Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Получение моноклональных антител к К99 и F41 адгезивным антигенам E. coli и разработка на их основе иммуноферментной тест-системы

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

АЛМАТИНСКИЙ ЗООВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ

ТТа ii[);U!;ix рукои'си

31У1\АПТАЕ1> Ка патбек Пгшзабекотшч

ПОЛУЧЕНИЕ М0НОК.1О11А.1Ы1Ы\ АНТИТЕЛ К Ш Н т АДГЕЗИВНЫМ АНТИГЕНАМ E.COLI

Л РАЗРАБОТКА НА ИХ ОСНОВЕ ИШНОФЕРШТИОЙ ТЕГТ-ИИ'ТЮШ

1 в 00.03 — иегерииарная микробиологии, иммунология.

мш.нюто.-югл» и пнфгкмлош'ЫС бо.н'.чни

:i:itn:)Tii!.l\

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание уч(чн'»н croiiemi кандидата ветеринарных наук

АЛМАТЫ, 1993

Работа выполнена в лаборатории по изучению инфекционных болезней молодняка сельскохозяйственных животных биотехнологйче-ского центра Акмолинского сельскохозяйственного института.

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, доцент К. К. Муканов.

Ведущая организация: Кустанайский сельскохозяйственный институт.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

А. Л. Котова,

кандидат ветеринарных наук Ш. Ж. Турсункулов.

Защита состоится « /'/' » ОЛлЫХъ'А-^^- 1993 г. в /О часов на заседании специализированного совета Д 18.01.02 при Алматииском зооветеринарном институте (480013, Алматы, пр. Абая, 28).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Алматияского зооветеринарного института.

Автореферат разослан « 1993 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат ветеринарных наук доцент

II. Н. АХМЕТСАДЫКОВ

ОБЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТ

Актуальность.

Эыерихиоз - острая инфекционная болезнь протекающая в энте-ритной форме или в виде сепсиса. Среди инфекционных болезней молодняка сельскохозяйственных животных эшерихиоз является одним из самых распространенных заболеваний. Возбудителем заболевания являются патогенные штаммы эшерихий. Особенность заболевании вызываемых эшерихиями определяется их способностью колонизировать места обитания и продуцировать термостабильные и термолабильнке токсины.

Известно, что адгезивные антигены играют важную роль в прилипании эшерихий к эпителиальным клеткам кишечника. К99 и Р41 адгезивные антигены являются наиболее важными факторами патоген-ности кишечной палочки. Штаммы эшерихий, содержащие указанные антигены, как правило, обнаруживаются при эшерихиозе у телят, поросят и ягнят.

При постановке диагноза, особую роль играет определение па-тогенности эшерихий. Для этого проводят бактериологическое исследование материала, которое предусматривает выделение чистой культуры, определение патогенности на белых мышах, а также исследование чистой культуры с помощью антиадгезивных моноспецифических сывороток• Однако проведение этих исследований требует достаточно много времени до 7 дней.

При эшерихиозе особую актуальность имеет проблема выбора компонентов бактерий для диагностикумов, что связано с множественностью серологических вариантов эшерихий. В настоящее время наметилась определенная стратегия в диагностике эшерихиоза, которая заключается в обнаружении факторов патогенности (адгезины, токсины), т.е. разрабатываются иммунореагенты обнаруживающие упо-

- 2 -

мянутые диагностически важные компоненты бактерий.

Одним из надежных " инструментов" в разработке диагностических тест-систем являются моноклональные антитела (МКА) получаемые методом гибрвдомной техники. Интерес к гибрвдомной технике определяется тем, что монохлональные антитела продуцируемые изолированным клоном клеток - это достаточно чистый белок, а не нео| ределенная гетерогенная смесь, которая, изменяется с каждым иммунизированным животным и даже с каждой порцией крови одного и топ же животного. Поскольку МКА гомологичны, проблема перекрестных реакций становитсь менее острой, чем в реакциях с обычной поли-клональной сывороткой.

Цель исследования. Целью настоящей работы является получена моыоклоиальных антител к К99 и Р41 адгезивным антигенам эшерихий и разработка на их основе тест-системы для определения патогенны эшерихий в пробах фекалий.

Основные задачи исследований:

1. Отработать методы очистки К99 и адгезивных антигенов

2. Получить гибридные клетки, продуцирующие моноклональнне антитела к К99 и ИГ адгезивным антигенам.

3. Изучить основные иммунохимические свойства полученных мо ноклональных антител.

4. Разработать иммуноферментный метод обнаружения адгезивны антигенов в пробах фекалии на основе использования моноклональ-ных антител.

Научная новизна и практическая значимость.

Отработаны методы очистки адгезивных антигенов, позволяющие получать достаточно чистые препараты К99 и Р41 адгезивных.антиге нов. Оптимизированы методы иммунизации мывей линий ЖА1|В/о,обес-

:иЕающие получение высоких титров антител в сыворотке крови. :.учены гибридные культивируемые клетки, продуцирующие моноклона-

:ые антитела к К99 и Г41 антигенам.

На штамм гибридом ЗР6Д получено авторское свидетельство на Сретение под № 1773938 от 8 июля 199И года.

Впервые разработан сэндвич вариант иммуноферментного анализа ; обнаружения адгезивных антигенов в пробах фекалий на основе ис-[ьзования моноклональных антител.

I. Получение моноклональных антител к К99 и Р41 антигенам ¡рихий.

Z. Изучение основных шмуко-хшичеекгас характеристик получен: моноклональных антител.

3. Разработка иммуноферментной тест-системы на основе использо-

гая моноклональных антител для диагностики эшерихиоза.

Вне^ение^ материалы диссертационной работы используются в Моратории по изучению болезней молодняка с.х. животных биотехно-пического центра и на кафедре микробиологии и зоогигиены лолинского сельскохозяйственного института

Апробация, основные результаты исследований долйжены на Все-озной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии (г. Це--юград, 1991) и на межлабораторном совещании сотрудников биотехнического центра и ветеринарного факультета Акмолинского ОХИ, Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 научных работ.

Диссертация изложена на 106 раницах п состоит из введения, литературного обзора, собственных следований, обсуждения полученных результатов, выводов, практиче-их предложений к списка использованной литературы. Список литера-ры включает 144 наименований работ отечественных и зарубежных ав-

горов. материалы диссертации иллюстрированы 5 таблицами, 3 фотографиями и о графиками.

¿¡ате^иалы^и^методы Работа выполнена в лаборатории иммунодиагностики инфекционных болезней молодняка с.х. животных биотехнологического центра Акмолинского Оль. Для выделения K9S и F4I антигена использовали Е.со цл'ам;.-;ов 09 и 0141 которые были получены из лаборатории бактериологии BiiSB.

Очистку антигенов проводили методом дифференциального ультрацентрифугирования и гельфильтрационной хроматографией С R.E. Isaacson, 1977; de Graaf F.K., 1983).

Чистоту очищенных препаратов антигенов определяли методом электрофореза по V.K.Laemmli,1970 . Концентрацию белка в препаратах антигена определяли методом связывания белка с Кумасси синим по Брэдфорду, М.М., (1976).

При иммунизации мышей линий BALB/c очищенными препаратами антигенов E.COLI использовали двухнедельную схему. Первую иммунизацию проводили 25 мкг антигена с неполным адьювантом (¿рейнда. Через неделю животных иммунизировали 3 дня подряд 2Ь мкг антигена в 0,01 I*! аСБ рН-7,2. Через 3 дня после последней иммунизации селезенку использовали для гибридизации.

Гибридомы получали при слиянии миеломной линий X-ob.Ag -8-о.о.З. с лимфоцитами мышей с помощью Ь0% полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 4000. Для выявления гибридных клонов, продуцирующие моноклональные антитела, осуществляли тестирование клонов методом иммуноферментного анализа С ®А ) с применением очи

щенных антигенов е концентрации 10 мкг/мл. Положительные клоны гибридных клеток клонировали методом лимитирующих разведений.

Для культивирования миеломных клеток и гибридом использоеэ-ли среду Ri3MI-I640 ( Gibco , Шотландия) с добавлением 20 мл/л L ~ глютамина ( Gibco,Шотландия), 0,1 М 2-меркаптоэтанола - 0,3 мл/л (Sigma ,США), HLTES - 3,375 г/л,(А.т1тес! .Швейцария), писувата натрия - 10 мл/л, NaHCOj - 37 г/л, 10* к объему среды Детальной сыворотки телят С Sigma ,'JiiiA), пеницилина - 1000 Ед/мл и стрептомицина - I мкг/мл ( Gibco , Шотландия). Селективную среду с гипоксантином,аминоптерином и тимидином (ГАТ) готовили путем добавления 2мл 50 кратного концентрата ГАТ в 100 мл приготовленой среды.

Продуктивность гибридом определяли методом иммуноферментно-го анализа в течение 8 дней. Для этого в 24 луночные планшеты с

с

одинаковой плотностью высевали 2x10 клеток/мл гибридом и ежедневно из лунок отбирали пробы для тестирования в ИФА с целью установления концентрации иммуноглобулинов и титра антител в су-пернатанте культуралььой жидкости.

После клонирования гибридные клетки наращивались до большой массы в культуре клеток. Затем 2хЮ^клеток гибридсдо вводили вну-трибрюшинно мышам линий ВА^В/с, которым за дней до этого вну-трибрюшинно введен пристан в дозе 0,5 мл/гол. По мере образования асцитной опухоли собирали асцитную жидкость.Очистку антител из последней осуществляли высаливанием раствором сульфата аммония до 50% насыщения.

Изотип антител определяли s реакции диффузионной преципитации (РдП) с моноспецифичоскими сыворотками к субклассам иммуноглобулинов фирмы Сигма, CiuA.

Для установления константы связывания иммунологические план-

веты в 3 рядах лунок сенсибилизировались антигеном в оптимальной с. концентрации и в 3 рядах ниже оптимальной. Затем на них раститро-вывали очищенные сульфатом аммония МКА, начиная с 5 мкг/мл. После проявления реакции по полученным данным строили графики и определяли концентрацию антител,связывающих 50% антигена. Подставляя

эти данные в формулу Ксв —------------- определяли константу

А Мав - 2 Мав'

связывания моноклональных антител, где Мав - концентрация иммуноглобулинов в нг/мл связывающих 50% антигена, иммобилизированного в концентрации 5 мкг/мл, Мав' - концентрация иммуноглобулинов в нг/мл связывающих 50% антигена, иммобилизированного в концентрации 10 мкг/мл.

Электрофорез антигенов и МКА проводили в полиакриламидном геле (ПААГ) по методу laemmli V.,(I970), иммуноблотинг осуществляли по методу Остерман Л.А. (1981). Коньюгат моноклональных антител с пероксидазой хрена готовили перийодатным методом по Каканв . 1974.

При создании тест-системы для обнаружения К99 и F4I антигенов с использованием МКА, использовали сэндвич вариант иёА на нитроцеллюлозной мембране.

Результаты исследований Получение и очистка адгезивных антигенов С учетом продуктивности штаммов E.coli для выделения и очистки К99 и F4I антигенов нами отобраны штаммы 09 ц 0141.

При выборе оптимальных вариантов выделения адгезивных антигенов из кишечной палочки использовались различные способы обработки клеток. Для этого кишечная палочка обрабатывалась 2 М мочевиной, тритоном X-IOO, додецилсульфатом натрия, ультразвуком и гомогенизатором. Результаты показывают, что обработка раствором тритоном Х-ЮО и додецилсульфатом натрия и ултразвуком приводит

к значительному снижен1« адгезивных антигенов. Наиболее оптимальным методом для этих целей является метод обработки 2 М мочевиной и разрушение бактериальных клеток на гомогенизаторе.

U целью выбора наиболее эффективных методов очистки К99 антигена были испытаны методы, описанные E.B.Isaacson, (1977) и F.K.de Graaf , (1980). Результаты анализа методик очистки К99 антигена показали, что очистка антигена по методу do Graaf обеспечивает получение чистого препарата антигена с концентрацией белка 0,3 мг/мл. Методика очистки описанная Isaacson позволяет получить из 4 литров бактериальной массы препарат антигена с концентрацией 0,5 мг/мл.

Результаты показали, что очистка антигена методом гельфиль-трационной хроматографии позволяет получать наиболее чистые препараты антигена. При очястке К99 антигена методом дифференциального ультрацентрифугирования препараты незначительно загрязняются посторонними белками. На электрофореграмме очищенный препарат К99 антигена распределяется в виде одной белковой полосы с молекулярной массой 18,5 килодальтон (КЗа).

для очистки антигена также были использованы два метода По результатам сравнительного анализа нами выбраны методики описанные do Graaf F.K., (1982) и Isaacson R.E., (l977).

Метод F.К.Graaf , предусматривающий гомогенизацию бактериальной массы и последующую хроматографию позволяет получать очищенный препарат F4I антигена в количестве 0,25 мг/мл. Метод Н.Е. Isaacson (1977) предусматривает разрушение бактериальной

массы на гомогенизаторе и последующее дифференциальное ультрацентрифугирование материала, огот способ позволяет получать 0,5 мг/мл препарата F4I антигена с небольшими примесями посторонних

белков. Очишенныр препараты подвергались анализу методом электрофореза в 11% потаакриламидном грле с 0,1% раствором додецилсуль-фата натрия. Электрофорез препаратов Р41 антигена показал, что он гомогенен и распределяется в виде одной белковой полосы в зоне с молекулярной массой 30 КДа. Молекулярные массы К99 и антигенов определялись с помощью денситометра фирмы Хоефер Сайн-тифик (США).

Получение моноклональных антител к К99 и РШ адгезивным антигенам кишечной палочки С целью получения гибридом, мыши линий йАЬЗ/с были иммунизированы очищенными препаратами К99 и антигенов. Оптимально оказались двух недельная схема иммунизации. Данная схема иммунизации позволяет получать достаточно высокие титры антител к указанным антигенам. Титр антител в сыворотке крови иммунизированных мышей к К99 антигену составил 1:2560, а при иммунизации Ш антигеном 1:20000.

Гибридизацию проводили с помощью полиэтиленгликоля по общепринятой методике с небольшими модификациями. Результаты исследования показали, что соотношение миеломных клеток .и спленоцитов иммунизированных мисей 1:5 является наиболее оптимальной. Нами получено 86 клонов гибридом, б из которых секретировали антитела специфические к К99 антигену. При использовании спленоцитов к антигену получено 563 клона гибридом. Однако только б из них секретировали антитела к антигену эшерихий (Таблица.1).

Таблица I.

Количественная характеристика результатов гибридизации клеток

К какому Количество ! Количество ! Количество

антигену высеянных ! полученных ! положительных

получено лунок в ! клонов ! клонов

планшете

К99 763 86 (II*) б а%)

F4I 763 563 (73$) б (IJ0

В результате было отобрано 4 наиболее активных субклонов.

В данной работе мы приводим описание характеристик штаммов гибридом ЗРбД и ЗД8Е4, продуцирующие моноклональные антитела к К99 антигену и CI0F6 и А36Й, продуцирующие моноклональные антитела к F4I антигену эшерихий.

Одним из основных характеристик гибридом является их продуктивность in vitro , которая определяется в течение 8 дней после высева их в планшет с питательной средой. Продуктивность штаммов гибридом CI0F6 и ЗРбД составила 50 мкг/мл антител. Тогда как клоны ЗД8Е^ и А38Д продуцируют 25 мкг/мл антител (Рис.1). Как видно из графиков, антитела к К99 антигену начинают появиться в куль-туральной среде на 2 день, а антитела к F4I антигену на 3 день, затем продукция антител повышается до 8 дня. При этом в динамике продукции антител просматривается небольшая разница. Так, у клона 3F6A наблюдается два пика в продукции антител на 3 день и на 5 день. У клона CI0F6 такой пик наблюдается всрго один раз на 5-6 день. Динамика продукции антител у клонов ЗД834 и А38Д несколько иная. У этих штаммов гибридом повышение продуктивности антител начинается с 3 по б день и далее этот показатель остает-

конц. . антител

мкг/мл

--ЗГ6Д

---СЮГ6

--- ЗД8Е4

—— А38Д

Т-1-Г

7 8 д ни

РиоЛ. Графики продуктивности клонов ЗГбД, С10Рб, ЗД8Е4 и А38Д.

ся на одном уровне.

С црлью получение препаративных количеств моноклональных антител гибридные клетки вводили внутрибрюшинно мышам линии ВАьВ/с. Рост опухоли в асцитной форме наблюдался у более 7С% животных. Концентрация моноклональных антител в асцитной жидкости обычно составляла от 8 до 16 мг/мл.

Класс и субкласс антител определяли в реакции диффузионной преципитации с моноспецифическими антисыворотками фирмы Сигма, Результаты показали, что вср 4 гибридомы продуцируют моноклональ-ные антитела класса (см.таблицу 2).

Очищенные сульфатом аммония препараты антител анализировались методом "электрофореза в ПААГ. Ррзультатч показали наличие крупных белковых полос с молекулярными массами 67,5 КЛа (тяжелая

цепь) и 29,5 КДа (легкая цепь).

Важнейшей характеристикой моноклональных антител является константа связывания (КСв) . Для определения Чг.в моноклональных антител с адгезивными антигенами использовали твердофазный метод МА. Качественную оценку результатов проводили по методу предложенный Веа-ЬЪу^ 1987.

зкстинкция экстинкция

(усл.ед) Сусл.ед)

у Олег <оспд> о>ст>^г г. ьч конц.иммуно-

глобулинов (нг/мл)

I Г 11 I I I I I I ■ I

!§'§§я ^кбнц.иммуно-

йс\г м глобулинов

Б (нг/мл)

Рис.2. Определение константы связывания моноклональных антител А - ЗРбД; Б - ЗД8Е4.

1 - кривая показывающая реакцию антител с 10 мкг/мл

антигена

2 - кривая показывающая реакцию антител с 5 мкг/ мл

антигена

ркстинкция зкстинкция

(усл.ед) (усл.ед)

Рис.3. Определение константы связывания моноклональных антител А - СОТб; Б - А38Д

1 - кривая показывающая реакцию антител с ГО мкг/мл

антигена

2 - кривая показывающая реакцию антител с 5 мкг/мл

антигена

Как видно из графиков концентрация моноклональных антител связывающих 50% антигена различна. Так например концентрация антител штамма гибридом ЗР6Д, связывающих 50% антигена составляет 156 нг - 78 нг (Ксв = ЗхкАг1), у штамма СЮБб - 312 нг и 39

нг (Ксв^хЮ^Г1), у штамма ЗД8Е4 - 2500 нг и 1800 нг ( Ксв =

V т

гхК^М-1) и у штамма. А38Д _ 2500 нг и 1250 нг (Ксв = Зх10 .

Таблица 2

Основные характеристики моноклональнчх антител к К99 и Р;Я адгезивным антигенам

Найме- ¡Мияломная Суб- .Продуктивно- !Титр ян~ Констан- К ка-

нование!линия класс сть штаммов !тител та свя- кому

гибрид-¡клеток анти- в культуре !после зывания анти-

ных' ! тел клеток !очистки гену

клеток ! ¡сульфатом ам-! ¡мония получены МКА

кон- !титр цен- !анти-

трац.!тел мг/мл!

1

ЗР6Д ЗД8Е4

ХбЭ.А^-8.653 15й 0,05 1:128 1:2СООСО ЗхЮ^Г1 К99 Х63.А^>8.653 18в 0,025 1:64 !• 100000 2x10%

.VI

К99

С1СР6 ХбЗ.А^-8.653 1ве 0,05 1.-256 1.-3200С0 ЫО^Г1 Ш А38Д X63.A9_8.653 16& 0,025 Х;б4 1:160000 ЗхЮ^-1 -Ш,

Из таблицы видно, что антитела продуцируемые штаммами клеток ЗГбД и СЮРб характеризуется достаточно высокой аффиностьи.

Специфичность моноклональных антител к К99 и Р41 антигенам изучали с помощью метода иммуноблотинга. Результаты иммунобло-тинга показали, что МКА клонов ЗР6Д и ЗД8Е4 специфически взаимодействуют с фимбриальным белком с молекулярной массой 13,5 КДа. Антитела, продуцируемые штаммами гибридом С10Р6 и А38Д взаимодействуют с Р41 антигеном с молекулярной массой 30 КДа. Эти данные соответствуют литературным данным. Учитывая достаточно высокую аффиность и- специфичность полученных монокдональных антител мм использовали их для разработки иммунофермектной тест-системы для обнаружения К99 и Р41 антигенов. В этой связи важно* значение имеет изучение перекрестных реакции с непатогенными эшерихи-ями, а также с возбудителями других кишечных инфекции. Для изучения перекрестных реакции использовали точечный твердофазный иммуноферментный анализ на нитроцеллюлозной мембране. Результаты

- 14 -

исследований приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Результаты изучения специфичности моноклональных антител в иммуноферментном анализе

Штаммы

гибрид-! ных "штТ клеток | 09

I 1

Эиерихии

_____Iбактер

Цитро-

ТПротвусТщ~ге л л~'

! шт. I шт. !непато-1дикий !

! 0101! 0141 ¡генный !пат. Г

! К12 ! . !шт.1-401штамм !

I ! ! ! !

флекснер

+ + + +

ЗГ6Д + + ЗД8Е4 + +

бюге + +

А38Д 4 +

Как видао из таблицы, моноклональные антитела не реагируют с нвпатаггнными штаммами кишечной палочки Т-40, а также с другими бактериями кишечной группы. Антитела реагируют с патогенными штаммами 0101, К12, 09, 0141 и полевыми патогенными штаммами эшерихий.

Исследование ¿0 проб чистых культур Е.ссИ методом иммуно-ферментного анализа и реакции агглютинации показало, что иммуно-ферментный анализ выявляет в 17 пробах наличие К99 антигена (85%) и в 9 пробах наличие Г41 антигена (45%). Использование моноклональных антител в реакции агглютинации показало, что реакция агглютинации выявляет в 18 пробах наличие К99 антигена и в 9 пробах наличие Р41 антигена. Тогда как реакция агглютинации с поликлональными антителами выявляет наличие К99 антигена в 7- пробах (35%) и в 6 пробах наличие Р41 антигена (30%). Результаты приведены в таблице 4.

Таблица Ч

Результаты сравнительного исследования культур E.coÜ на наличие и F4I антигенов с использованием моноклональ-ных и пплкклональных антител

Накмено-! вание ! реакции ! Антитела! Количество культур -! Положительный ! ! результат ! ! К99 Т piï Т ö процентах "К99 I"fÏÏ

Ш МКА 20 17 9 85 45

РА МКА 20 18 9 90 45

РА ПКА 20 7 б 35 30

МКА - моноклональнне антитела ПКА - полшслональные антитела

Таким образом, результаты показывают, что чувствительность

реакции агглютинации на основе использования моноклональных антител значительно выше чем реакция агглютинации с использованием поликлональных антител.

Разработка тест-системы нч основа моноклональных антител для обнаружения адгезивных антигенов зшерихиЯ в пробах П" то логического материала :1ч ос:'пве использования ;!о:5оклональных антител к К9Э и адгезивным антигенам эшерихий нами разработана иммунофермрнткэя тест-система и изготовлена опытная серия набора. Набо'р предназначен для исследования патологического материала на налгчие К99 и Р41 антигенов в точечном твердофазном иммуноферментном анализе на нитроцеллюлозной мембране. Лля обнаружения адгезивных антигенов могут быть использованы пробы фекалия, содержимое тонкого отдела кишечникч, паренхиматозные поганы и брыжречные лимфоузлы.

- к- -

Действующим началом тест-системы является моноклональные антитела к К99 и Р41 адгезивным антигенам эшерихий.и коныогат моноклональных антител к указанным антигенам с пероксидазой хрена. Для разработки тест-системы использован сэндвич вариант им-муноферментного анализа. Тест-система строго специфична, положительная реакция наблюдается только с К99 и Р41 адгезивными антигенами эшерихий. С непатоганными штаммами эшерихий а также с другими бактериями кишечной группы реакция отсутствует. Для проведения реакции необходимо полоску нитроцеллюлозноЯ бумаги (носитель) с точечной адсорбцией первых моноклональных антител выдерживать в испытуемом материале. Затем носитель переносят в раствор моноклональных антител, меченных пероксидазой. При наличии в образце К99 или Р41 антигена на бумаге образуется комплекс: моноклональкые антитела - адгезивный антиген - моноклональные антитела, меченные пероксидазой. При добавлении субстрата 4-хлор -1-няфтол комплекс выявляется по образованию серо-фиолетовых точек. Чувствительность метода 2 1СГб - б 1(Гб г белка в I мл или 250-500 тыс.микробных клеток в I мл.

Результаты исследования показали, что оптимальной концентрацией моноклональных антител наносимых на нитроцеллвлозную мембрану является 20x10"^ г/мл и ниже. Раститровка первых моноклональных антител наносится на мембрану в объеме 0,001 мл.

Проверка коньюгатов моноклональных антител с пероксидазой показала их достаточно высокую активность от 1:500 до 1:1000.

В набор для иммуноферментного определения адгезивных антигенов входят полоски нитроцеллюлозноЯ мембраны с адсорбированными антителами, мвноклональные антитела к К99 к Б'И антигенам, меченные пероксидазой хрена (коньюгат), положительные контрольные К99 и Р41 адгезивные антигены, концентраты буферов для отмы-

еки носителя и разведения коньюгатов, буфер для разведения субстрата, твин-20, 4-хлор-1-нафтол, этиловый спирт а такие перекись водорода.

Испытание_набора Д,ля_обнару»йния_К99_и_Р41 адгезивных_антигенов эшерихий в_пробах фекалий

С целью испытания набора для обнаружения К99 и Г41 антиген-нов кишечной палочки нами исследованы 80 проб патологического материала от телят с диарейным синдромом. Пробы материала исследовались бактериологическим и биологическим методами, а также точечным твердофазным иммуноферментным анализом на нитроцеллю-лозной мембране.

При проведении бактериологического исследования из суспензии стерильно отобранных проб фекалий делали посев на среду Эндо, мясопептонный бульон и скошенный мясо-пептонный агар. Через <¿4 часа инкубирования при 37°С каждая типичная для эшерихий колония, вырастая на среде Эндо или мясо-пептонном агаре пересевали на среду Симмонса и мясо-пептонный бульон.

В случае отсутствия роста колоний на плотных средах пересев на элективную среду проводили из мясо-пептонного бульона после предварительной бактериоскопии мазков, приготовленных из данной бульонной культуры и окрашенных по Граму.

Для определения ферментативных свойств исследуемых бактерий, 4-х часовую культуру, выращенную на мясо-пептонном бульоне пересевали на среды Гисса содержащие лактозу, маннит и индикатор бромтимоловый синий, который придавал среде болотно-зеленный цвет. Ферментативная активность выделенной культуры учитывалась через 24 часа и в последующие 4 суток инкубирования.

- ib -

iJepeceb из .«ясо-пептонного бульона на мясо-пептонный агар проводили с цельь получения чистых культур, необходимых для наработки антигенов и заражения белых мышей. Бактериоскопию мазков, окрашенных по Граму проводили в течение всего периода исследования.

Анализ результатов показал, что из 8о проб патологического материала в 79 пробах выделены культуры кишечной палочки. На среде Эндо эти бактерии дали окрашенные колонии J - *ормы.

Исследование ферментативной активности показало, что все ьыделенные культуры экерихий изменяют цвет среды Гисса, содержащей индикатор бромтимоловый синий от болотно-зеленного до желтого. Причем изменение цвета наблюдалось только в тех средах, где содержался маннит или лактоза. Эти данные показывают, что исследуемые бактерии ферментируют лактозу и маннит. На среде йиммонса культуры бактерии не дали роста, что указывает на то, что бактерии не утилизируют цитраты.

На жидких средах бактерии вызывали интенсивное помутнение. Баткериоскопия мазков, приготовленных из бульонной и агаровой культуры показала присутствие беспорядочно расположенных небольшие грамотрицательных палочек.

Таким образом проведенные исследования выкьили соответствие культурально-биохимических свойств выделенных культур с осноены-i.'ü характеристиками эшерихий.

Дль оценки патогенности выделенных эшерихий проводили биопробу. Белых мышей массой 15-16 грам заражали внутрибрюшинно микробной взвесью в дозе оСЮ млн.клеток. Концентрацию бактерий устанавливали с помощью бактерийного стандарта.

иказалось, что из 79 штаммов кишечной палочки 44 были патогенными для белых мышей. Патогенными считались те бактериальные кулыуры, которые на вторые сутки убивали одну или более мышей. Исследование этих культур в реакции агглютинации с СК-сыворс^'ками позволило отнести большинство иэ них к серогруша;.. Обо и 0101. Реже встречались штаммы 09, 010 и 018.

наряду с эшерихиями, из патологического материала выделены и другие бактерии кишечной группы, в том числе протеи были изолированы из 27 проб, кампллобактерии из 4 проб, энтерококки из Ь проб, цитробактеры из 3 проб и синегнойная палочка из I пробы.

При исследовании вышеуказанных 8о проб патологического материала методом точечного твердофазного иммуноферментного анализа на нитроцеллюлозной мембране в 48 пробах обнаружены адгезивные антигены. В том числе в 30 пробах обнаружен К99 антиген, в 4 пробах Г41 антиген эшерихий. В 14 пробах патологического материала обнаружена ассоциация двух антигенов (Таблица о).

Таблица 5

Результаты исследования проб фекалий на наличие К99 и Г41 антигенов

Наименование ! Количество ! Положительный результат

метода проб ;------------------

[ | Всего ! К99 ! Р41 ! К99+Р41

и И 8Ь 48 30 4 14

из 48 штаммов эшерихий, у которых методом иммуноферментного

- го -

анализа были обнаружены адгезивные антигены 36 оказались патогенными для белых мышей. Таким образом, сочетание пагсгенности и наличие адгезивных антигенов выявлено в 7э% исследованных культур.

Анализ корреляционной связи между патогенностью и наличием адгезивных антигенов, выполненный методом определения корреляции знаков,показал, что между патогенностью и адгезивностью есть определенная связь. Об этом свидетельсвует то, что коэффициент корреляции знаков, оцениваемый в интервале от 0 до I, составил 0,58. Известно, чем ближе коэффициент корреляции'к I, тем выше корреляционная связь.

I. Отработаны методы выделения и очистки К99 и Г 41 антигенов эшерихий на основе использования методов дифферменциального ультрацентрифугирования и гельфильтрационной хроматграфии, позволяющие получать чистые препараты антигенов.

2. Получены штаммы гибридных культивируемых клеток, продуцирующие моноклональные антитела к К99 и Б41 антигенам эшерихий и изучены их основные характеристики.

- 21 -

3. Моноклональные антитела обладают высокой специфичностью к КЭ9 и F4I антигенам. Константа связывания моноклональных антител составляет 2x10V1 - ЗхГС^-1. Все штаты гибридных клетох продуцируют мышинные иммуноглобулины класса IgG .

Ка основе использования моноклональных антител разработан набор для обнаружения К99 и F4I антигенов эшерихий в пробах Фекалии методом иммуноферментного янялизп. Диагностическая ценность набора V. специфичность г^дтвррэдгнл бактериологическими исследованиями. Чувствительность набор« составляет 2x10"^ - бхГО-^ г белка в I мл или 250-500 тыс. микробных клеток в I мл.

5. Установлено, что в исследуемых пробах фекалий наиболее часто обнаруживаются К99 антиген, как в отдельности (51$), так и в ассоциации с F4I антигеном (16$). F4I антиген в отдельности встречается в 21$ случаях от числа Исследованных проб. Установлена корреляционная связь между патогенностью и продукцией адгезивных антигенов кашечной палоЧки.

Практические предложения

1. Линия гибридом ЗРбД депонирована в связи с подачей заявки на изобретение в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур 26.12.90 под номером ВСКК/П/ 519 Д.

2. Для быстрого обнаружения К99 и F4I адгезивных'антигенов эшерихий в пробах патологического материала можно использовать разработанный нами набор реагентов для выявления указанных антигенов методом иммуноферментнпгч анализа.

Список опубликованных работ I. Мукантаев К.Н., Муканов К.К, Получение и характеристика моноклональных антител к К99 антигену E.coli . Материалы няуч-

ной конференции по с/х биотехнологии. Целиноград, 1991, стр.

рб.

2. Муканов К.К., Мукантаев К.Н. Разработка тест-системы с использованием моноклональных антител для диагностики желудочно-кишечных инфекции телят. Материалы научной конференции по с/х биотехнологии. Целиноград 1991, стр. 134.

3. Муканов К.К., Мукантаев К.Н., Кенжебулатов 5.Н. Получение и характеристика моноклональных антител к К99 антигену E^coli Зестник сельскохозяйственных наук Казахстана. 1991, №7. стр. 87.

Муканов К.К., Мукантаев К.Н., Кенжебулатов Б.Н., Соколова H.A., Шегидевич Э.А. Эффективный препарат в диагностике колибактери-оза молодняка. Биотехнология. Приложение и экспресс информация п Новости науки Казахстана" 1991, стр.105.

P E 3 Ivj hi E

MaHajia^a E.coli fiaKTepHHjiapflbiH a#re3HBTi aHTHreHflepiHe

^OHOKJiOHa^abiK aHTH^eHejiep a;iy scaHe co.'iapflb'. naft,na;iaHy apKH-iu -iM^yHjibiK (JepMeHTTiK TecT-cncTewa .nailbUflay xeHinjie co3 do.iraH

rieuece 250000-500000 <5aKTepna.HHK KneTKajiapjaw aHHKTayra MYMKiH-aiK depe^i.

■J?his dissertation concern to the obtaining of Monoclonal antibodies to the K99 and F41 adhesive antigens of E.coli. The ELISA test was developed for detection of these antidens on the basis of ¡„onoclonal antibobies.

The senseSivity of ELloA test 2x10-®-6x10-® g. protein per 1 ml or 2p0000-1300j00 bacterial cells per 1 ml.