Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Адгезивные свойства кишечной палочки и профилактика колибактериоза птиц

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК МЕЖРЕГИОНАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ЦЕНТР "ПЛЕМПТИЦА" САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ

, ОД

. : на правах рукописи

СМИРНОВА Любовь Ивановна

АДГЕЗИВНЫЕ СВОЙСТВА КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ И ПРОФИЛАКТИКА КОЛИБАКТЕРИОЗА ПТИЦ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Санкт - Петербург 1996

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте птицеводства

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук,

профессор А.Н.Борисенкова

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, •

профессор А.Я.Батраков; кандидат ветеринарных наук, профессор П.Ф.Сонш

Ведущая организация - Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Защита состоится " 25 " иН^НА 13Э6 года в 11 часов на заседании диссертационного совета 11.120.20.02 при Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины по адресу: 198084, Санкт-Петербург, Черниговская ул.,5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины.

Автореферат разослан " 56 " И А9\_1995 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

О.В.Узюмова

1. СЕ14«Я XA°At™Z^CT:?XA работы

Актуальность те к ы. 3 настоящее вре^'я ьромш-лекное птзцево (ство, как и многие другие отрасли народного хозяйства налей страны, переживает глубокий кризис. Часто воз?.7жашше стрессовые ситуации, связанные с невозможностью обеспечения оптимальных условий, светового, тешетэатурного, влакностного режима со-1бряания, необходимого уровня и качества кошления тяготят к значительное снихенна резистентности организма птиц, обострению течения различных заболеваний, в том числе колибактериоза.

Проб явкой колибакгертдаза птип зянкгглись мнотие исследователи /Грошева V.A. и тр. ,1979, /-ртемьева С.А., ".976, 19®, Байдев-лятов 1..Е. и то., 1987, ^здчук U.A., 1Э90, "очемяка. Н.В., 1991/. Однако, несмотря на большое количество, предложенных средств лечения и профилактики этой инфекции, проблема колибактериоза в современных условиях исключительно актуальна. Связано это со способностью элерихнй прижив .пять с я в организме птиц, цирку лотов ать по замкнутому циклу, то есть перепеваться с яйпом, с посгоянныш значи-тельнкмк экзопоступленияш возбудителя в хозяйствах в еле дсгвие ко-йтакинацяи кормсв, со способностью э-ерзхий длительное время сохраняться в объектах ьнелней сое ты, с развитием у них полпрезистент-аости ко кногам антибиотикам и ти/когг^епгротвк. Колнбактериоз регистрируется не толью как самостоятельное заболевание, но таксе в виде ассоциаций с ту?тоне: бактериальными и bztchhme болезнями птип. Сн значительно снижает кмг.?;нный статус птиц и поэтому оказывает отрицательное влияние на эффективность вакцинации против вирусных и бгктерпачьнах болезней. Имеющиеся средства специфической профилактики колибактериоза не всег обладают достаточной эффективностью, ч-:о обьясняется 1.<но"кест?еннссть.о сероваоягнтсв воз-бу ^кгеля и нг.ткчгем у неге большого чиста *-скторое патогенное?!:.

- 4 -

В последние годы с целью профилактики колибактериоза животных создаются вакцины нового поколения, включающие в себя поверхностные антигенные комплексы. Высказывалась возможность создания коммерческих вакцин с использованием адгезивных антигенов Е. coli / Naveh W.1^ е.а.,1984, Ävi 1 a Аллилуев А.П., 1988/. Имеются данные, свидетельствующие о том, что вакцинные препараты, включающие отдельные виды фиыЬрий, могут сообщать защиту против энтеротоксигенных E.coli Включение в вакцины адгезинов в значительной степени увеличивает их протективные свойства /Mc.Covmell МЛ,«.а..Ш), Sanbnetii R.J„1994

Однако роль E.coli с адгезивными свойствами в патологии птиц изучена далеко не достаточно. Мало данных о спектре и процентном сс отношении эшерихий, выделяемых при проявлениях колибактериоза у пте разных видов в различных возрастных группах, о выяснении корреляций адгезивности с вирулентностью и иммуногенностью, что имеет существенное значение в подборе штаммов при конструировании коли-вакцин. Актуальным является выяснение этих вошюсов.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось изучение адгезивных свойств эшерихий, выделенных от птиц разных видов, пш различном клинико-эпизоотическом течении колибактериоза, из различных географических регионов, выяснение корреляции их с вирулентными и иммуногенными свойствами и подбор штаммов эшеряхий с учетом их биохимических, вирулентных, антигенных и адгезивных свойств для создания инактивированной поливакцины.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

- изучить распространение E.coli, патогенных для сельскохозяйственной птицы разного возраста и вицов, в различных географических регионах, определить их культурально-морФологические, биохимические свойства, принадлежность по О-антигенам.

- изучить вирулентные свойства выделенных культур E.coli.

- определить типы ацгезинов E.coli по тесту 1-маннозочувст-вительности в реакции иммуноадгезивной гемагмштинащш и

- 5 -

в реенции агглютинация с-антладгезивными сввороткаш;

- изучить адгезивную активность выделенных культур на коцелях:

- эритроцитов человека;

- эритроцитов петуха;

- эпителиальных клеток трахеи цыплят, с определением среднего показателя адгезии(СНА) и коэффициента участия клеток-маленей в адгезивном процессе - К;

- изучить иммуногенные свойства эшерихий, обладающих высокой адгезивной активностью и подобрать штаммы Б.соИ , с учетом их биохимических, вирулентных, антигенных и адгезивных сеойств, для создания кнактиБироЕанной коли-вакцаны;

- провести дифференциацию патогенных микроорганизмов семейства энтеробактерий, близких к E.coli, с учетом их культурально-морфологи-ческих и биохимических свойств.

Научная новизна. Собрана коллекция штаммов E.coli выделенных от разных еидов птиц при различном клинико-эпизоотичес-ком течении колибактешоза в разных регионах, е хозяйствах различного технологического направления, определены типы адгезинов и степень адгезивной активности. Разработаны методы определения адгезивных свойств E.coli , выделенных от птиц, на моделях, близких к их биологическому типу: эритроцитах петуха и .эпителиальных клетках трахеи цыплят. Выяснена корреляция адгезивных сеойств эаерпхий с вирулентными свойствами "зучены иммуногенные свойства эзерихий, обладающих выраженными ацгезивн-нга свойствами. Подобраны штаммы эшерихий для создания инактив:тоЕанной вакцины на основе растворимых антигенных комплексов. ПпоЕедена ци^еренщгация E.coli в *?кк~обйологичес1сой системе ''^ВАНТ^'НГ' от дротах энтеробактерий, проявлявших сходные с ними ку-льтуралыю-моР'Т'ологичеекие & биохимические свойства по минимальному набору дифференциально-диагностических сред, "центифгадапованчыв б системе "'ЗАЕГГ'Г.М-П" культуры Klebsiella oxiloca бы.ли вирулентными.

- 6 -

Практическая ценность работы. На основании проведенных исследований разработана и предлагается методика изучения адгезивных свойств E.coli, выделенных от птиц, на моделях эритроцитов петуха и эпителиальных клеток трахеи пыплят. Определен зависимость между вирулентностью и степенью адгезивной активности эаерихий, подобраны штаммы для вакцины против колибактериоза с учетом их биохимических, антигенных, вирулентных и адгезивных свойств, Получены лабораторные образны вакцичы, обладающей широким спектром специфической защиты.-,. Установлено, что сходными по биохимическим свойствам с S.coli могут быть бактерии вида Klebsiella oxitoca которые обладали высокой вирулентностью по отношению к цыплятам и могут, следовательно, являться этиологическим фактором, ведущим к заболеванию и гибели птиц.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены, обсуждены и одобрены на заседаниях Ученого совета ВНИВИ птицеводства / 1983-1.395 гг./, на Научно-производственной ко нференции национального отделения России Всемирной научной ассоциации по птицеводству /Санкт-Петербург, 19ЭЗ/, на Научно-производственном координационном совещании "Проблемы ветеринарной профилактики в промышленном птицеводстве"/Петрозаводск, 1394 г/.

Публикация. По теме диссертации опубликованы 3 работ в которых изложено ее основное содержание.

Структура и объем работы. Тиссертация из ло-кена на страницах машинописного текста и включает введение, о зор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использован ной литературы и приложение, ^абота иллюстрирована 14 таблицами, 3 рисунками, 1 фотографией. Список литературы включает 220 наименс ваний работ, в том числе Э8 - зарубежных исследователей.

2. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Материалы и методы исследований

Экспериментальная' часть работы по теме диссертации выполнялась в течение 138Э-1Э93 годов в отделе микробиологии ВНИВИ птицеводства и в птицеводческих хозяйствах, расположенных в 10 различных географических регионах. Идентификаций энтаробактешй с помощью микробиологической системы "К8АНТ7СД-П" выполняли в лаборатории микробиологии ЛГИАГ имени Отто. %ссертационная работа является частьа плана ЧИР отдела микробиологии ВШВШ1 с номером го с. регистрации 01990067849.

Проведено бактериологическое исследование 24Э трупов цыплят, 35 трупов индюшат и 32 трупов утят разного возраста, 37 куриных эмбрионов, замерших на поздних стациях развития.

В лабораторных опытах использовано Я25 цыплят мясного кросса "Бройлер-6", 30 кур яичного коосса 288, породы белый леггорн, 3 петуха мясного кросса "Бройлер-6", 76 взрослых беспородных белых мышеи, 4 взрослых морских свинки, 90 кутаных эмбрионов 7-3 суточных. Эритрошты человека Q/I/ группы получали на Станции переливания крови IS 1 города Ленинграда. Эритроциты коровы, лоаади, барана получали из крови соответствующих животных в совхозе "Красная Балтика" Ленинградской области.

Изучение морфологических, н'лльтуральных, биохимических свойств E.coli и их идентификаций по минимальному набору диТчеренциально-ди-агностчческих сред проводили, руководствуясь "Методическими указаниями по микробиологической диагностике заболевзний, вызываемых эн-теробактериями", 1384 и "Методическими указаниями по бактериологической диагностике колибактериоза /эшерихиоза/ яиеотных", 1ЭЭ1 г, согласно определителе Берги, 1334 г.

Изучение Ферментативных свойств и идентификацию эшеряхий в

"Автоматической системе для идентификации бактерий" фирмы "АЗВОТ"

/СМ/ "КЗАНТУМ-Я" проводили согласно прилагаемому "Описание проведения идентификации бактерий" в одноразовых "Кассетах для иценти-

- 8 -

фикавди энтеробактерий". Идентификация производилась путем определения реакционного профиля в комплекте биохимических субстратов, срг енив&ощихся с матрицей вероятности, содержащейся в памяти компь^терг Реакции измерялись с помощью цветных pH индикаторов, которые детектировались спектрофотометрически в приборе "КЗАНГУМ-П", после чего производилась распечатка идентификации "КЗАНТУМ-П".

Серологическую типизацию Е. coli по О-антигеяу проводи.™ согласно "Наставлению по применении агглютинирующих О-колисывороток". утвержденному ГУВ Госагропрома СССР 16 июня 1990 года & 115-6а.Ис-пользовали агглютинирующие О-колисьшоротки производства Армавирской биофабрики.

Вирулентные свойства Е,coli проверяли на моделях: интрапериго-неального заражения 30-35 суточных цыплят/смывом суточной агаровой культуры в дозе 1 млрд микробных клеток/, интпаперитонеального заражения беспородных взрослых белых мнлей /смывом суточной агаровой культуры б дозе 500 микробных клеток/мл/, а такае на модели интра-орбитального заражения суточных цыплят по методике Борисенковой А.Н,/1978/.

Адгезивные свойства эшерихий определяв после выращивания их на средах, оптимальных для синтеза антигенов адгезии. Использовали мясо-пептонный бульон, мясо-лептонный агар, жидкую и плотную среду Минка, приготовленную по прописи, предложенной во "Временном наставлении по применению агглютинируюзих сывороток к адгезивным ан-тлгенам эшерихий К38, К9Э, Э87Р, F41, А20," ВНИИ прикладной микробиологии, 1989 г.

Восстановление адгезивных свойств эшерихий пооле длительного хранения культур проводили двухкратным пассанирование на 7-Э-даев-ных куриных эмбрионах, а также двухкратным пассанированием на жидкой среде Минка с последующим выращиванием на плотной среде ?.4тнка.

Тепы адгезинов определяли в реакции иммуноадгезиЕКОй гемаггла-тинации /РМГА/ с использованием эритроцитов человека, морской сви-

- 9 -

нки, коровы, барана, лошади, петуха. Реакции ставили в двух вариантах*. в отсутствии и в присутствии 2-х процентного раствора Т-маннозы, выявляя маннозочувствительные и маннозорезистентные адгазины. В опыте использовали культуры эшерихяй, выращенные на средах, оптимальных для синтеза антигенов адгезии: ШБ - для выявления неспевдфиче-ских фимбрий 1-го типа, маннозочувствнтельных; среде Ийнка - для выявления специфических, маннозорезистентных адгезинов. Реакшзз ставили на полистироловых пластинах с лунками. Руководствовались методиками, описанными Брилис В.И. и др.,1986, Землянкнной Л.П., Мартыненко Л.Л., 1Э89, Зарозой В.Г., 1ЭЭ1.

Выявление маннозорезистентных специфических адгезивных антигенов ЮЭ, К88, Э37Р, Б41, А20 проводили с помощью коммерческого набора диагностических антиадгезивных агглютинирующих эшерихиозных сывороток производства ЗШГТ прикладной микробиологии, согласно "Временному наставлению по применению аггтатиняруащих сывороток к адгезивным антигенам эшерихий К88, ЮЗ, Э87Р, Р41, А20", 1Э8Э.

Степень адгезиЕной активности эшерихий на модели эритроцитов человека изучали по методике, предложенной Бриляс В.И. я лр.,1Э86г. , Адгезивную активность эшерихий определяли при микроскопировании окрашенных,фиксированных препаратов из взвеси эритроцитов и микроорганизмов. Адгезивные свойства оценивали с помощью среднего показателя адгезии, CIA, под которым понимали среднее количество микробов, прикрепившихся к одному эритроциту /эпителиоциту/ при подсчете 25 эритроцитов, учитывая не более 5 эритроцитов в одном поле зрения.

При использовании в качестве модели адгезш эритроцитов петуха, применяли их 3-х процентную взвесь в ФосФатном буфере, приготовленном на изотоническом растворе хлорида натрия, рН 7,2. Предварительно эритроциты, полученные из гепаринизированной крови петуха, были двахцы отмыты центрифугированием при 300 об/шнуту 5 минут.

Эпителиальные клетки трахеи цыплят 20-30-суточного возраста получали соскабливанием частиц эпителия трахеи сколом предметного

- 10 -

стекла из предварительно промытых фосфатным буферным раствором отрезков трахеи. Суспензию клеток отмывали центрифугированием при 30Q об/минуту 5 минут, затем ресуспендировали б йосфатном буфере. Пробирки со смесью эпителиальных клеток и энерихий выдергивали в течение часа при 37°С при встряхивании, затем омывали от неацге-зировавшюс бактерий центрифугированием. Исследовали высушенный, химически Фиксированный, окрашенный по ^омановскому-Гимзе мазок.

Для получения поверхностных антигенных комплексов эшерихии дважды пассадаювали на жидкой среде Минка, затем культивировали на плотной среде Минка при 37°С в течение 6-8 часов, смывали изотоническим раствором хлорида натрия; далее растворимые антигенные комплексы получали по методике, предложенной Борисенковой А.Н., 137t В опытах по изучению имкуногенности использовали цыплят 20-30 суточного возраста.

Полученные результаты экспериментальных исследований обрабатывали статистически с использованием критерия Сгы>цента, придер'хи-ваясь правил вариационной статистики /В.П.Еремин, 1Э75/.

2.2. Характеристика Е. coli , выделенных от птиц разных видов и возрастных групп,при остром течении колкбактериоза, в различных географических регионах

Наш проведены исследования по выделению эшетжхий из трупов павших и вынужденно убитых птиц при энзоотиях котшбактериоза в 10 географических регионах: Северо-Запад, Карелия, Центр России, Юг России, Западная Сибирь, 7Ьльний Восток, Украина, Белоруссия, Северный Кавказ, Средняя Азия. Культуры E.coli были выделены при остром течении заболевглия. Пш этом отмечали следующие патологоана-томические признаки: 7 цыплят*1-8 дней заболевание протекало по типу острого сепсиса. При этом отмечали катаральную пневмонию, серозный перикардит, кровенаполнение сосудоБ в мшще сердш, коовоизли-

яния на эпикарде, на печени, катаральное воспаление слизистой кишечника и 'зедточньв. перитонит. У цшляг и индюшат 25-36 -суточного Еозраста отмечали перикардиты, перигепатиты, увеличение печени и селезенки и их застойную гиперемию, серозно-фябшнозный аэросакку-лит, пневмонии, иногда - энтериты. 7 утят помимо указанных изменений отмечали увеличение почек и кровоизлияния на них. У замеряих куриных эмбрионов наблюдали гиперемию и кровоизлияния на коясных покровах, различение и изменение цвета желтка, в некоторых случаях -лизис тканей эмбриона.

От замерших куриных эмбрионов, из трупов паЕаих и вынужденно убитых птиц: цыплят, утят, индюшат разных Еозрастов, а такае при исследовании клоачного мазка клинически здоровых взрослых кур было изолировано 347 культур, идентифицированных по минимальному набору дифференциально-диагностических сред как E.coli . Из них из замерших кури.-да эмЗрионов - 106 культур, от цыплят 2-8 суток - 14 культур, от цыплят старше 25 суток - 177 культур, от утят - 14 культур, от индюшат - 16 культур, из клоаки клинически здоровых взрослых кур - 20 культур.

7 148 культур было проведено изучение биохимических свойств при помощи "Автоматической системы для идентификации микроорганизмов", фирмы "ABBOT" /США/ "КВАНГУМ-iI". После идентификации в "КВА-НТУМ-П" производилась автоматическая распечатка идентификации, включающая интерпретацию каждого отдельного теста /положительную или отрицательную/, биокод микроорганизма, рассчитывающийся из полота -тельного или отрицательного значения результатов 21 биохимического теста, идентификацию организма - от двух до пяти организмов, которые печатались в порядке уменьшения их вероятности, значение процента вероятности. Все микроорганизмы, с высоким процентом вероятности / /92,80-99,84W идентифицированное Ь системе "КВАНТУМ-П" как E.coli, ферментировали глюкозу, лактозу, маннят, арабинозу, рамнозу, сорбит, давали положительную реакцию с метиловым красным и отрицательную - Фогеса-Проскауэра. Нй одна из ку.льтур не дала положительной

- 12 -

реакции с адогштом, инозитом, триптофаном, не утилизировала цитрат. В отношении других тестов культуры проявляли активность разной степени выраженности.

ИЗ 148 культур, отнесенных по результатам бактериологического исследования к роду эшерихия, по О-антигену оказалось возможным тк-пировать даль Э2 культура - 62,16t. При этом наибольший удельный вес приходится на серовар 078 - 33 культуры, что составляет 35,86t от всех типированных. На втором месте по встречаемости - серовар 02 - 24 культуры /26,08t/, на третьем месте - серовар 055 /10,85t/, 10 культур. СероЕар 01 встречался в 3,69t случаев от всех типированных, 015 - в 7,6t. Определялись такяе серовары 0111, 0126, 09, 04, 08, 0127, 0115. Существуют незначительные отклонения по частоте встречаемости эаерихий различных сероЕаров по географическим регионам и по видам птиц.

Не типировались со стандартными О-коли-сыворотками по О-антигену 56 культур - 37,83t от всех Еыделенных.

2.3. Вирулентные свойства выделенных культур E.coli,

У 128 культур E.coli , выделенных из трупов птие и эмбрионов при остром течении заболевания, были изучены вирулентные СЕойстьа в сравнении с 20 культурами кишечной палочки, выделенными из клоаки от клинически здоровых кур.

Вирулентные свойства выделенных культур определяли на моделях: Енутрибрзашнного и интраорбитального заражения цыплят и Е-нутрибрю-гганного заражения белых милей. 3 зависимости от сроков падежа зараженных аивотяых и патологоанатомических изменений, оцененных в баллах, культуры кишечной палочки были определены как высоковирулентные, вирулентные, слабовирулентные и авярулентные. Высоковирутант-ными считали культуры E.coli, которые вызывали гибель зараженных цыплят или белых мшей через 1-3 суток после заражения, вирулентными - культуры, вызывающие гибель хотя бы одного зараженного животного в течение 1-5 суток, а при патологоанатомическом исследовании

трудов погиб'лих или убитых в конце опыта птиц обнаруживались изменения, характерные для колибактериоза , в 4 балла. Слабовирулентными считали культуры, в результате заражения которыми наблюдали гибель одного из подопытных тавотных после переболевания через 6 и более суток после заражения, а такие переболевание птиц с последующим выявлением патологоанэтомических изменений, характерных для колиба-ктериоза, оцениваемых в 3 и 4 балла по 4-х балльной шкале / 0-изме-нений нет, 1 балд - слабое поражение одного из органов, 2 балла -умеренный перикардит и перигепатит, 3 балла - перикардит, перигепа-тит, энтерит, 4 балла - пневмония, фибриьозный перикардит, перигепатит, энтерит. / Авирулентными считали культуры, не вызвавшие гибели ни одного из зараженных животных, а при патологоанагомическом исследовании убитых в конце опыта цыплят изменений, характерных для коли-бактериоза, не обнаруживали.

Было установлено, что из 128 культур E.coli , выделенных от павших и вынужденно убитых птиц 116 /90,gV обладали вирулентными свойствами,. При этом 12 культуры /36,, были отнесены к высоковирулентным, 32 культуры/27,ё - к вирулентным, 42 культуры/36,2/ - к сла-оовирулентным. 12 культур &.coli/9,4t/, выделенные,в основном,от вынужденно убитых цыплят, были евирулентны.

Высокой вирулентностью обладали культуры E.coli , выделенные от индеек, куриных эмбрионов, цыплят старше 25 суток. Большое количество высоковирулентных культур относилось к сероЕарианту 078 и к нети-пируемым по О-антигену. Высоковирулентными были тагае культуры серо-варов 02, 055, Olli.

Все культуры E.coli , выделенные, из клоаки клинически здоровых кур, были авирулентыми для цыплят, кроме одной - относящейся к сероварианту 078, которая проявляла слабую вирулентность - вызывала переболевение цыплят.

- 14 -

2.4. Определение типов адгезивных антигенов по тесту Ч-манно-зочувствительности в реакции ишуноацгезивной гемагглготи-нации /РЖГА/ и специфических антигенов адгезии в реакции агглютинации с антиадгезивныш сыЕоротками,

Изучение адгезивных свойств по данному тесту птзовели у 116 культур эшерихий, у которых ранее были изучены культурально-морФологиче-ские, биохимические, антигенные и вирулентные свойства.

По результатам постановки реакции иметноадгезивнои гемагглюти-наши - вариант маннозочувствительная гемагглютинапия - было установлено, что реакция гемагглютиаации с эритроцитами нескольких еидов животных и человека, не проявляющаяся в присутствии 1-манкозы, наблюдалась у 74 /63,®?/ из 116 исследованных культур. Из них 65 культур были вирулентными для цыплят и белых мышей, 9 культур были ави-рулентными, что составляет 37,71 от группы вирулентных и 45t от груп пы аЕцрулентных. Культуры, даюдие маннозочувствительную гемагглюти-нацию, являются носителями неспеци^ических, общих адгезинов /фимЗрий 1-го типа/.

По результатам постановки реакции иммуноадгезивной гемагглюти-нации - вариант маннозорезистентная гемагглютинапия - реакция гем-агглютяаацяи, проявляющаяся как в отсутствии, так и б присутствии Д-маннозы,наблюдалась у 20 культур E.colx /17,35?/ из 116 исследованных. При этом 18 из них были вирулентными для цыплят и белых милей, а две культуры - авирулентными, что составляет 13,3я; от всех вирулентных и 1С$ от всех авттрулентных. Культуоы эшерахий, дающие маняо-г зорезистентную реакцию гемагглютинаши, являются носителями маннозо-резистентных, специфических антигенов адгезии /адгезивных антигенов/

При определении специфических антигенов адгезии у таких культур с помощью коммерческого набора антиадгезивных КЭЭ, К88, 387Р, Р41, А20 - сывороток было установлено, что лиыь небольшая часть /8,31/ исследованных культур обладала искомыми адгезивными антигенами. Выявлены адгезивные антигены КЭЭ и К88, причем в большинстве случаев

/7С$/ они присутствовали одновременно и только у Еирулентньгх культур Опещтфические адгезивные антигены були определены у 10 из ^0 культур Б. со И, дающих мэннозорезистентную ^ИАГА. 10 других культур из этой те группы не взаимодействовали в реакции агглютинации с сыворотками из коммерческого набора.

2.5. Изучение адгезивной активности выделенных культу? Е.Со11 .

2.5.1. Определение степени адгезишой активности культур

Е.со1х по ША на модеда нативных эритрсгдтоЕ человека С /1/йЬ+ группы.

^ри изучении степени адгезивной активности культур Е.соИ на модели натиЕннх эритроцитов человека о/1/ группы по методу Брили с В. II. и до. , 1386, быте использованы кчкьтуры, вырешенные в условиях, оптимальных для накопления неспецкФических адгезииов и в условиях, оптимальных для накопления специфических адгезинов. Считали высокоадгеаквньши культуры Е.соН , имеющие с эритроцитами челоьека средний показатель адгезии /СТА/ - свыше 4-х, среднеадгезивными -от 2,01 до 4,0, низкоадгезивными - от 1,01 до 2,0 и неадгезивкыш -при СПА от 0 до 1,0. Коэффициент участия эритроцитов в адгезивном процессе был высоким и принимался за 100.

Из 116 исследованных культур выявлено по тесту неспецифических адгезинов 57 адгезивных, что составляет &3,1%. Из них высоноад-гезивными быта 28 культур /49,1^/, среднеадгезиЕными 18/31,6ч/. низкоадгезивными 11 /19,Ъ%/. При этом показатели адгезивной активности различался у вирулентных и авирулентных Е.соН. Наибольший удельный вес у вирулентных Е.соИ составляли культуры с высокой и средней степенью адгезивной активности - 42 культуры из 49 /85,7^ от Есех адгезивных/, тогда как среди авирулентных к'-льтур Еысокоадге-зивных не было вообще, а среднюю степень адгезии проявляли лишь 4 культуры. '

При определении степени адгезиЕной активности культур по тесту специфических адгезинов, адгезивную активность проявляли только

- Iß -

24 /20,7®/ из 116 исследовзнных культур. Как вирулентные, так и ави-рулентные культуры не были вксокоадгезивными, среднею степень адгб-зи1ной активности проявили 12,5t вирулентных э^ерихий и ни одной из груш:ы авирулентных. К низкоадгезивным отнесены 18,3 t вирулентных и 20t авирулентных культур.

Представленные данные свидетельствует о пряю.й зависимости ме:жг ду степенью адгезивной активности и вирулентностью культур E.coli .

2.5.2. Определение степени адгезивной активности кчльтур E.cöli на годеди нативных эритроцитов петуха.

При испо.льзовании в качестве модели адгезии нативных эритроцитов петуха так ад, как и в опыте с эритроцитами человека, определяли средний показатель адгезии /СНА/. Считали неадгезивными культуры Б. Coli , имеедие с эритроцитами петуха СПА меныле 2-х, низкоадгезивными - при СПА от 2,1 до 4,0, среднеедгезивннми - при СПА 4,1 - 6,0, высокоацгезиьными - при СПА больше 6,0. Коэффициент участия эритроци toe б адгезивном процессе в этом опите такае бал высоким и принимался за 100.

Из 116 исследованных культур с эритроцитами петуха по тесту не-специ'1ических адгезинов взаимодействовали 7 6 культур /65, ЕЙ/. Из ни ьысокоацгезивными были 32 kv-льтурь! /42.lt от 76/, среднеадгезивными - 13 культур /17,1л от 7б/, низкоадгезиЕными - 31 - /40,öt от 76/. НеадгезиЕныш оказалось 34,5% от 116 исследованных культур,

Адгезивность культур по тесту спепи.Тических адгезинов, как и в первом опыте,была гораздо слабее. Как адгезивные определены 25 /21,1 из 116 исследованных культур E.cöli. Из них высокоадгезивных не было, среднюю степень адгезивной активности проявили 15 культур /'60t > низкоадгезивлыш был:-! 10 культур /40t / .

Наш определен коэффициент корреляции ме'гду показателями СПА с эритроцитами человека и показателями СПА с эритроцитами петуха. Значение коэффициента корреляции, рассчитанного на 2ВМ, составило

О,94, что свидетельствует о достаточно тесной корреляционной зависимостью ме.тсду количеством адгезивных культур, выявленных с применение зм первой и второй модели.

В гоупав вирулентных культур с эритроцитами петуха взаимодействовали /проявляли адгезивные свойства/ 70,8t по сравнению с адгезн-ровавыики к эритроцитам человека 51, Ш>. В группе авируяентных коли-. ?естЕО адгезивных культур было одинаковым и в том и в другом опыте,

- 4С%.

"Различия в доле адгезивных E.coli для вирулентных и ашрулентных культур статистически достоверны при использовании как первой, так и зторой модели адгезии /р 0,05/.

Определение адгезивности E.coli , выделенных от птиц, с использованием эритроцитов петуха, является лучшей моделью по сравнению с эритроцитами человека, так как позволяет выявлять большее количество адгезивных культур.

2.5.3. Изучение адгезивной активности культур E.coli на модели эпителиальных клеток трахеи цыплят.

При использовании в качестве модели адгезии эпителиальных клеток трахея цшлят установили, что E.coli е этом варианте активно взаимодействуют с эплтелиоцитами. Опытным путем было установлено, что шткмальной для наблюдения являлась концентрация эпителиальных вле-?ок, соответствующая стандарту мутности 1 млрд микробных клеток/мл.

Адгезивную активность прояеляли ьсе исслезоЕанные культуры. 1роцент клеток, имевших на СБоей поверхности адгезировавлие микроорганизмы - коэффициент участия эпятелиоцитов в адгезивном поовессе-К

- сильно колебался в зависимости от того, к каким по степени адге-зиености культурам относилась испытуемая. Он составлял от 23±3 для шадгезивных культур /с эритроцитами человека и петуха/ до 98-2 для внесенных к высокоадгезивным. При этом на отдельных эпителиоцитах, ;ак правило, имевших нарушения целостности, адгезировало до 30 и бо-гее бактерий. Значение коэффициента корреляции меяду показателями СИ с эритроцитами человека составляет при расчете на 2Ш 0,62. злители-

- 13 -

альные клетки трахеи цыплят, как • модель .адгезии для E.coli , выделенных от птиц, наиболее близкая к биологическому типу, позволяют выявить начбо-тдачее число го^еяшально адгезивных культур.

2.6. Изучение ишуногенных сеойств эшврилм, обладающих высокой адгезивной активностью, и подбор штаммов E.coli,,для создания инактивированной коли-ваквдн

Для изучения иымуногенных свойств было отобрано 5 штаммов E.coli обладающих высокой адгезивной активностью, имеюцих как неспецифические, так и специфические адгезивные антигены, высоковирулентных для цыплят. По О-антигену штаммы принадлежали к наиболее часто выделяемым от птиц сероварам 078, 02, 055. Тва штамма не типировались со стандартными 0-коли-сыворотками.

Т"и из пяти штаммов было выделено из трупов цыплят, павших от острого коли-седсиса в Еозрасте 30 - 45 суток, один штамм - от 30-суточного индюшонка, один штамм - от 40-суточного стенка. Штаммы были изолированы от птиц в хозяйствах из разных географических регионов.

Из всех штамков были получены растворные антигенные комплексы по методике, обеспечивающей снятие поверхностных антигенов /Борисен-кова А.Н., 1376/. Полученными антиген шми кошлексаш быта иммунизированы 30-суточные цыплята. Через 14 дней цыплята были заракены гомологичными штаммами. Была установлена Еысокая протективная активность полученных растворимых антигенных комплексов, уровень продуктивной. за;циты был в пределах 92,1t. Результаты были статистически дэ стоЕерны по отношению к неимгунизированному зараженному контролю / р < 0,05/.

Для последующей серии опытов быт отобраны три штамма, высоковирулентные для цыплят, представляющие сероьары П78, 02 и нетшируе-. мый. Б формуле штаммов бы,ли представлены адгезивные антигены К83, КЗ Были изготовлены образцы моновакпины из трех штаммов и бивалентная вакшна на основе расхьорш^ых антигенных комплексов. После иммуниза-

- 19 -

цш 30-суточных цыплят было проведено их зар^ение гомо- и гетероло-гичными штаммами.

Результаты изучения протективных свойств лабораторных образцов моноваксян при заражении цыплят гомологичными штаммами свидетельствует об их высоких защитных свойствах: все вакцины защищали от заражения 90,0 - 94,иммунизированных цыплят. Достоверность по отношение к контролю р< 0,05. Пш заражении гетерологичныет штампами уровень протективной защиты составлял 72,0-80,Oí. Однако эти различия статистическ недостоверны, что указывает на широкий спектр защиты ида/унизитюванных цыплят. Это подтверждено в опытах на цыплятах, иммунизированных бивалентной вакциной, уровень протективной активности которой при заражении гомо- и гетепологичными штатами составил 81,2 - 93,3Í и 87,соответственно.

На основании полученных результатов нами были предложены штаммы, испо,льзоЕанные в изготоЕлента инактивироБанной сорбированной коли-Еакцины. 3 соответствии с приказом директора Всероссийского НИВИ птицеводства ;E¡ 38-а от 30.05.94 проведены внутриинстит.утские лабораторные комиссионные испытания инактивированной сорбированной вакцины протие колибактериоза.

3 настоящее время в отделе такробиологии ВНИВШ проеодится разработка технологии изготовления опктно-промьшленной серии енкци-ны.

2.7. Дифференциация патогенных дздкрооргенизмов семейства энтеробактерип, близких по свойствам к E.coll.

При идентификации микроорганизмов семейства энтеробактерий, проводимом по минимальному набору диФФеречциальпо-дяагностчческях сред, не Есегда удается отди'Т'^еренцяроБгть бактерии, сходные с E.coll по основным культ?рально-мор]ологическим и биохимическим свойствам.

3 процессе работы из кроен сердца четырех 3-х-с.уточных цыплят, погибзих при явлениях септицемии на птицефабрике, наш были изолированы 4 культуры, ферментирующие лактозу, глюкозу, сахарозу,

- 20 -

ианнит, образующие индол и не образующие сероводород, не растущие на среде Симмонса, не расщепляющие мочевину, дающие положительную реакцию с метиловым красным и сомнительную - Фогеса-Проскаузра. В системе "КВАНТУМ-П" эти культуры были с высоким процентом вероятности идентифицированы как Klebsiella охНоса.Ото было подтверждено и по гесту на Клебсиеллу - цветная реакция с 5-аминосалициловой кислотой в питательной среде /Сиеолодский Е.П.,1Э38/. Бее четыре культуры Klebsiella, oxjtocö- были вирулентными для цыплят при экспериментальном заражении, вызывая у них развитие острого сепсиса и гибель.

Выделение бактерий Ul.oxii.oca из крови сердца цыплят, погибших при явлениях септицемии и выявление у них выраженных вирулентных свойств указывает на то, что этот вид мо«ет являться этиологическим фактором, ведущим к заболеванию и гибели птиц.

Использование микробиологической системы "КВАНТУМ-П" для идентификации бактерий позволяет расширить спектр выделяемых патогенных и условно патогенных для птиц микроорганизмов.

- ?i -

В У воды

1. Колибактериоз имеет широкое распространение среди различных видов сельскохозяйственной птицы /цыплята мясных и яичных пород, куры, утки, индейки/ в хозяйствах различного технологического направления, расположенных в различных географических регионах.У цыплят первых дней жизни колибактериоз протекает в виде острого сепсиса и сопровождается острой катаральной пневмонией, серозным перикардитом. У более старших цыплят и индюшат при колибактериозе отмечают фибри-нознне перикардиты, перигепатиты, азросаккулиты, катаральные энтериты, у утят, кроме того, нефриты. Клинически здоровые взрослые куры могут быть носителями патогенного серовара E.colt 078.

2. Из трупов павших цыплят, индюшат, утят и замерших куриных эмбрионов выделено 347 культур этерихий. При изучении культурально-биэхимячееких свойств 148 из них по 27 тестам, в том числе по 21 в микробиологической системе "КВАНТУМ-П" все были идентифицированы как E.coli , обладали типичными признаками рода и вида. При типировании по 0-антигену вьщеленные культуры были отнесены к сероварам 078, 02, 055, 015, 01, OUI и некоторым другим. 37,8% культур не типировались со стандартными О-колисыворотками.

3. При изучении вирулентных свойств культур'кипечной палочки, выделенных из трупов цыплят, индюшат, утят и замерших куриных эмбрионов на моделях интраперитонеального и интраорбитального заражения цыплят и интраперитонеального заражения белых мьпгей установлено, что 116 из 128 культур являются вирулентными /90,61/. В зависимости от сроков гибели цыплят, количества павших и патологоанатомических изменений, учтенных по 4-х балльной системе, 42 культуры /36,2%/ были отнесены к высоковирулентккм, 32 культуры /27,6%/ - к вирулентным,

42 /36,2Й/ - к слабовирулентньм. 12 культур /9,4%/ были авирулентны, не вызывали гибели зараженных цыплят и белых мдаей.

4. При изучении адгезивных свойств з реакции кицуноадгезивной гемагглютинации по тесту Д-маннозы установлено, что 74 культуры /

- 22 -

/53,8$/ имели неспецифические адгезивные антигены /фимбрии I типа/, 20 культур /17,2$/ имели специфические маннозорезистентные адгезивны антигены. При типировании со стандартными антиадгезивными сывороткам 10 из них были отнесены к адгезивным антигенам К88, К99.

5. При изучении адгезивной активности по среднему показателю ад-гезии(СПА)на модели эритроцитов человека 0/1/ группы установлено, что 57 /49,1$/ культур, имеюдях неспецифические адгезины /филзб-рии 1-го типа/ обладали выраженной адгезивной активность^. Из них 23 ку.дьтур было высокоадгезиЕных, 13 культур - среднеадгезивных, 11 культур - низкоадгезиЕных. Установлена прямая зависимость между степенью адгезивной активности и вирулентностью ку.дьтур кишечной палонк У Еирулентных культур 85,7$ от всех, имеющих фимбрии 1-го типа - со ставляли E.coli высокой и средней степени адгезивности, тогда i-сак среди авирулентных культур высокоадгбзиЕных не было вообще, а среднюю степень проявляли лиоь 4 культуры. Культуры E.coli, имеющие спе цифические адгезины, были значите.льно менее активны.

6. Для определения адгезивных свойств £.coli, выделяемых от птиц, разработаны и предлагаются модели, близкие к биологическому типу - эритроциты петуха и эпителиальные клетки трахеи цыплят, кото рые позволяют выявить большее количество эшерихий, способных к адгезии. Если со стандартной моделью клеток-мищеней - эритроцитами человека адгезиЕныки были 49,1$ исследованных культур, то с моделью клеток-миаеней - эритроциты петуха - 65,5$ проявили выраженные адгезивные свойства., а при использовании эпителиальных клеток трахеи цыплят в качестве клеток-миденей практически все культуры E.col: проявляли адгезивную активность.

7. испытанные модели адгезии отличались по величине коэффициента участия клеток-мишеней в адгезивном процессе. E.coli взаимодействуют практически со всеет эритроцитами человека и петуха. Процент участия в адгезивном процессе меток эпителия трахеи сально варьирует и меняется в зависимости от степени адгезивной активное^ культуры.

- ¿3 -

Б. Штаммы E.coli, имеющие высокую адгезивную активность по отношению к эритроцитам человека, петуха, эпителиальным клеткам трахеи цыплят, в формуле которых присутствуют не специфические и специфические адгезивные антигены К99, К88, высоковирулентные для цшлят, обладают выраженными имкуногенными свойствам, защищают от заражения гомологичными штаммами 90,0 - 94,4"? иммунизированных цыплят /р <0,05/. 7!з этой группы отобраны дез штамма /073 и не тапируе-мый по О-антигену^ из которых на основе растворимых антигенных комплексов изготовлена лабораторные образцы шактивированной коли-вакцины, обладающей широким спектром защиты при затзачен',:и как гомо-так и гетерологичными штаммами - 81,2^-93,3^ н 87,5t соответственно.

9. Энтеробактерии, идентичные S.coli по культурально-морфологичес-ким и биохимическим свойствам, определяемым по минимальному набору дифференциально-диагностических сред, могут быть идентифицированы е 'йкробяологической системе "ТСТСАНТ'Ч.НГ'по 11 биохимическою тесту. В это»: системе от кишечных палочек были дифференцированы культуры Kl. oxibca выделенные из трупов 2-х суточных цшлят. Культуры Kl.oxiioca были вирулентны для шплят при интрап^итонегльном способе заражения, бузывзя развитие острого сепсиса и гибель ¿.ыплят в течение 24-48 часов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ П^ГД^ОЗЕН^Я Па основании прое6деаных исследоБМШл разработано и предлагается: 1. Использовать для определения адгэзг?Еных свояств E.coli, Еыделенннх от птиц, клетки-мишени эритроцитов петуха; использовать для определения адгезивных свойогв E.coli , Еыделенных от птгц, эпитетаельн^е клеткч трахеи цыплят.

П. При конструирование инактивированных ко та-вакцин отбирать штаммы E.coli , обладающие высокой адгезивной активностью, имеющие как общие /неспецифические/, так и специфические антигены адгезии, вксокоБирулентнне для цыплят.

3. Использовать для более точной идентификации сходных с

- ;4 -

по гшятльнощ набору шрерёвдально-зщагностичесащх сред энтеробактерии другие метода идентификации с болыдкм набором биохимических тестов: 'Микробиологическая система "КВАНТУМ-П" и другие.

СПИСОК РАБОТ, 0ПУБ®!К0ВАННЖ ПО ТЕЙЕ .ЛЙССЕРТА1Щ

1. Смирнова , Борисенкова А.II. Адгезивные свойства ¿¿таимо] кшечной палочки, изолированных от птиц при колибактериозе.// Сб. трудов ЗНИВИП "Системы и меры обеспечения экономичва.ого благополучия птицеводческих предприятий".,С.Петербург.-1993.-С.63-69.

2. Борисенкова А.Н., Рокдестзенская Т.Ч., Смирнова Л.И. Сравнительная характеристика антигенных, токсигенных, адгезивных и вирулентных свойств элешхий, выделенных от птиц.//Т.ез;'докл. конф. по птицеводству. Нац. отд. 'России ВПАЛ. С.-Петербург, Ломоносов, 1993.-С. "203-204.

3. Смирнова Л.И. Дифференциация Е.со11 и и1еЬе1е11а ОхНоса при лабораторной диагностике с помоям микробиологической системы "КВАН7У?»НГ// Тез. докл. меарег. неуч.-произв. коордкн. совецааия: Проблемы ветеринарной профилактики в пром. птицеводстве /'2-4 марта 1994 г/ ВНИВШ.Петрозаводский Гос.Университет. Петрозаьодск.-С.-Петербург-Ломоносов.,1994. -С. 18.