Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Факторы патогенности возбудителей эшериохиозов сельскохозяйственных животных

1 '5 л < ___

.'ЕРОССИЙСКИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ КОНТРОЛЯ, СТАНДАРТИЗАЦИИ И СЕРТИФИКАЦИИ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

На прагах рукописи

СВЕТОЧ Эдуард Арсеньевич

ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЭШЕРИХИОЗОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, Еирустдэгия, элпзютсязгна, михолзгмя л нммунслгтич

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени дог.тара ктерк верных нгук

Москва

1992

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте прикладной микробиологии.

Научный консультант - доктор медицинских наук, профессор Волковой К.И.

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Г.А.Грошева доктор биологических наук, профессор Г.И.Ежов доктор ветеринарных наук, профессор М.А.Сидоров

Ведущая организация - Московская ветеринарная академия.

Защита состоится " " 1992 г. в час. к

заседании специализированного Совета Д.120.85.01 при Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов по адресу: 123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов.

Автореферат разослан

Ученый секретарь

специализированного

Совета

канд.вет.наук

Ю.А.Козырев

¡¡г.;." ч

AKTj'Of

кость проблемы

Зозш&фднее десятилетие получены кардинально новые сведе-я о детерминантах патогенности возбудителем колибактериоза вотных и их молекулярно-генетической характеристике. По их пару патогенные эперихии подразделяются, по крайней мере, на две новные группы: первая - энтеротоксигенные эшерихив, обуслов--вающие у ноЕорогденных колидиарею, и вторая - возбудители ко-септицемии ( Morris , Sojka , 1985). Ведущими факторами .тогенности энтеротоксигенных е.coli являются энте'ротокси-, индуцирующие диарейннй синдром, и группа термозависимых фиы-иальных антигенов белковой природы, обеспечивающих адгезию и следующую колонизацию возбудителей тонкого кишечника восприим-вого нквотного. Генетические детерминанта указанных факторов кализованы в основном на плазыидных геномах, известных в лите-.туре как плазмиды патогенности (Брода, 1982; Кудлай, 1977).

Особенностью антигенов адгезии и термолабильного энтероток-на является их высокая протективная активность, послужившая юдпосылкой для создания на их основе вакцинных препаратов про-1Б КОЛИДИареИ ПОрОСЯТ, ТеЛЯТ И ЯГНЯТ (Altnann , ¡Oukkur , S83; Rutter , Jones ,1973; Wilson et al., 1971).

У возбудителей колисептицемии факторы патогенности менее ¡учены. Помимо О и К антигенов, к ник относят продукты синтеза жтеряальных клеток, детерминируемые Hiy , Coiv и Vir шзыидами, хотя роль этих субстанций в патогенезе болезни да-зко не выяснена и в практике конструирования вакцин они исполь-гются крайне редко.

Описанные выше достижения в изучении возбудителей колибак-эриоза получены преимущественно зарубеннкыи исследователями, соналению, в нашей стране работы по изучению колекулярно-гене-ических свойств патогенных эшерихий проводились в ограниченном асштабе. Последнее отрицательно сказалось на тешах разработок □временных средств диагностики и специфической профилактики ко-ибактериозной инфекции. Особенно это касается колвдиареи. От-утствие до последнего времени диагностикумов для определения ан-игенов адгезии и энтеротоксинов не позволяло судить о степени аспространения данной формы болезни и соответственно сдерживало онструирование нового поколения вакцин против колидиареи.

Актуальным остаются поиск детерминант патогенности у во будителей колпсептицемил, выявление у них лротективкнх антигенов , а также выяснение доминирующих серогрупп по регионам стрг в изучение закономерностей их циркуляции.

Цель и задачи пзботы. Целью настоящей работы являлось и; чение факторов патогенности возбудителей колидиареи и колисеш цеыии и создание на их основе нового поколения диагностически: и вакцинных препаратов.

В соответствии с поставленной целью требовалось решить с. дующие задачи:

- изучить этиологическую структуру колибактериоза телят отдельных регионах страны;

- изучить основные фено- и генотипические свойства патог них дая новорожденных етвотных эшерихий;

- осуществить поиск и охарактеризовать молекулярные и ге тические свойства плазкид патогенности E.coli ; получить и ноплазмидные К88+ и К99+ штаммы кишечной палочки;

- провести, молекулярное клонирование генов синтеза фимб] альных антигенов адгезии, альфа гемолизина, а такке cva и генов, контролирующих соответственно синтез колицина v и устойчивость к бактерицидному действию нормальной сыворотки : ви; выяснить вклад клонированных генов в формирование патоге: ности ь\coli ;

- получить рекомбинактные плазмиды с генами патогенност возбудителей колибактериоза и сконструировать на их основе ш мы-продуценты протективных антигенов, пригодные дая создания диагностических и вакцинных препаратов нового поколения;

- изучить генетическую детерминацию некоторых поверхнсс антигенов е.coli , в том числе капсульных а антигенов, и ог нить их роль как факторов патогенности;

- осуществить поиск новых антигенов адгезии у штаммов;

- разработать способы получения диагностических агглюп рующих сывороток для тестирования антигенов адгезии;

- изучить природу мнокественной лекарственной устойчив! эшерихий, выделяемых от кивотннх.

Научная новизна и практическая значимость. Изучена этиологическая структура колибактериоза телят в хозяйствах северовосточного Казахстана. Показано, что в 70-е года энзоотии колидиареи телят здесь чаще всего вызывали эшерихии серогруппы 08, колисептицемии - серогруппы 0119.

По набору детерминант патогенности возбудители колидиареи телят отличаются от возбудителей колидиареи поросят. Первые преимущественно имеют K99+CTa+A+Col+Mrh+R+ - фенотип, вторые - K88aci/r+Hiy+Coi+Mrh+R+ - фенотип. Клинические К88+ штаммы, в отличие от К99+ штаммов E.coli , в течение первых суток сбраживают глицерин и не ферментируют сахарозу. К99+ штаммы наоборот: сбранивают сахарозу и не усваивают глицерин.

Для эшерихий серогруппы 0119 облигатными признакам являются гемолитическая и колициногенная активность.

Установлено, что синтез антигенов адгезии К88 и К99 у подавляющего большинства штаммов E.coli обусловлен генами, локализованными на неконъюгативных плазмидах. Гены синтеза антигена К88, как правило, сцеплены с Raf+ признаком, а гены синтеза антигена К99 - с маркерами антибиотикорезистентности.

Выявлены и охарактеризованы новые плазмиды pPMI и pPCI, детерминирующие соответственно синтез антигенов К88 и К99, и конъюгативнне плазмиды Coiv-DG9 и Coiv-DG340 , кодирующие синтез колицина V и повышенную устойчивость клеток к бактерицидному действию нормальной сыворотки крови (ИСК).

Плазмида pPMI конъюгативная имеет молекулярную массу 50 (±0,5) ш, кодирует синтез антигена К88ас и ферментацию

рафинозы. Плазмида pPCI молекулярной массой 23 ма конъюгативная, детерминирует синтез антигена К99 и устойчивость к стрептомицину и тетрациклину.

Плазмида jjPMI находится в слоеных взаимоотношениях с другими плазмидами. Она, например, стимулирует образование альфа гемолизина, кодируемого Н1у плазмидами, и в го не время ее функция подвергается репрессии со стороны некоторых r плазмад.

В составе векторных плазмид pBR322 , pBR325 и кос-мидного вектора рНС76 осуществлено молекулярное клонирование генов синтеза антигенов адгезии К88, К99, термолабильного энтеро-токсина, а также hiy , cva , cvi , iss генов, контролирующих соответственно синтез альфа гемолизина, колицина V и устойчивость к бактерицидному действию ИСК человека и кивотных.

Впервые клонированы hiy гены хромосомной природы штам— j ма E.coli серогруппы 0119, возбудителя колисепсиса телят, а такие хромосомные iss гены серовара 02:К1:Н6, детерминирующие устойчивость бактерий к комплементу сыворотки крови.

Сконструированы стабильные гибридные плазмида с генами патогенности E.coli : К88, K99f lt , cva , cvi , iss (плаз-мидной и хромосомной природа) и hly (плазмидной и хромосомной природы). Дня получашх плазмид построены физические карты. Показан вклад генов hiy и iss в формировании патогенности эш< рихий.

Продемонстрировано, что термостабильный А антиген К99+ шгш мов формирует у клеток истинную капсулу толщиной 3-5 мкм. Ее наличие у штамма коррелирует со слизистой консистенцией образуемы' им колоний. Капсула увеличивает устойчивость клеток к бактерицидному действию НСК и колицинам.

Предложена система поиска штаммов E.coli- носителей термозависимых фиыбриальных антигенов адгезии. Обнаружен новый антиген адгезии - антиген А20, нередко тестируемый у эшерихий, выделяемых от новороаденных телят с клиникой диареи.

Разработан новый метод количественного определения антигена К88 как на поверхности микробной клетки, так и в среде культивирования. Этот метод позволяет производить отбор штаммов-про дуцентов антигена К88 по количеству синтезируемого ими антигена

Предложены оригинальные способы получения диагностических агглютинирующих сывороток дая тестирования антигенов адгезии К88 и К99.

Создана коллекция природных и лабораторных штаммов E.coli носителей факторов патогенности и имыуногенности возбудителей колидиареи и колисептицемии новорожденных животных, которые используются для производства антиадгезивных сывороток и контроля их специфичности, а также дая получения рекомбинантной вакцины.

Новизна и приоритет научных исследований диссертационной работы подтвераушы восемью авторскими свидетельствами.

На основании диссертационных материалов разработаны:

- Рекомендации по профилактике и лечению колибактериоза те лят, утвержденные научно-техническим советом МСХ Казахской ССР в 1975 г.;

- Временная инструкция "О мероприятиях по борьбе с колибак териозоы молодняка сельскохозяйственных животных", утвержденная 1УВ МСХ СССР 8 декабря 1976 г.;

- Временная инструкция по изготовлению и контролю сывороток агглютинирующих эшерихиозннх, утвержденная директором ВНИИ прикладной микробиологии Министерства медицинской промышленности■ СССР в 1989 г.;

- Технические условия "Сыворотки агглютинирующие эшерихиоз-нне (ТУоп.64-15-109-89)", утвержденные ТУ "Биопрепарат" Минмед-проыа СССР 31 марта 1989 г. и согласованные ГУБ Государственного агропромышленного комитета СССР;

- Временное наставление по применению агглютинирующих сывороток к адгезивным антигенам эшерихпй К88, К99, 987Р, Р41 и А20, утвервденное ГУВ Государственного агропромышленного комитета СССР 13 мая 1989 г. взамен наставления по применению эшерихи-озной К88 сыворотки, утвержденного Г/В Госагропромышленного комитета СССР 27 "мая 1988 г.;

- Приказ по Госагропромншленному комитету СССР й 44 от

18 мая 1989 г. "О применении агглютинирующих сывороток к адгезивным антигенам эшерихий";

- Методические указания по бактериологической диагностике колибактериоза (зшерихиоза) кивотных, утвержденные в 1991 г. 1УВ Министерства сельского хозяйства и продовольствия СССР.

Аптзобадия работы. Результаты исследований долояены на итоговых конференциях Семипалатинского зооветеринарного института (19ТО-1976 гг.); Пленуме отделения ветеринарии ВАСХНИЛ по проблеме лечения и профилактики болезней молодняка сельскохозяйственных нивотннх, Москва, октябрь 1972 г.; Научно-производственной конференции ВГНКИ ветпрепаратов МСХ СССР, Москва, 19-20 декабря 1974 г.; Совещании по внехромосоыной наследственности микроорганизмов, Москва, 17-18 апреля 1975 г.; X Всесоюзном совещании по программе "Плазмида", Пущино-на-Оке, 1985 г.; XI Всесоюзном совещании по программе "Плазмида", Пущино-на-Оке, 1986 г.; Хд Всесоюзном совещании по программе "Плазмида", Путцино-на-Оке, 1987 г; ХУ1Всесоюзном совещании по программе "Плазмида", Нальчик,1990 г.; Всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии", Тарту-Кяэрику, 1988 г.; Всесоюзной конференции "Эпизоотология, эпидемиология, средства диагностики, терапии и специфической профилактики инфекционных болезней, общих для человека и вдвотных", Львов, 1988 г.; У Итоговой (1980) и IX Итоговой (1985) научных конференциях ВНЙИПМ; X Предытоговой (1986) и Хд Цредытоговой научных конферен-

щшх ВШ1И1Ы; Методических комиссиях В1ЖИ ветпрепаратов, 1988, 1989 гг.; Всесоюзной научной конференции "Совершенствование методов Государственного контроля ветеринарных препаратов" 14-16 мая 1991 г., Москва; Международной конференции по медицинской биотехнологии, иммунизации и спиду, Ле нинград, СССР, 12-18 июня 1991 г.

Промышленные и опытно-промышленные образцы разработанных сывороток демонстрировались на выставках "Химия и науч-но-техничесшй прогресс", ВДНХ СССР, Москва, 1988 г.; "Биотехнология - агропромышленному комплексу", ВДНХ СССР, Москв 1989 г.; "Технические процессы и оборудование для производства микробиологического синтеза и медицинских препаратов", ВДНХ СССР, Москва, 1989 г.; "Биотехнология - сельскому хозяйству", Болгария, февраль 1989 г.

Демонстрировавшиеся экспонаты дважды были удостоены с< ребряных медалей ВДНХ СССР.

Публикации. Основные результаты работы по теме диссер тации отражены в 45 статьях, брошюрах и восьми авторских с детельствах. Большинство экспериментальных данных, предстг ленных в диссертации, получено диссертантом в соавторстве сотрудниками отдела псевдомонадных и кишечных инфекций че. века и животных ВНИИ прикладной микробиологии и Семипалат: ского зооветинститута, работавшими совместно с автором ил под его руководством.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введе ния, обзора литературы (две главы), результатов собствен] исследований (12 глав), заключения и выводов. Диссертации написана на 578 стр., содержит 79 таблиц, 56 рисунков и приложений. Библиография включает' 566 наименований.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. Материалы и методы

В работе использованы различные штаммы, производные E.coliKi2, плазмидн г , R , Hiy , Coiv , Ent , а также фаги и Тп -элементы, полученные из ГОЛГ АН СССР от проф. Хмель И.А., ЙОГ АН СССР от проф. Гольфарба Д.М., из коллекции ВНИИ прикладной микробиологии.

Эталонные штаммы E.coli различных серогрупп и серова-риантов, референс-штаммы-продуценты антигенов адгезии К88, К99, 387Р, F41 , а также продуценты различных типов колици-нов получены из ВГНКИ ветпрепаратов от проф. Малахова Ю.А., из ВИЗЗ от проф. Поляковой О.А., из Института вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова от проф. Голубевой П.В., а таю;;е из ГИСК гал.Тарасевича.

Большинство клинических штаммов е. сои , предстаатен-ных в диссертации, выделены от животных автором в хозяйствах Казахстана, Алтайского края и других областей Российской Федерации. Часть штаммов была любезно предоставлена нам Кавру-комЛ.С. и Каревой Э.П.

В качестве питательных сред использовали МПА, МПБ, агар Хоттингера, L бульон и агар, глинимальные среды, специально дифференцированные среды, среду Минка ( Guinee et ai., i976).

Культуральше, биохимические, серологические, гемолитические, вирулентные свойства, а также чувствительность культур E.coli к антибиотикам определяли в соответствии с рекомендациями, изложенными в Стандартах СЭВ, 1980; в руководствах: Методы общей бактериологии, перевод с англ., 1984; The virulence of Escherichia coli, 1985).

Продукцию эшерихиями энтеротоксинов определяли на мышах-сосунках И кроликах ( The virulence of Escherichia coli, 1985). Колициногенность культур кишечной палочки и поиск продуцентов колицина v тестировали с помощью метода Lewis , 1968. Эксперименты по определению выживаемости эшерихий в нормальной сыворотке крови проводили по методу l.'oll et al., 1979 . Выделение антигена К88 осуществляли согласно Stirm et al., 1967.

Определение скорости потери рекомбинантных плазмид проводили, как описано в работе Попова с соавт., 1989; конъюгацию осуществляли по Миллеру, 1976, трансформацию - по методу Cohen et al., 1973.

Выделение ДНК, пригодных для конструирования рекомбинантных плазмид, проводили с помощью тритона Х-100 с последующим центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия. (Методы общей бактериологии'. Пер. с англ., т.2, 1984). Для быстрого скрининга плазмидных ДНК в клонах E.coli и получения ДНК для построения физических карт использовали метод Birnboim, Doly, 1979.-

Детали экспериментов по рестрикции и лигированию плазмидных ДНК, электрофоретический анализ в агарозе, получение фрагментов ДНК с определенным молекулярным весом подробно изложены в диссертационной работе.

Расчет среднестатистических величин и их стандартных ошибок, вычисленных при уровне вероятности не менее 95%, проводили в соответствии с методическими указаниями Ашарина и Воробьева, 1952.

2. Этиологическая структура колибактериоза телят в хозяйствах северо-восточного региона Казахстана и некоторых районах Алтайского края

За период с 1969 по 1976 гг. изучено распространение коли-бактериозной инфекции в 40 хозяйствах Семипалатинской и Восточно-Казахстанской областей и трех хозяйствах Алтайского края.

Из каждого органа павшего или' фекалий больного животного в зависимости от цели эксперимента исследовали в РА на стекле или "пробирочной" РА 10-20, иногда более культур кишечной палочки. Для изучения генетического родства выделяемых от животных культур E.coli (для доказательства энзоотической роли штамма) у ни помимо 0 антигена определяли такие свойства, как колициногеннос колициночувствительность, чувствительность к антибиотикам, способность лизировать эритроциты,сбраживать углеводы, подвижность

учитывали также морфологию колоний, образуемых культурой на пластинках МПА. У части выделенных культур е.coli ретроспективно изучали наличие антигена адгезии К9Э с помощью приготовленной нами агглютинирующей анти-К99 сыворотки.

Всего в течение восьми лет исследовали материал 137 павших и фекалии 560 больных телят. У 72,5 % павших новороаденных животных были изолированы эшерихии серологических групп 08, 0119, О101, 026, 078, 02, 0137, 0139, 0117 и 09. Доминирующими являлись серогруппн 08А+ и 0119. Далее по частоте встречаемости следуют Е.coli серогруппы 0101, 026 и провизорных групп "CK" и "СБ", этиологическая роль которых была нами установлена. Доминирование эшерихий серогрупп 08А+ и О119 закономерно прослеживалось в изучаемом регионе на протяжении шести лет.

Как показали бактериологические исследования, эшерихии серогрупп 0119 и 026, как правило, высевались из всех, большинства или отдельных органов павших животных, в то время как эшерихии серогруппы 08А+ выделялись из содержимого тонкого отдела кишечника и брыжеечных лимфоузлов. Следовательно, учитывая локализацию возбудителя, в первом случае логично констатировать сеп-тицемическую форму колибактериоза, во-втсром - кишечную (коли-диарею).

Серологически копированные эшерихии указанных выше 0 групп, а также групп 018, 015, 041, 055, 035, 020 выделены у 60 % исследованных больных телят. Эшерихии серогрупп 08 и 0119 составляли подавляющий процент от числа всех серологически типирован-НЫХ культур E.coli .

Результаты многолетних бактериологических исследований патологического материала павших и больных животных, а также данные эпизоотологических, патологоанатомических и клинических наблюдений за массовыми желудочно-кишечными заболеваниями новорожденных телят позволили сделать заключение о том, что среди данной группы заболеваний в 1969-1976 гг. в обследованном нами регионе значительный удельный вес занимала колибактериозная инфекция. При этом диагностировались две формы колибактериоза: кишечная и септицемическая. Основными возбудителями колидиареи являлись эшерихии серогруппы 08, способные синтезировать термостабильный (СТа) энтеротоксин, антиген адгезии К99 и термостабильный кадсульный А антиген. Наличие последнего у эшерихии коррелирует с особенностью морфология образуемых ими колоний - слизистой консистенцией, что необходимо учитывать при бактериоло-

гической диагностике колидиареи у телят.

Наиболее частые возбудители колисептицемии у телят, эшерихии серогруппы 0119, в отличие от Е.coli серогруппы 08А+, не образуют энтеротоксинов и антигенов адгезии. Однако дня них характерна способность синтезировать альфа гемолизин, колицины и сравнительно высокая вирулентность для белых мышей.

Показано, что одни и те же штаммы е.coli серогруппы 08А+ и 0ÏI9 в течение длительного времени (год и более) могут циркулировать в хозяйстве и являться причиной энзоотических вспышек ко-либактериоза.

У большинства животных с выраженной диареей, вызванной соответственно эшерихиями серогрупп 08А+ и 0119, возбудитель выделяется с фекалиями в больших концентрациях: приблизительно 30-100 % колоний е.coli , вырастающих на среде Эндо при посеве фекалий больного животного, относятся к указанным серогрулпам. Следовательно, больные тавотные являются основным источником заражения новорожденных телят и источником патогенных эшерихий во внешен среде.

Факт циркуляции в природе двух различающихся по биологическим свойствам групп эшзрихиы - энтеротоксигенных и септицемичес-ких возбудителей (соответственно, колидиареи и колисептицемии) является основным аргументом в пользу необходимости иметь два типа вакцин против колибактериозной инфекции: первый - для профилактики колидиареи, второй - колисептицемии.

3. Генетические детерминанты е.coli , контролирующие синтез фимбриального антигена адгезии К88

В 1979-1980 гг. в хозяйствах Ростовской, Курской, Липецкой, а в последующие годы Калужской и Московской областей были выделены эшерихии, продуцирующие фимбриальный антиген К88, преимущественно сероварианта "ас". В большинстве случаев К88 антиген был ассоциирован с эшерихиями серогрупп 0141 и 0149. Изученные К88+ штаммы вызывали маннозорезистентную агглютинацию эритроцитов морской свинки и барана ( Mrh+ ), синтезировали термолабиль ный энтеротоксин, практически в 100 % случаев продуцировали альфа гемолизины и колицины, характеризовались множественной лекарственной устойчивостью и сравнительно высокой вирулентностью для белых мышей. Все штаммы ферментировали рафинозу и адонит и, в отличие от К99+ штаммов, усваивали глицерин. Следовательно, для

клинических К88+ штаммов преобладающим является К88ас+ Ent+Hly+Col+Mrh+R+Raf+ - фенотип.

При изучении плазмидных да клинических К88+ штаммов РД-17, РД-21, РД-24, РД-25, КЭ-8 и КЭ-Ю установлено, что каждый из них содержит не менее 2-3 плазмидных дж различной молекулярной массы, а в штамме КЭ-8, имеющем фенотипы K88+Ent+Hiy+Col+Sm1' TcrKmrCmrApr , при электронно-микроскопическом анализе выделенной из него плазыидной ДНК показано наличие шести типов кольцевых молекул с массами: 2,3 Ш - две плазмида; 3,4 и ; 4,4'Ш ; 6,8 Md - две плазмиды, 50 Md и 135 И

При скрещивании клинических К88+ штаммов в клетки реципиента С600 кроме p.af+ маркера передавались и другие признаки, в частности, маркеры резистентности к ампициллину, тетрациклину и хлорамфениколу. Все штаммы передавали гены синтеза антигена К88, однако частота одновременного переноса маркеров Raf+ ;; К88+ в кроссах была различной (табл.1). Следовательно, при конъюгации не всегда в реципиентнке клетки переносятся одновременно Rar+ и К88+ признаки, как это можно было бы ожидать, учитывая данныс-Srrdth и Раг.чеИ ( IS75) о сцепленностн указанных признаков на плазмидны" гоно;.:^".

Наиболее Бадоятккм репликонок, на котором локализованы гену синтеза антигена К88 в исследованных нами штаммах, являются плазмиды. По крайней мере, это подтверждено с помощью конъюгации для штаммов K3-I0 и РД-21 и с помощью трансформации для штамма KS-8. В первом случае, анализируя Raf+ трансконъюганты, полученные в кроссах штаммов КЭ-Ю, РД-21 в реципиента С600 Nalr , удалось обнаружить два моноплазмидных К88+ клона. Во втором случае были отобраны трансформанты, которые утилизировали рафинозу и давали положительные РА и РДСГ с анти-К88 сывороткой. Полученные результаты прямо свидетельствуют о локализации генов синтеза антигена К88 указанных двух штаммов на плазмидных геномах.

Для изучения молекулярно-генетических свойств К88 плазмид. и их использования в практических целях с помощью конъюгационного скрещивания полиплазмидных штаммов Smi-2 и КЭ-Ю с реципиентом С600 были получены моноплазмидные штаммы Ш1 и Шва с К88 плазмидами ppi.il и р\УК88 .

По данным электронной микроскопии, плазмида рИД ямеет размер 50 га , плазмида рЖ88 - 44 Md . Более детальному исследованию была подвергнута плазмида pPMI.

______ Таблица I

Частота образования и фенотипы трансконъюгантов К88+ штаммов E.coli и реципиента С600 Kalr

Штаммы Фенотип Селективный маркер Результаты скрещивания

доноры донора Частота образов, транс-конъюг. Фенотип трансконъюгантов Частота встреч, транс-конъюг., cî ,0

I 2 3 4 .5 6

РД-17 K88+Raf+Hly+ Col+Ent+ïcr Ci:irApr Raf+ 3,4-Ю4 Raf+K88+Cm+Tcr Raf+Cm+Tcr Kaf+Tcr Raf+ 22 74 3 т

Т-к-УЛ <:5e"WH2y+ ^ J. XJ. i u nal I,G-I0~3 Iîaf+K88+CnrTcr Kaf+Cm Тс 44 56

11С-421 a K88 ' Kaf ' Col ' TcrCmrApr - .,4 1*3.1 7,5-lu"3 Raf+K88+Tcr Raf+Тсг 84 .16

РД-21 K88+Raf+Hiy+ Col Cm Te Raf+ 6.7-I0"4 Raf+K88+CmrTcr Raf+K88+ïcr Raf+CmrTcr Raf+Tc1 Raf4" 16,5 1,5 79,0 1.5 1,5

Raf+K88+CmrTcr 31,6

Raf+K88+Cm+ 2,1

Raf+CmrTcr 56,8

Raf+CmrTorAp1' 6,3

Raf+Cmr 2,1

Raf+CmrTcrAprK88+ I, I

Учитывая молекулярную массу плазмида pPMI (50 bid ), а также тот факт, что моноллазшдный штамм PMI получен при помощи конъюгации, можно было предположить, что плазмида pPMI являета конъюгатнвной. Однако при скрещивании в жидкой среде донора Pli и реципиентов 1Е392 , J53 и c600Nalr установить факт

• • • '*»

V • "' " . ■• 14

'переноса плазмиды рРЖ не удалось. В то не время она мобилизовалась на перенос плазыидами R6K , R1 , R100 , рН1у212 :: ТпЮ, P'ts lac :: ТпЮ . Мобилизация происходила независимо от того, находились ли эти плазмиды ( Ебк , R1 , R100 ) в доноре или реципиенте. Частота переноса плазмиды рЗШ составляла и зависела от мобилизующей плазмиды.

При скрещивании биплазмидных штаммов е.coli, содержащих плазмиду рРЖ и мобилизующую к или Hiy плазмиды, с реципиентом E.coli502 обращает на себя внимание факт отсутствия у многих образовавшихся Raf+ трансконъюгантов способности синтезировать антзген К88, то есть имеет место расщепление Raf+ и К88|'пркзна-коб, как это отмечалось и при скрещивании клинических К88+ штаммов. Однозначно объяснить феномен расщепления Raí4" и Кбб+призна-ков, локализованных на плазииде pPI.il, на основании наших данных не представляется возмояиым. Однако установленный (¿акт следует учитывать при генетически" исследованиях плазмид, детерминирующих синтез антигена К88, и при получении штаммов-продуцентов этого антигена.

Результаты экспериментов по мобплсзации плазмиды pPifl указывают на неоднозначность вза1:.:оотяои=ен2й кзеду плазм;:до:; р?.Д и другими плагаидага. Так, она стабильно, сосуществует с плазми-доК P'ts lac : : Тп1 о !' i¡e сказгтае? кнгябврутоего действия на выражение генов stoü плазмиды. Идас-мзда ррщ не только совместима с плазмидоц гемолитичности рН1у212 :: ТпЮ , но и существенно влияет на ее функцию: клокы биплазмидного штамма С600 (pE.il, рН1у212 :: ТпЮ), судя по диаметру зон гемолиза, продуцируют приблизительно в два раза больше альфа гемолизина, нежели клоны изогенного штамма с плазмидой рН1у212 :: ТпЮ.

В то ни время, как показывают наши исследования, плазшда R4oa , относящаяся к incC группе несовместимости, вызывает элиминацию плазмиды pPi/il из клетки-хозяина, а плазгада R124 подавляет функцию генов К88 плазмиды pPMI. Последнее подтверждается тем, что элиминация плазмиды R124 с помощью sds из биплазмидного штамма, приводит к восстановлению у него способности синтезировать антиген К88.

Выражение К88 генов плазмиды р?Н1 не зависит от функции гесА . Биплазмидные штаммы е.coli , полученные на осно-

ве гесА+ и тесл" штаммов С600 и H3I0I, соответственно, в одинаковой степени синтезировали антиген К88.

На основе плазмида pPMI получен лабораторный штамм РМХ, который, благодаря своим свойствам (стабильность синтеза антигена К88ас, авирулентность для лабораторных нивотных, множественная ауксотрофность и, как следствие, экологическая безопасность) в настоящее время используется в качестве производственного штамма-продуцента при изготовлении диагностической агглютинирующей К88 сыворотки.

С целью изучения структуры и функции К88 генов, решения прикладных задач в составе вектора рВй322 из ДНК плазмида pPMI с помощью рестриктазы Hindin было осуществлено молекулярное клонирование гено^^интеза антигена К88 и сконструирована реком-бинантная плазмийа с молекулярной массой 10,5 ш . На этой плаз-миде гены синтеза антигена К88 локализованы на Hindin фрагменте величиной 7,7 Kd . Показано, что клонированные К88 гены не имеют собственных промоторных участков и считывание информации с клонированных фрагментов происходит с промоторной области вектора PBR322

Используя частичный гидролиз ДНК плазмида рр?20 эндонук-леазой Ecoltl , размер фрагмента, несущего структурные К88 гены, удалось уменьшить до 4,3 Kd (плазмида рРП201 массой 7,1 ш). Для обеих рекомбинантвдх плазмид построены физические кар-

Рис.1. Физические каоты гибридных плазмид pPF20 И pFFi201 кодирующих синтез антигена К88. Толстой линией выделен вектор pBR322 . Гены синтеза антигена К88 клонированы из плазмида ррш •

ты (рас.1).

Плазмида рРР20 и рИ?1201 стабильно наследуются в неселективных условиях: скорость элиминации плазмида из штамма НВ101 составляет 3,3-юЗ, скорость потери плазмида рРР1201 из этого же шташа в 1,3-1,5 раза ниже. Обе плазмида наделяют клетки ре-

ципиента устойчивостью к ампициллину и способностью синтезировать 1 антиген К88, серологически идентичный К88 антигену штаммов Smi-2 и FL1I (серовариант "ас").

Полученный на основе гибридной плазмиды piT20 штамм FMI00 обладает высокими иммуногенными свойствами и применяется для получения анти-К88 сыворотки.

Для оценки количественного уровня синтезируемого К88+ штаммами е.coli антигена К88 с целью отбора штаммов-продуцентов нами предложена реакция конкурентного саязывания радиоактивномече -ных специфических К88 антител. Используя разработанный метод, показано (табл.2), что различные природные и рекомбинантние К88+ штаммы в значительной степени (в 10 и более раз) отличаются друг от друга по количеству образуемого ими антигена К88.

Таблица I

Сравнительная характеристика способности штаммов е.coli синтезировать антиген К88 на плотной и в жидкой питательных средах

Количество антигена К88, синтезируемого клетками (мкг на м.к.)

на плотной питательной в жидкой питательной

среде среде

КЭ-8 120 + 20 90 ± 22

КЭ-10 210 + 13 -

РД-25 300 + 50 270 + НО

Р-99 840 + 80 1100

KC-42I 60 + 14 60 + 30 .

0147:К88ас 700 + 200 1000

08 : К88ас 420 + 60 450

PM-IOO 350 + 40 -

га-200 440 + 100 320 + 80

4. Генетические детерминанты E.coli , контролирующие продукцию адгезивного антигена К99

Исследованные в работе К99+ штаммы е.coli были выделены от больных колидиареей телят в основном в хозяйствах северо-восточного региона Казахстана, а такта Московской и Тульской областей.

Идентификацию К99 антигена проводили в РА и РД1 с приготовленной нами анти-К99 сывороткой.

При определении типа О антигена у К99+ кшерихий установлено, что большинство из них принадаекит к серогруппам 08 и 0101. Однако ряд К99+ штатов не относились ни к одной из известных о серогрупп (08, 0101, 09,020),с которыми, как правило, ассоциирован антиген К99.

Опыты перекрестного истощения анти-К99 сывороток показали, что эпизоотически не связанные между собой клинические К99+ штаммы продуцируют идентичный по имыунохиыическим свойствам антиген К99.

Как свидетельствуют наши исследования, большинство клинических К99+ штаммов образует капсульный А антиген в термостабильный (СТа) энтеротоксин. Для них характерным является также синтез колицинов, хотя не все энзоотические штамма обладают этой способностью. Как и К88+ штаммы, они сбраживают ратинозу и адо-нит, однако в отличие от последних К99+ культуры ферментируют сахарозу (но не глицерин).

При изучении генетического переноса К99+ признака в кроссах десяти К99+ штаммов е.coli с реципиентом с600 i:alr (табл.3) было установлено, что только в одном кроссе (1407 х с600 На1г ) из пяти среди образовавшихся r+ трансконъюгантов были обнаружены клоны, дававшие положительную РА с анти-К99 сывороткой. Все трансконъюганты этого кросса имели фенотип K99+SmrTcrNalr

Таблица 3

Частота образования и фенотип трансконъюгантов, полученных скрещиванием К99-позитивных штаммов е.coli и реципиента е.coli сбоо iiair

Штаммы Устойчивость Селективный Частота об- Фенотипы доноры штаммов-доно- маркер в разования трансконъю ров к антибио- скрещивании трансконъю- гантов

тикам гантов

09:К99 AprTcrSmrCmr Cm IO-3 Стг0!сгК99-

1407 TcrSnr Sn IO"5 SmricrK99+

CA-I26 X* зг 3m Kn Sm IO"8 SmrKmrK99"

CA-I24 р г„ г ып Cm Sm I<T* ■v» -p _ Sm^Cn K99

CA-I64 TcrCmr Cir. IO-3 CmrTcrK99~

СА-220 Si/ Sra * IO-8 -

CA-2I3 TcrSmrliarCmr Kn с I0"b _

Продолжение табл.3

Штаммы доноры

Устойчивость штаммов-доноров к антибиотикам

Селективный маркер в скрещивании

Частота образования трансконъю-гантов

Фенотипы

трансконъ-

югантов

СА-222 CA-I72 08:К99

KrarCmr KmrCrnr SE^Tc^m1"

Km Cm Cm

<I0"

<C 10" <. 10"

Результаты экспериментов по переносу KS9+ признака, данные по его элиминации у четырех клинических штаммов с помощью sbs (табл.4) позволили сделать заключение, что гены синтеза антигена К9Э, по крайней мере, у четырех изученных штаммов, локализуются на плазмидных геномах, различающихся между собой набором маркеров устойчивости к антибиотикам и способностью к сбраживанию рафинозы: а) CmrRaf+K99+ , б) SmrRaf+K99+ , в) TcrSmrK99+ . Одна из плазмид с TcrSmrK99+ фено-

типом является конъюгативной. Остальные, по всей вероятности, нотрансмиссибельные или, если и передаются, то с низкой частотой.

Таблица 4

Элиминация маркеров антибиотикоустойчивости и синтеза антигена К99 из клинических штаммов е.coli

г,„ Фенотипы Изучено ларактеристика клонов, потеряв-

-1 штаммов клонов ши* после обработки бзб от-

после воз- дельные матжетш

действия фенотип Кол-во

oDS клонов

CA 124 SmrCmrTcr 300 SmrCmrTcrRaf"K99~ 2

Raf+K99+ SmsCmsTcrRaf"K99~ SmsCmrTcrRaf+K99+ 16 3

CAI23 SmrTcrCmr 2000 SmsRaf~K99~ I

KmrEaf+K99+ SrasTcsRaf~K99~ SnsTcsRaf~K99~ т 33

СА222 TcrCmrKmr 2000 KnsRaf+K99+ r> О

Raf+K99+ Km'<3TcsRaf+K59~l"

CAI64 TcrCmrRaf+K99 +2000 R маркеры не элими-

минровались

цучеи ¡»лвклрофидездчеокы.'и анализа ялаьмйднои клицоь кросса штаммов E.coli 1407 и С600 На1г удалось отобрать К99+ трансконъюгант с единственной плазшдой,обозначенной наш как pPCI. Плазмида pPCI имеет молекулярную массу более 20 ма , конъюгативна, частота ее переноса от донопа реципиенту составляет в разных опытах от до 2,9.10"^. Помимо генов синтез антигена К99 на ней локализованы маркеры устойчивости к стрелтс мицину и тетрациклину. Сцепленность K99+SmrTcr признаков подтверждена в опытах элиминации SmrTcr маркеров из клеток с помощью SDS

На основе плазыиды pPCI получен моноплазмидный штамм PCI, отличающийся стабильностью синтеза антигена К99. Штамм PCI оказался наиболее подходящим продуцентом антигена К99 и нашел npai тическое применение при разработке способа получения агглютинирующей анти-К99 сыворотки.

С помощью методов генетической инженерии осуществлено клонирование-детерминант синтеза антигена К99 клинического штамма E.coli CAI24, выделенного нами от больного колидиареей теленка Для клонирования Фрагмента ДНК с генами синтеза антигена К99 использовали продукты неполного BamHi -гидролиза суммарно] ДНК штамма CAI24 и ДНК космиды рНС79, обработанной этой же рос риктазой. В результате была получена гибридная плазмида рьк2 детерминирующая синтез антигена К99 и устойчивость к ампицилли: ДЕК плазмида р1К2 расщепляется эндонуклеазами EcoRl » EcoRV , Kpn1 , Xmal , BamHl , PstI ,И SalGI И Имеет MO лекулярную массу равную 8,1 ыа . Гены синтеза антигена К99 ра положены на фрагменте ДНК молекулярной массой 4 ш (рис.2)

Рис.2. Физическая карта гибрида плазмида рЬК2 , кодирующей синтез антигена К99. Толстой ли нией выделен вектор рНС79. Гены синтеза антигена К99 клонровак из клинического штамма СА124.

Рекомбинантная плазмида pLK2 нестабильна в штамме HBIOJ при культивировании его на неселективной среде. Добавление в

среду выращивания ампициллина позволяет стабилизировать ос я использовать штамм ЮЯ01 (pI.K?) в качество продуцента.

5. Поиски новых антигонов алгозии среди клинических ' штаммов е.coli , выделенных от телят

Известно, что у возбудитслой колидиареи но всегда удается обнаружить такие адгезшш как К88, К9Э, 987Р, F41 , роль которых в патогенезе болезни достоверна установлена. Появляется все больше сообщений о выявлении у энтеротоксигенннх эшерихий других фимбриальннХ антигенов ( Pohl et al. , 1983; Thome et al., 1982).

Разработав систему поиска антигенов адгезии у е.coli , включающую в себя отбор штаммов по способности их вызывать ган-нозорезистентную гемагглггинацию и индуцировать образованно антител к термозависимым антигенам у белых мышей и кроликов, при изучении более 600 штаммов е.coli , выделенных при диарее у новорожденных телят, удалось обнаружить штаммы, продуцирующие термозависимый фимбриальный антиген, обозначенный как А20, отличающийся по серологическим свойствам от антигенов К88, К99, 987Р и F41 . Антиген А20 хорошо внратается на обычных питательных средах при 37 °С, но не при 18 °С. При помощи электронной мищзоскопии установлено, что этот антиген расположен на поверхности бактериальной клетки в виде фимбрий.

Использование специфической агглютинирующей сыворотки к антигену А20 позволило показать, что А20+ штаммы е.coli сравнительно часта выделяются у новорожденных телят с клиникой диареи. Они изолированы от больных животных в хозяйствах Московской, Тульской областей и Татарстане. Патогенетическую роль этого антигена предстоит изучить.

6. Клонирование генов термолабильного энтеротоксина кишечной палочки

Учитывая иммупогеннне свойства термолабильного энтеротоксина е.coli и возможность использования его для конструирования вакцин против колидаареи, были проведены исследования по клонированию генов синтеза ЛТ энтеротоксина. Источником it генов являлась плазмида pSmi-7 из штамма Smi-7 . Клонирующим вектором в Опытах служила ДНК плазмида рБЯ325. Для клонирования it генов использовали неполный гидролиз плазмидной ДНК рестрик-

тазой КсоК1 . По;;ск клонов среди трансформантов штамма НВ101, синтезирующих: термолабильный энтеротоксян, проводили с помощью теста отека лап белых мышей, а также метода лигирозанных сегментов тонкого кишечника кролика.

В результате проведенных исследований был отобран клон, дававший положительную реакцию в обоих тестах. Рекоыбинантная плаз-ыида рН26, содержащаяся в этом клоне, млела молекулярную массу 14,3 ЫЙ.

Путем гидролизу ДЕ-С плазмиды рН26 эндонуклеазой ВатН1 на основе векторной плазмиды рШ322 удалось получить меньшую по размеру гибридную ДЕК с генами - плазмиду рВ14. Ее молекулярный вес составил 8,4 ма. , а размер встроенного фрагмента с lt генами - 5,6 ма . Для обеих плазмид построены физические карты доя эндонукдеаз-рестрикции (рис.3).

Рис.3. Физические карты рекомби-нантных плазмид рН26 и рВ14, кодирующих синтез ЛТ энтеротоксина. Толстой линией выделены вектора рВй325 и рВИ322 . Гены зл клонированы из плазмида рЗт±-7

Полученные рекоыбинантные плазмиды наделяют клетки реципиент-способностью продуцировать термолабильный энтеротоксин, что проявляется не только на лабораторных животных, но, как показали на-г ши исследования, и в цитотоксическом действии ультразвуковых ли-затов клеток, содержащих плазмиды рН26 и рВ14, на перевиваемые клетки СНО-441.

7. Свойства патогенные зшерихай, опосредованные колициногенныма факторами

Представленное е табл.5 данные свидетельствуют, что способ-кость продуцировать г.однцкны широко распространена среди энзоотических штаммов патогенных эимттахпй. Обращает на себя внимание Фаз

Таблица 5

Колициногенность и коллцинотипы энзоотических штаммов е.coli различных серологических о групп

Числе Наличие Колицинотпп

изучен- Col (тип чувствительности к

них куль- оактооа колкцинам) тур

Серогруппа 0119

a i 200 + E + J

й 2 60 + Резистентность

J* 3 70 + К (50 %) и KB (50 %)

а 4 25 + Резистентность

S 5 10 + Резистентность

Серогруппа 08А+

й 6 140 + К

!t 7 400 + ki, ivs4, s3+i,g,d,p

!k 8 600 - к, e+i,f,j+i,v,s4,s5

Jé 9 120 + k,e+i,p,j+i,v,s4,s5,í

Серогруппа 026

S 10 60 + p,j+r,v,s4,s5,s3+j

S II 15 +

Серогруппа 018

12 15 - V

Серогруппа "CK"

.'2 13 200 + Резистентность

Серогруппа "БС"

40 -г s4,s3+ï

I р':-

IOOjS-ной колищпГогенности штаммов серогруппы 0119, доминировавшей в 60-о и 70-е года в хозяйствах Московской области и северо восточном регионе Казахстана. В большинство случаев Col+ фено тип имели штаммы серогруппы 08, а также все изученные нами К88+ штаммы E.coli , возбудители колидиареи поросят. Нельзя исключить, что продукты синтеза Col факторов указанных серогрупп (по аналогии с продуктами синтеза плазмида Coiv ) могут выступать как антифагоцитарные, адгезивные или антагонистические фан торы. Последний тезис подтверждается результатами исследований изучению антагонистической активности эшерихий серогруппы 0119: они оказались слабо или совсем нечувствительны к колицинам набо Fredericq и в то жз время в 50 % случаев подавляли рост Со1+ штаммов серогруппы 08.

Чувствительность энзоотических штаммов E.coli разных серо групп к колицинам неодинакова (см. табл.5), что свидетельствуеа о разнообразии биологических свойств возбудителей колибактериоз принадлежащих к разным 0 серогруппам.

Определение чувствительности к колицинам у эшерихий, как г казывают наши данные, может использоваться в качестве дополните ного теста при установлении . 'этиологической роли штамма в возг новении вспышки колибактериоза, особенно в том случае, если эте не удается сделать с помощью известных диагностических о и К сь вороток.

В опытах на изогенннх А+ и А" штаммах е.coli продемонст! ровано, что колициночувствительность является достаточно надежг и простым тестом для качественной оценки изменения антигегяых свойств у эшерихий в ходе работы с ними или в процессе и': Хран« ния. Увеличение спектра чувствительности культуры к колицинам, . как правило, связано с потерей ею поверхностных антигенов.

Одним из Col факторов эшерихий, с которым связывают их i • тогенность, являются Coiv плазмида.

При изучении распространения coiv4 штаммов среди природ! изолятов E.coli установлено, что Coiv плазмида в значителы проценте случаев (37-96) обнаруживаются у септицемичоских эшер] хий. Реже они тестируются в изолятах из фекалий'телят с диарей-кым синдромом, переболевших и здоровых животных.

Эксперименты с 10 изолированными от телят клиническими Со штаммами позволили обнаружить и клонировать в клетках реципион ного штамма HBI0I две новые конъпгативные плазмида: Colv-DG9

и Coiv-DG340 . В этот не реципиент, кроме того, оыли переданы известные конъюгативные Coiv плазмиды: C0IV-K94 ,

C0IV-711 , F'ColVBtrp . Частота передачи в расчете на клетку реципиента составила для C0IV-DG340 и Coiv-711 плазмид величину Ю"3, для C0IV-DG9 , C0IV-K94 и р 1 ColVBbp плазмид ~ ю~2.

Все Coiv плазмиды, включая C0IV-DG9 и C0IV-DG340, наделяют клетки штамма HBIOI повышенной выживаемостью в нормальной сыворотке крови теленка, то есть придают им Iss фенотип (табл.6).

Таблица 6

Влияние coiv плазмид на выживаемость клеток е.coli в ИСК крупного рогатого скота

Номер Выживаемость клеток при указанных'

экспе- Штампы концентрациях НСК в пробе,

римента 0 0,56 1,12 2,25 4,5 9,0

I 2 345678

HBI0I 100 250 4,1 0,18 ¿0,1 <0,1

I HBIOKColV -К94) 100 69 64 1,6 <0,1 < 0,1

2 HBIOI 100 250 4,1 0,18 ¿0,1 <0,1

HBIOKCoIV-711) 100 135 III 0,4 ¿0,1 ^0,1

3 HBIOI 100 85 60,0 18,5 •¿0,1 <•0,1

НВ101(Со1У-Дс340)100 79 80 65 <0,1

4 HBIOI 100 100 120 32 <0,1 <0,1

HBIOI(CoIv-äg9) 100 114 III 92 50 <0,1

5 HBIOI 100 100 21 0,4 <0,1 <0,1

HBIOI ( pCoIvB trp ) 100 117 89 48 .34 <0,1

х Определение выживаемости е.coli в НСК проводили по методу Koll et al. » 1979.

Используя вектор pBR322 и эндонуклеазу Hindin » из ДНК плазмид C0IV-K94 и Coiv-711 были клонированы гены синтеза колицина v ( cva гены). Рекомбинантные плазмиды pvsioo

и рУБ102 , содержащие клонированные суа гены (рис.4,5), наделяли клетки реципиента способностью продуцировать колицин V , иммунность к действию колицина V штаммов К-94, 711, вбд и

Э0340 , однако не придавали им устойчивость к действию комплемента крови.

Рис.4. Физическая карта рекомби-нантной плазмиды рУБЮо , кодирующей синтез колицина V . Толстой линией выделен вектор рБй322 . Суа ген клонирован из плазмиды Со1У-К94.

Рис.5. Физическая карта рекомби-нантной плазмиды ртаюг , кодирующей синтез колицина V . Толстой линией выделен вектоп рВй322 . Суа ген клонирован из плазмиды Со1У-711

С помощью рестриктазы ватН2 из ДНК плазшды Со1У-711 были клонированы хэзгены, контролирующие устойчивость клеток-хо-зяина к бактерицидному действию НСК. Полученные рекомбинантные плазмиды рьгчг и с генами (рис.6) обеспечивали ре

ципиентным клеткам повышенную выживаемость в НСК (рис.7), однако они не детерминировали синтез колицина у , то есть нами, в отли чие от В1плз et а1. (1979), не обнаружено сцепленности ±зз и суа генов. Не установлено и эффекта дозы генов 1б8 на выжи ваемость штамма НВ101 з НСК (рис.7)

Fíic.6. Физическая карта текоыбу-нантной плазмида pLZi2 , кодирующей повышенную устойчивость клеток к бактерицидному действию НСК. Толстой линией обозначен вектор pBR322 . isa гены клонигюваш! из плазмида C0IV-711

Рис.7. Влияние iss генов на выживаемость E.coli в НСК.

1.E.coli HBIOI

2.EU coli HBIOI (ColV-711) E.coli mtqi J,j)Lzi2tL„

Плазмида сго1Т-71Ги pLZi2 в

одинаковой степени повышают устойчивость клеток к действию НСК, несмотря на большее число копий гена в штамме HBIOI pLZi2

Таким образом, полученные экспериментальные данные по изучению роли iss генов в биологии ColV+ штаммов E.coli позволяют рассматривать их в качество одного из детерминант вирулентности патогенных эаерихии.

Созданная нами коллекция рекомбинантных плазмид с iss и cva генами, а также природных, меченных транспозонами Тп1 , Тп5 , ТпЮ и 1'п9 плазмид, является основой дая дальнейших исследований роли Coiv плазмид и их генетических детерминант в патоген-ности возбудителей септического колибактериоза животных и птиц.

8. Изучение генетической детерминации и роли некоторых поверхностных антигенов патогенных эшерихий в устойчивости к бактерицидному действию НСК

Используя космпдаый вектор рНС74 и зндонуклеазу BanHl , из хром о с о;.:;; штамма А20а (Ой :01:Н6) клонирован фрагмент, который при передаче в составе сконструированной рекокбпнантной

плазмиды PVS151 (рис.8), придавал клеткам реципиентного штампа KBI0I устойчивость к бактерицидному действию ИСК и свойство пигментировать колонии при культивировании на ША. Уровень устойчивости штамма HBIOI к НСК, кодируемый плазмидой pVSioi , был значительно выше, чем у этого ке штамма с природной плазмидой Co1V-Dg9

Рис.8. Физическая карта космиды pvsi51 , кодирующей устойчивость клеток е.coli к бактерицидному действию HGK. Толстой линией- выделен космидный вектор рКС79. las ген кло-нипован из хромосомы штасла А20.

Механизм устойчивости клеток к НСК, обеспечивае.'.'кй клонированным детерминантом, видимо, отличается от механизма действия iss генов Coiv плазмид. Во всяком случае, введение плазмидн ColvB штамм HB 101 (pvsi51 ) дополнительно повышает выживаемость клеток последнего в НСК (рис.9). Следовательно, действие iss генов Coiv плазмид и хромосомных iss генов носит аддитивный характер. Это в свою очередь свидетельствует о полиде терминал т-ном характере устойчивости возбудителей колисептицемзп к бактерицидному действию НСК, одному из основных свойств данной групш

Рис.9. Аддитивный эшйект плазмид PVS151 и Colv-DG"9 на вынавае-мость клеток е.coli в нормальной сыворотке крови.

1. E.coli K3I0I

2. е.coli HBIOI (pVS151)

3. E.coli KBIOI (pVS15l, ColV-DG9)

патогенных зиерихий.

Высокую устойчивость к повреждающему действию НСК обусловли вают у К99+ штаммов E.coli поверхностные термостабильные А ан

тигенн (рис.10), формирующие вокруг бактериальной клетки мощную

капсулу толщиной 5-5 мкм (рис.II).

j

Рис.10. Устойчивость А+ и А~ клеток E.coli к бактерицидному действию сыворо.гки крози. А+ клетки существенно превосходят

А" клетки по устойчивости к бактерицидному действию НСК.

л-3*т*' t-SiW m-StiiiS' »" о-мт*- i-s.*'*'- '

Рис.II. Электронная микрофотография ультратонкого среза метки E.coli . Продольный срез Ат клетки К99+ шташа ПК46 (ув.22000). Вокруг клетки сформирована капсула.

Утрата клеткой капсулы (А антигена) увеличивает ее чувствительность к комплементу и колицинам. Отмеченные у К99+ штаммов Е.соИ свойства, опосредованные капсулой, с учетом данных о ее■антифагоцитарной активности (Езепчук, 1985; Голубева, 1985), позволяют отнести А антиген, наряду с антигенами адгезии и энте-ротоксинами, к факторам патогенности возбудителей колидиареи телят.

9. Гемолитическая активность патогенных для новорожденных животных эшерихий: генетическая природа и патогенетическая роль

Роль альфа гемолизина как фактора вирулентности достоверно установлена для улопатогенных эшерихий ( Hacker et а1.,1983и др.)

Вопрос о вкладе альфа гемолизина в формирование патогенности возбудителей колибактериоза остается открытым (Smith, 1963, 1971)

Изучая природу детерминант гемолитичности hly генов, использовав дая этого конъюгационные скрещивания, мобилизацию, трансформацию, элиминацию признака гемолитичности с помощью ДНК-тропных веществ, нам не удалось получить доказательств в пользу плазмидной локализации hly генов у 55 штаммов е.coli , принадлежащих к разным 0 серогруппам, в том числе OII9, а такке к К88+ штаммам.

По Есей вероятности, в большинстве случаев hly детерминанты у патогенных для животных эшерихий локализованы на хромосоме бактериальной клетки. Подтверждением тому являются результаты наших исследований по клонированию генов гемолитичности из клинического штамма САН (0II9:BI4), выделенного у теленка при колисепсисе. Используя Sau3A и BamHi эндонуклеазы, на косшдном векторе pHC7S был клонирован фрагмент ДНК этого штамма, кодирующий синтез альфа гемолизина. Принадлежность его к хромосомной Д1К подтверждена в опытах блот -гибридизации. Изучение сконструированной рекомбинантной плазмиды pPGl311 с генами га-молитгчкости штамма САН (молекулярная масса плазмиды 27 i,:d ) и се укороченных производних - плазмид рР^252 л pFGi3i3 (о молекулярными массами соответственно 17,5 и 10,4 ш ) с помощью зн-донукпеаз EcoRI, Kpnl, Xhol, SalGI, Psti позволило

установить, что hly гены энзоотического штамма САН (0II8:BI4) локализованы на фрагменте его хромосомы величиной 4,8 ш (рис.12

Рис.12. Физические карты рекомбинантно плазмиды pPGl311 и ее производных рРХ252 и PPG1313 • Толстой линией выделены вектора рНС79 и pBR325 Hly гены клонированы из хромосомной ДЖ штамма CAII T0II9:BI4).

Для сравнительной оценки биологической активности генов гемолитичности хромосомной и плазмидной природы на векторе pBR322

• - •••-: ••••• so

были клонированы hly гены конъюгативных плазмид рН1у212 и pHiyi11 , выделенные Smith. (1967) и Голубевым (1980), соответственно из E.coli от больного диареей поросенка и здорового человека. Полученные рекомбинантные Hly плазмиды имеют молекулярную массу 13 щ (рРН-15) и 18 ма (рРН-1Н). Для плазмиды рРН-1 s построена физическая карта с локализацией на ней сайтов рестрикции для эндонуклеаз SaiGi и EcoRi (рис.ГЗ^.

Рис.13. Физическая карта рекомбинант-ной плазмиды рРН-1s , кодирующей синтез альфа гемолизина. Толстой линией выделен вектоп pBR322 . Hly ген клонирован из дЯК плазмиды рН1у212.

При изучен'::: рол;; Hly плазмид ь (Тлрглироьанпт: патогепност;: е. coli показано, что введение в клетки азирулентного штамма IIBIOI как природных, так и рекомбинантных плазмид приводит к значитель-му (в 5-10 раз) увеличению вирулентности его для мышей-тетрагпб-ридов. В большей степени вирулентность индуцируется рекомбинантны-ми плазыидаш (табл.7). Эти различия, скорее всего, связаны с эффектом дозы hly гена, поскольку рекомбинантные Hly плазмиды (в отличие от природных, присутствующих в клетке в одной-двух копиях) являются мультикопийными.

Более выраженное влияние клонированных hly генов на вирулентность E.coli было отмечено в экспериментах на штаммах серс-групп 019 и О101, которые, в отличие от штамма HBIOI, являлись прототрофами и находились в s форме: введение рекомбинантных hly плазмид увеличивало их вирулентность в 10-50 раз. Наибольший эффект при этом был получен от введения гибридной плазмиды pPGi 313 с hly генами хромосомной природы (табл.8).

О токсическом действии на макроорганизм продуктов синтеза генов гемолитичности свидетельствует также резко выраженная дер-монекротическач реакция, развивающаяся у кроликов и морских свинок в ответ на внутрпкскное введение животным клеток штаммов

Таблица 7

Вирулентность изогенных вариантов штамма НВЮ1, несущих различные природные и рекомбинантные Н1у плазмида, дая мышей-тетригибридов

Штаммы

Молекулярн. Величи-масса плазм., ны ЛДсл» ш

м.к. ■

Доверительн. Источник интервал Н1у

плазмид или Ы.у гееов

НВ101 КВ101(рН1у212) 72 7 I ,50-,25- Ю9 Ю9

НЗЮ1 (Р1Р240) 38,0 I ,18- Ю9

НЗЮ1 (рН1У195) 52,0 I ,39- юэ

КВ101 (РН1у111) 50,0 1 ,12- с 10"

К3101 (рРН-18) 12,6 5 у (^О ю8

Е3101 (рРК-1К) I и, 0 - ,40- г- ■70°

НВЮКр ро 1313 ) 10,4 5 ,51' ■ю8

5,92'109-9,9-Ю9

0,90-109-1,6-Ю9 больной поросено!

О,74•109-1,62•ТО9 больной теленок

0.88 • Ю9-1,72• Ю9 больной ребенок

0,б0-Юу-1,44-Ю9 здоровы!

человек

4,24-108-6,24-108 плазглш рН1у2^2

4,^-105-С,29-10б плазывдг

4, о2 * 10^-8,34 • Ю8 Хр.ДШу

рН1у111

£р.ДНК шт.сш

•НВ101 и 019 с рекомбинантныыи плазмидами ргн-чэ , рРН-1Н и рРв1313 , в то время, как внутрикояшое введение животным бесплаз-мидных клеток этих же штаммов не вызывает у них повреждения кожи, Полученные результаты позволяют утверждать, что имеется непосредственная связь между продукцией штаммами альфа гемолизина и их дермонекротическими свойствами.

Альфа гемолизин, детерминируемый клонированными Ыу генами, обладает иммуногенными свойствами. Так, многократная иммунизация кроликов рекомбинантныы штаммам НВЮ1 (рРй1313) приводит к накоплению в сыворотке крови животных протективных антител против альфа гемолизина. Сыворотка таких кроликов защищает от гибел! мышей, зараженных смертельными дозами как гомологичного штамма НВ101 (рРС1313) , так и гемолитическим!; штаммами с рекомбинант-нымп плазмидами рРН-чг и рРН-1К. В то -е время нормальная кроличья сыворотка, а также сыворотка кроликов многократно имму-

Таблица 8

Вирулентность штаммов НВ101, 019 и 0101 и их Н1у+ производных для мышей-тетрагибридов

Гемолитич- Величины Доверительный ность шт. Л%о'М.к. интервал

НВ101 ' ' 7,50' •то9 5, 92" 'Ю9- -9 ,90' •ю9

НВ101 (рРН-1з) + 5,28 •Ю8 4, ,24- 108- -8. ,24' •ю8

НВ101 (рРН-Ш) + 5,40' •ю8 4, ,28' 'ТО8- -8 ,29' •то8

НВ101 (рРо1313) + 5,51 •то8 4, ,32- •то8- -8, >34' 'То8

019 - 3,98' •ТО9 2, ,38' •109- -о [О9

019(рРН-18) + 2,53 •ю8 2, ЭТ- ■ТО8- -4 ,89' •то8

019 (рРН-Ш) + 3,21 ■ •ТО8 2, ОТ' •то8- -5 ,68' •то8

019(рРо1313) + 8,89 •ю7 6, .30« -I ,20' 'ТО8

0101 ' - 4,06' •ю9 г-. ^, 21" ■ю9- -9 ,84- •то9

01СЧ)рРН-18) + 2,85' ■ю8 I, 69" 'Ю8- -4 ,90' •то8

0101 (рРН-Ш) + 2,95 •ю8 I. 62' -4 ,82' •тоь

ОЮКррс 1313) 4- 7,54 •то7 5, .94' то7 '2. ,ог •то8

низированных бесплазмидным штаммом НВ101 защитными свойствами не обладали.

Иммуногенные свойства штамма НВЮ1 (рР01313) проявляются также в опытах активной иммунизации кроликов. У животных,пяти-кратно иммунизированных указанным штаммом, в отличие от неим-муннизированных или иммунизированных бе сплазмидным штаммом НВ101, при внутрикожном введении клеток гомологичного штамма, НВ101 ( РР01313)- и штаммов 019 ( рКЛ313), 019 ( рРН-1Б ), 019 (рРН-Ш) дермонекротическая реакция не развивалась. Следовательно, альфа гемолизины, детерминируемые различными ы.у генами ( независимо от происхождения), сходны или близки по иммунологическим свойствам. Полученные результаты позволяют надеяться, что используя живые клетки гемолитических рекомбинантных штаммов, например штамма НБ101 ( ркизчз), можно получить антигемолитическую сыворотку с протективными свойствами. Ее применение могло бы способствовать выяснению роли альфа гемолизина в патогенезе инфекции, вызываемых н1у+ вариантами патогенных зшерихий.

10. Множественная лекарственная устойчивость эшерихий

К середине 70-х годов в хозяйствах северо-восточного региона Казахской ССР, а также в ряде хозяйств Алтайского края сформировались популяции эшерихий, в том числе патогенные, характеризующиеся множественной лекарственной устойчивостью. Так, например, 100 % изученных штаммов серогрупп 08, 09 и 0119, основных возбудителей колибактериоза в регионе, были устойчивы к тетрацикл ну, левомицетину, канамицину и неомицину, 90 % - к полимиксину и 71 % - к стрептомицину. Большой процент устойчивых штаммов (от 45 до 100 %) отмечен и среди других серогрупп. Аналогичная ситуация отмечается в настоящее время в хозяйствах Московской и Тульской областей.

Как показывают результаты наших исследований, полиантибио-тикорезистентность эшерихий в значительном числе случаев объясняется присутствие!.: в клетках е плазмид. По крайней мере, 53,5 % испытанных нами культур E.coli при скрещиваниях передявааи реципиенту маркеры антпбиотикорезистентности. Чаще всего передавались детерминанты, контролирующие резистентность к тетрациклину, канамицину, левомицетину и ампициллину. Перенос R маркеров обнаружен у эшерихий 14 серологических групп: 08, 09, 020, 0101, О119, 02£ 02, 0126, 0103, 035, 0117, 01, 018, а также у серологически не-типированных культур E.coli .

Широкое распространение полирезисгешюсги среди возбудителей колибактериоза свидетельствует, что в настоящее время и в ближайшие годы основной путь борьбы с колибактериозом - проведение противоэпизоотических мероприятий и применение высокоэффективных вакцин и лечебных сывороток.

11. Получение диагностических эшерихиозных агглютинирующих антиадгизивных сывороток

Разработанные нами способы получения агглютинирующих анти-К88 и -К99 сывороток основаны на использовании для иммунизации кроликов нативных культур дефектных по диагностически значимым (кроме К88 и К99) О, К и Н антигенам штаммов E.coli . В нашем случае такими штаммами являлись сконструированные генетическими методами производные E.coli KI2: штаммы С600 и HBIOI, содержащие природные (pPMI, pPCl) или рекомбинантную ( рРРго) плазмиды с генами синтеза антигенов адгезии К88 и К99. Иммунизация кроликов

моноплазмидшнми К88+ СPI-.il, ЕЛ100) или К99'г (PCI) шталшии приводит к накоплению в сыворотке крови животных в основном антител к поверхностным антигенам адгезии. Наличие других (диагностически незначимых) антител минимальное и они (при рабочем разведении сыворотки 1:10) не влияют на ее специфичность.

Высокая активность антиадгезивных сывороток достигается посредством четырехкратной внутривенной иммунизации кроликов • через 7-8 дней в дозах: для К88+ штаммов Evil (pPMI) и РМЮО (рРР20 ) - 2,0; 4,0; 8,0; 12,0 млрд.м.к./животное; для К99+ штамма PCI (pPCl) - 1,0; 1,0; 1,0; 1,0 млрд.м.к./животное. При этом титр сывороток в РА на стекле достигает 1:40-1:160 и более. Такая сыворотка пригодна не только для постановки капельной и пробирочной РА, но и РД1.

В отличие от известных методов изготовления антиадгезиЕШ.х сывороток предаокеннче наш способа асклочавт стадию адсорбции, которая, как претило, приводит к снижению активности сыворотки и удорожанию ее производства.

Па оснсванп:: разработанных спососов получения антяадгезивных сывороток начато продленное производство диагностических агглютинирующих сыЕороток: К86, К99, 987Р, ?41 и А20, что поззолило в свою очередь внедрить в практику ветеринарии новые методические указания по диагностики колибактериоза (эшепихиоза) животных,_ в соответствии с которым для идентификации энтеротоксигенных эше-рихий, возбудителей кслидаареи, необходимо использовать антиадгезивные сыворотки. IÍX применяют в капельной РА на стекле.

12. Изучение протективных свойств факторов патогенности

Протективные свойства факторов энтеропатогенности и генов гемолитичности изучали в экспериментах на мкшах-тетрагибридах и морских свинках, которых иммунизировали живыми клетками моно-(К88+; К99+; Ent+^iyt),6H-^S8+Ent+; Ent+ Hly+ ) и триплазмндных (К88+ Ent+ Н1у+ ) вариантов штаммов С600, KBI0I и J53 , для получения которых использовали как природные плазииды (рШ1, pPCI, pPG86 , рН1у212::Тп1о ), так и рекомбинантные плазыпды с генами синтеза термолабильного эитеротоксина (рН26), антигена К88 ( рРР20 , рРР1201 ) и альфа гемолизина (рРН-1Н).

Для заражения вакцинированных и контрольных животных применяли клинические шташы КЭ-8 (K88+Ent+Hly"tCol+R+ Mrh+ ), CAI24 (К99+ Ent+ Hly+ Col+ R+ ), 0157:К88, а также штаммы С600 и

J53 с плазмидами К88+Н1у или K88+Hly+Ent

Установлено, что бесплазмидные штаммы С600, 1Ш101 и J53 , использованные для вакцинации мышеи, не индуцировали у них иммунного состояния против смертельной колиинфекции (коэффициент защиты находился в интервале 0,4 до 1,5). Эти Ее штаммы с Ent и Hiy плазмидами обеспечивали коэффициент защиты у животных равный 0,6-2,2. Выраженные протективные свойства выявлены для моноплазмидных штаммов, синтезирующих антигены К88 и К93. В этом случае устойчивость животных к заражению возрастала в 2,8-9,0 раз по сравнению с контролем. Защитные свойства антигенов адгезии проявлялись и в опытах на морских свинках.

Показано, что уровень защиты животных от экспериментальной колиинфекции зависел от дозы иммунизирующего К88+ штамма. Увеличение дозы антигена, как правило, приводило к повышению защищенности животных от заражения их вирулентным штаммом E.coli .

Вакцинация животных очищенным антигеном К88 повышала устойчивость мышей к заражению вирулентным штаммом 0157:К88 в 1,8-6,4 раз. Следовательно, полученные результаты подтверждают исследования других авторов о высоких протективнкх свойствах антигенов адгезии и указывают на возможность использования сконструированных нами штаммов для создания вакцины против колидиа-реи животных.

Необходимо также отметить, что изложенные выше экспериментальные данные показывают, что несмотря на то, что мыши-тетра-гибриды и морские свинки далеко не адекватная модель для воспроизведения колидиареи, тем не менее они могут использоваться для предварительной оценки протективных свойств штаммов E.coli при условии воспроизведения экспериментальной колиинфекции у вакцинированных животных штаммами, обладающими известными факторами патогенности.

ВЫВОДЫ

I. Колибактериозная инфекция у новорожденных телят и поросят может протекать в кишечной (колидиарея) и септицемической формах. При колидиарее возбудитель болезни обнаруживается в фекальных массах, содержимом тонкого кишечника и регионарных брыжеечных лимфоузлах. При колисептицемии возбудитель помимо кишечника выявляется в крови и паренхиматозных органах.

2. Основными факторами вирулентности возбудителей коли диареи являются флагеллярные антигены К88, К99, 987Р и А20, обеспечивающие колонизацию кишечника, и энтеротоксинн (тепмолабиль-ный и термостабильный), ответственные за диарейный синдром инфицированного животного.

3. Наряду с антигенами адгезии и энтеротоксинами роль фактора патогенности возбудителей колидиареи телят (KS9+ штаммов) выполняют поверхностные термостабильные А антигены. Они повышают устойчивость клеток к.coli к бактерицидному действию нормальной сыворотки крсзи жзвотннх и человека и некоторым колвдинзм. А антиген;.-; формируют у клеток истинную капсулу тслщинпй 3-5 ш. Наличие капсулы у итам;.;а коррелирует со слизистой консистенцией образуемых в« колоний. Признак слпзеобразования может использоваться для первичного отбора клонов е.coli при бактериологическом анализе материала на колидиарео.

4. Патогенность возбудателе?. коласептицемии наряду с'эндотоксином и други:::; .убктора/и определяется iss детерминантами Со1У-плазиадно1; и г-роыосошгоЛ природы, обеспечиваккгдоп устойчивость к шлплекейту, а альфа гемолизинами, оказывающими ци-тотскспческос действие на различные клетки макрооргаппзма. Установлено, что продукты iss генов плазмидной и хромосомной природа сказывают аддитивное влияние па выживаемость клеток, что свидетельствует о наличии у септвцемических этерихиЗ различных механизмов устойчивости к бактерицидному действию сыворотки крови.

5. Гемолизины, кодируемые хромосомными генами, более токсичны для макроорганнзма по сравнению с гемолизинами плазмидной природы. Альфа гемолизин, детерминируемый хромосомными генами, обладает протектизнкми свойствами. Многократная иммунизация кроликов Н1у+ штаммами индуцирует накопление антител, предохраняющих мышей от смертельной инфекции Н1у+ штампами кишечной палочки, и купирует у них развитие дермонекротической реакции на энутрикожную аппликацию гемолитических клеток E.coli .

6. Установлено, что энзоотические штаммы E.coli , вызывающие колнеептицемию и колидиарею, в подавляющем большинстве случаев продуцируют колицпны. Стопроцентная колициногенность характерна для септицеыических эперихий серогруппы 0119, а также К88+ штаммов E.coli .

Определение чувствительности к колицинам и типа продуцируемого колицина можно использовать как дополнительный тест для идентификации возбудителей в очаге колибактериозной инфекции.

7. Возбудители колидиареи и колисептицемии в подавляющем большинстве случаев обладают множественной лекарственной устойчивостью преимущественно плазмидной и в меньшей степени хромосомной природы. Наиболее широко распространена резистентность

к тетрациклинам, Клорамфениколу и аминогликозидам. В последнее время увеличивается число культур, устойчивых к рифампицину, цефалоспорину, хинолонам и сульфаниламидам.

С учетом повсеместного распространения лекарственной устойчивости антибиотикотерапия колиинфекции должна основываться на предварительном определении антибиотикограмм возбудителя.

8. Осуществлено молекулярное клонирование плазмидных и хромосомных генов E.coli , детерминирующих синтез фимбриальных антигенов К88, К99, термолабильного энтеротоксина ( It генов), аль фа гемолизина (hly генов), колицина V ( cva генов) и продуктов, обеспечивающих повышенную устойчивость клеток е.coli к бактерицидному действию ИСК (iss генов). На основе указанных детерминант сконструированы рекомбинантные плазмиды, стабильно наследуй мые и экспрессирующиеся в реципиентных штаммах E.coli. На основе рекомбинантных и природных плазмид получены штаьмы - продуценты соответствующих антигенов, пригодные для создания диагностических и вакцинных препаратов.

9. Разработаны способы получения диагностических агглютинирующих сывороток к антигенам адгезии К88 и К99. Составлена и у вервдена научно-техническая документация на промышленное производство и применение антиадгезивных сывороток. Налажен выпуск набора агглютинирующих сывороток для тестирования антигенов К88 К99, 987Р, F41 и А20. Разработаны и утверждены методические указания по бактериологической диагностике колибактериоза (эше-рихиоза) животных, включающие в себя этапы использования антиадгезивных сывороток для прижизненной и посмертной диагностики колидиареи новорожденных животных.

о о

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Светоч Э.А.,Бловченко С.А. Колициногенность E.coli , выделенных от телят. -Инфекцион., паразитарн. и незаразн. заболевания с.х. кив-ых. - То.Семипалатинского зооветин-та. - Т.У1. -вып.2. - Алма-Ата, 1970.'- С.38-40.

2. Светоч Э.А..Жунусов М.К. Колицинотипирование кишечных палочек, выделенных от телят. - Taw не. - С.41-45.

3. Светоч Э.А..Федосеев B.C.,Полященко А.П. Из -опыта борьбы с колибактериозом телят. - Инспекционные и паразитарные заболевания сельскохозяйственных животных. - То.Алма-Атинского зооветеринарного ин-та. - T.XX. - Алма-Ата, хЭ72. - С.97-101.

4. Сиеточ S.A..Рубцова Л.Н. Патогенные сепотипы, выделенные от телят при массовых желудочно-кишечных заболеваниях в некоторых хозяйствах Семипалатинской области. - Там же. - С.105-108.

5. Федосеев B.C..Светоч Ж.А.,Рубцова JI.H. Характеристика культур эшепихий, выделенных птш колиоактешозе у полосят. - Там же. - C.II5-II8.

6. Светоч Э.А. К воппосу эпизоотологии колибактешоза у новорожденных телят. - Там же. - C.II9-I20.

7. Светоч Э.А. Проблема внехромосомной наследственности у бактерий в ветеринарной микробиологии. - Таги же. - C.I2I-I25.

8. Светоч Э.А..Квятковский В.Н..Атачкин S.A. Рекомендации

по профилактике и борьбе с массовыми желудочно-кишечными п легочными болезнями молодняка с.х.животных в хозяйствах Семипалатинской обл. - Семипалатинск, 1973. - 9 с.

9. Рубцова Л.Н..Светоч Э.А. Характеристика штаммов сальмонелл и кишечной палочки, выделенных от цыплят при смешанной инфекции. - Тез.докладов второй научн.конференции целиноградской йаучно-исследов.вет.станции. - Целиноград, 1973. - С.53-56.

10. Светоч Э.А.,Жунусов М.К. Селекция патогенных эшерихий на основе свойств, детерминированных внехромосомными «акторами наследственности. - Тез1докладов научно-пооизводствен.конФёиенцип (19-20 декабля 1974 г.). ЫСХ СССР, ГУ ветеринарии, НШЙГветппе-паратов. -М~, 1974. - С.124-126.

11. Светоч Э.А. Колициногенность и колицинотипирование патогенных эшешхий, выделенных от телят. - Профилактика и лечение заболевании молодняка с.х. жив-ых.. - и., i9?4. - Изд."Колос". -С. 251-254.

12. Светоч Э.А.,Жунусов М.К. Этиологическая структура колибактешоза в хозяйствах Семипалатинской области. - Вестник с.х. науки'Казахстана. - Алма-Ата. - 1974. - Л 4. - С.21-24.

13. Светоч Э.А. Агрессины кишечной палочки. - Инфекцион. и паразитарные б-ни с.х. нив-ых. - То.Алма-Атинского и Семипалатинского зосЕетин-тов. - Т.ХХуп. - Алма-Ата, 1974. - С.173-177.

14. Светоч Э.А.,Жунусов И.К. Множественная лекарственная устойчивость бактерий и пути рационального применения антибиотиков в ветеринатшой поактике. - Вестник с.х. натай Казахстана. -Алма-Ата. - 1975. - Ъ 4. - С.74-77.

15. Светоч Э.А..Петров В.М. Рекомендации по профилактике и лечению колибактериоза телят. - Изд."Кайнар". - Алма-Ата, 1975.

19 с.

16. Еумабеков'Х.С..Светоч Э.А. Некоторые данные о колибакте-риозе ягнят. - Болезни овец. - Изд. "Кайкар", Алма-Ата, 1975. -С.124-125.

17.- Светоч Э.А.,Еунусов М.К. Эписомная резистентность эшерихий, выделенных от животных. - Внехромосомная наследственность микроорганизмов. - ГЛ., 1975. - С.67^68.

18. Белавин В.В.,Светоч Э.А. Этиология и причины стационарности массовых желудочно-кишечных заболеваний новорожденных телят в хозяйствах Бе скап агай ск о г о пайона Семипалатинской области. Инфекц. и паразитарн. "б-ни с.х.жив-ых. - Тр.Алма-Атинского и Семипалатинского зооветин-тов. - Т.ХХХи. _ Алма-Ата, 1976. -

С. 122-127.

19. Светоч Э.А. Использование колицинотипирования патогенны* эшерихий пш эпизоотологическом анализе случаев колибактериоза

у телят. -"Там же. - С.127-130.

20. Жунусов М.К.,Светоч Э.А. Носительство антибиотикоустой-чивых эшерихий у коров и телят и обнаружение их на объектах внешней среды. - Там же. - С.I31-135.

21. Светоч Э.А..Жунусов М.К. Природа антибиотикоустойчивости эшеоихий, выделенных от телят. - Вестник с.х. науки Казахстана.-Алма-Ата. - 1976. -НА.- С. 54-57.

22. Белавин В.В.,Светоч Э.А. Распространение и свойства патогенных эшерихий, выделенных от телят в Семипалатинской области. - Вестник с.х. Казахстана. - Алма-Ата. - 1976. - 3. -

С.74-79.

23. Попов Е.И.,Светоч Э.А. Рекомбинантные плазмиды, кодирующие синтез антигена К88 E.coli//Сб.проблемы переноса генетической информации. М.: ВШИСЭНТИ, 1985.'- С.137. '

24. Шитов В.Т.,Черепанов П.А.,Светоч Э.А..Волковой К.И. Клонирование-фрагментов ДК E.coli , ответственных за устойчивость

к действикГкомплемента. - X Всесоюзное совещание по программе "Плазмида" (27-31 октября, 1985). - Пущино, 1985. - CCI79-I80.

25. Светоч Э.А.,Попов Е.И..Кулешова Т.Н. и др. Изучение трансмиссивности плазмид, контролирующих синтез антигена К99 у эшерихий// Молекул.биология и генетика плазмид. - Пущино ,1986. С. 51.

26. Попов Е.И..Светоч Э.А..Кулешова Т.Н. Характеристика пла: миды pPMI, детерминирующей синтез антигена К88/Даы же.-С.44.

27. Светоч Э.А..Попов Е.И..Тугаринов О.А..Малахов Ю.А. и др, Способ получения агглютинирующей эшерихиозной анти-К88 сыворотки/ Авт.свид. Jfc 1277459, СССР, 1986.

28. Пучков Е.О.,Ирхин А.И.,Шитов В.Т..Герасимов В.Н., Светоч З.А.Долотов В.Ю. Сравнительное изучение морфологии и чувствительности к повреждающим шактопамкапсульного и бескап-сульного вариантов Escherichia coll СА1В9/ШЭИ. - 1987. - С.12-16

29. Попов Е.И..Светоч Э.А..Тугаринов О.А..Малахов Ю.А. и др Способ получения эшерихиозной агглютинирующей К88 сыворотки/ Авт.свид. )» 1385339, СССР, 1987.

30. Светоч З.А.,üyлюпин O.K.,Попов i5.il. , Тугаринов O.A., ¡."алалов ¡O.A.- Способ получения аггл'отнкиЬую^де:; анти-К09 су-

воротки / Авт.свид. ü 1405147, СССР, 1988.

51. Попов Е.И.,Светоч Э.А..Тугаринов O.A..Малахов ¡O.A. и др. Способ получения зшешхпозной агглют:?inir-vKiei: К99 суео-откн / Авт. свнд. 'S I4I2069, СССР, 1988.

32. Светоч З.А. Генноннкенерные препарат;; для диагностики и профилактики эшерихиоза //Зппзоотол.,"эпидемнол..средства диагн., тепалии и спец.поой.шюекц.болезней, общих дая чел', и ей в. -Львов, 1988. - С^ 25-26.

33. Попов E.H.,Светоч Э.А.,Гусев 3.В..Глазков H.H. .Тугаринов O.A. Изучение протективных свойств факторов патогенности зге-рихий при экспериментальной колзинфекции//ТоЬ ке. - С.566.

34. Тугаринов O.A.,Светоч 3.А.,Попов Е.й.,Гусев В.В. Разработка методических подходов к изготовлению диагностических агглютинирующих эшерихиозних К88 и К99 сывороток/Дач ке. - С.370-371.

35. Щулюпин O.K.,уодоп И.ы.,Полянин В.П.,Светоч S.A., Волковой К.И. Мутагенез in vitro плазмид гемолитичности // Докл. АН СССР. - 1968. - T.I3I2. - C.3II2-3II5.

36. Светоч 3.А.,Полов Е.И..Черепанов П.А. и др. Молекулярное клонирование детерминант, контролирующих синтез антигенов адгезии кишечной палочки и перспективы'их использования в практике приготовления диагностических препаратов //Генная и клеточная Енкёне-ппя в решении фундаментальных проблем биологии. - Таптт - Кпзоику, 20-22 сент.1988. - Тарту, 1989.'- С.184-188.

37. Попов З.К..Светоч 3.А.,Павлов B.U. и Ду. Конструирование штампов Escherichia coli , ппе;-уц1^\т-:днГ К6& автпген 7/ tno-технология. - 1989. - Т.о. tf I. - С.9-14.

39. Тугашксв О.А. .Пявохзсов 1.1.К. .Малахов Г. А., Попов Е.И. и Светоч Э.А. Штамм бактериТ! Escherichia coli - продуцент адгезивного антигена К88 /Авт.свид. Л 151568-4, СССР,'1989.

40. Торский С.П.,Баннов В.А.,Светоч Э.А.,Попов Е.И. и Тугапиков О.А. Способ отбора штампов Escherichia _coli -продуцентов антигена К88/ Аэт'.свид. й 1597727, СССР', i989.

41. Мулюпин O.K.,Светоч Э.А.,миленков 2.М. .Гусев 3.3., Тугаринов 0.А.,Малахов й.А. питательная среда для выявления фиы-боиального антигена адгезии F41 • полокит.яешекие на заявку ]Г4796093/13/145736/. - 1989.

41.' Зинченко Е.В..Светоч Э.А. .Попов Е.И.,Гусев В.В. .Глазков Н.К. Получение сывороточного диагностикума против антигена адгезии 987Р, синтезируемого энтеротоксигенными штаммами кишечной палочки/Состояние проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекции (1-2 ноябчя 1989 г., Оболенск).- Оболенск, 1990. -С.123.

42. Щулюпин O.K.,Светоч З.А..Шевченко 0.3.,Гусев В.В. Влияние ¿тлеводов на слизистый рост кишечной палочки /Там »£. - С.±24.

43. Шулюпик O.K. .Светоч Э.А.,«¡ленков E.JI.,Гусев 5.Б., Глазков Н.К.,Баннов В.Л. Влияние компонентов питательных сред на уровень синтеза Escherichia ccili антигена F41 /Та'.; ко.-

^ о с.

44. Шитов В.Т. .Светоч 3.А.,Волковой К.И., Клонирование шпаг ментов ДНК Coiv плазмид/БактеРиапьные илазмидн. - Нальчик, IS90. - С.65-66.

45. Полянин В.П..Черепанов П.А.,Светоч 3.А.,Шитов В.Т., Волковой К.К. Клонирование щ.у генов E.coli Хромосомной и плаг мндной локализации 7 Там-ке. - С.64-65.

46. Банков В.А.,Зинченко Е.В.,Попев S.И.,Светоч Э.А., Шитов З.Т. Клонитювание генов, детерминирующих синтез ппотектш ного антигена Зб^Т/Там ;;ie. - С.66-67?.

47. Шитов В.Т.,Сзеточ Э.А..Волковой К.й. Роль Coiv плазми. в патогенности кишечных палочек/Там ке. - С.70-71.

48. Shulyupin O.K., Svetoch Б.A., Popov E.I., Gusev V.V. A biological method to increase the specificity and titre of diagnostic serum // Intern, confer, on Medical biotechnology, Immunization and Aids, June 12-18, 1991. - Leningrad, USSR, p.29.

49. Gusev V.V., Svetoch E.A., Shylyupin O.K., Popov E.I. Specific diagnosis of intestinal infections // Intern, confer, on Medical biotechnology, Immunization and Aids, June 12-18, 1991. - Leningrad, USSK. P.19.

50. Попов E,И.,Светоч Э.А. Новый антиген адгезии эшерихий возбудителей колидиареп телят//Совершенотвованио методов Государственного контроля ветеринарных препаратов. — 1л., 1991. -C.SI0-2II. ' ' '

51. Гафйаров й.з..Спиридонов Г.п.,Гусев В.Б., Светоч ¿.¿г. Попов >J.И. "Изыскание слецйюическпх средств диагностики и nvoqa лактики колибактерпоза телят в условиях промышленных комплекс! Татарской ССР .//'Там so. - С, 208-208.

ПОДПИСАНО В ПЕЧАТЬ И В СВЕТ 20.05.92 ЗАКАЗ й 61. ТИРАЖ 100 экз.

Ротапринт ВНИПЙсгатинформ