Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Получение и изучение реактива для определения активированного парциального тромбопластинового времени на основе фосфолипидов сои

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЕ вПЕРАЦИИ ЛЕНИНГРАДОМ НАЭТНО-ИССЛ^ОВАТЕЛЬСЮЙ ИНСГ/1УТ

гвшоесгл! к перекеания крсзви

На правах рукописи

"Ддя служебного пользовалил"

Экз 9 №

Старицына Наталья Николаевна

ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ РЕШИВ А. ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВИРОВАННОГО ПАРЦИАЛЬНОГО ТРОМЮаЧАСМЮВСГО ВРЕМЕНИ НА ОСНОВЕ «ОСФОЛИПВДОВ сои

14.00.2Э. - гематология и перелагали« крови

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ КА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЯ СТЕПЕНИ КАНЭДцДТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

ъ ! ; ф к

Санкт-Петербург - 1993 год

габст* Лусаке*« в Т. унгнгрллехоы на;~-шс-не следовательском институте геыегелоггн и г.ер^дги'-чк« хрсвх Ыиьнстерсрва здравоохранения Российской Седерацки.

Каучкые руководители: доктср медицинских наук, сг&рси? научный сотрудки» А..Майская, доктор медицинских к»>х, с гатг. и Г на^ну? сотрудник Л.П.Лалаян.

спаонвнть-:

доктор биологических науи, гдавниГ. научный сотрудник Ц.З.Харченко докрр медицинских наук, профессор Н.Н.Летризев.

Вед/цая организация: Ккрэеск#й научнэ-хсследоае'г-яшчв институт гематологии и перелизан»» крови.

Зацхта диссертации состоится л Я(уг^ ГССЗ года

в /3 «чеов иа. еасвдякяк сге'т*»лызх70ваиног^/св»е?:; £екикгр*«-сгего научно-исследовательского института гематологии и переливания крови по адресу: 1^3024, г. Санхт-Г.етербург, ;,л.2-я Советская доц 16.

С дкгеер!ацие* мехно ознакомиться в библиотеке Леккмградсксг ' гематологии и переливания крови.

IX

А1гсре$ера? разослан 1X3 года.

Ученый секретарь ссециадил'.рованнох с совета кандидат медицинских наух

5,С."ыхо*

ОБЩАЯ ХАРАКГЬРИС'Г/КА РАГОТЫ.

Актуальность работы« Одной из актуальных задач современной коагулологии является разработка стандартных методов определения коагуляционного потенциала крови. В настоящее время одним из основных скриниг-методов исследования процессов свертывания крови яв-ляе.тсл активированное парциальное тромбопластиновое время (А1ГЛЗ). АПТВ представляет собой модификацию времени рэкальцификации плазмы. Вариабельность, присущая обычной рекальцификации, в тесте АШВ снижается за счет стандартизации условий: введением в систему контактной активации поверхностно-активным веществом и максимального каталитического эффекта фосфолипидов (ФЛ), который обеспечивается присутствием заменителя тромбоцитарного фактора 3, так называемого АП'1В-реактива. В этих условиях время свертывания плазмы зависит исключительно от уровня плазменных факторов, участвующих в процессе внутреннего пути свертывания крови: ХП, XI, УШ, IX, У, X, протромбина и фибриногена. В связи с этим проведение этого теста рекомендуется при профилактических исследованиях больных перед всеми хирургическими вмешательствами народу с определением времени кровотечения и протромбинового времени / Баркаган З.С., 1988, Федорова З.Д., Т977/. Тест АШВ широко используется для оценки состояния гемостаза у больных с нарушениями I фазы свертывания крови, в том числе для диагностики гемофилии А и В, болезни Вил-лебранда. Кроме того, АП'Ш очень чувствительно реагирует на присутствие гепарина в плазме, поэтому используется и для контроля гепаринотерапии.

Фосфолипидные реактивы, используемые в тесте АШВ, в основном получают экстракцией органическими растворителями из высушенных ацетоном порошков кадаверного или животного мозга / /-^о" ,У/

РоС&'г, /, хотя известен и реактив растительного проис-

хождения - <5Л, выделенные из бобов сои / Л.!^с /996 /. Несмотря на длительный срок (более 30 лет) широкого применения за рубежом теста АПТВ и использования коммерческих АГПВ-реактивов, до сих пор активно обсуждаются вопросы оценки чувствительности различных фосфолипидных реактивов к выявлению коагуляционных нарушений, что связано со значительными расхождениями в данных, полученных с разными реактивами. Это объясняют тем, что не все реактивы обладают высокой чувствительностью ко всему спектру коагуляционных изменений. Наиболее чувствительными

оггоо.1.. .

к е»¡явлению коагуляционных нарушений разной степени тяжести считают реактивы "Мачестер АПТГ" (Англия) из мозговой ткани человека и' "Актин ФС" (СЬА) из бобов сои /УКб/% Кроне того,

до сих пор не сформулирован« требования к физико-химическим своР-ствяц фосфолипмдмых смесей, применяющихся в лабораторной практике в качестве заменителя тромбоцитариого фактора 3.

Отечественная практическая медицина до сих пор недостаточно обеспеоена реактивами для проведения тесте АПТВ. Используемые я в лабораториях фосфолипидные диагностические препяратн представлены фирмой "Реваал" (Венгрия), ВГ11Ц (препарат "Эрилид" из эритроцитов человека). Ленинградским и Кировским НШ гематологии и переливания крови (сырье - кадавермъ'Я мозг «еловекя). Все перечисленные .реактивы изготавливаются из биологических материалов и не исключают возможности инфицирования персонала при работе с исходным веществом. Кроме того, получение и переработка * промышленном масштабе трупного мозга человека затруднительны как вследствие его дефицита, так и по этическим соображениям. Недостатками указанных реактивов является их нетехнологичность из-за источников сырья. В связи с етим разработка технологии получения дешевого, безопасного и чувствительного реактива для определения АПТВ является актуальной проблемой.

"¡-{ель настоящего исследования. Разработка способа получения нового реактива для определения АПТВ на основе фосфолипидов сои.

'Для достижения указанной цели были поставлены следующие еадачи.

. ...,>1. .Определить возможность применения соевых фосфолипидов в кэддстве заменителя"тромбоцитарного фактора 3 в тест-системе для определения АПТВ. Установить зависимость между физико-химическими свойствами фосфолипидных смесей и их прокоагулянтной активностью.

2. Разработать способ получения АПТВ-реактива из бобов сои, используя отходы производства соевого лецитина.

• Получить лиофилизированную форму АП'ГВ-реактива из бобов сои.

, Определить оптимальные условия определения АПТВ с применение« АГТГВ-реаетива из бобов сои.

-5. Обосновать возможность применения АПТВ-реактива из бобов сои для диагностики нарушений в системе гемостазе.

6. Составить лабораторный регламент производства реактива для определения АПТВ из бобов сои и инструкцию по его применению.

Научная новизна. Разработаны критерии физико-химической оценки фосфолипидов, обладающих высокой прокоагуллнтной активностью. Разработан способ получения первого отечественного реактива для определения АПТВ на основе растительного сырья, обладающего стабильной активностью и высоко!* чувствительностью к различным коагуло-патиям. Способ получения реактива защищен Авторским свидетельством » Т7К7743 с приоритетом от П?.П'7.Ч0.

ГР?КТ_е_ • Создание нового АП'1В-реактива из бобов сои расширяет номёклатуру фосфолипидных диагностических препаратов. Применение АП'ГВ-реактива из бобов сои позволяет с большей точностью диагностировать наследственные коагулопатии - гемофилию А и В и болезнь Виллебранда по сравнению с реактивом фирмы "Реанал" (Венгрия), что особенно ваяно для выявления скрытых форм заболевания. Предлагаемый реактив также более "ув?твителен к присутствию гепарина в терапевтических пределах и потому может быть использован для контроля гепаринотерапии. Разработанная технология позволяет утилизировать отходы производства соевого лецитина, не используемые в настоящее время, и получать сравнительно дешевый АПТВ-реактив. Использование реактива из растительного сырья снимает риск инфицирования вирусом гепатита и ВИЧ персонала специализированных и клинических лабораторий. На основании полученных результатов составлены "Лабораторный технологииекиР регламент производства реагтивч из бобов сои для определения активированного парциального тромбопластинового времени", утверждении? vreHvw Советом НИИ гематологии и переливяниг крови г.Санкт-Петербурга (02.04.92.) и инструкция по его применению.

Внедрение в практику. Лиофилизированний АП1В-реактив из бобов сои используется в лабораториях свертывания НИИГиПК г.Санкт-Петербурга, Республиканского Центра по лечению больных гемофилией, диагностических лабораториях медицинских учрстадвни!» г.Санкт-Петербург« и других городов России.

_°АпроРация работу. Результаты работы были доложены на 1У Всесоюзном совещании специалистов по клинико-лабораторной диагностике,Москва, 199I г., на I Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 1СС2 год, ни научном совещании ?МИГиПК г.Санкт-Петербурга, 19Э2 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 научных работы, получены Авторское свидетельство и 1767743 с приоритетом от 02.07.90., удостоверение не рационализаторское предложение 407 ЛНИИГиПК от 13.05.91.

На_ защиту вносятся слолр/гщие полодения._

1. Физико-химические характеристики фоофолипидов, обладающих высокой прокоагулянтной активностью.

2. Способ получения реактива для определения АПТВ из отходов производства соевого лецитина.

3. Обоснование пригодности предлагаемого реактива для диагностики нарушений в системе гемостаза.Доказательство более высокой чувствительности предлагаемого реактива к нарушениям гемостаза по типу гипокоагуллции по сравнению с реактивом фирмы "Реанал" (Венгрия).

Объеми структура работы. Работа изложен« н» страницах

машинописного текста, иллюстрирована 34 таблицами и С рисунками. Диссертация состоит иа введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, обсуждения и выводов. Библиографический указатель включает 149 источников литературы, в том числе 28 отечественных и 12! зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТУ.

Матернали и меторы исследования. С целью получения ?Л соетелс бобов, пригодных для использования в качестве гемокоагуляционного реактива, нами выделены и изучена фосфолипгдные смеси различного состава. Источником ФЛ был соевый фосфатидный концентрат, выпускаемый пищевой промышленностью, ОСТ 18-227-7о. Для получения фосфо-липидных смесей различного состава обезжиренные ФЛ сои фракционировали по методу ■ Оолча/ 'У'/Л /.

Для сравнительной оценки были исследоввны «ГЛ мозговой ткипи человека, полученные экстракцией хлороформом препарата тканевого троыбопластина /Папаян Л.П., 1980/, а также хроматографичевки чистые ФЛ: фосфатидилэталоламин (ФЭ), фосфатидилсерин (ОС), фосфа-тидилинозит (ФИ) Харьковского предприятия по производству бактериальных препаратов, фосфатидилхолин (ФХ) фирмы "Кальбиохем" (ФРГ).

Изучена возможность использования в качестве сырья ТЛ, не-

растворившихся в этаноле в процессе экстракции из обезжиренных ФЛ соевого лоцитина, который является эмульгатором жировой эмульсии "Инфузолипол" / Пучковя 0.М., /. Нерастворившиеся п этаноле ФЛ составляют около 70£ от веса обезжиренных ФЛ и в настоящее вре-кя не используются.

Учитывая трудоемкость и длительность оригинального метода Фолча, мы модифицировали его, объединив несколько последовательных операций и подобрав оптимальное соотношение растсорителей.

Таблица I.

Объем работы по выделению различных образцов фосфолипидов.

Метод выделения ФЛ Количество полученных

образцов ФЛ

Фракционирование по методу Фолча

- нативного комплекса ФЛ сои 24

- остатков после экстракции

соевого лецитина 12

Фракционирование по разработанному

методу остатков после экстракции 15

соевого лецитина

Выделение ФЛ из мозговой ткани I

человека

Итого: 52

Все фосфолипидные смеси анализировали по физико-химическим параметрам. Определяли содержание индивидуальных ФЛ, жирнокислот-ный состав, на основе которого рассчитывали йодные числа, содержим« фосфора и своОодниА лирных кислот ССЖК), кислотные числа, показатели окисламност*: порекисныс числа, содержание диенов и триенов.

Для получения ли*®илизировенной формы ФЛ, которые могут быть применены в качестве АПТВ-роахтим, совместно со ст.н.с., к.х.н. Р.П.Ивановой был разработан режим лиофилиэации. Изучено влияние процессов замораживания и лиофиличлции на прокоагулянтнуг способность ФЛ. Апробировано 25 вариантов среды лиофилиэации.

Всего приготовлено 53 серии лиофильно высушенного реактива.

Оптимальные условия и срок хранения лиофильно высушенного реактива установлен»' н» основании значений АПТБ плазмы здоровых лиц, ОиредСленмых лиофильно высудьшил реактивом из бобов сои 17 серий, хранившихся при комнатной температуре и при -t4 + +8°С в течение 4, 8, 12, 18 месяцев.

йоагуляционную активность ФЛ определяли в тест-системе А17ГБ / Папаян Л.П., 1900/. Контролем при научении прокоагулянтмой активности &J1 служили показатели каолинового времени в тех же образцах плазмы, в которых исследоаали АГГ1В. Для получения сравнимых результатов при исследовании коагуляционной активности различных образцов 5Л мы использовали отношение каолинового времени к АПТВ СКВ/АПТВ).

Для отработки оптимальных условий определения АП7Б применительно к полученному реактиву г. тесте АПТВ мы меняли концентрацию хлорида кальция, степень очистки каолина, время активации системы, среду активатора.АПТВ. Срок и условия хранения восстановленной формы реактива установлены на основании эначоний АЛТЗ плазмы здоровых лиц, определенных лиофильно лысукенным реактивом 4 серий в процессе хранения восстановленной формы реактива при комнатной температуре, при -»4 + -»8°С и при -Ь -г -Ю°С.

Исследование коагуляционной активности в процессе разработки способа получения фосфолипидн°г° реактива проводилось на 750 образцах плазм здоровых людей.

Нативный реактив из бобов сои сравнивали с реактивом фирмы "Рваная" (Венгрия) при исследовании в тесто АП'ГВ плазмы 4Ь здоровых лиц, 74 больных гемофилией А и 27 больных с клиническими проявлениями гипвркоагуляции (оОлитерирущий атеросклероз, ппсггром-бофлебитическая болезнь, варикозная болезнь).

Лиофилизированный реактив из бобов сои (б серий), хранившийся от 15 дней до 12 месяцев при +4 + +0°С, сравнивали о реактипом фирмы "Реанал" (Венгрия) и реактивом, выдолонным из мозговой ткани человека (Ленинградский и Кировский НИЛ гематологии и переливания крови). Сравнение реактивов проводили при исследовании в тесте АПТВ плазмы 87 здоровых лиц, 708 больнкх пювЛидиви А, 7 больных гемлфилией В, 12 больных бллязнью Виллебранда, 45 больных с клиническими проявлениями гиперкоагуляции ( облитерир.угаций атеро-оклероз, облитерирующий эндоартериит, посттромбофлебитичвская бо-

левнъ, мрикопн** болёянь, !'ГС). 1'сследования проводили совместно с н.с., к.б.н. П.В.ХролоАо!1.

Прп тестировании дольних для полудни« сравнимых результатов вычисляли индекс ЛПT7Í: отношение ЛПТВ плаями больного к АПГВ контроля (смесь свеииг нативных плазм здоровых лиц или лиофилизироеан-нчй" стандарт донор^яоГ плазмы) / fe&t'c, /. Индекс AIITí

показывал глубину ковгуляционного дефекта в каждом конкретном случае. Свпоставляя индексы АШВ, полученное с помощью реактивов из бобов сои и фирмы "Рваная" для одного и того же больного, мы сравнивали чувствительность этих реактивов к выявлению различных заболе~ ганиГ IP^^i^S^', /W.

Сравнение реякти»* из бобе* е*и с ре*кти*»м, полненным из мозговой ткали человека, проводили при исследовании плазмы здоровых лиц с дебамгккем к не? гепарина в предел« от 0,05 до 0,60 ед/шг. Эти количества гепарин» соятветствутт принятым терапевтический 'границам 'для адекватной renap«HOBOf янтикоагулгатной терапии f fá^ /. Чувствительность реактивов к гепарину оцепи-

вали стнсгаяниеы значения АПТВ плазмы с гепяриноу к значению АП7В плазмы без гепарина.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью методов, изложенных в книге Каминского Л.С. "Статистическая обработка лабораторных и кджккиесииу данных", 1964, и "Руководстве по методам исследования, технохимическому контролю и учет ту производства в масложировой промышленности", 1974.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И Ж ОХУЗДЕИИЕ.

При фракционировании нативного комплекса $Л сои методом Фол-ча получено 6 фосфолипидных фракций, все они были исследованы нами в качестве возможных заменителей тромбоцитарного фактора 3 в тест-системе для определения АП'ГО. Установлено, что прокоагулянтная активность всех фракций ФЛ зависит от их количества в тест-системе. Для каждой фракции установлена довольно узкая область оптимальных количеств в тест-системе в пределах 0,066 - 0,200 мг.

Исследование каидой фракции ФЛ в оптимальном количестве для определения Aíl'íB выявило их различные коагуляционные свойства. Как видно из данных табл. 2, наибольшей свертывающей активностью обладают фракции i (КВ/АП'Ш 1,90), Ш (КВ/А1ТГВ 1,86), УШ (КВ/АП1Б 2,22). Значительно меньшая прокоагулянтная способность выявлена

для фракций П, 1У, У и УП, для фракции У1 был характерен ингибиру-ющий эффект (КВ/АП7Б 0,73). Свертывающая активность ФЛ мозговой ткани человека ненамного превышала активность фракции Ж Ш сои (КВ/АПТВ 2,43 и 2,22, соответственно).

Таблица 2.

Прокоагулянгьая активность и физико-химические показатели фосфолипидов сои, полученных из обезжиренного фосфатидного концентрата по методу Фолча, и фосфолипидов мозговом ткани человека (X ¿«Sx, >v=5).

Образцы фосфолипидов Содержание фосфора,$ Кислотное число, мг КОН 2: K/SIH КВ/АП1В для 0,1 мг фосфолипида

?ОСфОХШШ£Ь| со*, фракции по «олчу I 2,0^0,1 «\e5ic\03 1,89±0,13

П 2,0^0,1 67,9i4,6 1,07^0,03 l,29iO,CG

Ш 2.4Ю.1 40,7l4,2 0,33¿0,05 T,?5i0,03

1У I.910.T 70,0^3,0 2,69¿0,II I,18^0,12

У 2,3^0,1 69,£¿I,3 2,30¿0,I3 Í,3bi0,09

У1 2.2Í0.I 70.4Í2.4 2,60¿0,T9 0,73'i0,0fí

уц — 66,7l3,6 I,*I¿0,T3 !,34¿0,05

'УШ 2,7¿C,I 57,CÍ2,5 0,46^0,06 2,22¿0,T7

<?осфолипиды мовговой ткани иелевека 2,8¿0,I U.VO^U.UJ ¿,4.J¿0,08

Таким образем, фракция соевух ^Л (УШ), полученная нами при фрахциопнрованте обезжиренных ФЛ сои по методу ^олча, в оптимальном количестве обладает значительной прокоагулянтной активностью, еравинкой с активностью ФЛ мозга.

Фиакко-химичосков исследование выделенных соевых фооролипид-ных фракций и Ол мезгввой ткани человека показало, что наиболее активные фосфолипидные смьси отличаются от менее активных чистотой, отсутствием нефосфолипидных примесей, что определяется высоким содержанием фосфор»: 2,4 - 2,8$.

Выявлена зависимость между прокоагулянтной активностью ЛЛ и степенью их кислотности, кетврая выражеется значением кислвтиоге

числа и отношением еуммм гис.чмх г p^îiî» ияРтрчлъпнх ЛЛ (sjr/s-H). Остановлено, что «Krnwwe ■"Л имеют ?>слотнне

числв в интервеле <10 - РО кг КОН и отношение -т. к/а^и 0,3 - 0,9, несмотря un яы.:епше разлуигг п их £ое*ол«»гндном состгве. Повышение степени кислотности ФЛ: увеличение значений кислотных чисел до 67 - 70 мг КОН и отношения zk/sh до 1,01 - Г.,69 ведет к снижению прокоагулянтноП активности. Нами показано, что высокие кислотные числа некоторых фракций ФЛ обусловлены их собственной кислотностью, а не присутствием СЖК, которые могут накапливаться в ФЛ при хранении.

С целью установления влияния на процесс свертывания отдельных фосфолипидных классов исследов".»в?ь грч»»т»грп*»:чески чистые ТЛ. Установлено, что свертывающая активность последних гораздо ниже активности изученных фосфелипидних смесей. Отсутствие« эш»м-симость прокоагулянтной активности фосфолипидных смесей от содержания в них какого-то определенного ФЛ. Для получения высоко* прокоагуляитмоР активнорстг дотжко быть достигнуто определенное соотнесение гиелнх и неГтральных 'Л. ?. ТЛ сои необходимая кислот-жзст» дссриг-йтся r.pi;cjTcii.neM в пврвур ««ередь фосфатидных кислот U'rt) и меньшим содержанием uC и <й1. В *Л мезгево? ткани человека

отсутствует, кислые представлены высокими количествами ТС и 'И.

Таким образом, наиболее активной в тесте АПТВ является.выделенная из ТЛ сои фракция VJ], которая в оптимальном количестве ускоряет свертк»анве здоровых лиц в 2,? раза, лишь немного' уступая по активности ТЛ моага, и характеризуется кислотный числом 40 - &> мг ТОН и отношением S- к/з;н 0,3 - 0,8.

Следующим этапом работы явилось изучение возможности использования в качестве сырья для получения ТЛ с высоко!* прокоагулянтной активностью остатка после экстракции соевого лецитина, хоторыР применяется как эмульгатор жировой эмульсии "Инфуявлкрвл". Фосфв-липидныя остаток после экстракции лецитин» составляет около 70$ от исходного фосфатидного концентрата и до пястояцегч времени не используется. Исследование остатков пооле экстракции лецитина показало их пригодность для получения к» методу Фолча из них фракции, идентичной фракции УШ, выделенной из мя/гивншх сои «

Учитывая трудоемкое:1:. и длительность фракционирования по ме- . тоду Фолча, мк модифицировали его, подобуаь оптимальное соотношение растворителей и объединив несколько последовательных операций.

При этом малоактивные, ингибирующие, плохорастворимьж, твмноокра-шенные ФД выделяются в одну фрвкциг - побоину? продукт, Выход основного продукте - ФЛ, обладающих высокой прокоргулянтной активностью, при фракционировании по предлагаемому методу,' упеяичивкет-ся до 22 - 27% против выхода в 12 - 14% при фракционировании по Фолчу.

Схема фракционирования остатка после экстракции соевого лоцитина по предлагаемому методу.

Остаток после экстракции лецитина + 8 объемов хлороформа + 37-40 объемов этанола, выдержка, центрифугирование.

Супернатантвыпаривают под вакуумом, сухой остаток растворяют в I объеме эфира + 5 объемов ацетона, центрифугирование.

Супернатант не используется.

Осадок

(побочный продукт, выход 73-78&)

Осадок

(основной продукт, выход '¿¿-2.4%).

Таблица 3.

Прокоагулянтная активность и физико-химические показатели фосфолипидов сои, полученных из остатка после экстракции лецитина по предлагаемому метод'' (X * & х, «.=5).

Образцы

Содержание Кислотное

фосфолипидов фосфора,%

Остаток после

экстракции

лецитина

Побочный продукт

Основной продукт

2,5*0,1 2,4*0,1 3,1*0,1

число,

мг КОН

58,4*2,5 65,4*3,1 54,0*2,7

1Ш/АПТВ

к/^н ■цля °»1 мг '^ фосфолипида

0,90*0,06 1,61*0,03 2,10*0,09 1,42*0,13 0,35*0,03 2,36*0,12

Данные фяяихо-хицичесхого исследования свидетельствуют, что предлагаьмый нами способ фракционирования позволяет получить основной продукт более чмсхым, чем исходная смесь ФЛ: содержание фосфоре увеличивается с ¿.5 до 3,1 % (табл. 3). Меняется содержание индивидуальных ФД в сторону увеличения количества нейтральных Фл и уменьшения количества кислых, что приводит к снижению значения кислотного числа, уменьшению отношения гн/хн с О,СО до 0,35 и по»мпвнию прокоагулянтной активности: значение отношения ¡Ш/АПТВ увеличивается от 1,81 для исходно!1 смеси до 2,36 для основного продукта.

Таким образом, ЗЛ, полученное из отходов производства соевого лецитина по разработанному нами способу, обладают высокой прокоагулянтной активностью и стабильными фив»*ко-хиуи«вским»» характеристиками, сформулированными ранее для активных фосфолипидних смесей. При введении получении:; "Л в оптимальном количество в тест-систему для определения АПШ выяснилось, что значения ЛПТВ плазмы, содорж«ицеп тромбоциты, и бестрамоицитний плвамы, практически не отличаются, то есть, получьнные нами ФЛ способны заменить тромбо-цитарний фактор 3 в АШВ-системе и могут быть применены в качестве АЮТ-реактива.

для оценки диагностической ценности препарата нами проведано сравнительное изучение нативноге регитиви из оооов сои, полученного по разра0ог.1Нмиы1у сиоооод п реактива фирмы "Рваная" (Венгрия). При определении АЛ'ГО в плазме здоровых людей установлена большая прикоагулянтная активность"реактиьа из бобов сои, в то же время в группе больных гемофилией Л вняплено статистически достовернее увеличение АЛ'ЛЗ, определенное натииным реактивом из бобор сои, что свидетельствует о его большей чувствительности к дефициту фактора УИ по сравнению с реактичпм фирмы "Рваная". Б группе больных с клянгческп-!г прпгвлг»иирми гиперкоагуллции разница между значениями АЛЛ} с применением двух реактивов не наблюдалось, то есть оба реактива обладали одинаковой чувствительностью к выявлению гинеркоагуллции. Полученные результаты позволили нам сделать вывод о правомочности использования нативного реактива из бобов сои для диагностики^ нарушения г системе свертывания крови.

Известно, что нативные фосфолипидныв реактива нестабильны при хранении и, совтвететвуишо , имеют малый срок годности. Повышение стаояд»ности, увеличение срока годности, а также транспортиров-

ка реактива возможны при наличии его лио^нлипчрованной формы, •'з рада факторов, оказывающих плипние ня стабильность а:.'ивности /■ в процессах замораживания, лиофилиз*чии и хранения, наиболее > важным является состав среды реактивя. "if.ni иссле'двяно вариантов разлитого состава среды, "роме ФЛ и дистиллированной воды исследуемая среда высушивания содержала хлорид натрия, сорбит, маннит, сахарозу в различных концентряциях. Еак как для достижения контактной активации тест-система АП'[В должна содержать поверхностно-активное вещество, в качестве которого № использовали каолин, была предпринята попутке добевления последнего к ФЛ перед их лиофилизацией.

Сравнительное изучение ФЛ, лиофилигированнис с применением различных сред, показало, что при сушке раствора ФЛ в дистиллированной воде и физиологическом растворе без защитных веществ прокоагуллнт-ная способность ФЛ в значительной степени падает. Чтобы избежать Ч потери ФЛ, необходимо добавить достаточное количество эффективных наполнителей, присутствие которых обеспечивает создание мелхопо-^ ристой структуры с включенными инее ФЛ. В качестве подобных защитных веществ нами были изучены многоатомные спирту сорбит, маннит и углевод сахароза в различных концентрациях. Устэловлено, что ФЛ, высушенные в присутствии Ъ% сорбита и моннита и 2% сахарозы, имеют плотную кристаллическую структуру и не тордгат прокоагулянтной активности в процессе лиофилизации. Возможно хранение реактива в замороженном состоянии при -30 + -60°С в течение 6 недлль.-

Разработан температурный режим лиобильноР сутки. Начальный период характеризуется понижением давления в сублимационной камере от атмосферного до значения ке вше 5 + еЛО"*" мм рт.ст. и понижением температуры замороженных ФЛ до-43 + -50°С. Температ.'.рп препарата в течение первых 12 - 15 часов сушки не должна превышать -20°С, затеи через 18 - 21 час от начала сушки температуру постепенно повышают от минусовой х плюсовой. Температура ФЛ в конечном периоде сушки не должна превышать 22°С. Для получегия сухого реактива с остаточной влажностью не более общая продолжительность с.упж; должна составлять не менее 36 часов.

Нами исследована прокоагулянтная активность лиофильно высушенного реактива в процессе хранения при разных "»•мнерлтуре.х в течение 1а месяцев. Реактивы, высушенные с прикененивм сорбита без каялина, были стабильными при хранении при - 'Н°С в течение

1Ь месяцев; реактивы с сорбитом и каолином стабильны в течение 12 месяцев. Реактивы, содержащие маннит, были стабильными лишь в течение О месяцев. Реактивы с сахарозой были стабильными при хранении при +4 + +ь°С в течение 1« месяцев, с сахарозой и каолином - в течение Ш месяцев.

Таким образом, проведенные исследования показывают, что использование в качестве защитной среды сорбита и сахарозы способствует сохранению специфической активности лиофилизированного реактива при хранении его при +4 * +Ь°С в течение года, использование маннита не приводит к сохранению исходной прокоагулянтной активности реактива при хранении. Добавление каолина уменьшает стабильность реактива при хранении.

ипгимальныыи условиями определения АШ'в с использованием лиофилизированной формы АНТВ-реактива из бобов сои является применение в качестве активатора А11ТВ каолина, очищенного от механических загрязнений и крупных частиц, в концентрации 5 мг/мл в дистиллированной воде с минимальным временем активации не менее 2 минут и концентрации раствора хлорида кальция 0,277$. Выяснено, что предлагаемый реактив из бобов сои обладает высокой стабильностью вовстановленной рабочей формы. Она не теряет свойй активности при хранении при +4 * +8°С в течение 15-20 суток, что создает условия для более экономного использования реактива клиническими лабораториями и, в конечном итоге, делает его более дешевым. Отмеченная высокая стабильность восстановленной формы предлагаемого реактива из бобов сои существенно отличает его от аналогов, получаемых из биологического сырья, в частности, реактива фирмы "Реанал", которые теряют свою активность ухе на следующий день поели восст*ноьления.

лиофилизироваииый реактив из бобев сои, полученный по разработанному нами способу, был апробирован при тестировании АП1В параллельно с реактивом фирмы "Реанал". Установлено, что лиофилизи-рованная форма реактива не отличалась от реактива фирмы "Реанал" при исследовании АП1В в плазме здоровых лиц (табл 4). Не отмечено значимых различий в показателях АП'ГО в зависимости от защитной среды. При исследовании плазмы больных гемофилией А, лиофилизиро-ванный реактив, также как и нативный, оказался гораздо более яа-чувствительным к выявлению дефицита фактора Ж различной степени выраженности. Статистические данные индексов АШВ у исследованных

больных гемофилией А (табл. 5), гемофилией В, болезнью Виллебранда подтверждают отмеченную в каждом отдельном случае большую чувствительность реактива из бобов сои к выявлению нарушений в системе гемостаза по типу гмпокоагуляции. •

Таблица 4.

Значения АП1В (сек.) плазмы здоровых лиц при использовании различных фосфолипидных реактивов (X -Лх).

№ серии Состав Число АП1В с реактивами

реактива наблю-

из бобов среды дений, из бобов сои фирмы "Рваная" сои п.

10 сорбит 15 48,1*1,6 46,6И,2

17 сорбит 25 48,011,5 46,811,0

30 сорбит 20 46,111,7 45,911,5

33 маннит 16 46,512,2 46,6*1,8

41 сахароза II 48,511,6 47,1*1,8

Таблица 5.

Значения индекса АПТБ у больных щемофилией А при использовании различных фосфолипидных реактивов (X - 2> х).

№ серии реактива из бобов сои. Состав среды Число наблюдений, п. Индекс АПТВ из бобов сои с реактивами фирмы "Рваная"

10 сорбит 32 3,1210,21' 2,2610,16

16 сорбит 9 2,83Ю,4Г 1,9410,16

17 сорбит 20 2,6910,25' 2,0110,16

30 сорбит 19 3,41*0,28' 2,5410,15

33 ханнит 16 2,5310,17 1,8810,38

41 сахароза 12 2,8910,24 2,4210,31

^■мгвй** ■ ■> - ршчь* еъ*г*шг(<-.ч<1, * <• ••.'"Л.

Следует отметить, ч|то реактив с сорбитом в качестве защитной среды имел большую чувствительность к выявлению заболеваний по типу гипокоагуляции по сравнению с реактивами, содержащими

маннит и сахарозу.

Поскольку гост АПГБ широко применяется для контроля терапии гепарином, мы проводили исследование гепаринизированной плазмы параллельно реактивами, полненными из бобов сои и мозговой ткани человека. Установлено, что при увеличении количества гепарина в плазма от 0,05 до 0,60 едДтл отношение АП'ГВ плазмы с г»л.*.рином к АПГЬ плазмм бея гепарина увеличивается с 1,08 до 3,42 для реактива из бобов сои, и с 1,1'j до 2,36 для реактива из мозговой ткани человека. Хотя по группе статистически достоверных различий в значении этих отношений на определено, отмечаемая тенденция а каждом отдельном случае ивидетельетвупт о большей чувствительности реактива из бобов сои к искусственно созданному добавлением гепарина состоянию гипоксагулпции.

Чувствительность реактив» из бобов сои оценивалась и относительно нарушений гемостаза по типу гиперкоагуляции. Показано, что значения индекса АП1В как при использовании реактива из бобов сои, так и реактива фирмы Тернях", iv.íhwkm.

Трким обрасоч, полуисн'гые н<\ги данные позволим1 сделать вывод о том, что предлагаемый рв&ктив для определения АГГГО, выделенный из бобов сои по разработанному нами способу, идентичен реактиву фириъ! "Роалал" при исследовании плазмы здоровых лиц и больных с проявлениями гиперкоагуляции, но гораздо более чувствителен к выявлению нарушений в т фазе свертывания крови, обусловленных снижением активности факторов Ук и IX различной степени выраженности, что особенно ваяно для ггяг-ления скрьггюс форм гемофилии. Реактив из бобов сои также боле« чувствителен к присутствию гепарина, а потому может быть применен для контроля терапии гепарином.

ВЫВОДЫ

*

1. Фракционированные фосфолипидн сои с вусокоЯ прокоагулянт-ной активностью, способные заменить тромбоцитарный фактор 3 в тест-састяме для определения АГПВ, характеризуются кислотным числом

40-60 мг НОН и отношением jr к/^гН 0,3 - 0,8.

2. Разработан способ получения натигного АПТБ-реактива с выходом 22 - из фосфояипидов, меристворивиихся в этиловом спирте в процессе экстракции соевого лецитина, который применяется в производстве жировой эмульсии "Лнфузолипол".

3. Разработан способ лиофилиэации нативного реактива из бобов

1С

сои с применением в качестве аашитной среды сорбита, что позволяет сохранить прокоагулянтную активность реактива при хранении при +4 + +8°С в течение года.

4. Установлены оптимальные условия определения АШВ применительно х реактиву из бобов сои.

5. Реактив из бобов сои идентичен реактиву фирмы "Ре»нал" (Венгрия) при исследовании АШВ в плазме здоровых лиц и больных с клиническими проявлениями гиперкоагуляции, но обладает большей чувствительностью к выявлению нарушений, обусловленных снижением активности факторов Ж и IX.

Реактив из бобов сои с большей чувствительностью реагировал на увеличение количества гепарина в плазме, чш реактив ив мозговой ткани человека.

Реактив из бобов сои может быта применен для диагностики нарушений внутреннего пути свертывания крови, определения отдельных факторов и контроля терапии гепарином.

6. Составлен "Лабораторный регламент производства реактива из 0обов сои для определения активированного парциального тромбо-пластинового времени", утвержденный Ученым Советом НИИ гематологии и переливания крови (02.07.92.), составлена инструкция по его применению.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕЖМЩАЦМ

1. Создание нового АПТВ-реактива из бобов сои позволит практическому здравоохранению более широко применять один из основных скрининг-тестов при исследовании процессов свертывания крови. Баяне, что раотительное сырье является безопасным для персонала по сравнению с биологическим материалом, используемым в настоящее время для производства данных реактивов.

2. АПТВ-реахтив из бобов сои с большой точностью диагностирует нарушения гемостаза по типу гипокоагуляции: позволяет выявлять наследственные коагулопатии - гемофилию А и В, болезнь Виллебранда, а также контролировать гепаринотерлпгоо.

3.АПТВ-реактив из бобов сои может быть использован для одностадийного определения факторов, участвующих во внутреннем пути свертывания крови.

СГГССОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТИЛЕ Д'/ССЕРГАЦЖ

I. Старицына H.H., Шанская А.И., Папаян Л.П., 1'вяногв Р.П., Хролова П.В. Способ получения реактива для определения активировал-ного парциального тромбопластинового времени. Авторское свид^т-ль-стсо СССР J.* 1767743 с приоритетом or С2.С7.90.

' 2. Старицына H.H., Хролова Л.В., Иванова Р.П., Шанская А./., Папегн Л.П. Но ruf диагностический рее.г<-.ент - парциальный тромбе-плпотин из фосфолипидов сои. Сб.: Клинико-лабораторная диагностика. Тезисы докладов 1У Всесоюзного совещания специалистов по клинико-лабораторноД диагностике. М., 1991.

3. Старицына H.H., Иансяая А.^., Хролова П.В., Попаян Л.П., Иванова P.II. Новый фосфолипидный реактив из бобов сои для исследования активированного парциального трембопд^пшового времени. Тезисы I Российского Национального Конгресса "Человек и лекарство". М.,1992.

РАЦИОНАЛИЗАТОРСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНА?

Па"6пособ получения реяктив« для определения актяркрованного парциального тромбопластинового ?ремени" получено рационализаторское предложение V 407 ЛНИИГиПК от 13.UÜ.ÜI.

РТП П1 Зак.« Hi Тир. £о

-1993 г.