Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Совершенствование лабораторных методов выделения и идентификации микобактерий туберкулеза у крупного рогатого скота

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ Ш1СКОХОЗЙ0ЙВНЗШ/'HÁ.VK ./

ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВДЩИНЫ 0!ЖКОГ^/А^ЛИ!ОГО

На правах рукописи ■УДК 616:612,98:579.873421Т:636.22/.28.

Т А Л Л Е Р ЛЮБОВЬ АРКАДЬЕВНА

V

СОВрЧЙНЮТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ МЕТОДОВ ШДЕЖИЙЯ И И1ШТЮИКАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

16.00.03 - вотерйнарнвл микробиология, вируоология, эпизоотология, иакологил и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой отепени кандидата ветеринарных наук

г. ОМСК - 1995 г.

Работа выполнена в лаборатории дцагностикц и микробио -логии туберкулёза Всероссийского научи о-исслэдоватшхьского института бруцеллёза и туберкулёза животных

Научный руководитель: Кандидат биологических наук Л.М.Ходун

Официальные оппоненты: Доктор ветеринарных наук, црофессор В.Г.Ощэпков Доктор ветеринарных наук В.К.Диоитковский

Ведущая организация - Государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации, сертификации ветеринарных пренаратов.

Завдт состоится у -"<1995 года в А час. на ааседашш диссертационного совета К.120.4В.01 при Институте ветеринарной медицины Омского аграрного университета. 644007, Омск - V, ул. Октябрьская, 32.

С диссертацией нежно ознакомиться в библиотеке Института ветеринарной медицины Омского аграрного университета.

Автореферат разоолон 1995 г.

Учений секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальности темы. Всемерное увеличение к улучшение качества продуктов кивотноводства и значительной степени зависит от благополучия хозяйств по хроническим инфекциям. Одной из важнейшее задач ветеринарной науки является разработка методов профилактики и ликвидации такого опасного заболевания, как туберкулез сельскохозяйственных яивотннх, напосяп.его оолъиой социальный и экономический ущербi Успех борьбы с туберкулезом во многом зависит от правильной и своевременной диагностики. В комплексе диагностических мероприятий решающее значение имеет бякгериологи-ческре исследования биологического материала от убитнх с диагностической цельо животных - выделение и последующая идентификации возбудителя,

В основе метода тащелеггая лежит способность микобактерий размножаться на специальных'питательных средах. Наибольшее признание б ветеринарной.практике получили плотине яичные питательные оредн Левенштейна-Йенсена, Гельборга, Финн-2. Основным недостатком этих и других используемых в ветеринарных лабораториях питательных оред является длительные сроки культивирования и, как правило, очень скудный рост. Это побуждает ученых продолжать исследования по соверяенствованию и создании новых питательных сред.

Так, Б.Г. Мальник, Б.В. Плоскирев, Б.М. Розенблат / 1S70 / изготовили сухой аспарагино-глицииовнй бульон, в котором для стимуляции роста использовали сернокислый цинк. Э.Р. -Зянн /1973/ предложил безаспарагшговую среду, обладающую хорошей высевае-мостью. Т.Е. Коронвлля, Н.П. Фадеева /1?£6/ провели испытание агаровой среды, в которой единственным источнпгссм углерода являлся жидкий парафин. По сообщения авторов обильный рост мико-бактерий удалось получить па 5-й день. А.Д. Ляпунова с соавт. /1584/ провела исследования по сравнению различных яитателг— l'izx сред и пришли к выгоду, что для получения более оптимального результата при выделении М. бовис из биологического материала целесообразно' сочетать 2-3 среды разпых но составу.

Поиск, более элективных питательных сред, позволяющих значительно ускорить выделение мякобактеряЗ туберкулеза из биологического материала, предполагает и принпгспиялыю новый

подход для их идентификации, так как изменяется главный таксономический признак - их медленный рост.

Оптимальным решением этой задачи монет быть изыскание ыо-ноклочалъннх антител к разным видам микобактерий и о их помощью проведение идентификации иммуноферментным методом. Литературные данные подтверждают преимущества этого метода /Т.С)& Л ('¿902^ З.М^еЬс1П1хе,Р^.ъе]аггг1п,Щ?.кЛшйт, М.А.Сафин, 1905; ¡«1. А. Владимирский, 198? /. Высокая чувствительность 'Ш позволяет разрабатывать методики обнаружения туберкулезных антигенов в секротах животных, в очологлческом материале и во внешней среде.

Б последнее десятилетие с помощью гибридомшй технологии получены антитела к разнообразным антигенам бактериального п вирусною происхождения. В сравнении "о йоликлоналышми антителами они обладает высокой специфичностью и, кроме того, их получают без каких-либо белковых примесей, в почти чистом виде. Линии гибрздомннх клеток практически бессмертны и их можно попользовать для получения антител бесконечно длительное время /Я.и.Кспп.е1;Т^,Л1с.КегП; 1981 /. Попытки получения монокло-нальных антител против антигенов микробактерий туберкулеза предпринимались как в нашей стране,'так и за рубежом /Т. О а л 1е2,43

Б.Л.Ирин, Е.Я.Смирнова, 1987 /, однако практического применения Б диагностике туберкулеза они пока не нашли.

Цвль к задачи исследований. Целью исследований является разработка ускоренных методов выделения и идентификации микобактерий туберкулеза бычьего ьида из биологического материала крупного рогатого скота.

Для выполнения били поставлены следующие задачи:

1. Разработать питательную среду, Позволяющую ускорить выделение микобактерий из биологических материалов больных туберкулезом животных.

2. Разработать методику идентификация микобактерий туберкулеза бычьего вида на основе моноклоиалькн\- антител й реакции твердофазного иммуноферментного анализа.

Научн&Я ..койизИа. Впервые разработана плотНач питательная , среда, позволяющая сократить срок вндёлейия мякобакторий туберкулёза б^чЬего веда из биологических материалов крупного

рогатого скота до 19 - 20 дней. Впервые разработана методжа идентификации возбудителя туберкулеза на основе мо'токлоналышх антител в реакции лммунофергяонтного апзл*лза.

Практическая ценность. Сокращенна сроков исследования биологического материала от подозреваемых в заражении туберкулезом животных позволяет более оперативно организовать противотуберкулезные мероприятия при выявлении туберкулеза я предотвратить необоснованный убой здоровых киеотных в случае исключения диагноза' на туберкулез.

Использование моно'кленаяьных антител для идентификации возбудителя туберкулеза значительно сникает стоимость лабораторных исследований, так как в большинстве случаев отпадает необходимость в постановке биологических проб на животных.

Результаты исследований включены во-"Временное наставление по применению набора для идентификации микобактерий бычьего вида методом ичмуноТкзрментпого анализа", утвержденное Департаментом ветеринарии ШХП РФ 20.05.94г.

х^пробапия г-аботн. Материалы диссертационной работы долокз-1Ш на научной конференции преподавателей ОГВИ /19С8/, па конференции молодых ученыг'ВНШБТК / 1990 /, мектабораторпом соведапии ЕНИКБТЕ / 1995 /.

Публикации. . По материалам диссертант! опубликовано пять печатных работ, получено'два авторских свидетельства на изобретение я подана заявка на получение патента.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, заключение, выводы, практические предложения и список литературы. Работа?иллюстрирована 13 таблицами, 15 рисунка»®. Список используемой литературы включает 148 источников, й т.ч. 21 иностранных.

На защиту... вшюсится:

1, Питательная среда дня ускоренного выращивания чякобактзркй туберкулеза пз биологических материалов крупного рогатого окота.

2. Методика идентификация микобактерий туберкулеза на основе Моноклональных антитая в ичмунсфермеитнои анализа.

СОБСТВЕННЫЕ ИОСВДОВАШ Материалы и методы исследования. ПастояЕ1ая работа выполнена в лаборатории диагностики и микробиологии туберкулеза Всероссийского няучш-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза ¡штатных, часть исследований выполнена и лабораториях иммунологии Московского НИИ туберкулеза РФ / д.м.н. М.А. Владимирский, к.б.н. М.В. Андросова / и олектронной микроскопии ВШИ биологической промышленности г. Москва /к.в.н. Б.Е. Еле-' хермая/.

Для исследований использовали биологический материал / лимфатические узлы, кусочки легкого, печени, селезенки / от 157 голов крупного рогатого скота, 10 кроликов, о глордких свивок, а также культуры микобактерий музейных штаммов: JJ. Sotrig им, JU. iov'A Bee,) U/. ЬлЛиплиЛ^^ Хц-Нл-; M.Or/'U^nj JJ.phJpg. vtf. lb. и культуры полевых штаммов микобактерий

бычьего вила и атипичных микобактерий

Посевы проводили на средах Левенштейна-Яеноена / производство Тюменского 11ИКТИ / и Гельберга. В состав указанных сред вводили ряд предельных углеводородов и изучали их влияние на • скорость роста музейных и полевых культур микобактерий бычьего вида. За посевами.наблюдали ежедневно, отмечая появление первичного- роста и его газтенривность. Результаты оненлвата по следу-ьшвй схеме: 0 - нет роста; 1 - единичная пылевидная колония; 2 - до 5 мелких или единичная.крупная /1-2 мм/» 3 - от Ю до 20 мелких или одна крупная /2-5 т/-, 4 « До 50 мелких колоний или несколько крупных /более 5 Им/; 5 - оплошной рост» .

Видовая принадлежность выделенных культур микобактерий во всех случаях устанавливалась или контролировалась путем по-eiahOBKit биопробы на лабораторных яшютних,

Злектронио-микроскопичёские исследования мшюЗактериальных клеток в Динамике ех роста на пятетельных средах проводили путем изучения интактных Препаратов it ультратонких срс-зов на йлектронном микроскопе %£U/-/Oo&l Япония / при ускоряющем напряжения 80 кВ » aneptypHort д.м!раг"/е 20 мкм. Ддй исследования использовали культуры М. Йойис, выращенные йа экспериментальное и стандартной средах.

Для постановки И5Л использовали стандартное оборудование и реаклтвы /тгаггтетн полистироловне, спектрофотометр "Диагност" для определения оптической плотности, пипеточнне дозаторы, буферные растворы, антитела против иммуноглобулинов мнши, моченные пероксидазо? хрена, моноклоналыше антитела.

В качестве положительного контроля использовали культуру М. &p¡s¿í пт. 8, отрицательным контролем слуэтши атипичные ми-кобактерии или l\.tuSe2Cit£oá¿3 H97H.V.

Всего 'методом ИФА было изучена 180 культур мпкобактерий /музейных и выделенных от больных животных/.

Цифровые данные обрабатывали метолом математической статистики о использованием таблицы Стьгодента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССДОДШШ

Влияние твои Н-злканов ¡та рост мпсобактспий. На первом стане мы изучали-влияние смеси предельных углеводородов на рост музейных и полевых культур микобактерий бычьего вида на средах Левенштейна-Йенсена и Гельберга. Смесь включала в. себя следующие углеводороды: ундекан, додекал, трвдекан, пентадекан, гек-садекан. Ит очеттаали в рапных частях и после автоклавирования прибавляли к яичным питательным средам в дозе 0,2 мл на пробирку в двух вариантах: непосредственно перед посевом и яа сутки до посева. Контролем слупит яти se среды без углеводородов. За посевами наблядали ежедневно до появления первичного роста, а затем каждые 7 дней.

На таблице 1 предстпвлепн результаты проведенных исследования. В ходе наблюдений за ростом музейных культур установлено, что смесь углеводородов сокращает сроки появления первтчнагб роста па 2 - 3 дня по сравнению с контролем. Причем, на срёде ЛевенштеЯна-йенссна с углеводородами отмечали более ранний рост /на 11 день/, чем па контрольной /на 14 день/.

Полевые культуры лучше развивались на среде Гельберга и добавление углеводородов вызывало значительной сокращение сроков появления первичного роста. На испытуемых средах рост 1 начинался на 21 день, па контрольных в 1,5 раза пояднеп, на 33 день.

Наряду с ootcpa'iiMwcr.i сроков роста на средах о углеводородами происходило интенсивное накочлошга бакмассы. Через 3-4

7

. Таблица I

Влияние смеси углеводородов на рост кузейгых и долевых культур Ы. боЕИС на яичных питательных средах

Питательная . среда I Зрокз появления первичного роста ( дна ) . Интенвивность накопления бакмассн ( : н е л е г и баллы )

Н+ц : Р ; I 2 3 4 5

В У 3 Е /1 Е А Я КУЛЬТУРА

Гельберга

I. контрольная 16,6+0,9 - 1.1 1.9 2,4 2,9 3,2

2. гстяуекаяг 13,8+1,1 <■0,05 3,1 3,9 4,9 5,0

Лавенштейна-йансена •

•I» контрольная 14,4±0,5 • 2,1 3,2 3,8 4,1 4,9

2» испытуемая П, 1+Р,9 <0,05 3,9 - 4,9 5,0

оа . ПОЛЕВЫЕ КУЛЬТУРЫ

* Гвльберга

I. контрольная 33,6±Р,5 _ 1.2 1.5 1.9 2,1 2,8

2. исшлуегля 21,6+0,9 <0,05 3,1 4,2 4,8 5,0

Лавенятейна - Йенсейа

I. контрольная . Зб,1±1,0 — 1.1 1.5 2,6 3,1 3,1

2« испытуемая 24,4+1,5 <0,05 2,6 3,2 3,8 4,1 4,1

недели культивирования интенсивность оценивалась в 4-5 баллов, на контрольных средах в ¡эти сроки интенсивность, но преступала 2-3 баллов.

Таким образом бия подтвержден факт ускорения роста гчпсо-бакторий туберкулеза бычьего ввда т плотных яичннх питательных средах, наиболее значительно это влияет на ускорение роста полевых культур.

Изучение влияния различных углеводородов и.^ рост музейных ж полевых культур чикобактерий. Для выяснения, какие углеводороды являются наиболее эффективными стимуляторами роста микобакте-рий, было решено исследовать отдельно взятые углеводороды с различным углеродным числом: ундекан С-11, тетрадекан 0-14. гетсса-декан С-16. Каждый из указанных углеводородов добавляли к питательным средам Левзиптейна-Йонсена и Гельбсрга в разных дозах : по 0,1; 0,2; 0,4 мл на пробирку. В результате било установлено, что наиболее 'аффективной является доза 0,2 • г/иг.

В таблице 2 представлены результаты влияния исследуемых углеводородов на рост музеИных и полевых культур г/пкобакТерий туберкулеза бычьего вида; ~

При добавлении к среда- Гельберга тетрадекана рост музей* них культур появился на 12,1- 1,8 день, при добавлении гексаду-кана на 10,5±1,1 день. На среде Левенштейна-Иенсена эти сроки идо короче: на 1С,5±0,5 п 9,8±1,0 дни соответственно. В то яй Время на среде с ундеканои рост микобактеряй. не наблюдался в течение всего срока наблюдения.

При изучении влияния »тих углеводородов на полевые культуры установлено, что на среде Гельберга с тетрадеканом рост появился на 16,2±0,-9 день, э на среде с гексадеканом на 15,8^0,8 день, что примерно в 1,5 раза ранило, чем на контроле. С этими не углеводородами на преде Лееешгтейна-Йенсена ро1т полевых культур микобэктерий появлялся па 18,1^1,9 - 19,ь1о,Э дни. При добавлении ундекана роот микобактерий также не наблюдался.

Обращает на себя внимание, что под влиянием углеводородов усиливается интенсивность роста микобактерий, особенно на -среде Гельбегзга, от 3,6 до 5,0 баллов, при 2-4 бгллах на контроле.

9

Таблица 2

Влияние углеводородов на рост музейных и полевых культур М. бошо

Питательная среда

Сроки появления первичного роста ( дай )

Интенсивность накопления бакыассы ( баллы )

Ц + м

!

МУЗЕ 11 К Гельберга

Контроль Уьдекан Тетрадекан Гекоадэкйн

I ЛбйешптойньЙенсеяа Контроль Ундекан , Твтрадокш Гокседекан •

ЫВ КУЛЬТУРЫ 1Б,3+1,5

12,1+1,8 10,5+1,1

15,5+0,7

10,6+0,5 9,8*1,0

<0,05 ¿0,05

<0,05 <0,05

ПОЛЕВЫЕ КУЛЬТУРЫ Гальберга

Контроль 27,3±0.В

Ундекан • , ~

Тетрадекан 16,2+0,9 ' «¿г 0,05

Гексадакан 15,Б±0,8 <0,05

.Йейбнштайна - ¿¡ансена

Контроль 30,5+1,2 Уйдэкан

Тетрадекан 19,6+0,9 *0,05

ГоковдеКан . 18,1+0,9 <0,05

• к о д е л и

I 2 3 4 5

:

2,4 3,7 4,0 4,0 4,0

' 3,9 4,8 5,0

3,7 4,9 5,0

2,6 3,4 ■ 3,7 4,0 4,0

3,9 4,7 5,0

3,5 4,8 5,0

1,1 1*6 2,1 2,4 2,4

3,6 4,8 5,0

3,7 4,8 5,0

1,0 1,6 1,8 2,1 2,1

3,2 3,8 4,5 5,0

3,6 4,1 4,6 5,0

Изучение влияния .углеводородов па скорость гидрдения микобактепий туберкулеза из биологического •■•атсчпялл. Положительные результаты укапанных исследований поолуяили основанием для изучения влияния тетрадекана и гсксадекана на рост культур микобзктег-ий туберкулеза при выделении их из биологического материала животных, зараженных микобактерикш бычьего вид?.

При посеве бяомагеркала от г^орсктк свинок и кролшеов /табл. 3/ наиболее раннее появление первичного роста микобгк-терий отмечено на среде Гельберга о гексадеканом в среднем на 19,111,0 день, с /гетрадекансм чуть позднее, на 23,811,3 - 25,21 0,9 дни, а на среде без углеводородов на 40,511,5 - 41,711,1 дни, т.е. примерно в 2 раза позднее. В момент появления первичного роста в контроле на среде Гелъберга с гексадеканом гштен-синность накопления бактериальной массы оценивалась в 4,9 балла.

На основании этит данных ореда Гелъберга с гексадеканом была избрана как оптимальный вариант для дальнейшего испытания на биоматериале от крупного рогатого скота.

На таблице 4 представлены результаты. Исследования проведены на биоматериапе от 26 голов крупного рогатого скота, реагировавших на туберкулин, у которых на вскрытии установлены туберкулезные поражения лимфатических узлов и внутренних органов, и от 12 голов, реагировавших на туберкулин, у которых при вскрытии видимых туберкулезных поражений но установлено.

На среде о гексадеканом рост микобактерий из йиоматерна-ла с туберкулезными поражениями установлен узе на 20,510,4 день, на среде о тетрадеканом па 24,110,4 , в то время как на контрольной среде без углеводородов на 43,311,4 день, т.е. в 2 раза позднее. Интенсивность роста культур мтсобактериК на пегштуе-тх средах к атому моменту уже достигала 3,3-4,7 балла.

При исследовании бяомэтериалов без. вцппмнх туберкулезных поражений культуры микобактёрий были выделены в 2-х случаях. На среде'о гексадеканом рост появился на 20,511,1 дань, о тетрадеканом - на 22,111,3 день, на контрольной среде без углеводородов на 42,511,0 день, т.е. в 2 раза позднее, Интенсивность роста на испытуемых средах и в атом случае была 3,9 - 4,0 балла.

Изучайте ультоаотруртутш и -.'орТхгтогин М,.. ботю в дпнамзг у.а. культивирования на среде Гельберга с .гексадеканом.

И

таблица 3

Выделение микобоктариЗ туберкулёза из биологического материала от лабораторных животных

Питательная 1 Сроки появления первичного | Интенсивность среда I роста ( дай ) • | накопления башассы

I п ! Цш I Р I ( бшиш }

А. Екоматериш: от мороких овннок '

1. Гельбэрга

контроль 12 41,7+1,1 - ■ Х.о

+ тетрадокан 12 25,2*0,9 <0,05 4,1'

+ гексадекан 12 : 19,1+1,0 <0,05 4,9

2. Лавенштейна -

Ионовна

контроль 12 48,3+1,7 1.0

+ тетрадокан 12 27,0+1,3 <0,05 3,5

+ гексодокан 12 26,6+1,2 ' <0,05 4,0

Б. Биоматериал от кроликов

1. Гельборга

к онтроль <¡4 40,5+1,5 . «я 1,0

+ тетрадэкан 24 23,8+1,3 <0,05 4,2

+ гоксадекан 24 19,8+0,4 '0,05 4,9

2, Левенштейна -

Ионсена

контроль 24 39,3+1,0 — 1.0

+ терадокан 2Л 25,8+1,3 <0,05 3,1

+ гексадекан . 24 . 19,1+0,5 <•0,05 4.1

таблица 4

Бцщзленяо ютобактераЗ тубер::улЗза па среда Гсльбарга с углеводородами но биокатериала от крупного рогатого скота

Питатальнса среда

Кашгеесгво проб

басиаюрзала

• Поаозлальнно | пробы

I1вол-ва I

' Появление !

!

первичного роста

!

¡¿■+ ц

4 Интенсивность ' накопления бакмассн ! ( бадлн )

Л." Бвсиаязрашг с тубаркудазии Гояьберга

контроль + ютрадекан + гексадзказ

25 25 25

Езмонешшьп

21 25 25

5» Биоиатзрпал без ендш,ес туборпулёзных изменений Гельборга

контроль 12

+ твтрадекан 12

+ гаксадеказ 12

2

2 р

92,3 35,1 35,1

16,6 16,6 16,6

43,3+1,4 24,1+0,4 20,5+0,4

42,5+1,0 22,1+1,3 20,5+1,1

: 0,001 ^ 0,001

<0,001 <С,С01

1,0 3,3 4,7

1,0 3,9 4,0

Представляло интерес изучить, особенности морфологии и анатомии мтиобактериальных меток е связи.с ускорением их роста на питательных средах с углеводородам. С этой целью мы провели электронно-микроскопическое исследование культур микобактерий на 7; 14; 30-й дни после появления первичного роста на испытуемой среде и на 30-й день после появления роста на контрольной среде без углеводородов.

В результате нами установлено, что 'уже к 7 - 14 дням поело появления первичного роста на испытуемой среде культура микобактерий содержит большинство морфологически и анатомически полноценных клеток. На контрольной ореде без углеводородов аналогичная картина наблюдалась лишь к 30 дню культивирования. К этому сроку в культуре на испытуемой среде № наблюдаем дегенеративные изменения в цитоплазме и деструкцию клеточной стенки у большинства клеток.

Таким образом, использование углеводородов тетрадекана и гексадекана о яичной питательной средой Гельберга позволило значительно сократить сроки выделения первичных полевых культур и значительно уоилить интенсивность их роста.

В дальнейшем проводилось систематическое использование среды Гельберга с углеводородами при исследовании биоматериала от крупного рогатого скота, реагировавшего на туберкулин. Всего было иссяедозано 157 проб биоматериалов и ввдеяеио 90 культур микобактерий туберкулеза бычьего вида.

Разработка методики илентиТикагоги микобактерий. выделенных из биоматериалов животных на основе моноклональных антител в иммуно^етзментном анализе. Для идентификации микобактерий туберкулеза бычьез?о вада нами, совместно с М.Л. Владимирским и М.В. Авдросовой /г. Москва/, проведены исследования по изысканию гибридомных линий, способных продуцировать соответствующие моноклональные антитела.

В результате были отобраны две гибридомные линии, проду-цируюшие моноклональные антитела пробив М. бовис ЩК /2А5/ и против В. бовио /2А1/, которые были испытаны с музейными и полевыми культурами микобактерий, всего было исследовано 180 культур.

Для проведения идентификации нами отрабатывалась методика 14

"нммуно<ферментного анализа. На первом этапе исследований бил разработан режим инактивации бактериальной массы испытуемых культур микобактерий, который обеспечивает сохранение антиген-пых свойств. С- этой целью использовали хлорофэрм. Затем были отработаны и оптимизированы компоненты реакции 1Ш /количество бакмассы для отрицательного и положительного контролем и испытуемых образцов суспензировали 1 мг/мл; моноклон&льные антитела разводили из расчета 5 мкг на лунку; в качество конь-'югата использовали антитела против иммуноглобулинов киши, меченные пероксидазой в рабочем титре 1:1000/ и разработана схема ее постановки /табл. 5/.

Таблица 5 . Схема иммуноферментного анализа для идентификации микобактерий

Этапы исследования : Режим исследования: Отмывание

1. Инкубация 1-2 колоний микобактерий о хлороформом

2. Приготовление гомогенной бактериальной суспензия и стан дартиввция по мутности

3. Обработка планшета поли-Л-лизином

4. Сенсибилизация планшета анализируемыми суспензиям! и контрольными образцами

б. Блокирование не сп ецифиче око го связывания 10 % раствором яичного белка в ССБ

6. Инкубация о моноклональ-тшми антителами

7» Инкубация о иньюгаТом

8, Внесение субстратной смеси

9, Остановка реакции 60? оерной кьсяотой

4 чаоа, 22 О

0,5 часа, 22 С

2 часа, 37 С

1 чао, 22 С

1 чао, 37 О 1 чао, 37 С 5 мин, 22 С

Водопровод-нал вода-Зраза и водопроводная вода о 0,055? твш -20 - 1 мий. -все повторить трехкратно

Вначале методику ЯМ отрабатывали с ноноклоналышш антителами 2А5, полученными против М. бовис БЦ£. В качестве испытуемых были взяты культуры, выделенные от больных туберкулезом людей / 3 / и тавотных / 11 /, а такке культура, выделенная с места прививки ЩК, Результаты иммуноферментного анализа представлены в таблице 6.

Таблица 6

Идентификация пособактеряй ыоноклональ -хшш антителшдя 2Л5 и 2Л1 в реакции И5Л

Штаыш 'Показатель оптической плотности К+м

ыааобакторкИ ыоноклонадышв антитела • ( и !

: 2А5 (к М.бовисБЦЯ ): 2Л1 (к Ы.бошо)

М. бошс БЦЕ М. бовпе шт. 8

Культуры М. бовио от болышх коров . Культуры м. tuMneu£®Ui от больных лвдей Культуры М, бовис от лабораторных апвоишх Культура, выделенная о шета прививки ВЦП

0*6It0,0I -

0,44t0,0X 0,SSt0,0I

0,03+0,02 0,05+0,01

0,00 0,S3+0,C3

0,00 0,06+0,02

0,00 0,85+0,02

0,75+0,02

Моноклональпые антитела 2А5 активно взаимодействовали о вакцинным штаммом БЦК / оптическая плотность 0,81 / и с культурой, выделенной о места прививки / оптическая шютнооть 0,75 /. Гораздо слабее о'ни реагировали о культурой музейного штамма М М. бовио - оптическая шютнооть вдвое ниже / 0,44 / и практически но реагировала о музейной культурой человеческого вида и культурами микобакторий, выделенными от больных людей и животных.

В дальнейшем были получены клона гибредомннх клеток, 16

продуцирующие моноклональные антитела против М. бовио, и так как они значительно отличались друг от друга по специфичности, из них был Енйран клон 2А1, продуцирующий моноклональние антитела, преимущественно реагирующие о микобактериями бычьего я не вступавшие в реакцию с микобактериями человеческого вида и атипичными микобактериями. В качество положитачьного контроля в реакцию была взята культура М. бовио шт. 8, отрицательного - \КАиЛглеа£си$ Иъ+НЬгВсего- исследовано 70 культур М. бовио, выделенных от крупного рогатого скота, 7 культур М. бовио от лабораторных животных и 12 культур, ввделен-ных от людей, больных туберкулезом / табл. 6 /.

В результате было установлено, что все культуры, выделенные от крупного рогатого скота и лабораторных животных, полони-тельно реагировали о моноклональными антителами 2А1, оптическая плотнооть 0,93 - 0,85 ед. и отнесены к 1-1. бовио. Музейные культуры микобактерий человеческого вида и культуры, выдолешше от больных людей,с моноклональными антителам! 2А1 не реагировали.

Таким образом, культуры М. бовис, выделенные после ускоренного выращивания на средах о углеводородами, а также культуры ЩН могут быть о высотой специфичностью идентифицированы моноклоньльннмл антителами в реакции иммуноферментного анализа.

На основе стих результатов бйла разработана иммунофермен-тная тест-система для идентификации микобактерий бычьего вида и проведено ее комисспоянов испытание в Государственном НИИ контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов, Департамент ветеринарии МСХП РФ рекомендовал тест-систему для широкого производственного' испытания.

В И В о д ы

1. Предельные углеводороды оказывают стимулирующее дейсизяо ва рост микобактерий туберкулеза бнчьегй вида на яичных питательных средах. Под их воздействием яизненннй цдал микобактерий сокращается: через 7-10 дней послё появления йер-вичного роста паблюдаем максимальное количество морфологически л анатомичеокя полноценных клеток.

2. Добавление предельных углеводородов о длинной углеродной

цепью к яичной питательной среде Гельберга позволяет получить первичный рост микобактерий туберкулеза бычьего вида кз биологических материалов животных на 15-20 день после посева.

3. Предельные углеводороды о длинной углеродной цепью опосяЗствуют значительному увеличению интенсивности роста и накоплению бактериальной маосы на яичных питательных средах. К 15-20 дню после появления первичного роста интенсивность накопления бактериальной массы оценивается 3,8 - 5,0 баллов, в то время как на стандартных яичных питательных средах накопление бактериальной массы не превышает 1,5-2,0 баллов.

.4, Получены клоны гибридог.шых клеток, продуцирующих мо-нозигональнне антитела, специфически реагирующие с микобактери-ями туберкулеза бычьего вада и микобахтериями вакцшшого атаммя БЦЖ.

5. Разработана яммунофермеитная тест-система на основе моноклональнызс антител, позволяющая проводить идентификацию наделенных культур микобактерий туберкулеза бычьего вида.

6. Комплексное применение питательной среды Гельберга

о добавлением предельных углеводородов для ускоренного выращивания микобактерий туберкулеза из биоматериалов глвотных к тест-системы иммуноферментного анализа на основе моноклональ-ннх антител позволяет сократить сроки лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота до 20-25 дней. '

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРВДШЕНИЯ

1. Для лабораторной диагностики туберкулеза использовать яичную питательную'среду о добавлением предельного углеводорода о целью ускоренного выделения возбудителя туберкулеза бычьего вида из биологических материалов крупного рогатого скота.

2. Временное наставление по применений набора реагентов для идентификации микобактерий туберкулеза бычьего вида методом иммуноферментного анализа.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ильиных Л.А. Сравнительное изучение модификаций яичной питательной среды для ввделения и культивирования шгкобакте-рий туберкулеза // Сб. Науч. тр. ЫШБТЖ - Новосибирск,

1990. - С. 45-48. -

2. Ильиных Л.А. Ускоренный способ бактериологической диагностики туберкулеза // Сб. науч. тр. /-Р.АС.Ш СО. BJüfflBTS -Новосибирск, 1S91. - С. 30-34.

3. Андросова !.1.В., Владимирский H.A., Ильиных Л.А. и др. Штамм гибрвдомных культивируемых клеток животных «JJjMr ткл&г^-й-у исшльэуемис для получения моноклональных антител к

БЦЖ. // Авторское свидетельство на изобретение № 1445183 от 15.08.88г.

4. Ходун Л.М., Ильиных Л.А., Погуляева Л.В. и др, Моно-клональные антитела для эдентщмжашпт микобактерий туберкулеза у животных // Сб. науч.' тр. / РАСХН СО. ВЮШБТЬ. - Новосибирск, 1992. - С. 12-15.

5. Ильиных Л.А. Иммунологический метод идентификации микобактерий туберкулеза // Сб. науч. тр. / FACXH СО, ВНИИБТ2, Новосибирск, 1992. - С. 63-ß5.

6. Андросова М.В., Владимирский М.А., Ильин® Л.А. и др. Штамм гибридных культивируемых клеток гивотных JUuz^iüi осu£ii% продуцент моноклональных антител к

// Авторское свидетельство на нзобретенио 5 1742326 от 22.02.92r.

7. Ходун Л.М., Погуляева'Л.В., Овслнов Н.И., Ильиных Л.А.

н др. Выделение атипичных микобактерий от животных благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйств.// Сб, науч, тр. ШЗХНИЛ, ВШдаБТК - Новосибирск, 1990. - 0. 124-132.

и