Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Варианты изотипирования компонента (4 компонента человека)

Актуальность проблемы

Одним из направленийпрофилактической медицины является создание единообразных тест-систем для клинических обследований гуморального статуса человека, в том числе на основе иммуноферментного анализа (ИФА) [3]. В последние годы все больше возрастает интерес исследователей к определению статуса системы комплемента (СК) в организме человека, особенно ключевых компонентов СК. В группе молекулярной иммунологии ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского разрабатываются иммунофер-ментные методы определения функциональной активности компонентов и факторов СК [26,30]. '

Настоящая диссертационная работа связана с разработкой и применением ИФА изоти-пов С4А и С4В компонента С4 комплемента сыворотки человека. Ключевая роль компонента С4 состоит в том, что он участвует в самом начале каскада ферментативных реакций, осуществляемых СК после инициации классического пути (КСК), когда активацией С4 начинается формирование СЗ-конвертазы (С4Ь2а).

Определение белков СК в микропанельных вариантах обычно основаны на определении содержания компонентов СК как антигенов. Однако, наиболее информативным является оценка функциональной активности этих белков, которая и характеризует каскадное развитие патологического процесса.

Таким образом, разработка надежных и высокочувствительных методов установления статуса изотипов компонента С4 является актуальной задачей. Новые методы улучшат диагностику, прогноз и мониторинг аутоиммунных и инфекционных заболеваний человека.

В связи с вышесказанным была поставлена цель исследования - разработка вариантов ИФА функциональной активности изотипов С4А и С4В, а также их количеств после изоэлектрофоретического разделения изотипов и применение разработанных методов в исследовании С4-изотипического статуса сывороток в норме и патологии.

Для выполнения цели были поставлены следующие задачи исследования:

• разработать, варианты ИФА функциональной активности С4А и С4В в микропанели; на их основе разработать микропанельные варианты ИФА для определения констант ингибирования акцепторами функционально активных С4А или С4В;

• разработать варианты ИФА, включающие изоэлектрофокусирование сывороток в полиакриламидном геле, электроблотинг, иммуноблотинг и хемилюминесценцию пероксидазной реакции в режиме живого изображения, для визуального определения С4А и С4В;

• апробировать разработанные варианты ИФА на сыворотках больных с дефицитами С4А и С4В;

• с помощью разработанных вариантов ИФА исследовать дефициты С4А и С4В в сыворотках крови людей, в том числе с нарушениями беременности и при иммунном ответе на СогупеЬас1егшт сИрШИепае.

Научная новизна:

• разработаны высокочувствительные варианты ИФА функциональной активности изотипов С4А и С4В компонента С4 комплемента человека в микропанели и количественного хемилюминесцентного анализа изотипов С4А и С4В, позволяющие определять любые варианты дефицитов изотипов С4 в сыворотке, а также выявлять индивидуальные сывороточные особенности изотипов С4А и С4В;

• разработан высокочувствительный метод микропанельного ИФА ингибирования функциональной активности индивидуальных изотипов С4А и С4В сыворотки человека бактериальными антигенами;

• исследование наличия дефицитов изотипов компонента С4 .комплемента может быть использовано в диагностике течения гестационного процесса и выделения групп повышенного риска женщин в невынашивании беременности, особенно по типу неразвивающейся беременности;

• наличие дефицитов С4В в сыворотке крови может приводить к снижению уровня антибактериального иммунного ответа против СогупеЬаМепит сИрЫкепае.

Практическая значимость работы

• Упрощена технология изотипирования компонента С4 комплемента в микропанели, предусматривающая использование более чувствительных и доступных реагентов - антител против СЗ и пероксидазного конъюгата этих антител по сравнению с реагентами на основе С4 человека;

• метод позволяет определять дефицит С4А и С4В в сыворотке больных, что может быть расценено, как фактор риска развития аутоиммунных и инфекционных заболеваний и может быть рекомендован для широкого использования в клинических условиях для диагностики нарушений в иммунной системе вместе с другими клиническими показателями;

• практическая ценность работы подтверждена двумя патентами.

Заключение

Представленные выше материалы диссертационной работы содержат научную новизну и практическую значимость.

Научная новизна выполненной работы заключается в следующем. Разработаны высокочувствительные варианты ИФА функциональной активности изотипов С4А и С4В компонента С4 комплемента человека в микропанели и количественного хемилюминесцентного анализа изотипов С4А и С4В. Разработан метод микропанельного ИФА ингибирова-ния функциональной активности индивидуальных изотипов С4А и- С4В сыворотки человека бактериальными антигенами. Установлено, что количественное определение дефицитов изотипов компонента С4 комплемента может быть использовано в диагностике течения гестационного процесса и выделения групп повышенного риска женщин по невынашиванию беременности. Показано, что дефицитность сывороток по изо-типу С4В может приводить к снижению уровня антибактериального иммунного ответа на СогупеЬас1епит сИрШИепае.

Практическая значимость выполненного диссертационного исследования состоит в следующем. Упрощена технология изотипирования компонента С4 комплемента в микропанели, предусматривающая использование более чувствительных и доступных реагентов - АТ против СЗ и пероксидазного конъюгата этих АТ.

Новые варианты микропанельного ИФА С4А и С4В позволяют выявлять различия в действии антигенов на С4А или С4В. Предложен метод С4-изотипирования сыворотки человека путем использования ИФА на блоте после изоэлектрофокусирования. Определение дефицитов С4А и С4В в сыворотке человека позволяет оценивать риски невынашивания > беременности.

Представленные в диссертации данные о новых способах тестирования функциональной активности изотипов С4А и С4В и их визуального наблюдения являются базисом для дальнейшего развития анализов функционирования С4А и С4В, изучения механизмов переключения функционирования комплемента с использованием С4А- или С4В-каскада. Разработанные в диссертационной работе способы оценки дефицитов С4А и С4В могут найти применение для выявления рисков возникновения аутоиммунных болезней, а также ряда бактериальных и вирусных инфекций у населения.