущества и недостатки.

Поликлональные антитела (ПКАТ) весьма гетерогенны по своим свойствам, поскольку образуются в результате функционирования различных клонов иммунокомпетентных клеток; кроме того, несмотря на то, что технология их получения развивается уже более 100 лет. и этот процесс непрерывно совершенствуется, так и не выработано общих правил, гарантирующих положительный результат иммунизации, поэтому в каждом конкретном случае перед исследователем встает проблема выбора оптимальных условий получения пригодных для иммуноанализа антисывороток к данному конкретному антигену.

Основными достоинствами МКАТ являются их однородность по специфичности, аффинности и изотипу. а также возможность получения реагентов с заданными, стандартными Физико-химическими характеристиками в ■ неограниченных количествах (G. Kohler. С.Ullstein, 1975; О.В.Рохлин. М.Н.Петросян. 1982; Б.Б.Фукс с соавт., 198о; Falkenberg е.а. .1984 и др.). Тем не менее, эти их безусловные пре -мущества перед ПКАТ. по мнению ряда авторов (P.Mancal. 1983; R.H. Yolken. 1983; Н. В.Пивень. 1986). нередко обуславливают и ограничения для применения МКАТ в иммуноанали-зе, в частности, указывается на их слабую аффинность, неспособность преципитировать поливалентные антигены в силу соей моноспецифичности, а также на то. что весьма рысокая избирательность МКАТ может затруднить обнаружение с их помощью антигенов со сложной структурой, особенно, если она имеет тенденцию к вариабельности (как, например, у вируса гриппа). Поэтому нередко рекомендуется использование смеси нескольких МКАТ. ли-

бо их комбинации с ПКАТ. либо вообще отдается предпочтение последним (P.Mancal. 1983; H. В. Ливень. 1Э86; А. К. Барсуков с соавт.. 1990).

В настоящее Бремя различные модификации РИА, ÎÎ ГА и других современных видов иммунологического и иммунохимического ан- п.и-зов. основанные на применении как поли-, так и моноклинальных антител, широко используется для диагностики инфекционных и паразитарных болезней, эндокринной, сердечно-сосудистой, онкологической и другой соматической патологии, при углубленной характеристике иммунного статуса здоровых и больных людей, а также для обнаружения возбудителей в объектах внешней среды, контроля банков крови и биологических препаратов (А.С.Аметов. 1982; Е. Н. Гаврилова, 1982; Б. Б. Дзантиев. А.Н.Егоров. 1982;

B.И.Покровский, Б.Ф.Семенов, 1982; А.Н.Егоров. 1983. 1988;

C.А.Еремин. 1989; Л.Н.Падюков, Б.Ф.Семенов. 198Э; В. И. Покровский, C.B. Шаба лина, 1989; P.M.Темпер. 1989). Зарубежные фирмы выпускают для этой цел:! очень широкий набор препаратов, в пос ледние годы данная отрасль биотехнологии усиленно развивается в России и в других странах СНГ. В рамках этого процесса перед нами и были поставлены задачи разработки и промышленного внедрения иммунореагентов и тест-систем различного назначения на основе поликлональных антител.

Цель работы. Научное обоснование и разработка оптимальных методов получейия поликлональных антител к некоторым биологически активные веществам и изучение возможности их использования в различных методах иммуноанализа.

Работа выполнялась по заданию Министерства здравоохранения СССР. Некоторые ее разделы выполнялись в рамках общесоюзной научо-техническоЛ проблемы 0.69.07 "Иммунология и медицинская генетика".

Основные задачи исследования, В соответствии с поставленной целью решались следующие основные задачи:

1. Отработать оптимальный режим иммунизации морских свинок инсулином с целью получения активной антисыворотки, пригодной для радиоиммунного и иммугоферментного методов определения данного гормона в сыворотке крови человека и разработки технологии производства соответствующих наборов.

2. Получить активную кроличью сыворотку против миоглобина человека, пригодную для создания экспресс-метода диагностики

инфаркта миокарда с применением радиоиммунного анализа на мп-оглобин.

3. Разработать схему иммунизации кроликов сердечным тро-понином С. обеспечивающую получение высокоактивных антител к данному кальций-связывающему белку: с использованием полученных реагентов разработать иммуноФерментный . метод определения сердечного тропонина С в модельных опытах и в биологическом материале.

4. Получить кроличьи антисыворотки к ангиотензинам I и II. изучить возможность их применения для разработки иммунофер-ментных методов выявления этих биологически активных веществ.

5. Разработать оптимальную схему получения кроличьей антисыворотки ч антигенам марит Ор^ШогсМэ ГеПпеиз и изучить ее пригодность для создания иммуноферментного метода диагностики острого и хронического описторхоза.

6. Получить высокоспецифичные препараты антител к фрагментам иммуноглобулинов й человека и кролика: использовать эти реагенты для синтеза активных антивидовых иммуноферменткых конъюгатов. пригодна для оценки активности в 1М>А кроличьих антисывороток к различным биологически активным веществам, а также при титровании сывороток больных людей с различной патологией.

7. На основе поликлональных антител к эритроцитам быка и их строме создать набор иммунореагентов для определения субпопуляций лимфоцитов человека методами розетксобразовгння; п;о-вести клиническую апробацию набора и внедрить его в практику здравоохранения.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований:

- предложена птимальная схема иммунизации морских свинск инсулином, позволяющая стабильно получать высокоактивные антисыворотки: методами радиоиммунного и иммуноферментного анализов изучены свойства полученных препаратов: их.активность, аффинность и специфичность: показана пригодность препаратов для разработки и промышленного выпуска РИА-наборов гчя определения данного гормона в сыворотке крови человека с целью диагностики и оценки эффективности лечения сахарного диабета:

- впервые детально отработана схема получения кроличьих антисывороток к миоглобину человека; изучены их свойства и по-

казана пригодность для создания радиоиммунного метода определения миоглобина в сыворотке кроЕИ человека экспресс-методом с целью диагностки инфаркта миокарда;

- впервые изучена эффективность различных схем иммунизации кроликов сердечным тропонином С; предложена рзционал'чая схема, позвс-.яющая получать антисыворотки с высоко!! активностью, аффинностью и специфичностью; препараты этих антител использованы при апробации различных вариантов ИФА для определения данного биологически активного вещества; в сравнительных исследованиях показаны преимущества конкурентного авиднн-био-тинового метода определения сердечного тропонина С в модельных опытах; проведена клиническая апробация выбранного метода, которая показала принципиальную возмолшость его применения для количественного определения данного маркера повреждения сердечной мышцы с целью усовершенствования диагностики инфаркта миокарда и оценки тяжести его течения;

- в сравнительных опытах изучена эффективность нескольких схем получения кроличьих антисывороток к ангиотензинам I и II; исследованы свойства данных реагентов и возможность их использования при разработке иммуноферментных методов выявления этих биологически активных веществ; показана принципиальная возможность применения авидин-биотинового варианта ИФА для количественного определения ангиотензина I в модельных опытах; отработаны условия конкурентного ИФА с применением авидин-биотиновой системы для выявления нормальных и повышенных концентраций ангиотензина II в модельных опытах;

- разработана оригинальная схема иммунизации кроликов комплексным антигеном из марит 0. ГеИпеиз. позволяющая значительно гократить затраты антигенного материала и сроки .получения высокоактивных реагентов (приоритетность исследований защищена авторским свидетельством на изобретение N 1767974 от 8 июня 1990 г.); изучены свойства полученных антиопнсторхозных сывороток в ИФА: с использованием данных реагентов апробированы различные иммуноферментные методы выявления антигенов О.ГрИпеиз в модельных опытах: показана принципиальная возможность применения для этой цели конкурентного ИФА. основанного на авидин-биотиновом взаимодействии, который после проведения клинических испытаний может быть рекомендован в качестве дополнительного чубствит°льного теста с целью усовершенствования

диагностики описторхоза, особенно при слабой степени инвазии.

- научно я экспериментально обоснована технология получения антител к 1еС (ГаЬ/Т(аЬ)£) и (Гс) человека и кролика, а также к легким цепям иммуноглобулинов человека; впервые разработаны способы получения иммунной асцитической жидкости белых кышей, содержащей антитела к фрагментам 1£С человека и кролика и к Ь-цепям иммуноглобулинов человека; установлена возможность использования всех указанных реагентов для получения высокоактирных и специфичных антивидовых или класс-специфических икмуноф^рментных конъигатов;

- подобраны оптимальные способы получения кроличьих антисывороток к эритроцитам быка и их отроме; научно и экспериментально обоснованы методы приготовления из этих антисывороток препаратов ¿ля идентификации методами, розе!кообразовання имму-норегуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов (Т^-хелперов/индукто-ров и Т^-супрессоров/эФФекторов), а также В-лимфоцитов; проведена широкая клиническая апробация разработанного набора реагентов, показана его пригодность для характеристики иммунного статуса здоровых лиц и больных с различной патологией.

Практическая ценность работы- Материалы исследований по получению антиинсулиновых сывороток вошли в технологическую документацию на "Набор реактивов для радиоиммунологического анализа инсулина с использованием радионуклида 1-125 (РИА-ИНСУЛИН- 1-1 25)"; 11 серий препарата, приготовленных на базе лаборатории иммунохимии ТомНИИВС НПО "Вирион". использованы ::ри промышленном выпуске указанных наборов на Ташкентском хозрасчетном опытном предприятии "Ралиопрепарат" Института ядерной Физики АН Узбекистана.

Материалы по получению кроличьей антисыворотки к миогло-бину вошли в экспериментально-производственный регламент И 6887 на "Сыворотку диагностическую миоглобиновую для радиоиммунного анализа сухую" (утвержден МЗ СССР 20 июля .987г.). а также в ТУ 42-20-86 на "Набор реактивов для радиоиммунологического анализа миоглобина с использованием радионуклида 1-125 'РИА -МИ0ГЛ0БИН-1-125)" (утверждены МЗ СССР 2 июля 1987 г.) и инструкцию по применению набора (рекомендована комиссией по реактивам Комитета по новой медицинской технике КЗ СССР - протокол N 1 от 26.02.86 г.).

Препарат использовался при выпуске коммерческих наборов

"РИА-миоглобин-1-125" на базе хозрасчетного опытного предприятия "Радиопрепарат" Института ядерной физики АН Уасср.

Результаты исследования по разработке методов получения поликлональных антител к фрагментам иммуноглобулинов человека и кролика вошли в следующую технологическую документацию:

- "Инструкция по изготовлению и контролю антисывороток к IgG (Fab) и IgG (Fc) человека для лабораторных исследований" (утверждена директором Томского НИИ вакцин и сывороток 5.11.1985 г. и директором НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН 29.02.1988 г.);

- "Инструкция по изготовлению и контролю антител против Fab-. F(ab'),}- и Fc-фрагментов иммуноглобулина G кролика для лабораторных исследований" (утверждена директором Томского НИИ вакцин и сывороток 25.12.1987 г.);

- Временная фармакопейная статья К 301 ВС-91. экспериментально-производственный регламент N -337-91 и инструкция по применению (утверждены МЗ СССР 24.09.1991 года) на "Тест-систему иммуноферментную для определения аутоантител к миоглобину"

- Временная фармакопейная статья н 383 ВС-93. экспериментально-производственный регламент К 426-93 и инструкция по применению (утверждены МЗ Pi 15 карта 199? года! на "Тест-систему иммуноферментную для выявления igM к Oplsthorchls fellneus"; освоен промышленный выпуск данной тест-системы на базе предприятия по производству бактерийных и вирусных препаратов НПО "Ви'^ион" (г.Томск):

- Временная фармакопейная статья, дополнение к экспериментально-производственному регламенту К 426-93 и инструкция по применению на "Тест-систему иммуноферментную для выявления IgG к Oplsthorchle fellneus" (документация находится на утверждении) .

- Временная фармакопейная статья, экспериментально-производственный регламент и инструкция по применению на "Тест-систему иммуноферментную для определения иммуноглобулинов класса М человека к вирусу клещевого энцефалита (документация находится на утверждении).

- Временная фармакопейная статья, экспериментально-производственный регламент и инструкция по применению на "Тест-систему иммуноферментную для определения иммуноглобулинов класса G человека к вирусу клещевого энцефалита (документация находится на утверждении).

Утверждена технологическая документация на "Набор иммуно-реагентов для определения субпопуляций лимфоцитов человека": Временная фармакопейная статья И 42-205 ВС-89; регламент производства Н 170-89 и инструкция по применению (утверждены МЗ.СССР 6 марта 1989 года); налажен серийный выпуск набора на базе лаборатории иммунохимии ТомНИИВС НЛО "Еирион".

Таким образом, проведенные комплексные исследования позволили научно и экспериментально обосновать перспективные подходы к получение на основе поликлональных антител различной специфичности реагентов, пригодных для разработки современных высокочувствительных методов диагностики некоторых эндокринных, сердечно-сосудистых к паразитарных заболевании, а также для характеристики иммунного статуса человека.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Необходимость выбора оптимальной схемы иммунизации морских свинок инсулином, обеспечивающей стабильное получение активных антисывороток, подробной характеристики данного препарата методами радиэиммунного и иммуноФерментного анализов, его использования в РИА-наборах для определения инсулина.

2. Целесообразность разработки метода получения кроличья сывороток против миоглобина человека, изучения их свойств, создания на основе полученных реагентов радиоиммунного экспресс-метода определения миоглобина с целью диагностики инфаркта миокарда.

3. Необходимость научного и экспериментального обоснования оптимальных с::ем иммунизации кроликов сердечным тропонином С. подробной характеристики свойств полученных антител и изучения их пригодности для создания чувствительного иммуноФерментного метода количественного определения данного специфического маркера -.овреждения сердечной .' мышцы с целью усовершенствования методов диагностики инфаркта миокарда.

4. Целесообразность изучения эффективности различных схем иммунизации кроликов с целью получения антисывороток к ангио-тензинам I и II и исследования возможности разработки иммуно-ферментных методов определения указанных биологически активных веществ с применением полученных реагентов.

5. Необходимость разработки эффективного способа получения антисыворотки к антигенам марит Ор^ГюгсМз ГеИпеи?,. подробного изучения ее свойств и исследования возможности при-

менения данного препарата для создания иммуноферментного метода диагностики описторхоза.

6. Необходимость получения поликлональных антител к Фрагментам иммуноглобулинов человека и кролика путем иммунизации животных различных видов, иммунохимической характеристики /"ш-ных реагентов и изучения возможности их применения при синтезе иммуноферментных кoнъюгarcJ различной специфичности.

7. Научное и экспериментальное обоснование выбора оптимальных схем иммунизации кроликов эритроцитами быка и их строкой. разработка технологичных методов получения из данного сырья реагентов для идентификации методами розеткообразования В-лимфоцитоз и иммунорегуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов (Т^-хелперов/индукторов и Т^-супреосоров/эффекторов). изучение возможности применения данных препаратов для оценки иммунного статуса здоровых людей и больных с различной патологией.

Апробация диссертации. Основные положения диссертации доложены на:

1. Всесоюзной конференции "Иммунология атеросклероза и ишемической болезни сердца" (Томск. 1985 г.).

2. 1У Всесоюзном симпозиуме "Нейрогуморальная регуляция иммунного гомеостаза" (Ленинград, 1936 г.

3. 2-м пленуме правления ВНОМЭП им. И.И.Мечникова "теоретические проблемы эпидемиологии и инфекционной иммунологии на современном этапе" (Нальчик. 1986).

4. 1У Вс ;союзной конференции "Адаптация человека к клима-то-географическим условиям и первичная профилактика" (Новосибирск, 1986 г.)..

5. Межинститутской научной конференции, посвященной 80-летию Томского НИИВС (Томск. 1986 г.).

6. Всесоюзной научной конференции "Актуальные вопросы биотехнологии" (Ленинград, 1987 г.).

7. Научной конференции "Экспериментальная и клиническая иммунология на востоке страны" (Красноярск, 1988).

8. Первом Всесоюзном съезде иммунологов (Сочи, 198Ь).

9. Научной конференции "Гельчинтозоонозы - меры борьбы и профилактика (Москва, 1994 г.).

10. 3-й научно-практической конференции "Актуальные вопросы гастроэнтерологии" (Томск. 1995 г.).

Кроме того, материалы диссертации докладывались на итого-

вых научных конференциях ТомШШВС и ТМИ (Томск. 1983. 1984. 1987. 1988 г.г 1.

По теме диссертации опубликовано 66 статей.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 321 стр. машинописного текста, включая 36 таблиц и 32 рисунка. Список литературы содержит 697 источников (404 отечественных и 293 иностранных авторов). Диссертация состоит из введения, двух глав обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, пя^и глав, отрахающих результаты собственных исследований и их обсуждение, общего заключения, выводов, списка цитируемой литературы, приложения и перечня технологической документации, разработанной по материалам диссертации.

Натериз"ы и методы исследований. В качестве животных-продуцентов пслнклональных антител различной специфичности были использованы: 314 кроликов породы шиншилла массой 2.0-3.5 кг. 796 морских свинок массой от 250 до 1000 г. 1000 белых мышей линии Ва1Ь/с массой 14-16 г и 1200 беспородных белых мышей массой 16-18 г. Для иммунизации применялись либо нативные.- либо конъюгированные с белками-носителями антигены производства -различных отечественных и зарубежных Фирм или полученные в на-шер лаборатории^. С целью усиления иммунного ответа использовались полный и неполный адыованты Фрейнда (ПАФ и НАФ соотьетс-, твенно). метилированный бычий сывороточный альбулин (мБСА). градекс. цетиллиридиния хлорид (ЦПХ) и кальций-тартратный гель.

В работе применялись различные методы выделения из натиа-ных сывороток иммуноглобулиноьых фракций, в том-числе солевое осаждение. гель-Фильтрация,ионообменная и аффинная хроматография.

Комплексная характеристика .антисывороток и ' полученных из . них препаратов (определение титров антител, их аффинности и специфичности) осуществлялась методами радиоиммунного и иммунофер-ментного анализов, в реакциях гемолиза (РГ) и .'емагглютинации (РГА). а также с помощью таких иммунохимических и иммунологических методик, как двойная радиальная иммунодиффузия (ДРИ),'. иммуноэлектрофорез (ИЭФ). диск-электрофорез в попиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ). гель-фильтрация в тонком слое сефадекса.

Статистическую обработку результатов экспериментов осуществляли общепринятыми методами, вычисляя среднее арифметическое и его ошибку, величину стандартного отклонения, коэффи-

- и -

циенты вариации, а также достоверность полученных результатов с применением критерия t Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ H ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Разработка рациональных схем получения поликлоналышх антител для диагностики соматических заболеваний

Антисквороткя к инсулину и их применение для диагностики сахарного диабета Известно, что сахарный диабет - широко распространенная патология эндокринной системы - возникает вследствие нарушения функции поджелудочной железы с развитием инсулиновой недостаточности. однако с клинической точки зрения для диагностики данного заболевания нет необходимости в определении в крови уровня самого гормона (за исключением случаев гипогликемии), достаточно знать динамику содержания сахара после перорального глюкозотолерантного теста. Однако измерение концентрации инсулина крайне необходимо для дифференциации разных форм явного сахарного диабета, выбора лечебного препарата и оптимальной схемы его применения, а также дл.<. выяснения патофизиологии заболевания (А. Г. Резников. 1980; Г.А.Ткачева с соавт. .1983 и др.), В рамках работы по созданию отечественных наборов реактивов для радиоиммунологического определения инсулина (основные разработчики - Новосибирский институт органической химии (НИОХ) СО РАН и Ташкентское предприятие "Радиопрепарат "Института ядерной физики АН, Узбекистана) перед нами была поставлена задача получения пригодных для этих целей антиинсулиновых сывороток.

При выборе наиболее рационального метода получения антиинсулиновых сывороток было установлено, что из семи апробированных режимов иммунизации морских свинок инсулином наиболее эффективной оказалась схема, предложенная J.Havrankova & J.-L. Petit (1984). которая предусматривала три подкожных дробных инъекции антигена на 1, 40 и 60 дни опыта в дозе 0.5 мг на свинку; для первой иммунизации, соответственно рекомендациям авторов, масляную Фазу (вазелиновое масло и ланолин в соотношении 7:3) соединяли с водной Фазой (раствор инсулина в 0,3 ï-ной фенольной воде. рН 2,3 + ПАФ в соотношении 7:3) а перемешивали до образования эмульсии: для остальных инъекций раствор

- 12 -

инсулина смешивали с равным объемом НАФ.

Предложенная нами упрощенная модификация этой схемы, по которой первую иммунизацию осуществляли путем введения иммуно-гена, полученного простым смешиванием равных объемов раствора инсулина в О,3%-ной фенольной воде и ПАФ. практически обеспечивала аналогичные результаты.

Используя обе схемы, мы смогли в достаточно короткие сроки (на 10-20 сутки после 3-й инъекции инсулина, т.е. в течение 2,5-3 нес) у 75? продуцентов стабильно получать антисыворотки с титрами в ИФА по конечной точке титрования от 1:320000 до 1:5120000. хорошей связывающей способностью (титры по 502-ному связыванию в РИА у них нередко достигали значений 1:10000 -1:20000. в ::ФА - 1:500000 - 1:1000000) и самой высокой аффинностью (эффективные константы связывания наиболее активных сывороток колебались в пределах от 2.43 до 56.8 х ю'м""')- Важным преимуществом выбранных схем перед остальными оказалась также сравнительно невысокая летальность животных в процессе иммунизации.

При изучении специфичности полученных антиинсулиновых сывороток была проверена степень их кросс-реактивности с проин-сулином. В нашем распоряжении был препарат проинсулина из ВНИИ технологии кровезаменителей и гормональных препаратов со следующими характеристиками: основное вещество (проинсулин) -50,255; инсулин - 8%; прочие (в основном, фрагменты проинсулина и инсулина) - 41.8 X,

Методом конкурентного торможения в ИФА установлено, что антитела к инсулину активно нейтрализуются проинсулгном в диапазоне концентраций от 31 до 2000 нг/мл. при этом процент перекрестных реакций с инсулином колеблется от 100 до 41.73?, несколько снижаясь при использовании в реакции больших разведений антисывороток за счет увеличения в этом случае доли высокоаффинных популяций антител. Такой результат был предопределен па крайней мере двумя причинами: во-первых, антигенной близостью инсулина и его предшественника принсулина. во-гто-рых. тем. что использованный нами препарат.прсчнсулина был в значительной степени загрязнен инсулином и его фрагментами. Данные литературы также свидетельствуют о том. что проинсулин связывается антителами к инсулину в эквимолярном соотношении, причем эта способность у коммерческих антиинсулиновых сыворо-

ток варьирует в различных наборах (J.Havrankova L J.-L. Peilt. 1984).

Если учесть, что нормальное содержание проинсулина в крови составляет оыло 5-1055 от концентрации инсулина (D.F.Steiner, 1969) то, делая соответствующие поправки к расчетам, можно избежать существенного искажения результатов определения инсулина при использовании наших антисывороток. Кроме того, наличие реагентов с двойной специфичностью может представлять интерес при необходимости измерения уровня самого проинсулина в крови, который может быть повышен при инсуломах, а также у больных сахарным диабетом на определенных стадиях заболевания., при .панкреатитах - в тех случаях, когда воспалительный процесс захватывает и эндокринную ткань поджелудочной железы (P. Cuat-recasas. 1976; J.Havrankova & J.-L. Petit (1984). В частности, измерение концентрации проинсулина может быть осуществлено с помощью так называемого ферментативного метода при использовании инсулинспецифическ^й протеазы, расщепляющей молекулу инсулина за определенное время, но не действующей в течение этого же времени на молекулу проинсулина. после чего последний может быть определен радиоиммунным методом (L.K.Staroseltzeva,1978).

Полученные нами по выбраннык схемам иммунизации антиичсу-линовые сыворотки были использованы при разработке на базе лаборатории ультрамикробиохимии НИОХ СО РАН конкурентного радиоиммунологического метода количественного определения данного гормона в сывсротке крови человека. В настоящее время с использованием наших препаратов налажен промышленный выпуск наборов реактивов для радиоиммунологического анализа инсулина "РИА-ИНСУЛИН-1-125"^на Ташкентском предприятии "Радиопрепарат".

Технология получения кроличьих антнсывороток . к миоглобину человека, их характеристика и применение

Одним из наиболее ранних молекулярных маркеров острого инфаркта миокарда является миоглобнн (ИГ) - гемовый протеин, обратимо связывающий и транспортирующий кислород в скелетных и сердечной мышцах (Н. В. Овтрахт с соавт,. 1981; Г.А.Ткачева с соарт.. 1983; А.Ю.Ташматова с соавт., 1986; В.Н.Титов с соавт.. 1993; Н.Г.Шевченко, 1993; В.Тадеушек. 1994).

Для получения сыворотки против миоглобина человека (с целью дальнейшего ее использования для разработки радиоиммун-його метода диагностики инфаркта миокарда) было апробировано 5

различных схем иммунизации кроликов нативным МГ и установлено, что. независимо от способа его введения и интервалов между инъекциями (дозы со всех случаях равнялись 1 мг). активный иммунный ответ формируется только в результате длительного и достаточно модного антигенного раздражения: антитела в крови экспериментальных животных обнаруживаются методом РИА лишь после 4-7 иммунизаций. Сравнительный анализ показал, что наиболее эффективной, позволяющей получать активные антимиоглоби-новые сыворотки "срез 4-5 мес от начала эксплуатации продуцентов, является схема иммунизации, которая предусматривает подкожное вьедение нативного МГ'. смешанного с ПАФ или НАФ. в 1. 21. 31. 71 и 111 дни опыта. Периодические бустер-ингекции МГ при использовании любой схемы позволяли поддерживать достигнутый уровень антителообразования в течение длительного периода.

Изучение аффинности и специфичности самых активных образцов антимиоглооиновой сыворотки (с титрами в РИА по 50Х-ному

связыванию от 1:1280 до 1:1500) показало, что они имеют высо-

to -i

кие значения константы связывания (0.5 - 1.03 х 10 м ) и практически не дают иммунологических перекрестов с сывороточными белкам)! (альбумин. IgG) и гемоглобином. Эти препарата были использованы при разработке на базе лаборатории ультрамик-робиохимии НИОХ СО РАН В.В. Рошке с соавт. (1983.1934) быстрого радиоиммунного анализа на миоглобин, который, после оптимизации всех параметров, имел следующие характеристики: чувствительность - 4,5 нг/мл МГ; наибольшая точность - в диапазоне концентраций 90-1Г5 нг/мл; коэффициент вариации - 4.5%; специфичность анализа - 100л, его достоверность - не кенее 95%. Данный метод позволяет в течение 40-60 мин проводить измерение уровня миоглобина в крови больных в наиболее важном для диагностики инфаркта миокарда диапазоне концентраций (от 5 до 800 нг/мл), поэтому его можно успешно применять для экспресс-диагностики острого инфаркта миокарда, а также для выявления рецидивов заболевания и контроля за ходом его развития и эффективностью лечения.

Получение, характеристика и применение поличлональных антител к сердечному тропонину С

Целью данного раздела работы было создание иммунофермент-ного метода определения сердечного тропонина С (СТС) - специализированного кальций-связывающего белка, входящего в состав

тропонинового комплекса и выполняющего функцию рецептора ионов кальция в сердечной мышце, а также осуществляющего их обмен, транспорт и являющегося (в отличие от МП высокоспецифпчным маркером повреждения миокарда (J.-P. van Eerd и K.Takahashl. 1976; I.Ohtsukl.1980; Y.Onoyama. 1986). Разработка чувствительных и специфичных методов определения белков тропониноього комплекса в периферическс . крови может служить как для изучения функционального состояния скелетных и сердечной мышц при значительной нагрузке, так и для строгой дифференциации повреждения этих мышц. в частности, для диагноза и прогноза острого инфаркта миокарда (P. Cumralns е.а.. 1987; н.A.Katus е.а.. 1989; 1991; J.Malr е.а.. 1991; В.Тадеушек. 1994).

Нами впервые предпринята попытЛа получить антисыворотку к сердечному тропонину С и разработать метод его определения. При иммунизации кроликов этим низксмолекулярным антигеном (м.м. оксло 18500) варьировались не только схемы введения на-тивного СТС, но и применялись различные способы активизации иммунного ответа. В частности, помимо общепринятых адъювантов (ПАФ и НАФ) были использованы и такие стимуляторы антителооб-разования. как мБСА. ЦПХ и градекс. а также, с целью увеличения иммуногенности самого СТС. его конъюгировали с белком-носителем (ЛСА) с помощью глютарового альдегида. Кроме того, был апробирован и такой прием, как практически одновременное внутривенное введение праймированным животным небольших доз натив-ного СТС и предварительно полученной на другой группе кроликов антитропониновой сыворотки.

Из семи изученных режимов иммунизации наиболее продуктивными оказались'Три.

Во-первых, это схема S.KltaJlma е.а (1983). предложенная для получения антисывороток к кальмодулину. согласно которой кролики вначале' иммунизировались 6 раз с интервалом в 7 дней подкожно дробно эмульгированной с ПАФ суспензией нативного СТС (1- нг на инъекцию) в 2%-ном растворе мБСА, затем суспензию СТС с мЕСЛ дваэды вводили внутривенно с 2-недельными интервалами, ->?. реикмунизалю осуществляли каждче 2-3 месяца, чередуя поди' внутривенные инъекции антигенного материала.

Во-зторых, это двухэтапная схема, когда на первом этапе на отдельной группе животных получали антитропониновую сыворотку со сравнительно невысоким титром антител (1:12800), ко-

торую затем использовали при иммунизации основной группы продуцентов. предварительно грундиммунизированных подкожно небольшой дозой (300 мкг) нативного СТС в смеси с ПАФ. а через 3 -4 недели им внутривенно вводилось по 0,2-0.3 мл сыворотки, полученной на первом этапе, и через 5 мин в вену другого уха -СТС в дозе 50 -100 мкг; реиммунизации осуществляли аналогичным образом.

Наконец, это разработанная нами схема, состоящая из основного цикла - 10-11 подкожных дробных инъекций связанного с ЛСА сердечного тропонина С (дозы колебались от 200 до 400 мкг). эмульгированного с ПАФ, с двухнедельными интервалами - и последующих периодических реиммунизаций либо конъюгированным с ЛСА, либо нативным СТС.

Именно последняя схема позволила получить у кроликов наиболее активные антитрс.;ониновые сыворотки с высокими титрами антител в ИФА по конечной точке (их максимальные значения равнялись 1:102400 - 1:154000), хорошей связывающей способностью и аффинностью. Эффективные константы связывания при использовании данной схемы иммунизации по окончании основного курса инъекций АГ достигали максимальных значений: от 3,87 х 103 М*1 до 2.04 х 10'Л.;'1. Таких результатов не удалось достичь ни с помощью мБСА и градекса. ни при применении комбинированного введения СТС с антителами к нему с целью увеличения иммуноген-ности за счет образования иммунных комплексов.

Изучение специфичности антитропгшновой сыворотки по отношению структурно и .функционально родственных СТС белков (скелетный тропонин С человека - STC. сердечные тропонины С быка и свиньи, кальмодулин - КМ) показало, что величина индексов перекрестной реактивности (G.E.Abraham, 1969).существенно зависит от условий постановки анализа. В частности, при малых разведениях сыворотки (1:1000) индекс перекрестной реактивности с STC превышает 100% и выявляются перекрестные реакции с КМ (от 2,3 до 1,435). С увеличением разведения сыворотки перекресты с КМ не обнаруживаются совсем, а индекс Абрахама для STC последовательно снижается, причем следует отметить, что. начиная с разведения сыворотки 1:2000, в интервале концентраций от О до 50 нг/мл STC практически не ингибирует антикардиотропони-новую активность сыворотки, повышение его дозы приводит к увеличению степени нейтрализации, однако его количество, необхс -

димое для полумаксимального связывания активности антител, существенно превышает соответствующее значение для СТС (например. для 50%-ного связывания антител в сыворотке, разведенной 1:3000, STC требовалось в 15,5 - 18.4 - 37.8 раз больше, соответственно при 15 - 30- и 60-минутном контакте с активированной твердой фазой, чем СТС). Минимальные перекресты с STC (1.758) зарегистрированы при разведении .антисыворотки 1:5000 и продолжительности контакта с иммобилизованным СТС - 15 мин.

Поскольку конкурентные кривые для сердечного и скелетного тропонинов в определенном диапазоне концентраций, как правило, параллельны друг другу, можно гог рить о преобладании в сыворотке перекрестной реактивности к STC первого типа (кросс-реактивности). обусловленной гетерогенностью эпитопов антигенов Характер кривых для КМ принципиально иной и свидетельствует о низкой перекрестной активности антитропониновой сыворотки с этим белком.

Снижение перекрестной реактивности антитропониновой сыворотки с STC по мере ее разведения, по-видимому можно объяснить тем. что при малых разведениях в большей степени проявляется активность низкоаффинных популяций антител, которые обычно менее специфичны, при больших разведениях их вклад во взаимодействие с антигеном уменьшается и характер этого взаимодействия зависит от более специфичных высокоаффинь х популяций антител.

Изменение специфичности антитропониновой сыворотки в динамике иммунного ответа изучалось путем постановки реакции нейтрализации. Полученные данные показывают, что в процессе длительной гипёриммунизации кроликов очищенным Г-ТС человека специфичность антисывороток сохраняется примерно на одном уровне: наибольшая активность сыворотки проявляется с гомологичным антчгеном - СТС человека, при этом она совершенно не нейтрализуется КМ. практически не взаимодействует с сердечными тропонинами другой видоий* специфичности и дает небольшой процент перекрестов со скелетным изотипом тропонина С.

С целью повышения активности антисывороток к СТС и удаления из них неспецифических белков проводили выделение иммуног-лобулиновых фракций и аффинных антител. ~:его получено более 20- серий препаратов.

Наш опыт показал, что титр специфических антител в имму-

ноглобулиновых препаратах возрастает по сравнению с исходными сыворотками в среднем в 4-8 раз. Однако, фракционирование сывороток с титром ниже 1:16000 не имеет практического смысла, поскольку активность полученных из них аффинных антител ке достигает уровней, достаточных для последующего их применения в ИФА. Более того, и аффинные антитела, полученные из высоко-титражных антисывороток к СТС. имеют эффективные константы связывания, как правило, на порядок ниже, чем соответствующие показатели в исх'адой антисыворотке.

Более низкая активность аффинных антител выявлена также в сравнительных опытах по их использованию в непрямом ингибитор-ном ИФА параллельно с нативной антисыворотокоП к СТС, из которой они был;' выделены: относительно четкая обратно пропорциональная зависимость в калибровочном графике в опыте с применением для преинкубации аффинных антител наблюдается лишь в диапазоне концентраций белка от 50 до 1000 нг/кл. тогда как чувствительный регион анализа при использовании антисыворотки сдвигается в сторону гораздо меньших концентраций СТС (от С.9 до 31.25 нг/мл). что явно свидетельствует о большей чувствительности метода в этом случае.

Наши опыты показали и меньшую специфичность аффинных антител по сравнению с исходной актпсывороткон: в иммунофермент-ной реакции последовательного насыщения, когда на твердой фазе сорбировались аффинные антитела (в концентрации 1 мкг/мл), которые затем инкубировались с различными дозами СТС и структурно- родственных ем:- белков в течение 18 ч при 4*С; а количество оставшихся свободными антигенсвязывающих участков ь дальнейшем проявляли с помощью меченного пероксидазой.СТС. аффинные антитела связывали скелетный тропонин практически с той же активностью, как и гомс .огичный белок - СТС. Тропонин С, выделенный из сердца свиньи, в больших концентрациях также активно взаимодействовал с иммобилизованными антителами, отмечалось и определенное взаимодействие аффинных антител к СТС с КМ.

Таким образом, в данном варианте ИФА регистрируется довольно низкая специфичность аффинных антчтел, сравнимая со специфичностью исходной сыворотки, разведенной 1:1000,. когда основным действующим началом в ней является низкоаффинная популяция антител.

Высокая кросс-реактивность аффинных антител с сердечными

тропонинами С свиньи и быка подтверждена и в другой модификации ИФА, когда за центры связывания иммобилизованных на твердой фазе аффинных антител конкурируют меченный биотипом гомологичный антиген и неспецифические белки: индекс Абрахама для СТС свиньи и быка в данном случае достигал 33 и 32;' соответственно. Перекрест со скелетным изотипом тропонина здесь Сил существенно ниже, чем в модели последовательного насыщения (7,7%), а с КМ в исследуемом диапазоне концентраций (от 5 до 1000 нг/мл) аффинные антитела к СТС вообще не взаимодействовали.

Полученные нами результаты 'подтверждают мнение некоторых авторов (Е. 1?иоз1агИ;1. 1979; Н.~.Пивень. 1986 и др.) о том. что улучшение специфичности и аффинности антител путем аффинной хроматографии не всегда эффективно, поскольку при исполь-. зовании этого метода высокоаффинная и специфичная компонента сыворотки, как правило, теряется из-за того, что практически бывает невозможно разрушить прочные связи этих антител с имму-носорбентом даже при использовании элюирующих буферов с сильны)® денатурирующими свойствами, и в результате доля низкоаффинной фракции в препаратах аффинных антител оказывается существенно большей.

Кроличьи антисыворотки к СТС. а также полученные из них Фракции аффинных антител были использованы при разработке им-муноферментного метода определения данного вы жоспецифичного маркера повреждения миокарда. Из трех апробированных вариантов твердофазного ИФА (метод непрямого ингибиторного анализа, метод последовательного насыщения и конкурентный ИФА) наиболее приемлемым оказался авидин-биотиновый метод, в основе которого лежит конкуренция за центры связывания сориированных на твердой фазе аффинных антител между СТС. меченным биотином, и немеченым СТС. Этот метод в модельных опытах обеспечивал достаточные для "линических испытаний минимальный порог чувствительности анализа (7.8 нг/мл) и диапазон определяемых концентраций СТС (от 7,8 до 500 нг/мл). а также максимальную точность измерения (за счет увеличения соотношения "сигнал - шум" и оптимального угла наклона калибровочной кривой) и' его высокую специфичность. Кроме того, существенными преимуществами выб- , ранного метода являются его экспрессность (продолжительность анализа - 5 ч) и простота получения необходимых реагентов: меченного пероксидазой авидина и биотинилированиого СТС.

- 20 -

После адаптации конкурентного авидин-биотинового анализа к выявлению СТС в биологическом материале (показана необходимость использования а качестве основы для калибровочного мате- . риала истощенной на октил-сефарозе сыворотки крови и разведения для анализа стандартной и исследуемых сывороток от больных до 1:50) была проведена его клиническая апробация. Всего было исследовано 69 сывороток от 10 больных инфарктом миокарда в ' динамике патологического процесса и 20 здоровых доноров. Установлено. что выделение СТС в кровь из зоны повреждения миокарда регистрируется примерно через 4-9 часов после начала болевого приступа, его концентрация у больных превышает норму в 610 раз. а сам выход СТС из области некроза сердечной мышцы в кровяное рус по носит волнообразный характер (чаще всего наблюдается три подъема концентрации даного маркера в крови) и протекаем индивидуально у каждого больного. ' . • Таким образом, нами впервые получены поликлональные антитела к сердечному тропонину С и на их основе„раз, аботан авидин ■ -биотиновый конкурентный ИФА для определения этого каль-ций-связывающего белка - маркера повреждения сердечной мышцы. Данный метод после проведения углубленных клинических испытаний и технологической доработки может быть использован для усовершенствования диагностики инфаркта миокарда и оценки тяжести его течения.

Кроличьи антисыворотки к ангиотек-инам I и II

Наш опыт подтвердил данные литературы о том, что наиболее трудной задачей является получение активных антисывороток к биологически активпм соединениям с молекулярной массой около 1000, таким как ангиотензины I и II (ÄI и АН соответственно), играющие существенную роль в функционировании ренин-ангиотен-зин-альдостероновой системы' - важного звена'в сложной цепи взаимосвязей между почками, сердечно-сосудистой системой, надпочечниками, центральной и периферической нервной системами -и, следовательно, в патогенезе различных соматических заболеваний. в том числе, гипертонической болезни (И. А.Власенко с соавт., 1975: В. А. Алмазов с соавт.. 1983; Е. Е.Гогин с соавт.. 1983; Г.С.Ершова. 1987; Л.Ф.Келешева с соавт.. 1988: S. Ullk. 1973: D.Ganten е.а.. 1983).

При получении поликлональных антисывороток к AI и АН из всех апробированных нами схем сравнительно более эффективной

оказалась напряженная схема иммунизации кроликов, предложенная сотрудниками НИИ экспериментальной кардиологии КНЦ РАМН (Г.А.Ермолин. В.П.Звелинскене, 1975: Л.В.Курманова. 1986) для получения антисывороток к низкомолекулярным антигенам, включающая комбинированное (субконъюнктивальное и подкожное) введение нативных пептидов тремя циклами в 1-3. 7-9 и 13-15-й дни эксперимента с последующей внутривенной реиммуннзацией на 45 день и аналогичными дополнительными бустер-инъекциями через 23 месяца. В каждом трехдневном цикле дозы антигенов били постоянными (суммарно по 1,5 мг на кролика), а количество введенных пептидов при реиммунизациях колебалось от 0.5 до 2.4 мг. Прогрессивное увеличение доз АН в процессе первичной иммунизации (как рекомендуется авторами схемы), а также чередование, внутривенных и подкожных бустер-инъекций у этих продуцентов не дало заметного положительного эффекта. Следует отметить, что применение данной схемы при иммунизации кроликов СТС также не позволило нам получить соответствующие антисыворотки с высокой активностью и аффинностью.

В итоге проведенных экспериментов нам удалось достичь следующих максимальных показателей качества антисывороток .. ангиотензинам.

Антисыворотки к AI: титры в "ФА по конечной точке -1:32000 - 1:64000. по связывающей способности - 1:2000 -1:8000, максимальная величина константы связывания - 1.5 х 10* М"*.

Антисыворотки к All: татр в ИФА по конечной точке -1:256000. по связывающей способности - 1:16000, максимальное значение эффективной константы связывания - 1,11 v 10* М'±.

Изучение специфичности антисывороток к ангиотензинам относительно стр'т.турно и функционально родственных пептидов показало, что кроличьи сыворотки против AI высокоспецифичны и не взаимодействуют с ангиотензинами II и III. Отдельные образцы антисывороток к АН иногда давали незначительные (от 3.8 до 5,7%) перекрестные реакции с AI, но практически в 100% слу .аев связывались с AIII, являющимся продуктом распада АН (эти результаты подтверждаются и данными других исследователей: Ю. А.Серебровская. С.Е.Устинова. 1976: J.Nussberger е.а.. 1983).

С целью улучшения основных характеристик поликлональных ан.ител к ангиотензинам I и II и дальнейшего их применения при

разработке высокочувствительных иммуноферментных методов определения данных пептидов из натпвных антисывороток были выделены IgC-фракции и аффинные антитела. Установлено, что эти приемы позволяют получить реагенты с более высокими титрами антител и, что особенно важно, с несколько большей аффинностью по сравнению с исходными сыворотками, правда эти изменения не имеют кардинального характера, особенно при использовании низ-котитражного сырья. Константы связывания аффинных антител к AI колебались в пределах от 0.35 до 2,37 х 10* Диапазон этого показателя в препаратах аффинных антител к АН составлял 0,39 - 1,80 х 101 НВ последнем случае регистрируется и полное отсутствие перекрестной активности с ангиотензином I, хотя сохраняется н°специфическое взаимодействие с ангиотензином III.

Учитывая сравнительно невысокую аффинность полученных нами ант::тел к ангиотензинам I и II. при разработке иммуноферментных методов их определения были использованы варианты ИФА. основанные на авидин-биотиновом взаимодействии, позволяющие повысить чуствительность анализа за счет высокого сродства между авидином и биотином. В отличие от предложенного на. .и конкурентного ИФА на СТС схема постановки реакции при определении AI и А Г. Сила иной-, на твердой фазе сорбировались антигены. а затем в планшеты вносили (после предварительной инкубации) реакционную смесь, содержащую фиксированное количество меченных биотином соответствующих аффинных антител и последовательно снижающиеся концентрации ан"!отензиков; в результате с иммобилизованным антигеном взаимодействовали б::от;;н;:л;:роьан-ные антитела, не l лзавииеся с антигенам пробы в процессе инкубации, а количество этих антител выявлялось с помощью меченного пероксидазой авидина.

Оптимизация условий ИФА в модельных опытах обеспечивала измерение концентраций AI в диапазоне от 1 до 250 нг/мл (его уровень в норме, по данным разных авторов, колеблется в пределах от десятков пг/мл до 1 нг/мл. при различной патологии он может как повышаться, так и снижаться [В.Н. Сливнов с соавт., 1981; S. Schrpe е.а., 1987]), а чувствительный регион анализа АН составлял 250 пг/мл - 128 нг/мл (у здоровых людей концентрация этого пептида в плазме крови не превышает 250 пг/мл [G.W. Boyd, 1967; J.P.Coghlan & Ph.D.Melb, 1967; M.Valloton е. a.,19671).

- 23 -

Таким образом, в модельных опытах нам- показана принципиальная возможность применения конкурентного авидин-биотинового иммуноферментного анализа с предварительной нейтрализацией для количественного определения ангиотензинов I и II, однако качеЬ-тво полученных кроличьих антител к этим биологически активным пептидам не позволяет достичь чувствительности, необходимой для применения разработанных методов в клинической практике.

• II. ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИЮТОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ПАРАЗИТАРНЫХ ИНВАЗИЙ

Кроличьи антисыворотки к антигенам Ор1зИюгсШз ГеПпеиз

Основной целью, которую мы ставили перед собоч при выполнении исследований по данному разделу, была разработка эффективной схемы иммунизации кроликов комплексным антигеном, выделенным из марит гельминта 0р1зиюгс111з ГеПпеиэ (ОпАГ), и использование полученной антисыворотки для разработки иммунофер-ментного метода диагностики описторхоза, который составляет одну из доминирующ« нозологических форм в структуре краевой патологии населения Западной Сибири, а также многих друых регионов России и стран ближнего и дальнего зарубежья (А.М.Пономарева. 1981; А.В.Лепехин с соавт., 1992).

Нами предложен оригинальный способ получения кроличьей антиописторхозноп сывсроткп, позволяющий существенно сократить затраты антигенного материала и сроки получения высокоактивных реагентов. Данный способ включает первичный цикл иммунизации продуцентов, состоящий из трех комбинированных - субконъюнктп-вальных и подкожных - введений ОпАГ в 1, 7 и 14 дни опыта, при этом суммарная доза антигена (1 мг на каждую инъекцию) делится следующим образом: 200 мкг вводится субконъюнктивально. а 800 мкг - подкожно дробно в смеси с равным объемом ПАФ. Первая реиммунизация осуществляется через 1 нес, остальные - с интервалами в 1-3 мес, антиген в этих случаях вводится либо вышеописанным комбинированным методом, либо только подкожно с ПАК либо внутривенно. Способ защищен авторским свидетельством И 1767974.

Кролики, иммунизированные по указанной схеме, в большинстве случаев демонстрировали выраженный иммунный ответ уже в процессе первичной вакцинации и, особенно, после первсй-вт;рои

реиммунизаций. Дополнительные бустер-инъекции ОпАГ позволяли поддерживать антителообразование на достаточно высоком уровне в течение плительного времени. ' "амые активные антисыворотки имели г ИФА титры по последней то-же - 1: Ю24000, по связывающей способности - 1:32000, а в разведении 1:4000 данные сыворотки связывали до 90% иммобилизованного ОпАГ.

Более подробное изучение свойств антиописторхозных сывороток показало, что они взаимодействуют не только с комплексным' ОпАГ, но и с входящими в него метаболическим компонентом (МАГ) и антигеном из яиц 0.Ге11пеиз (ЯАГ), причем, активность связывания с ЯАГ. как правило, превышает соответствующие показатели для МАГ. но в том случае, когда для реиммунизации кроликов используется непосредственно МАГ. нейтрализующая способность антисывороток по отношению к этому антигену возрастает.

Косвенная характеристика аффинности полученных антисывороток путем вычисления доз ОпАГ. ЯАГ и МАГ. снижающих их активность на 5035, показала. во-пер"ых, что т процессе гиперим-мунизеили сродство антител как к комплексному ОпАГ, так и . к отдельным его компонентам постепенно увеличивается, и, во-вторых, что прочность связывания антител с ОпАГ всегда выше, чем с ЯАГ или МАГ. В свою очередь, эффективность связывания сывороток с ЯАГ по сравнению с МАГ была более выражена только на первоначальных стадиях эксперимента, а после 3-4 реиммунизаций регистрировалась более высокая аффинность к МАГ. независимо от того, какой вид описторхозного антигена использовался для бустер-инъекций.

Из кативных антиописторхозных сывороток методом хроматографии на иммуносорбентах с ОпАГ и МАГ были выделены и подробно охарактеризованы в различных иммуноферментных реакциях аффинные антитеза. Самые активные реагенты с хорошим выходом целевого белка (0,5 мг из 1 мл исходного сырья) были получены из антисывороток кроликов, подвергшихся наиболее длительной гипериммунизации ОпАГ, когда степень "созревания аффинности" была, по-видимому, особенно выраженной. Они имели высокие константы свя""шания с меченными пероксидазой ОпАГ и МАГ в прямом ИФА (3,92 и 3,70 х 10а соответственно), а также эффективно связывали как упАГ. так и оба его компонента в непрямом ИФА и в реакции нейтрализации.

Исследование наличия иммунологических перекрестов у на-

тивных антиописторхозных сывороток и выдел^нних из них аффинных антител с белками сыворотки крови человека, в частности, иммуноглобулинами различных классов показало, что они способны взаимодействовать с данными антигенами, иммобилизованными на твердой фазе, лишь в разведениях ниже 1:1000 (антисыворотки) или только в концентрациях от 20 до 5 мкг/мл (от~ельные серии аффинных антител), причем даже высокие дозы указанных белков (20 мкг/мл) не способны снижать их специфическую активность в реакции нейтрализации.

В процессе разработки иммуноферментного метода выявления ангтенов 0. ГеПпеиэ с целью создания высокочувствительного и достоверного способа диагностики описторхоза в модельных опытах изучались различные модификации ИФА: два варианта "сэндвич-анализа (общепринятый, - с использованием антител к ОпАГ. меченных пероксидазой, и "удлиненный" - с применением на промежуточном этапе биотинилированных антиогхторхозных антител) и два варианта конкурентного авидин-биотинового метода (первый . предусматривал иммобилизацию на твердой фазе ОпАГ, который на следующих стадиях реакции конкурировал за центры связывания меченных биотином антител с антигеном пробы; при второ!.. планшеты активировались антителами, а конкуренция за их центры связывания происходила между биотипилированным антигеном и антигеном пробы).

Все апробированнкэ варианты обеспечивали получение четких . калибровочных графиков' при использовании в качестве основы для растворения ОпАГ как фосфатного буферного раствора, так и различных биологических субстратов (сыворотка крови, желчь, слюна, копрофильтраты, взятые в .определенных разведениях и в некоторых случаях предварительно обработанные слабым раствором ингибитора протеаз - фенилмет::лсульфонил флюорида - согласно рекомендациям С.7.Кп1з1еу е. а, 1989)..

В модельных опытах подтверждена специфичность каждой модификации ИФА. Однако, при исследовании различных биологических материалов, полученных от .больных людей, мы столкнулись с трудностями подтверждения достоверности выявления в них антигенов О. ГеШецэ, поскольку в природном очаге описторхоза практически невозможно абсолютно исключить наличие заражения, особенно при низкой степени гельминтозной инвазии. По предварительным данным можно сделать заключение, что методом выбора

для диагностики описторхоза с помщью ИФА может являться один из вариантов конкурентного авидин-биотинового анализа. Для окончательных выводов необходим" проведение широких клинических исгггакий с тщательной верификацией диагнозов, а также углубленным изучением чувствительности и, особенно, специфичности метода.

III. НАУЧНОЕ Н ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНиЕ ОБОСНОВАНИЕ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ФРАГМЕНТАМ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

Антитела к фрагментам иммуноглобулинов человека и кролика

Антисызоротки к классам (субклассам) иммуноглобулинов человека и жчвотных, а также к отдельным компонентам их молекул - цепям, доменам. Фрагментам - яв..яются важным инструментом тонкого иммунохимического анализа. Особый интерес представляет использование антител к фрагментам и цепям молекул иммуноглобулинов в качестве основы для получения имм^ноферментных конъюгатов различной специфичности. Известно, что гипериммунные антисыворотки к пулу иммуноглобулинов, которые, как правило, служат сырьем для получения антивидовых i-ммуноферментных конъ-вгатов, могут давать широкие перекрестные реакции из-за наличия перекрестно реагирующих антигенов у иммуноглооулинов человека и различных видов животных (Е.В.Чернохвостова с соавт.. 1978; М. V,. Любинская, В. А.Алешкин, 1984; А.Я.Кульберг, 1985; Л. И.Ванеева с соавт.. 1937; R. Oriol е.а!. 1968; B.A.L.Hurn, 1974). Использование в качестве конъюгатов меченых антител из антисызороток к отдельным классам иммуноглобулинов также не гараншрует специфичность таких высокочувствительных методов анализа, как РИА я ИФА, прежде всего вследствие общих антигенных детерминант у разных изотипов иммуноглобулинов одного и того же вида [А.Я.Кульберг, 1985). Решение данной проблемы возможно путем применения антител к различным фрагментам молекул иммуноглобулинов. Так, предложено использовать в качестве универсальных антивидовых конъюгатов меченче антитела к FabA (аЬ^-фрагкентан или легким цепям иммуноглобулинов, поскольку с их помощью можно выявить иммуноглобулины всех классов из-за обцг.ос^и входящих в их молекулы L-цепей (Л. В.Курманова, 1986; Е.М.Егоренкова с соавт., 19d7; H.B.Ливень. И.П.Вигдсро-ви„ 133Г»; G.Torrlglanl е.а., 1968). Напротив, антитела, стро-

го специфичные к антигенным детерминантам тяжелых цепей или Fc-фрагментов молекул иммуноглобулинов, проявляют исключительно класс-специфические свойства (С.А. Луговская с соавт., 1983; Л.В.Курманова с соавт.. 1984; A.Falthe.a.. 1982).

В рамках исследований, направленных на получение поликло-нальных антител к фрагментам иммуноглобулинов и изучение возможности их использования в качестве основы для синтеза различных иммуноферментных конъюгатов. нами было предложено несколько способов иммунизации животных различных видов Fab-, F(ab)x- и Fc-фрагментами IgG человека и кролика, а также L-це-пями иммуноглобулинов человека. выделенными Т.Д.Лимаревой (1989) под нашим руководством и при непосредственном участии.

При получении антисывороток против IgG (Fab) и IgG (F(ab)x> человека в качестве животных-продуцентов были использованы кролики. Их иммунизация соответствующими иммунохимически чистыми фрагментами IgG человека по- двум схемам, описанным в работах Д. В. Стефани с соавт. (1976). Р.Л.Пануриной (1980). Н.Н.Козловой и Б".Б.Першина (1981), и предусматривающим первоначальное трехразовое подкожное введение достаточно больших доз антигенов (от 2 до 6 мг) в смеси с ПАФ с 7- или 14-дневньии интервалами и последующие периодические внутривенные или подкожные бустер-инъекции, оказалась достаточно эффективной и позволила получить реагенты с титрами в ДРИ от 1:8 до 1:64 (наиболее активные антисыворотки были получены при имунизации F(ab)£-фрагментами в силу их большей молекулярной массы).

Антитела к антигенсвязывающим фрагментам IgG кролика были получены путем иммунизации морских свинок и белых мышей. В первом случае из трех апробированных схем продуктивной была лишь длительная схема, включающая 6 еженедельных подкожных с адъювантом (ПАФ или ШФ) и внутривенных инъекций Fab- или F(ab)i-фрагментов IgG кролика в дозах 0,5-1,0 мг.Тчтр специфических антител у этих животных в ДРИ достигал значений 1:16 -1:32.

Использование в качестве продуцентов белых мышей позволило нам получить от них иммунную асцитическую жидкость. (ИАЯ) с более высоки™ титра!«! антител к Fab- и F(ab)j>-Фрагментам кроличьего IgG - 1:32-1:64. В этих экспериментах схема иммунизации состояла из 8-10 внутрибрюшинных еженедельных инъекций антигенов (по 100-ЗС0 мкг) либо в смеси с ПАФ или НАФ (четыре

первых введедения), либо без адыованта, а для индукции асцито-образования применялись клетки асцит-саркомы 180 TJ. Выраженный иммунный ответ наблюдался у мышей уже после пятой иммунизации. а наиболее высокий титр г.^еципитинов регистрировался в ИАЖ,.полученной после 9-10 инъекций антигена.

Описанный способ был достаточно эффективен и при получении мышиных ИАЯ, содержащих антитела к Fc-Фрагментам IgG человека и кролика (в качестве иммуногена здесь были использованы преципитаты, полученные с помощью ИЭФ), а также к легким цепям иммуноглобулинов человека (антиген - нативные L-цепи).

Для получения антисывороток к L-цепям иммуноглобулинов человека была также использована схема комбинированной иммунизации кро.пиков нарастающими дозами антигенов, предложенная Г.А.Ермолиным и В.П.Звелинскене (1975) и Л.В.Курмановой (1986) и апробированная нами в опытах по получению антител к таким низкомолекулярным антигенам, как сердечный тропонин С и ангио-тензины I и II (см. выше). И в данном случае эта схема в наших опытах не обеспечивала активного антителообразования. и лишь дополнительная стимуляция иммунного ответа путем введения ЦПХ позволила достичь следующих титров антител в сыворотке крови продуцентов: 1:8 - 1:16 в ДРИ и 1:12800 - 1:25600 в ИФА.

Наиболее трудной задачей оказалось получение поликлональ-ных антисывороток к Fc-фрагментам иммуноглобулинов G человека и кролика. Помимо уже упомянутого метода получения мышиных ИАЖ данной специфичности (титр соответствующих преципитирующих антител в них достигал уровня 1:32). нами использовались разные приемы усиления иммуногенных свойств этих фрагментов (конъюгация с ЛСА, применение иммунных преципитатов и др.) при иммунизации кроликов и морских свинок. В итоге, максимальный титр антител к Fc-фрагментам IgG человека в ДРИ, который нам удалось получить при иммунизации кроликов по схеме Т.В.Гневковс-кой с соавт. (1985) преципитатами, образованными Fc-фрагмента-ми IgG человека в ИЗФ с анти-IgG (Fe) человека ("Cappel",США), был равен 1:8. А сыворотки против IgG (Fe) кролика с титрами спе-чфических преципитинов 1:4 продуцировали морские свинки, прсиммунизированные малыми дозами цельных юлекул IgG согласно рекомендациям R.Oriol е.а. (1968).

Has опыт показал, что наиболее эффективным является получше мокоспецифических антител к Гс-фрагмен: "Л IgG человек с

помощью последовательного освобождения от примесных антител коммерческих антисывороток к IgG (производства НИИЭМ. г. Ниж-ний-Новгород. НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи, г.Москва) на сорбентах с иммунохимически чистыми IgM, IgA и Fab-фрагментами IgG человека. Этот прием перекрестной иммуносорбции при необходимости был использован нами и для удаления антител к посторонним антигенам из других антифрагментарных сывороток, а также при очистке коммерческих сывороток против IgM и IgA человека с целью получения антител, строго дифференцированно взаимодействующих с Fe-участками тяжелых цепей соответствующих иммуноглобулинов.

Таким образом, используя самые различные подходы, мы получили активные и специфичные политональные. антитела против IgG (Fab). IgG (F(ab)<j), IgG (Fc) человека и кролика, а также к легким цепям (каппа+лямбда) иммуноглобулинов человека.

Впервые предложен эффективный метод получения иммунной асцитической жидкости мышей, содержащей преципитирующие антитела к различным фрагментам иммуноглобулинов человека и кролика.

Из нативных антифрагментарных сывороток и ИАЖ были выделены IgG- или гамма-глобулиновые фракции, а также аффиньые антитела. Эти препар?ты послужили основой для синтеза активных и специфичных антивидовых иммуноперонсидазных конъюгатов, которые используются при титровании в ИФА кроличьих антисывороток к различным биологически активным веществам, а также для оценки уровня специфических антител в сыворотках крови больных людей с различной'инфекционной и неинфекционной патологией.

Полученные путем перекрестной иммуносорбции моноспецифические антитела,' выявляющие в ИФА IgG. IgM и IgA человека, использованы для получения* специфических иммуноферментных конъюгатов. с помощью которых можно дифференцированно определять у больных антитела соответствующих классов к различным антигенам.

IY. АНТНСЫВОРОТКИ К АНТИГЕНАМ ЭРИТРОЦИТОВ

Разработка набора реагентов для определения субпопуляций лимфоцитов человека

Определение уровня популяций и субпопуляций иммунокомпе-тентных клеток - одна из основных характеристик иммунного статуса человека. Оно базируется на наличии на поверхности имму-

некомпетентных клеток разнообразных маркеров (рецепторов, антигенов) и выполнении клетками определенных эффекторных и ре-гуляторных функций.

Особенно важное значение при углубленной оценке иммунного статуса имеет количественная идентификация иммунорегуляторных субпопуляций Т - лимфоцитов (Т-хелперов и Т-супрессоров) и определение иммунорегуляторного индекса - отношение Т-хелперы/ T-cynpejcopu (Б. Д. Брондз, 1980; Р. В. Петров с соавт., 1980; Л. В. Ковальчук с соавт., 1981; Л. В. Ковальчук, А.Н.Чередеев. 1986; В. М.Манько, Р.М.Хаитов, 1987; Р.В.Петров с соавт.. 1992, 1994). Для этой цели разработано три основных методических подхода: использование ИКАТ к дифференцировочным антигенам различных субпопуляций Т-лимфоцитов (А.Н.Чередеев, 1984; Р.В. Петров с соавт.. 1986; К. А. Лебедев, И. Д. Понякина, 1990; . Р. В. Петров с соавт., 1992, 1995); постановка нагрузочных тестов с теофиллином (Р.В.Петров с соавт., 1992; S.Llmatlbul е.а., 1978; A.Shore е.а., 1978); выявление рецепторов к Fc-Фрагмен-там IgG и IgM (Б.Д.Брондз, 1980; В.М.Манько, Р.М.Хаитов, 1987; L.Moretta е.а., 1976, 1977; S. Gupta & R. A. Good, 1977. 1978; L. Moretta е. з., 1979; J. Е. Merrill е. а. ,1980; A. More t ta, 1982 и др.),

Каждый из этих методических подходов имеет свои достоинства и недостатки, поэтому выбор конкретного метода определения иммунорегуляторных субпопуляций т-лимфоцитов зависит от возможностей и оснащенности лабораторий клинической иммунологии. При этом, по справедливому заключению К.А.Лебедева и И.Д.Поня-киной (1990). необходимо иметь в виду, что наличие того или иного маркера на клетке далеко не всегда свидетельствует о выполнении ею определенной функции, поскольку, во-лервых, эту функцию выполняет лишь небольшое количество лимфоцитов с данным маркером; во-вторых, н*. поверхности каждой клетки находится огромное ко. ячество разнообразных рецепторов и антигенов, поэтому разделение популяций по одному маркеру позволяет выявлять лишь субпопуляцин. весьма гетерогенные по другим маркерам п Бшт..яемсГ! функции; в-третьих, необходимо учитывать разницу в физиологической активности клеток одной и той же субпопуляцин и существенные различия в функциях клеток In vivo и in vitro. Из этого следует, что наиболее информативным и полезный является комплексное применение различных методов.

Перед наш: в рамках общесоюзной научно-технической проб-

лемы 0.69.07 "Иммунология и медицинская генетика" (задание ГКНТ СССР Н 03. 02.<89) была поставлена задача разработки технологии получения стандартных реагентов для определения Т « -хел-перов/индукторов и Tj.-супрессоров/эффекторов методами розеткь-образования; параллельно была отработана технология получения А-сыворотки. содержащей антитела к эритроцитам быка преимущественно IgM класса, для выявления B-лимфоцитов методом ЕАС -розеткообразования. В выполнении этого задания принимали активное участие сотрудники 2-го МОЛГМИ H.H.Свирежева и Э.Г.Скрябина.

Поскольку для осуществления способа определения Т>- и Т^-лимфоцитов путем розеткообразования (РО) с бычьими эритроцитами ОБ) необходимы высокоочищенные антитела к ним соответственно IgM и IgG классов, мы поставили перед собой задачу получения этих ¡еагентсв из сывороток кроликов, иммунизированных либонативными ЭБ, либо их стромой.

Кроличьи антисыворстки к ЭБ с преимущественным содержанием IgM-AT, предназначенные, во-первых, для выделения очищенного IgM (для выявления Т^-клеток), и. во-вторых, в нативном виде - для выявления B-лимфоцитов, получали на высоте первичного иммунного ответа; IgG против ЭЕ (для определения Tj-клеток), напротив, выделяли из гипериммунных сывороток с преобладанием антител класса IgG.

Из семи различных схем иммунизации кроликов указанными антигенами наиболее простой, эффективной и технологичной оказалась схема Е. Кзбота и М. Мейера (1968), которая состояла из 11 ежедневных внутривенных инъекций стромы ЭБ с содержгнием белкового азота 1.0 - 1,1 мг/мл (1-й день - 0.1 мл, 2-6 дни - по 1,0 мл. 7-11 дни- по 2.0 мл). Она обеспечивала получение примерно от 70% продуцентов'высокоактивного сырья для последующего выделения IgM (реагента для определения Т/и -хелперов/индук-торов). нативные сыворотки от остальных животных с титрами ге-магглютининов от 1:4 до 1:16 использовались в качестве так называемой А-сыворотки. предназначенной для определения В-лимфоцитов методом ЕАС-РО, а реиммунизация этих кроликов через 11.5 мес после окончания первичного цикла путем внутривенного введения 5 мл 10% взвеси нативных ЭБ и периодическое повторение аналогичных бустер-инъекций позволяли поддерживать у них вторичный иммунный ответ на значимом уровне в течение длитель- • ного времени и получать сырье для выделения IgG (реагента для

определения fy -супрессоров/эффекторов) с высокими титрами в РГА (> 1:256 у 40% продуцентов).

С использованием кроличьих антиэритроцитарных сывороток Н.Л.Кондратьевой (1990), под нашим руководством и при непосредственном участии, разработана технология выделения иммунохи-ыически чистых IgM и IgG для определения соответственно Ijt - и Т^-лимфоцитов человека методами розеткообразования In vitro, а также А сыворотки для выявления В-лимфоцитов в тесте ЕАС-РО.

' Кратко схемы производства включают следующие этапы.

Для выделения' IgM используются антисыворотки кроликов, иммунизированных стромой ЭБ, с титлами в РГА не ниже 1:16, в РГ - не ниже 1:512. После апробации нескольких способов фракционирования IgM выбран метод, предусматривающий первоначальную обработку нативной сыворотки хлороформом (10% к объему) с целью удаления л..попротеинов; далее проводится осаждение гло-булиновой фракции сульфатом аммония и двойное промывание осадка глобулинов насыщенным раствором той же соли, разведенным 1:1 дистиллированной водой; после диализа полученного продукта для удаления солей и установления рН 8.6 против 0,05 М трис -буфера с 0,15 М НаС1, рН 8.6 смесь иммуноглобулинов разделяется путем гель-фильтрации на сефадексе G-200 или сефарозе 6В.

IgM-содержащие фракции объединяются, концентрируются (общий белок 0,5-1.53!) и проверяются на иммунохимическую чистоту (методами ИЗФ, ЭФ в ПААГ, гель-фильтрации в тонком слое сефа-декса) и специфическую активность (РГ, РГА). К препарату IgM предъявляются следующие основные требования: отсутствие примесей других иммуноглобулинов (допускаются незначительные примеси агд-макроглобулинов или липопротеидов, которые не влияют на результаты тестов РО) и специфическат активность в РГА не ниже 1:8, а в РГ - 1:640.

. Препараты IgG получают из иммунных против нативных ЭБ кроличьих сывороток каприлатно-спиртовым методом с доочисткой на ионообменниках (сефадекс ДЭАЭ-А-50 или целлюлоза Сервацел ДЭАЭ-51,. При сравнительных исследованиях именно этот метод оказался наиболее подходящим для получения иммунохимически чистого IgG против ЭБ, при этом часто не требовалось проведения доочнстки препаратов на ионообменниках и обеспечивался высокий выход целевого белка. Специфическая активность полученных по разработанному методу препаратов IgG, определенная в

РГА, колебалась от 1:16 до 1:2048. При анализе в ИЭФ они образовывали одну характерную для дугу преципитации с сывороткой против иммуноглобулинов кролика и с сывороткой против белков сыворотки кролика. Иммунохимическая чистота препаратов подтверждалась также при гель-фильтрации в тонком слое сефа-декса и методом ЭФ в ПААГ, в обоих случаях они давали одно пятно, располагающееся в зоне подвижности гамма-глобулиновой фракции сыворотки.

Препарат А-сыворотки в нашей работе фактически являлся побочным продуктом при получении сырья для ^м. Для его приготовления обычно использовались сыворотки с титрами в РГА 1:4-1:8, непригодные для выделения ^М. Специфическую активность этого реагента также проверяли в РГ и. РГА. Титр гемаг-глютининов в данном случае колебался в пределах разведений от 1:4 до 1:16, а гемолизинов - от 1:1280 до 1:10240.

Отработаны режимы стабилизации всех указанных реагентов методом лиофильного высушивания, методы определения рабочих разведений для каждого препарата и оптимальные условия приготовления соответствующих эритроцитарных комплексов (ЕАС, ЕАди ЕА^) [М.Л.Кондратьева, 1990].

Три этих препарата вошли в "Набор иммунореагентов для определения субпопуляций лимфоцитов человека", который прошел широкие клинические испытания на базе клиники инфекционных болезней Сибирского медицинского университета (г.Томск), и клиники НИИ кардиологии ТНЦ РАКН и был использован для характеристики иммунного статуса здоровых людей, а также болишх клещевым энцефалитом, хроническим описторхозом. брюшным тифом, инфарктом миокарда и др. заболеваниями.

Приготовленные нами' экспериментальные серии .препаратов применялись также при изучении иммунологических показателей здоровых и больных людей в Институте проблем онкпогии АН Украины и.Киргизском НИИ кардиологии. Во всех исследованиях показано, что разработанный нами "Набор иммунореагентов для определения субпопуляций лимфоцитов человека" позволяет стандартизовать методы оценки иммунного статуса и проводил изучение иммунорегуляторного звена Т-системы, а также определять количество В-лимфоцитов как у здоровых лиц. так и у больных с различной патологией.

Таким образом, резюмируя весь изложенный в настоящей ра-

Соте материал, можно сделать общее заключение о том, что проведенные комплексные исследования позволили научно и экспериментально обосновать перспективные подходы к получению на основе поликлональных антител различной специфичности реагентов, пригодных для разработки современных высокочувствительных методов диагностики некоторых эндокринных, сердечно-сосудистых и паразитарных заболеваний, а также для характеристики иммунного статуса человека.

ВЫВОДЫ

1. Предложена технологичная ^хема иммунизации морских свинок инсулином, позволяющая стабильно получать высокоактивные и аффинные антисыворотки, пригодные для разработки и промышленного выпуска РИА-наборов для определения данного гормона в сыворотке крови человека с целью диагностики и оценки эффективности лечения сахарного диабета.

Материалы исследований по получению антиинсулиновых сывороток вошли в нормативно-техническую документацию на набор реактивов для радиоиммунологического анализа инсулина с использованием радионуклида 1-125 (РИА-ИНСУЛИН-1-125),

2. Отработана оптимальная схема получения кроличьих антисывороток к миоглобину человека, на их основе создан экспресс-метод радиоиммунного определения миоглобина в сыворотке крови с целью диагностки инфаркта миокарда.

Материалы по получению кроличьей антисыворотки к миоглобину вошли '. в нормативна-техническую документацию на сыворотку диагностическую миоглобиновую для радиоиммунного анализа сухую, а также на набор реактивов для радиоиммунологического анализа миоглобина с использованием радионуклида 1-125 (РИА-МИОГЛОБИН -1-125).

3. Впервы. предложена эффективная схема иммунизации кроликов сердечным тропонином С; получены антнсыворотки с высокой активностью, аффинностью и специфичностью, которые были ис-пользоьдны для разработки иммуноферментного метода определения данного маркера повреждения миокарда.

. В сравнительных исследованиях показаны преимущества конкурентного авидин-биотинового метода; проведена его клиническая апробация.- подтвердившая принципиальную возможность при-иенепия указанного метода для количественного определения сер-

дечного тропонина С с целью усовершенствования диагностики инфаркта миокарда и оценки тяжести его течения.

4. Изучена эффективность нескольких схем иммунизации кроликов ангиотензинами I и II: в модельных опытах научно обоснЬ-ваны методические подходы к применению полученных антисывороток для разработки конкурентного авидин-биотинового иммуно-ферментного метода определения указанных биологически активных пептидов.

5. Предложена оригинальная схема иммунизации кроликов комплексным антигеном из марит 0.fellneus, позволяющая значительно сократить затраты антигенного материала и сроки получения высокоактивных реагентов (приоритетность исследований защищена авторским свидетельством на изобретение N 1767974 от 8 июня 1990 г.); при апробации с использованием полученных антител различных вариантов иммуноферментного анализа в модельных опытах показана возможность применения конкурентного авидин-биотинового ИФА для выявления антигенов о. fellneus. который после проведения клинических испытаний может быть рекомендован в качестве дополнительного чувствительного теста с целью усовершенствования диагностики описторхоза.

6. Научно и экспериментально обоснована технология получения антител к IgG (Fab/F(ab)2) и IgG (Fc) человека и кролика, а также к легким цепям иммуноглобулинов человека. Впервые предложен эффективный способ получения иммунных асцитических жид. костей белых мышей указанной специфичности. Установлено, что

данные препараты могут быть использованы для синтега высоко-■ активных и специфичных антивидовых и класс-специфических им-иммуноферментных коньюгатов.

Результату исследований по этому разделу работы вошли в нормативно-техническую документацию на следующие препараты: антисыворотки к IgG (Fab) и IgG (Fc) человека для пабораторных исследований; антитела против Fab-, F(ab')i- и Fc-фрагментов иммуноглобулина G кролика для лабораторных исследований; тест-система иммуноферментная для.определения аутоантител к миоглобину; тест-система иммуноферментная для выявления IgM к Opistorchis fellneus; тест-система иммуноферментная для выявления IgG к Opistorchis fellneus; тест-система иммуноферментная для определения иммуноглобулинов класса И человека к вирусу клещевого энцефалита: тест-система иммуноферментная для оп-

ределения иммуноглобулинов класса й человека к вирусу клещевого энцефалита.

7. Предложен оптимальный способ получения кроличьих антисывороток к бычьим эритроцитам и их строме, на их основе разработана технология про., водства препаратов для идентификации методами розеткообразования иммунорегуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов (Т/1-хелперов/индукторов и Т^-супрессоров/эффекто-ров). а также В-лимфоцитов человека.

Проведена широкая клиническая апробация полученных реагентов, показана их пригодность для характеристики иммунного статуса здоровых и больных с различай патологией. Утверждена нормативно-техническая документация на "Набор иммунореагентов для определения субпопуляций лимфоцитов человека"

8. разработаны научно-организационные подходы к получению на основе поликл^нальных антител различной специфичности реагентов. пригодных для создания современных высокочувствительных методов диагностики некоторых эндокринных, сердечно-сосудистых и паразитарных заболеваний, а также для характеристики иммунного статуса человека.

Результаты научных исследований внедрены в практику здравоохранения: препараты антиинсулиновых и антимиоглобиновых сывороток,. приготовленные на базе лаборатории иммунохимии Том-НИИВС НПО "Вирион", использованы при промышленном выпуске со-отвествующих коммерческих РИА-наборов на хозрасчетном опытном предприятии "Радиопрепарат" Института ядерной физики АН Узбекистана; на предприятии по производству бактерийных и вирусных препаратов НПО "Вирион" освоен промышленный выпуск тест-системы иммуноферментной для выявления IgM к Oplst.horcl.ls Ге11пеиз; налажен серийный выпуск набора иммунореагентов для определения субпопуляций лимфоцитов человека на базе лаборатории иммунохимии ТомШИВС КлО "Вирион1'.

***

Искренне чту память доктора биологических наук профессора Георгии Ефимовича Синельникова, бывшего генерального директора НПО "Вирион". который стоял у истоков данной работы и проявлял постоянное внимание к ее выполнению.

Выражаю сердечную благодарность всем, принимавшим участие в проведении настоящих исследований, особенно сотрудникам лаборатории иммунохимии Томского НИИ вакцин и сывороток за помощь и поддержку.

- 37 -

СПИСОК СТАТЕЙ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Разработка быстрого метола радиоиммуноанализа на миог-лобин для экспресс-диагностики инфаркта миокарда // Вопросы мед. химии.- 1983,- К 6,- С. 127-131 (соавт: Грачев М.А.. Лактионов П. П., Матвеев Л. Э., Прессман Е.К. ,Рошке В. В.. Кондратьева М.Л.. Никитин Ю.П., Бондарева З.Г., Бредихин A.B.).

2. Опыт получения антимиоглобиновой своротки для радиоиммунного определения миоглобиня // Биологические препараты и иммунологическая реактивность организма: Материалы XXI итоговой научной конференции ТомНИИВС и ТМИ.- Томск: Изд-во Томского ун-та, 1983,- С. 54-55 (соавт. Кондратьева М.Л., Рош-ке В. В., Матвеев Л. Е. ).

3. Иммунологические показатели у больных хроническим описторхозом ''/ Вирусные и бактерийные препараты: Труды ТомНИИВС и ТМИ. - Томск: Изд-во Томского ун-та, 1983.- Т. 32,- С. 170-181 (соав". Лепехин A.B., БужакН.С.. Пьяных A.M.. Киселев В.П. Власова Т.А., Кириленко В.А. ).

4. Выделение Fab-фрагментов иммуноглобулина G человека и получение антисывороток к ним // Там же,- 1984. - Т.33.- С.100 -105 (соавт. Лимарева Т.Д.. Кондратьева И.Л.).

5. Характеристика иммунологического статуса больных с различной инфекционной патологией // Современные методы иммунотерапии: Тезисы докладов научной конференции (Ташкент. 24-25 октября 1984 г.).- Москва-Ташкент, 1984.- С. 49-50 (соавт: Лепехин А. В., Бужак Н. С!, Портнягина Л. К., Жарова Н. В.. Зорина 3. И., Чуйкова К.И., Светкина З.А.. Твердохлебов С.А ).

6. Получение антисывороток для радиоиммунного и иммуно-ферментного определения биологически активны.; веществ и использование их в кардиологической практике // Иммунология атеросклероза и ишемической болезни сердца: Тезисы Всесоюзной конференции (Томск, 15-16 октября 1985 г.). - Томск. 1985.- С. 113-114 (соавт. Кондратьева М. Л.. Менявцева Т.А.. Максимов И.В., Кожинова И.Н., КенихН.И. ).

7. Создание отечественного набора реагентов для характеристики иммунного статуса больных различной патологией // Там же,- С. 115-116 (соавт. Кондратьева М.Л., Свирежева М.Н., Скрябина Э. Г. ).

8. Получение иммунореагентов для определения Фрагментов иммуноглобулинов G человека и животных // Там же,- С. 116-117

- 38 -

(соавт. Лимарева Т.Д.. Кускова 3. Р., Кондратьева И. Л.).

9. Получение препаратов антител для определения антигенс-вязывающих фрагментов иммуноглобулинов G человека и кролика // Медико-биологические препараты и иммунологическая реактивность организма: Материалы XXII итоговой научной конференции ТомНИ-ИВС и ТМИ, - Томск. 1985.- С.50-52 (соавт. Лимарева Т.Д.. Кускова 3. Р.).

10. Разработка реагентов для определения субпопуляций Т-лимфоппгов человека //Там же, - С. 57-59 (соавт. Кондратьева М.Л1

И. Получение антисывороток для определения ГаЬфрагментов иммуноглобулина G // Рукопись депонирована в ВИНИТИ N 6113 от 25.08.86 (соавт.Лимарева Т.Д., Кускова з. Р.. Кондратьева М. Л.).

12. Информационно-функциональная модель иммунного статуса в норме и при патологии // Ш. микробиол. - 1986.- N 9.- С. 44-48 (соавт. Лепехин A.B.. Пашнева Г.Е.. БужакН.С.. Портня-гинаЛ.К.. Жарова Н.В.. Зорина 3.И.. Кондратьева М.Л.).

• 13. Разработка реагентов для микроанализа и оценки иммунного статуса человека // Актуальные вопросы производства медицинских иммунобиологических препаратов: Материалы межинститутской научной конференции.- Томск. 1986,- С. 172-174.

14. Информационные аспекты структуры функционирования им-мунорегуляторных клеток в норме и при различной инфекционной патологии // Нейрогуморальная регуляция иммунного гомеостаза: Тезисы докладов IY Всесоюзного симпозиума (Суздаль. 5-7 мая 1986 г.).- Ленинград. 1986,- С. 211-212 (соавт. Лепехин A.B.. Пашнева Г.Е.. Ьужак Н.С.: Портнягина Л. К.. Зорина З.И.. Жарова Н. В.. Кондратьева М. Л.. Рогозенко Г.Ф.).

15. Информационные аспекты оценки иммунного статуса у больных с различной инфекционной патологией // Теоретические проблемы эпидемиологии и инфекционной иммунологии на современном этапе: Материалы 2-го пленума правления ВНОМЭП им. И.И.Мечникова.- Нальчик. 1986,- С. 143-148 (соавт. Лепехин A.B., Пашнева Г.Е.. БужакН.С.. Портнягина Л.К.. Зорина 3.И., Жарова Л. В., Кондратьева М. Л.).

16. Критерий оценки здоровья популяции на основе изучения структуры взаимодействия иммунорегуляторных клеток с использованием информационно-логического анализа // Проблемы создания и соврешенствования автоматизированных информационных систем охраны труда, окружающей среды и здоровья населения про-

.мышленных городов: Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции (Ангарск. 17-18 сентября 1986 г.). - Ангарск. 1986,- С. 113-114 (соавт. Лепехин А. В.. БужакН.С., Портнягина Л.К.).

17. Информационная оценка структуры иммунорегуляторнУх клеток при инфекционных заболеваниях человека на уровне популяции // Адаптация человека к климато-географическим условиям и первичная профилактика: Тезисы докладов IY Всесоюзной конференции (Новосибирск, 2-3 июля 1986 г.). - Новосибирск. 1986. -Т. 2.- С. 171 (соавт. Лепехин A.B., Пашнева Г.Е.. Бужак Н.С.).

18. Состояние клеточного и гуморального иммунитета и некоторых факторов неспецифической резистентности у больных хроническим описторхозом в периоде диспансерного наблюдения // Ж. микробиол.- 1987,- N 6.- С. 50-54 (соавт. .Лепехин A.B.. Васильев Н. В., БужакН.С., Портнягина Л. К., Зорина 3. И.. Жарова Н. В. i Кондратьева М.Л.).

19. Оценка активности сывороток к некоторым низкомолекулярным антигенам методом иммуноферментного анализа // Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов: Тезисы докладов 3-й Всесоюзной конференции (Москва. 21-23 октября 1987 г.). - М.. 1987,- С. 215-216 (соавт. Менявцева Т. А., Абдулкина Н. Г., Феоктистова A.C.).

20. Информационно-энтропийный анализ взаимодействие имму-нокомпетентных клеток в норме и при инфекционной патологии // Вирусные и бактерийные препараты: Труды ТомНИИВС и ТМИ.-Томск: Изд-во Томского ун-та. 1987,- Т. 34,- С. 201-208 (соавт. Лепехин A.B.. Пашнева Г.Е.. Бужак Н.С.).

21. Опыт получения кроличьих иммуноглобулинов классов М и G для определения субпопуляций Т-лимфоцитов человека // Там же. - С. 157-162 (соавт. Кондратьева М. Л.).

22. Основные требования к иммунореагентам. используемым для идентификации Т-лимфоцитов человека // Методология, организация и итоги массовых иммунологических обследований: Тезисы докладов Всесоюзной конференции (Ангарск. 23-25 июня 1987 г.). -Ангарск. 1987,- С. 188-189 (соавт. Свирежева М.Н., Скрябина Э. Г.. Кондратьева М. Л.).

23. Разработка стандартных отечественных биореагентов для оценки иммунного статуса // Актуальные вопросы микробиологии, эпидемиологии и иммунологии инфекционных болезней: Тезисы республиканской юбилейной конференции. посвященной 100-летию

Харьковского Н11ИМВС им. И.И.Мечникова (Харьков, 13 октября 1987 г.).- Харьков, 1987,-С. 109-111 (соавт. Кускова 3.Р., Пехенько В.Г., Менявцева Т. А.,' Колмакова М. В., Лимарева Т.Д., Кондратьева М.Л., Абдулкина Н. Г.).

24. Опыт разработки биореагентов для оценки иммунного статуса человека // Актуальные вопросы биотехнологии:' Материалы Всесоюзной научной конференции (Ленинград, 14-16 января 1987 г.).- Ленинград. 1987,- С. 18-19 (соавт. Кускова З.Р.. Менявцева Т.4., Пехенько В.Г.. Колмакова Н.В.. Лимарева Т.Д.. Кондратьева М. Л.. Абдулкина Н.Г., Сергеева И.А.).

25. Состояние иммунного статуса у больных стертой формой клещевого энцефалита, пртекавщего на фоне описторхоза // Иммунологическая недостаточность, клинические и лабораторные методы выявления. Иммунокоррекция: Тезисы областной научно-практической конференции.- Томск, 1988,- С. 36 (соавт. Портнягина Л. К.. Кондратьева М. Л., Лепехин А. В., Гулина Т. И.).

26. Опыт разработки иммунодиагностических препаратов и тест-систем // Там же. - С. 79-80 (соавт. Менявцева Т.А., Кускова З.Р., Колмакова М. В.. Лимарева Т.Д.. Кондратьева М.Л.. Феоктистова A.C.).

27. Структура иммунорегуляторных клеток как отражение их взаимодействия при инфекционных заболеваниях // Ж. микробиол.-1988.- Ы 3.- С. 66-69 (соавт. Лепехин A.B.. Пашнева Т.Е.. Бу-жак Н.С.. Кондратьева М.Л.. Портнягина Л.К.).

28. Влияние различных факторов на показатели клеточного и гуморального иммунитета -у больных хроническим описторхозом. Сообщение 1. Показатели клеточного и гуморального иммунитета у больных хроническим описторхозом в зависимости от длительности болезни // Мед. паразитол. - 1988,- N 2.- С. 18-21 (соавт. Лепехин A.B., Бужак Н. С., Васильев Н. В.).

29. Получение антивидовых коныогатов для иммуноферментного анализа // Медико-биологические препараты и иммунологическая реактиЕНОсть организма: Материалы XXIY итоговой конференции ТомНИИ^ и ТМИ.- Томск. 1988.- С. 40-41 (соавт. Менявцева Т.А.. Лимарзва Т.Д.).

30. Оценка развития вторичного иммунодефицита как отражение функционирования иммунокомпетентных клеток у больных хроническим описторхозом с различной длительностью заболевания // Экспериментальная и клиническая иммунология на востоке страны:

Тезисы докладов научной конференции. - Красноярск, 1988,- С. 125-126 (соавт. Бужак Н.С., Паинева Г.Е., Лепехин А. В.). '

31. Применение иммуноферментного анализа для контроля специфической активности антисывороток к вазопрессину // Вопр. мед. химии, - 1988.- N 5. - С. 114-116 (соавт. Менявцева Т. А., Лимарева Т. Д., Масенко В. П.).

32. Влияние различных факторов на иммунный статус у больных хроническим описторхозом. Сообщение 2. Изменения иммунологических показателей у больных хроническим описторхозом с разной кратностью лечения хлоксилом // Мед. паразитол. - 1989,- N 5. - С. 21-24 (соавт. Бужак Н. С.. Лепехин А. В.. Кондратьева М.Л.).

33. Изучение иммунного статуса больных клещевым энцефалитом с помощью набора иммунореагентов для определения субпопуляций лимфоцитов челзека // Ж. микробиол.- 1989.- N 11.- С. 61-64 (соавт.. Кондратьева М.Л.. Портнягина Л.К.. Лепехин A.B.).

34. Динамт'ка иммунологических показателей у больных хроническим описторхозом после лечения хлоксилом в зависимости от длительности болезни // Там же.- 1989,- N 12,- С. 114-115 (соавт. Лепехин A.B.. Васильев Н.В.. Бужак Н.С., Кондратьева М.Л.. Киселев В. П.).

35. Разработка иммунодиагностических препаратов и тест-систем для микроанализа // Первый Всесоюзный иммунологический съезд: Тезисы докладов (Сочи, 15-17 ноября 1989 г. ).-М.. 1989. - Т. 1,- С. 169.

36. Разработка тест-систем для иммунологической диагнстики соматических заболеваний // Там же.- С. 162 (соавт. Менявцева Т. А., Лимарева Т. Д., Феоктистова А. С.).

37. Получение иммунной асцитической жидкости мышей, содержащей антитела к фрагментам иммуноглобулинов // .Вирусные и бактерийные препараты: Труды ТомНИИВС и ТМИ.- Томск: Изд-во Томского ун-та. 1989.- Т.35.- С. 106-110 (соавт. Лимарева Т.Д.).

38. Состояние иммунной системы у больных хроническим описторхозом, работающих .на промышленных предприятиях с различным антропогенным воздействием // Научные основы оздоровительной работы при гельминтозах и некоторых арбовирусных инфекциях.-Омск. 1989.- С. 86-90 (соавт. Бужак Н.С., Лепехин A.B.).

39. Влияние инвазии описторхисами на клиническое течение и исходы брюшного тифа. Сообщение 4. Перекрестно-реагирующие с комплексным антигеном из марит 0.fellneus антигены 3. typhi и

их возможная роль в исходе брюшнотифозной инфекции, протекающей на фоне описторхознсй инвазии // Мед. паразитол.- 1990,- N 4. - С. 32-35 (соавт. Лепехин А.В.. Менявцева Т. А. ).

40. Определение ревматоидных факторов и гомореактантов им-муноферментным методом // Медико-биологические препараты и иммунологическая реактивность организма: Материалы XXYI итоговой конференции ТомНИИВС и ТМИ. - Томск. 1990. - С. 48-49 (соавт. Лимарева Т.Д., Менявцева Т. А., Сергеева И. А.).

' 41. Опыт получения антител к легким цепям иммуноглобулинов человека и кролика // Актуальные вопросы медицинской биотехнологии и прикладной иммунологии: Тр.да ТомНИИВС и ТМИ.- Томск: Изд-во Томского ун-та, 1990,- Т. 36,- С. 80-85 (соавт. Лимарева Т.Д., Абдулкина Н.Г., Менявцева Т.А.. Диков N.M.).

42. Влияние антигельминтиков бильтрицида и хлоксила на уровень клеточного и гуморального иммунитета у больных хроническим описторхозом // Мед. паразитол.- 1991,- H 2,- С. 11-13 (соавт. Лепехин A.B., БужакН.С.. Кондратьева М. Л. ).

43. Получение кроличьих антисывороток к ангиотензину II и их характеристика с помощью твердофазного ИФА // Актуальные вопросы медицинской биотехнологии: Материалы научной конференции." Томск. 1991,-Т. 2,-С. 50-52 (соавт. ШульгаН.В.. Феоктистова A.C.).

44. Разработка иммуноферментного анализа IgM-антител к возбудителю списторхоза // Там же,- Т. 1,- С. 167-169 (соавт. Менявцева Т.А.. Стручкова C.B.).

. 45. О наличии антигенной общности у 0. fellneus с белками сыворотки крови человека // Описторхоз. Современное состояние проблемы, перспективы развития: Тезисч юбилейной конференции.-Тюмень, 1991.- С. 204-206 (соавт. Кускова З.Р.. Менявцева Т.А., Стручкова C.B.).

46. Разработка иммуноферментного метода диагностики острого описторхоза // Там же,- С. 140-142 (соавт. Менявцева Т.А., Стручкова C.B., Лимарева Т.Д., Колмакова М.В., Степанова Т.Ф., Сушков ¿:И.).

47. Субпопуляции Т-лимфоцитов у больных раком желудка // Вопрогч онкологии.- 1992,- N 7-8.- С. 800-805 (соавт. Дизер И. А., Смольянинов Е. С., Тихонов В. И. ).

43. Иммуноферментный метод определения ревматоидных факторов IgH.IgA и IgC классов // Клиническая лабораторная диагнос-

тика,- 1992,- N 9-10.- С. 48-50 (соавт. Лимарева Т.Л . Меняв-цева Т. А.).

49. Разработка иммуноферментного метода определения класс-пецифичеоких ревматоидных факторов // Первый съезд иммунологов России: Тезисы докладов (Новосибирск. 23-25 июня 1992 г.).-Новосибирск, 1992.-С. 397-398 (соавт. Лимарева Т.Д., Менявце-ва Т. А.).

50. Иммунологические показатели больных инфарктом миокарда в динамике // Актуальные вопросы медицинской биотехнологии и прикладной иммунологии: Труды ТомНИИВС и ТМИ.- Томск: Изд-во Томского ун-та, 1992,- Т. 37. С. 171-177 (соавт. Кондратьева М.Л., Пушкарева И.З.. Марков В. А., Карпов Р. С.).

51. Приготовление эритроцитарных диагностикумов для определения В-лимфоцитов // Там же,- С. 127-130 (соавт. Кондратьева М.Л. , Лимарева Т.Д., Сергеева И. А.).

52. Кроличьи антисыЕоротки к ангиотензинам. сообщение I. Получение антисывороток к ангиотензину I и их использование в иммуноферментном анализе // Экспериментальная и клиническая иммунология,- Томск! 1995.- С. 43-48 (соавт. Кондратьева М.Л., Шульга Н.В.).

53. Кроличьи антисыворотки к ангиотензинам. Сообщение II. Получение и характеристика антисывороток к ангиотензину II // Там же. - С. 87-92 (соавт. Кондратьева М.Л., Шульга Н.В.).

54. Опыт получения антисывороток к инсулину и изучение их пригодности для микроанализа // Там же.- С. 73-78 (соавт. Ме-нявцева Т. А., Кондратьева М. Л.).

55. Получение и характеристика кроличьих антисывороток к сердечному тропонину С // Там же.- С. 78-83 vcoaBT. Феоктистова А. С., Менявцева 1.А.).'

56. Иммуноферменгная тсстсистема для серологической диагностики острого описторхоза // Там же.- С. 60-65 'соавт. Менявцева Т. А., Колмакова М. В., Степанова Т. Ф.. Постникова Т. Ф.. Лепехин А. В., Сергеева И. А., Стручкова С. В.).

57. Polyclonal antibodies to Opistorchis fellneus: preparation and characterization // XYI European congress of allergology and clinical Immunology.- Madrid, 1995,- Abstract N 0873 (соавт. Kondratyeva M.. Menyavtseva T., Sergeyeva I.. LepyokhlnA.. Stepanova T.. Postnlkova T.).

58. Diagnosis of acute and chronic opisthorchiasis In

solid phase ELISA // Там же,- Abstract H 0874 (соавт. Henyavt-seva T., Kolmakova M., Lepyokhln A.. Stepanova T..Postnlkova T., Lukashova L.. Buzhakh N. ).

59. Immune status In patients with opisthorchiasis depending on the disease periods // Там же,- Abstract N 0877 (соавт. Lepyokhln A.. Buzhak N.. Kondratyeva M.. Odlntsova L., Lukashova L.).

60. Получение антисыворотки к антигенам Opistorchis felineup и ее характеристика // Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине: Материалы международного симпозиума. посвященного 150-летию со дня рождения И.И.Мечникова и 90-летию Уфимского НИИВС им. И.И.Мечникова НПО "Иммунопрепа-рат".- Уфа. 1995.- Часть 2.- С. 92-96 (соавт. Менявцева Т.А.. Кондратьева Н.Л.. Сергеева И. А., Колмакова М. В.. Степанова Т.Ф.. Постникова Т. Ф.. Лепехин A.B.).

' 61. Получение и характеристика поликлональных антител к антигенам Opistorchis fellneus // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии,- 1995,- Т. 1.- N 1,- С. 52 (соавт. Кондратьева И.Л., Менявцева Т. А.. Сергеева И.А.. Лепехин А. В., Степанова Т.Ф.. Постникова Т. Ф.. Бражникова H.A.).

62. Диагностика острого и хронического описторхоза методом твердофазного ИФА // Сибирскчй журнал гастроэнтерологии и гепатологии. - 1995,- т. 1.- M 1. - с. 48 (соавт. Менявцева Т. А., Колмакова И.В., Лепехин A.B.. Степанова Т.Ф., Постникова Т.Ф.. Лукашова Л. В.. Бужак Н. С. ).

63. Иммуноферментный ' анализ в диагностике хронического оысторхоза // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии,- 1995,- Т. 1,- H 1.- С. 47-48 (спавт. Лукашоьа Л.В..Лепехин A.B., Бужак H.С. Колмакова М.В. ).

64. Иммуноферментный а..ализ в диагностике описторхоза. Сообщение I. Разработка метода иммуноферментного анализа IgM -антител к опксторхозному антигену // Мед. паразитол,- 1996.-Н 1 (в печати) (соавт. Менявцева Т.А.. Стручкова C.B., Колмакова M.J.. Степанова Т.Ф., Лепехин A.B.. Майер В.А. ).

65. Иммуноферментный анализ в диагностике описторхоза. Сообщение II. Характеристика иммуноферментной тест-системы для диагностики острого описторхоза // Там же. - (соавт. Менявцева Т. А.. Стручкова C.B.. Колмакова М. В., Степанова Т.Ф.. Лепехин А, В.. Мзйер 3. А. ).

66. А. С. N 1767974 (СССР) Способ получения гипериммунной антиописторхозной сыворотки / Томский ордена Трудового Красного. Знамени научно-исследовательский институт вакцин и сывороток; Тюменский научно-исследовательский институт краевой инфекционной патологии: Авт.изобрет. Ратнер Г.И., Менявцева Т.А., Сушков В.И., Стручкова C.B. Заявл. 10.07.90 г.; N 4849836; Зарегистрировано в Гос. реестре изобретений СССР Э.06.92 г.

Заказ 21 Тира л 100 экз. УОП ТГУ, Томск, 29, lliiKinim.i.4.