Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Действие на систему комплемента пептидных регуляторов препаратов лимфы и брыжеечных лимфатических узлов

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ ЧИТИНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи

РГБ ОД

СЕМЕНОВА / 4 ОКТ

Людмила Юрьевна

ДЕЙСТВИЕ НА СИСТЕМУ КОМПЛЕМЕНТА ПЕПТИДНЫХ РЕГУЛЯТОРОВ ПРЕПАРАТОВ ЛИМФЫ И БРЫЖЕЕЧНЫХ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ

14.00.16 - Патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Чита - 1999

Работа выполнена на кафедре биохимии Читинской государственной медицинской академии.

Научные руководители: Заслуженный деятель науки РФ,

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор В.Н.Иванов,

кандидат химических наук, доцент Б.Б.Шойбонов

Официальные оппоненты:

Лауреат премии Совета Министров

СССР, доктор медицинских наук,

профессор

Н.Н.Цыбиков,

доктор медицинских наук,

профессор Г.И. Бишарова

Ведущая организация:

Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского

Защита диссертации состоится 1999 г. в 10 часов

на заседании специализированного совета Д 84.74.01 при Читинской государственной медицинской академии по адресу: 672090, г. Чита, ул. Горького, 39-А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Читинской государственной медицинской академии по адресу: 672090, г. Чита, ул. Горького, 39-А.

Автореферат разослан 1999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, с.н.с.

А.Н.Ложкина

РП?. б1/, ¿>

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Система комплемента (СК) играет важнейшую роль в поддержании нормального иммунного статуса эрганизма. В последнее время наряду с традиционными взглядами на роль комплемента как неспецифического фактора защиты от бактерий, вирусов, гельминтов, простейших и паразитов увеличивается число исследований, указывающих на его участие в патогенезе иммуннокомплексных и опухолевых заболеваний (Frank MM., Fries L.F., 1991; Asghar S.S., 1995; Baldwin W.M. etal., 1995).

Система комплемента представляет собой совокупность более чем 30 сывороточных и клеточных компонентов, включая активированные белки, рецепторы и регуляторы (Kinoshita Т., 1991; Liszewski М.К. et al., 1996).

К функциям комплемента в настоящее время относят не только литическую (открытую первой), но и регуляторную (Козлов Л. В., 1994, 1997), поскольку освобождающиеся фрагменты компонентов системы являются медиаторами многих воспали- тельных процессов, анафилаксии, секреции регуляторных простагландинов, цитокинов. свертывания крови и пр. (Morgan В.Р., 1990; Ember J.A. et ai., 1994; Reinartz J. etal., 1995).

Возможность уничтожения клеток и инициация многих цепных реакций организма комплементом определяет множественность систем контроля (Козлов Л.В., 1992). Нарушение механизмов естественной регуляции может приводить к развитию иммунологических и биохимических сдвигов (Лебедева Т.В., 1995).

В связи с этим актуальной проблемой является поиск, выделение и изучение модуляторов комплемента, которые легли бы в основу направленной терапии ряда иммуннокомплексных, опухолевых и инфекционных заболеваний.

В последние годы пристальное внимание ученых уделяется биорегуляторам, выделенным из самых различных органов и тканей (Будажабон Н.Г., 1988; Белокриницкая Т.Е., 1988,1990; Морозов М.Ю., 1994; Степанов М.А., 1994; Аюшеев О.Д., 1991,1995; Витковский Ю.А., 1991,1995; Кузник Б.И., Цыбиков Н.Н., 1984,1988,1989; Кузник Б.И.. 1988,1991,1995,1998; Степанов А.В., 1991; Жгенти Г.Р., 1995; Папава К.М., 1995; Резников Ю.П., 1995; Бадмаева Э.Э., 1995.1997). Их функция заключается в регуляции генетического гомеостаза, репаративных и адаптационных процессов, иммунитета, неспецифической

резистентности, гемостаза(Кузник Б.И. и др., 1981-1996; Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1979-1998).

Более ранними исследованиями, посвященными действию биорегуляторов на комплемент, выявлено, что в составе цитомединов имеются эффекторы, оказывающие воздействие на эту протеолитическую систему (Кузник Б.И. и др., 1988; Шойбонов Б.Б., Бадмаева Э.Э., 1995; Шойбонов Б.Б., 1996; Ложкина А.Н., 1998; Шойбонов Б.Б. и др., 1995-1998).

Знание молекулярных механизмов естественной регуляции, а также методов воздействия на нее позволило бы, во-первых, понять основу многих заболеваний, этиология и патогенез, которых неизвестны ш™ остаются спорными; во-вторых, создать средства эффективногс искусственного контроля, направленного на коррекцию комплементарно? активности.

Цель и задачи исследования. Цель работы - выделение и изучение механизмов действия эффекторов пептидных фракций брыжеечны? лимфатических узлов и лимфы на систему комплемента

В соответствии с поставленной целью последовательно решалиа следующие задачи.

1. Разработать методы фракционирования пептидных препаратов и брыжеечных лимфатических узлов и лимфы.

2. Установить химическую природу изучаемых эффекторо] комплемента.

3. Исследовать молекулярный механизм действия данны: пептидных препаратов на систему комплемента.

Научная новизна. В ходе работы впервые получены очищенные ингибиторы фермента С1 б из пептидов лимфы и субкомпонента С Ц из пептидов лимфатических узлов брыжейки. Выявлено, что эффектор из пептидов лимфы является низкомолекулярным гидрофобным соединением

с молекулярной массой около 300 Д, а регулятор из пептидов лимфатических узлов - более высокомолекулярным соединением пептидной природы с молекулярной массой менее 1 ОкД. Впервые исследован механизм воздействия данных эффекторов на систему комплемента. Установлено, что пептиды брыжеечных лимфатических узло связываются с глобулярными головками молекулы СЦ и тем самым блокируют связывание компонента С1 с иммунными комплексами и последующую активацию комплемента. Впервые показано, что эффектор I пептидов лимфы взаимодействуют с компонентом С4 и продуктом его

протеолиза - С4Ь, иммобилизованным на мембране; препятствуют связыванию С2 и ингибируют формирование СЗ-конвертазы классического пути за счет предотвращения активации фермента С1 е.

Практическая значимость. Представленные результаты позволяют расширить знания об эндогенных регуляторах классического пути активации системы комплемента в организме человека.

Полученные данные о пептидах лимфы и брыжеечных лимфатических узлов свидетельствуют о том, что они могут быть источниками новых регуляторов этой системы и их применение может явиться одним из важных подходов к лечению широкого круга заболеваний, обусловленных изменениями иммунного статуса и неспецифической резистентности организма.

Разработанные методы внедрены и используются в учебном процессе кафедр биологической химии, микробиологии, патологической физиологии Читинской государственной медицинской академии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В брыжеечных лимфатических узлах содержится бдокагор связывания субкомпонента С1ц первого компонента с иммунными комплексами, в лимфе - ингибитор фермента С15.

2. Эффектор из пептидов лимфы взаимодействует с компонентом С4 и продуктом его протеолиза - С4Ь, иммобилизованным на мембране; препятствует связыванию С2 и ингибирует формирование СЗ-конвертазы классического пути за счет предотвращения активации фермента СЬ. Ингибитор С1б - низкомолекулярное гидрофобное соединение пептидной природы с молекулярной массой около 300 Д.

3. Пептидная фракция лимфатических узлов брыжейки связывается с глобулярными головками молекулы С^ и тем самым блокирует связывание компонента С1 с иммунными комплексами. Блокатор СЦ - соединение пептидной природы с молекулярной массой менее 10 кД.

Апробация работы. Материалы исследований доложены на научной конференции молодых ученых и студентов ЧГМА (Чита, 1998), Всероссийской научной конференции "Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии "(Санкт-Петербург, 1998), региональной научно-технической конференции "Теоретические и практические

проблемы безопасности Сибирского региона" (Иркутск, 1999), совместном заседании кафедр биохимии, нормальной физиологии, гистологии, патологической физиологии и микробиологии Читинской медицинской академии (Чита, 1999).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, общего заключения и выводов; включает 7 таблиц, 17 рисунков и список литературы, содержащий 275 источников, в том числе 152 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение сенсибилизированных антителами кролика эритроцитов барана (ЕА) проводили по методике Л.В. Козлова и соавт. (1982). Изотонический вероналовый буфер, рН 7,4 (VBS), содержащего ионы Са2+ и Mg2+ (VBS2+) готовили по методике Williams С., Chase M.W. (1974). Гемолитическую активность комплемента оценивали по степени лизиса ЕА сывороткой человека (классический путь активации) и по гемолизу эритроцитов кролика (альтернативный путь активации).

Функциональную активность отдельных компонентов комплемента (Clq, С1-С5, факторов В, D) определяли методом гемолитического титрования по Л.В. Козлову и соавт. (1982) при добавлении к нативной сыворотке крови доноров специальных реагентов. Использование этих реагентов в гемолитической системе дает линейные зависимости активности соответствующих компонентов от величины z, которую определяли по формуле

Кп.л- KR Z - In_, где

Кп.л.~ А405

Kr - контроль реагента (буфер вместо тестируемой пробы), Кцл. ~ контроль полного лизиса эритроцитов, А405 - измеренное значение (в тестируемой пробе) надосадочной жидкости над эритроцитами после проведения реакции комплемент-зависимого гемолиза.

Выделение функционально активных субкомпонентов Cl осуществляли аффинной хроматографией на колонке с иммобилизованным Ig G по методу Л.В. Козлова и соавт.(1989). Пептиды получал» уксуснокислой экстракцией по методу В. Г.

Морозова и В.Х. Хавинсона (1981). Гель-фильтацию осуществляли на колонке (2,5 х 40 см) с сефадексом G-50 (superfine), уравновешенной 0,01 М трис-НС1-буфером, содержащим 0,15 М NaCl (рН 7,4). Для определения молекулярной массы в качестве стандартов использовали тиреоглобулин, хемотрипсин, РНК-азу, глутатион, триптофан ("Serva", ФРГ).

Высокоэффективную жидкостную хроматографию под давлением (HPLC) проводили на колонке Macrosphere GPS 60 7U (Alltech) (4,6 x 250 мм), используя хроматографическую систему LKB 2135 UltroPax (Швеция). Колонка была уравновешена в 0,04 М фосфатном буфере, содержащем 0,2 М NaCI и 10% этанола, рН 6,8 при 20°С. Количество элюируемых пептидов определяли спектрофотометрически при длине волны 220 нм. На колонку наносили 100 мкл вещества.

Ионообменную хроматографию проводили на колонке с ДЭАЭ-сефарозой, уравновешенной 0,01 М трис-НС1-буфером, содержащим 0,15 М NaCl (рН 7,4) и на колонке с СМ-сефарозой, уравновешенной 0.02 М фосфатным буфером (рН 6,5).

Диализ проводили через полупроницаемую мембрану (диаметр пор до 10 кД) в вероналовой буферной системе.

Содержание белка определяли качественными реакциями на белки и аминокислоты: биуретовой, нингидриновой, ксанто-протеиновой, методами Фоля, Миллона, Сакагучи, Адамкевича. Гопкинса-Коле, Паули.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Действие пептидов лимфы на классический путь активации комплемента человека

Для получения эффекторов комплемента препатат Г1Л подвергали фракционированию гель-фильтрацией, которую проводили на колонке с сефадексом С-50, уравновешанной 0,01 М трис-НС1-буфером. содержащим 0,15 М №С1, 0,01 % ЫаЫз (рН 7,4) со скоростью 25 мл/час. После элюирования всех фракций спектрофотометрически определяли степень светопоглощения при

Р А

1

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

00

■220

V

II I I II IIIII I IIIII И II IIIIIIIIIIIIIIГ1I II

№

15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 фракции

Рис. 1. Гель-фильтрация пептидов лимфы на колонке с

сефадексом 0-50, уравновешенной 0,01 М трис-НС1-

буфером, содержащим 0,15 М ЫаС1, 0,01 % ЫаЫ3.

А&о- По данным элюции ПЛ был построен график, на котором имеются два пика: первый - высокомолекулярный, не обладающий антикомплементарной активностью и второй - низкомолекулярный обладающий активностью (рис.1). По результатам гель-фильтрации маркировочных соединений: была оценена молекулярная масса нашего пептида около - 300 Д.

В дальнейшем низкомолекулярный пик подвергали исследованию в модельных гемолитических системах на различных этапах активации. Установлено, что антикомплементарная активность низкомолекулярной фракции обусловлена ингибированием формирования СЗ-конвертазы за счет связывания с субкомпонентом (Лв.

Далее пептиды диализовали через полупроницаемую мембрану в буферной системе изотонического вероналового буфера в количественном соотношении 1:10 (1мл ПЛ и 10 мл УВБ). Выявлено, что фракция, вышедшая в диализный буфер, более активна, в ней сохраняются все предыдущие эффекты ингибирования формирования СЗ-конвертазы.

Данную активную фракцию ПЛ анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, которую проводили на колонке МасговрЬеге вРБ 60 711 (АШесЬ) (4,6 х 250 мм), используя хроматографическую систему ЬКВ 2135 1Лй"оРах (Швеция). Количество элюируемых пептидов оценивали спектрофотометрически

Активность, %

№1 №2

[ПЛ],

О 3,2 6,4 9,6 12,8 16 19,2 22,4 25,6 МКГ/МЛ

Рис.2. Ингибироваиие препаратом ПЛ классического пути комплемента в зависимости от концентрации и времени преинкубации.

1 - преинкубация 15 минут,

2 - без преинкубации.

о степени светопоглощения при 220 им. ПЛ разделялись на 9 пиков и сновная часть разделяющегося вещества была сосредоточена в двух павных пиках, один из которых обладал значительным нтикомплементарным эффектом. ПЛ оказались гидрофобными. Время здержки пептидов на сорбенте пропорционально степени их идрофобности. Начало элюции цитомединов лимфы происходило на 14-й минуте. На 16-19 минутах появлялись пики основной части вещества то свидетельствует о повышенной степени гидрофобное™ пептидов.

Была исследована способность пептидов лимфы (ПЛ) нгибировать классический путь комплемента. На рис.2 показано озозависимое подавление гемолиза по классическому пути с реинкубацией сыворотки с эффектором и без преинкубации. [редварительное выдерживание разбавленной сыворотки с ПЛ не лияет на степень подавления гемолитической активности.

Это может свидетельствовать об отсутствии инактивации какого-ибо компонента комплемента и об обратимом характере связывания нгибирующего фактора.

Таблица 1.

Количество комплекса ЕАС4Ь, образующегося в присутствии ПЛ (2. - доля эритроцитов, несущих С4Ь)

ПЛ, Ъ ПЛ, Ъ

мкг/мл мкг/мл

0 0,85 19,2 0,16

6,4 0,68 25,6 0,1

12,8 0,24 44,8 од

Для установления механизма действия ПЛ на комплемент был< изучено влияние этого эффектора на разных этапах активации системы Было найдено выраженное ингибирующее действие ПЛ при посадке С41 (табл. 1) и оценена константа ингибирования равная 2,04 мкг/мл

ПЛ связываясь с иммобилизованным С4Ь, препятствуют посадк компонента С2 и формированию СЗ-конвертазы, константа ингибировани образования СЗ-конвертазы составила 7,03 мкг/мл, что в три раз превышает К; стадии посадки С4Ь на ЕА. Ингибирование формирования СЗ конвертазы ПЛ могло быть обусловлено блокированием связывания С2 I С4Ь в ходе активации комплемента. Для проверки этого предположени были проведены эксперименты по определению обратимого №2+ зависимого связывания компонента С2оху комплексом мембраносвязанног< С4Ь (ЕАС4Ь) и ингибирования этого процесса препаратом ПЛ.

Количество связавшегося С2оху определяли по активност] формирующейся СЗ-конвертазы. Количество несвязавшегося С20Х определяли по его активности в супернатанте после инкубации ЕАС4Ь I центрифугирования в системе с реагентом И2.

Показано, что при увеличении концентрации ПЛ количестве несвязавшегося С2 в супернатанте увеличивается. Данные о распределен!« активности в растворе и на комплексе ЕАС4Ь (в виде ЕАС4Ь2аоху приведены в таблице 2.

Ингибирование формирования СЗ-конвертазы обусловлено блокирование:*, связывания С2 с С4Ь в ходе активации комплемента ферментом С1б.

Таким образом, исследование влияния ПЛ на стадии активации С4 ферментом С1в показало сохранение антикомплементарного эффекта и после посадки С4Ь на ЕА.

Таблица 2.

Ингибирование препаратом ПЛ связывания компонента С20Х> на ЕАС4Ь и образования СЗ-конвертазы (ЕАС4Ь2аоху)

ПЛ, Доля С2 в ПЛ, Активность СЗ- Ингибирова-

мкг/мл растворе, г мкг/мл конвертазы, % ние, %

0 0,01 0 100 -

6,4 0,01 6,4 89 11

19,2 0,03 12,8 67

25,6 0,04 19,2 28 72

44,8 0,06 25,6 17 83

Действительно, количество стабилизированной ионами \!Г СЗ-конвертазы, образующейся при инкубации комплекса ЕАС4Ь с реагентом Я3ох\ зависело от количества добавленного в систему цитомедина. На сформированную СЗ-конвертазу, стабилизи- рованную ионами никеля, препарат действия не оказывал. Как оказалось ингибирование формирования СЗ-конвертазы обусловлено подавлением процесса активации компонента С2 тем же ферментом С15.

При определении химической природы эффектора комплемента оказались положительными реакции на белок: биуретовая, нингидриновая, ксантопротеиновая на ароматические аминокислоты: фенилаланин, тирозин и триптофан, реакция Сакагучи на аргинин. Отрицательными - на наличие тирозина, триптофана, пролина, гистидина, цистеина, метионина и цистина. Установлено, что очищенный препарат ПЛ является гидрофобным низкомолекулярным соединением с молекулярной массой около 300 Д пептидной природы, который проявляет свойства ингибитора фермента С1 э.

2. Регуляция системы комплемента пептидами из брыжеечных лимфатических узлов

Пептидный препарат брыжеечных лимфатических узлов (ПБЛУ) дозозависимо подавляет гемолиз эритроцитов барана (ЕА) по классическому пути (рис. 3).

Лизис, %

Рис. 3. Ингибирование препаратом ПБЛУ классического пути

активации комплемента в зависимости от концентрации и времени преинкубации.

1- без преинкубации,

2- преинкубация 15 минут.

Предварительное выдерживание разбавленной сыворотки с ПБЛУ не влияет на степень снижения гемолитической активности.

Следовательно, действие препарата связано непосредственно с функционированием определенных стадий комплементарного каскада.

Для выделения активной фракции ПБЛУ предварительно диализовали через полупроницаемую мембрану в вероналовой буферной системе, после чего определялась антикомплементарная активность в диализном буфере и в диализуемом препарате. В ходе работы выявлено, что обе фракции способны ингибировать систему комплемента. При исследовании низкомолекулярной фракции на различные стадии комплементарного каскада обнаружено выраженное ингибирующее действие ПБЛУ на связывание С4Ь с системой ЕА (табл. 3).

При исследовании последующих этапов гемолитического каскада было выявлено, что влияние низкомолекулярной фракции, ингибирующей связывание С2 с комплексом ЕАС4Ь, сопоставимо с его влиянием на связывание ЕА с С4Ь.

Эффект ингибирования формирования СЗ-конвертазы низкомолекулярной фракцией значительно ниже, чем действие на посадку С4Ь и после посадки С4Ь на ЕА.

Таблица 3.

Количество комплекса ЕАС4Ь, образующегося в присутствии низкомолекулярной фракции (2. - доля эритроцитов, несущих С4Ь)

Низкомолекулярная фракция, мкг/мл Ъ

0 0,23

3,84 0,13

7,68 0,09

12,8 0,08

16,64 0,05

Аналогично исследовали и высокомолекулярную диализную фракцию лимфатических узлов.

Для установления механизма действия этой фракции ПБЛУ на комплемент было изучено влияние эффектора на разных этапах активации комплемента Выявлено выраженное ингибирующее действие пептидов при связывании субкомпонента С 1ц на ЕА (табл.4) и оценена константа ингибирования, равная 37 мкг/мл.

Ингибирование связывания С1ц может быть обусловлено либо блокированием комплемент-связывающего участка в молекуле в, либо взаимодействием с коллагеноподобной частью СЦ и диссоциацией субъединиц С1 г2С 1 з2.

Для выявления одного из возможных механизмов была проведена предварительная инкубация эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика с пептидами из лимфатических узлов. При этом снижение комплементарного гемолиза не происходило. ПБЛУ также не влияли на лизис комплекса ЕАС реагентом II После связывания СЦ с ЕА пептидный препарат лимфоузлов в исследованных концентрациях эффекта не оказывал. Получены убедительные данные о том, что пептиды высокомолекулярной фракции из лимфоузлов брыжейки овец взаимодействуют с глобулярными головками молекулы С 1ц и тем самым ингибируют связывание С1 на иммунных комплексах и последующую активацию комплемента.

Для исследования влияния ПБЛУ на последующие стадии комплементарного каскада проведены эксперименты по формированию мембраносвязанной СЗ-конвертазы классического пути.

Таблица 4.

Количество комплекса ЕАСЦ, образующегося в присутствии ПБЛУ (г - доля эритроцитов, несущих С Ц)

ПБЛУ, мкг/мл ъ

0 0,30

6,4 0,27

12,8 0,20

25,6 0,16

38,4 0,12

Выявлено ингибирование формирования СЗ-конвертазы, которое обусловлено дополнительной посадкой СЦ из К3оху. Поэтому ингибирование на посадку С4Ь более эффективно, чем связывание С2а. Данные полностью подтверждены отсутствием действия после посадки СЦ. На образованную СЗ-конвертазу, стабилизированную №2+, препарат ПБЛУ однозначно не влиял, так же, как и на последующие стадии комплемента: образование С5-конвертазы, ее функционирование и действие мембраноатакующего комплекса.

Гель-фильтрацию низкомолекулярной фракции ПБЛУ проводили на колонке с трисакрилом ОР-05, уравновешенной 0,01 М трис-НС1-буфером, содержащим 0,15 М ЫаС1, 0,01 % ЫаЫз (рН 7,4). После элюирования всех фракций определяли степень светопоглощения при А220 на спектрофотометре. Фракции, имеющие высокую степень поглощения света, изучали в модельных гемолитических системах. Низкомолекулярный пик обладал антикомплементарной активностью (рис.4).

Используя ионообменную хроматографию после диализа раствор низкомолекулярной фракции наносили на колонку с ДЭАЭ-сефарозой СЬ-6, уравновешенной 0,02 М трис-НС1-буфером, содержащим 0,15 М ЫаС1 и 0,01% 1Ма1Мз (рН 7,5). Элюцию связавшейся фракции проводили 0,02 М трис-НС1-буфером, содержащим 1 М ЫаС1, 0,01% №N3 (рН 7,5). При этом с колонки элюировалась фракция, обладающая антико мл ементар ны м эффектом.

При изучении химической природы пептидов брыжеечных лимфатических узлов выявлены положительные качественные реакции на белки: биуретовая, ксантопротеиновая, нингидриновая

Лизис, %

Рис.4. Антикомплементарная активность фракций после гель-фильтрации на колонке с трисакрилом ОР-05.

на наличие аминокислоты пролина. Исследования показали отрицательные результаты на содержание аминокислот: тирозина,триптофана, аргинина, гистиднна, цистеина, метионина и цистина.

Полученные результаты свидетельствуют, что очищенный эффектор из ПБЛУ - это низкомолекулярное соединение, имеющее в своем составе кислые и гидрофобные аминокислоты, обладающие эффектом ингибирования формирования СЗ-конвертазы классичес- кого пути активации комплемента. Высокомолекулярная фракция ингибирует связывание Ск] с иммунными комплексами.

Таким образом, в нашей работе были выявлены, выделены, очищены и охарактеризованы эффекторы комплемента из лимфы и лимфоузлов. Проведенные исследования позволили обнаружить в препарате брыжеечных лимфатических узлов регулятор субкомпонента СЦ первого компонент;!, в лимфе - ингибитор фермента С ¡б.

Препарат ПЛ является перспективным в плане получения регулятора ключевого фермента системы комплемента - С1 э, который мог бы широко использоваться в клинической практике для лечения состояний, связанных с дефицитом С1-ингибитора, в частности, при отеке Квинке. Выделенный регулятор С 1ч из ЛУ является удобным инструментом изучения стадии инициации комплементарного каскада и, кроме того, как свидетельствуют результаты, может найти применение в клинической практике в виде блокатора активации классического нуги системы комплемента.

-16-выводы

1. Разработаны методы выделения регулятора субкомпонента С1 э из пептидов лимфы и регулятора СЦ из пептидов брыжеечных лимфатических узлов способом многостадийного фракционирования.

2. Ингибитор фермента С1э из пептидов лимфы - низкомолекулярное гидрофобное соединение пептидной природы с молекулярной массой околс

3. Ингибитор субкомпонента Clq из пептидов брыжеечньо лимфатических узлов - соединение пептидной природы с молекулярное массой менее ЮкД.

4. Пептиды лимфы предотвращают активацию С4, посадку компонент; С2 и образование СЗ-конвертазы.

5. Пептиды брыжеечных лимфатических узлов связываются глобулярными головками молекулы Clq, ингибируют взаимодействи компонента С1 с иммунными комплексами и тем самым препятствую последующей активации комплемента.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пептиды лимфы, блокирующие формирование СЗ-конвертаз (С4Ь2а) классического пути комплемента человека // Заб. мед. вестник. Чита, 1997. -Т.1, N 2. - С. 21-24. (Соавт.: Шойбонов Б.Б., Иванов В.Ь Зинченко A.A.).

2.Механизм ингибирования активации комплемента челове] пептидами из брыжеечных лимфатических узлов // Фундаментальные прикладные аспекты современной биохимии. Том I. — Тр. науч. конф. 15-окт.1998 г. - Санкт-Петербург, 1998. - С.63-67. (Соавт.: Шойбонов Б.1 Иванов В.Н.).

3. Регуляция системы комплемента пептидными препаратами лимфы брыжеечных лимфатических узлов // Теоретические и практическ проблемы безопасности Сибирского региона. - Иркутск, 1999. - С. 45-z (Соавт.: Шойбонов Б.Б., Иванов В.Н.).

4. Пептццный препарат лимфы - специфический ингибитор С конвертазы классического пути комплемента // Цитомедины, цитокинь антигены главного комплекса гистосовместимости (HLA). Выпуск 2. Чита, 1999. - С. 28-29. (Соавт.: Шойбонов Б.Б., Иванов В.Н.).

300 Д.