Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Использование аминоацил-тРНК-синтетаз как аутоантигенов для выявления аутоантител и антиидиотипических антител в сыворотках больных системной красной волчанкой и ревматоидным артритом

- , г

■ ГОСУДАРИ ВЕШШЙ 1ЖМТЕТ РС1СР . - САНИТАРПО-ЭМИДВ'ИОЛОППЕСКОГО НАДЗОРА МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИМ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ 11 микробиологии им. Г.И.ГАБРИЧЕВСКОГО

На правах рукописи

ВАРТАНЯН .Ольга Арамовна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АМИНОАЦИЛ-тРПК-СИНТЕТАЗ КАК АУТОА11ТИГЕНОН ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АУТОАНТИТЕЛ И АНТ1ШДИОТИПИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКАХ

сольных системной красной волчанкой и ревматоидным артритом 14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискании учрноп степени кандидата медицинских наук

Москва - 1992

Ык

; /

V

Ч / - V-

Работа выполнена в Институте молекулярной ополпш АН СОД-1

член-корреспондент ЛИ СССР, проф. Л.Л.Киселев

Научные руководители:

кандидат Онологических наук С.Ф.Ьеростень кандидат медицинских наук Н.Н.Кондрашина .

Официалыше оппоненты: доктор медицинских наук, профессор В.А.Ляшенко кандидат химических наук А.!.ГаСибов

К.034.10.02 МНИЮМ им. Г.Н.Габричевского Госкомитета РСФСР санэпиднадэора (125212, г.Москва, ул. Адмирала Макарова, 10 1.

С диссертациеи можно ознакомиться в библиотеке Московского НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского.

имени В.А.Энгельгардта

Научный консультант;

Ведущая организация Институт иммунологии Ш СССР

часов на заседании специализированного совета

Автореферат разослан " ф "

1992 г.

Ученил секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

О.В.Кстелышкова

iSTSF^jr;

ие;„тации ~~ ПьП?

Актуальность проблемы Важное значение* в патогенез« аутонммун-заболевзпнй играют аутоантитела к различным клеточным компонентам. Исследования сольных системной красноя волчанкой (СКВ i и ревматоидным артритом (РА) показал^, что в сыворотках этих сольных содержатся характерные аутоантитела, в осооенности анти-ДИК, типичные для больных СКВ (Dar ct al., 1990; Laplancha et. al., 1990: Carson, 1991) и анти-Ig антитела I ревматоидный фактор), типичные для больных PA (Lorber ct al., 1?S8; Jones et al., 1990). В настоящее время широкое распространение получила концепция идиотипи-■ ческой регуляции иммунной системы и вое чеченке идиотипичсских и антиидиотипичоских антител в аутоиммунные процесс» (Hebert et al., 1990 ). Возможно, что антиидиотипические антитела могут индуцировать аутоиммунные заболевания (Mendlovlc et.al., 1983; Mozcs et al., 1989); они могут быть вовлечены в регуляцию аутоиммунных заболеваний (Valderraira Я. et al.r 1968; rioscl et al., 1989); могут быть ценными в предотвращении и лечении аутоиммунных заболевания IHoltt et al., 1983; Chanh et al., 1991).

Например СКВ можно вызвать у мышей, иммунизируя их анти-ДИК идиотипическими антителами человека (Mendlovic et al., 1060; Shoenfeld et al, 1989). Эти идиотипы играет важную роль в патогенезе СКВ.

Впервые аутоантитела к таким важным клеточным ферментам, как аминоацил-тРНК-синтетазы (КФ 6.1.1.) обнаружили при миозите; от количества аутоантител к гистидил-тРНК-синтотазе в сыворотках больных зависит клиническая картина зафлевания (Ramsden et al., 1909).

Аминоацил-тРНК-синтетазы играют важную роль в организме, учас- . твуя в начальных этапах синтеза белков. Аутоантитела, обнаруженные к 5 аминоацйл-тРНК-синтетазам, ингибируют их ферментативную активность (Mathews etal., 1984; Ramsden et al., 19S9;. Targoff , 1990; rargoff and Arnett, 1990), что может привести к нарушении синтеза белков и углубить патологический процесс. В результате возможен синтез дефектных белков, которые,'как известно, могут играть роль аутоантигенов и аутоиммунизация может принять генерализованный характер. Известно, что гистидил-тРНК-синтетаза вызывает и поддерживает аутоиммунное состояние I Miller et al., 1989).

Аутоантитела к треонил-тРНК-синтетазе были выявлены и при ■ СКВ (Mathews et al,, 1964). ■

Ни водном из приведенных случаев антиипиотипических антител

ne искали, хотя известно, что они могут быть важным звеном в механизме формирования аутоиммунного процесса.

Ьышесказанное свидетельствует об актуальности задач, связанных с выявлением аутоантител к аминоацил-тРНК-синтетагам и антиидиотипических антител к ним у'больных системными аутоиммунными заболеваниями.

Цель работы. Получить моноклоналыше антитела к фенилаланил- и тирозил-тГНК-синтетазам и разработать на основе монсклональных антител к фенилаланил-, тироэил- и трипюфанил-тГНК-сшпетазам диагностических тест-систем иммуноферментного анализа (ИФА1 для выявления аутоантител и антиидиотипических антител в сыворотках оолышх СКВ и РА.

Основные палачи исследования:

1) выделение иысокоочищенного препарата фенилалалил-тРНК-син-тетази из печшш быка;

2 1 получение моноклональных антител к фенилаланил- и тирозил-тРИК-синтетазам, их иммунохимическая характеристика;

3) разработка диагностической тест-системы ИФА на основе имеющихся антигенов для выявления аутоантител у больных СКВ и РА;

4 I разработка диагностической тест-системы ИФА на основе полученных моноклональных антител для выявления антиидиотипических антител в сыворотках больных СКВ и РА.

Научная новизна:1 I разработан быстрый метод выделения фе-пилаланил-тРНК-синтетаэы, в результате которого получен гомогенный, очищенный в 0000 раз препарат из печени оыка;2) впервые получены моноклональные антитела методом гибридомнои технологии к . фенилаланил- и тирозил-тРПК-синтетазам и дана их иммунохимическая характсфистика;3 ) отработана и оиробирована новая диагностическая тест-система ИФА для выявления аутоантител к фенилаланил-, тирооил-и триптофанил- тРНК-синтетазам в сыворотках больных РА и СКВ; 4) отработана и опробирована новая диагностическая тест-система для вы-ления антиидиотипических антител к аутоантителам против трех син-тетаз в сыворотках больных РА и СКЬ. Впервые у этих больных выявлены антнидиотипические антитела против аутоантител к синтетазам. Практическая ценность. Разработан быстрый метод выделения фенил-аяанил-тГ'НК-еинтетаэы из тканей млекопитающих, с .помощью которого в короткие сроки мо;шо получить необходимое количество фермента. С iiomolui) разработанных диагностических тест-систем ИФА можно выявить

аутоантитела и антиидиотипические антитела к ряду аминоацил-тРИК-синтетаз в сыворотках больных СКВ и РА, а также установить закономерность формирования аутоантител и антиидиотипов.

Внедрение результатов работы. Диагностическая тест-система на основе иммуноферментного анализа для выявления аутоантител к ряду аминоацил-тРНК-синтетаэ и антиидиотипических антител к ним внедрена в отделе иммунологии 2-го МОЛГМИ им. Н.И.Пирогова для тестирования сывороток больных аутоиммунными заболеваниями.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доло.тени на 13-ом международном совещании по тГНК Санада, 19U9) и на 15-ом международном биохимическом конгрессе (Израиль, 1991).

Диссертация апробирована на заседании научного коллоквиума • лаборатории молекулярных основ онкогенеза ИМБ АН СССР 4 ноября 1991 года.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано б работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на J35~ страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание методов исследования, результаты работы и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы, содержашля J.5-2. источника. Работа илюстрирована 7 таблицами и 22 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

л С целью выявления аутоантител к фонилаланил-, тирозил- и триптофанил-тРНК-синтетазам и антиидиотипических антител к ним обследовали 24 сыворотки больных системными аутоиммунными заболеваниями: 12 сывороток больных СКВ; 12 сывороток больных РА, а также 12 сывороток здоровых доноров. Сыворотки любезно предоставлены Институтом ревматологии АМН СССР.

Фенилаланил-тРНК-синтетазу выделяли из печени быка. Для этого разработана следуошзя схема: 1 кг печени гомогенизировали; осаждали белок полиэтиленгликолем (ПЭГ 1-6000 (3%); повторно осаждали ПЭГ-' 6000 (0*. >; хроматография на DEAE-Touopearl 650М; хроматография на геплрин-сефарозе CL6B, элюция линейным градиентом KCl (0 - 0,5 М), фчрмент элюируется в 0,25 М KCL; хроматография на гидроксилапатите HA-Ultrogel, элюция сложным градиентом фосфата (рис. 1), фермент элпируется в 0,2 И фосфатном буфере; на последней стадии использовали клтионообменник MonoS системы FPLC, элюция градиентом KCL

(0-u, a Ml, фермент олгжровлся в 0,15 М KCL (рис. 2 I .Активность Фермента определяли в -реакций амшюацилирования как описано Ах-вердяиом В.З. и др.(1977) с изменениями. Очищенные препараты Фе-нилаланил-тРНК-синтетаз из E.coii и Т. thermop'hilus били любезно предоставлены Лаврик 0.C?. (Институт биоорганическои химии Сибирского отделения АН СССР, Новосибирск!. Белки характеризовали по молекулярной массе и гомогенности методом электрофореза в полиак-риламидном геле (ПААГ) по методу Laemmll 11970) в присутствие.доде-цилеульфата натрия (DDS-Na), а такта использовали DDS~Na электрофорез с градиентом пористости геля от 72 до 22%. О специфичности мо-ноклональных антител, о типе и консервативности антигенной детерминанты судили по данным иммуноблотинга iBurnette, 1901), а также но данным дот-блотинга. Для этого на нитроцеллюлознып фильтры наносили фенилаланил-тРНК-синтетазу (0,2 мг/мл) из различных источников, оставшиеся адсорбционные места блокировали 0,5Х БСА в PBS, затем инкубировали фильтры с моноклональными антителами (0,2 мг/мл). В качестве вторых антител использовали IgG козы против IgG мыши . коньвгированные с пероксидазой хрена в разведении 1/1000. Окраску проявляли раствором 4хлор-1нафтола в присутствии Н202.

Для тестирования моноклоналышх антител, сывороток больных СКВ и РА проводили ИФА на всех этапах работы. Моноклональные антитела получали гибридизацией иммунных спленоцитов с мяеломными клетками мышеи линии P3/Ag0.653 в соотношении 1:1 в 0,5 мл 50% ПЭГ-4000 ("Mere", ФРГ). Клетки рассеивали в 96-луночные планшета ("Costar", США) по 10000 тис. спленоцитов и клеток миеломы. Клетки первичных гибридных популяции клонировали предельным разведением, затем гибридные клетки (0,5 х 106 клеток), вводили внутрибршинно мышам и .пассировали в виде асцитноя опухоли. Моноклональные антитела получали из асиитнои жидкости на колонке DEAE-ToyopearI ("Toyo Soda"I. Концентрацию определяли спектрофотометрически . используя значение

1 г и

. коэффицопта экстинции при 230 нм Bj¿jJ./MJ, = 1,35.

Аутоантитела и антиидиотипы выделяли из сыьороток больных СКВ и РА методом иммуноаффиннои хроматографии на колонке с сефарозои 4В, активированной ВгСН. Антитела характеризовали по молекулярной массе и iомогенности.методом DDS-Na электрофореза в ИААГ.

Класс моноклональиых антител, аутоантител и антиидиотипичес-. ких антител определяли по иммунопреципитации в агаре по Оухтерлони t Ле.ркоитс и др., 1ÜÖ3K

Рис. 1,. Хроматография на колонке Нл-иНго0е1 объемом 20 мл, уй 16/20. "Скорость-элюции 1 мл/мин. Точки •- активность фенилаланил-тРНК-синтетазы в реакции аминоацилирования.

Рис. 2. Хроматография на колонке МопоЗ НП 5/5 системы РГГ.С, объемом 1 мл. Точки - активность фенилаланил-тРНК-синтетазы в реакции аминоацилирования.

üjyjlbTATbl ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Очистка фенилаланил--тРНК~синтетазы из печени быка Изложенный в данной работе способ выделения фенилаланил-тРНК-синтетазы из печени быка предложен впервые. Вся процедура выделения занимает только два дня и состоит из 4 стадий. В результате нами получен гомогенный, очищенный в 5000 раз препарат фенилаланил-тРНК-синтетазы из печени быка с удельной активностью 6 ¿д/мг белка, (табл. 1). Основные преимущества предложенного нами метода - быстрота и хорошая воспроизводимость. Предложенный ранее (Lanks et al., 19'П > метод включал значительно больше стадии , при этом кратность очистки не превышала 500. Дальнейшее усовершенствование (Techerne et al., 1Ü73) привело к увеличению очистки до 1500-кратной, но прибавило еще две стадии

• Таблица 1.

Выделение фенилаланил-тРНК - синтетазы из печени быка.

Стадия Объем, Концентра- Удельная Кратность Выход, мл ция белка, активность, очистки, %%

мг/мл ед/мг раз

Экстракт 1000 67,50 0,0016 1 100

Гепарин- •

Т-ефароза ' 50 ' 5,00 0,3100 200 40,0

HA-U1tröge 1 15 0,09 3,6000 2250 2,5

Mono 3 1 0,30 0,0000 5000 1,2

После электрофоретического разделения в ПААГе в присутствии ИШз-Ма молекулярные массы а- и р-субъединиц после денатурации имели значения 59 и 72 кЛа, соответственно. Молекулярная масса натив-ного фермента - 260 кДа.

Иммунохимическая характеристика моноклональных антител к фенилаланил- и тирозил-тРИК-синтетазам В результате проверки первичных популяций гибридом и после-яуыд.-то клонирования получены два клона, секретирувщие моноклональ-нна антитела к фенилзланил-тРНК-оинтетазе из печени быка, обозна-

ченные Рд и Pj2 11 олип клон, секретируюшмй моноклинальные антитл.г к тирозил-тРНК-синтетазе мэ печени быка, обозначенной Т^. Анализ методом дот-блотинга выявил способность моноклинальных антител Ре и Р]2 к взаимодействию с гомогенной фенилаланил-тРНК-синтетазои из плаценты человека и полное отсутствие взаимодействия с ферментом из Е.соИ и Т. МепгярЬНих (рис. 3).

1 9L 3 4 5 6 7 8

Рис.3. Анализ методом дот-блотинга взаимодействия моно-клональных антител Pg и Р^ с фенилалянил-тРНК-синтетазой из E.coll и Г. thvrmphllus (5, б) и из плаценты человека 17, 0), соответственно для Гд и Pj,; 1,2- сывороточный альбумин быка, адсорбиропаиныа на нитроцеллюлозе.

12 3

V

-94

Y

67 60

43 30

Рис. 4. Иммунореактивноость мо' ноклнальных антител Рд (2 ) и Pj2 '3) по результатам иммуно-блотинга. 1 - нитроцеллмопнмп

фИЛЬТр,КрашеННЫЙ аМИДОЧГфт.'М.

Цифры справа - молскулярнь;'.« массы маркеров в кДЛ.

Антигенная детерминанта для моноклональных антител Р6, по-видимому .линейного типа, поскольку сохраняется в денатурирующих условиях и находится на а-субъединице, что нельзя сказать о моноклональных антителах Р12> как видно из результатов иммуноблотинга I рис .41.

При анализе методом иммуноблотинга способность моноклональных антител 1'3 связываться с очищенным препаратом тирозил-тРНК-синтета-зы, нами выявлено,что антигенная детерминанта сохраняется при денатурации фермента (рис. Ьа, 1). Таким образом, антигенная детерминанта для моноклональных антител Т3, так.ке как и для Р^, по-видимому, линейного типа.

И! "Т ;

•и/

I ^

^ ¡¡«11(1

■■' А

Рис. 5, Иммунореактивность моноклональных антител Т3 с очищенным препаратом тирозил-трнк-синтетазы из печени быка (а, 1) и с тироэил-тРНК-синтетазой из гомог.ената ткани плаценты человека после хроматографии (а, 2); б, 1 - гель после переноса на нитроцеллюлозныя фильтр; б, 2 - электрофорез гомогената ткани плаценты после хроматографии (окраска раствором кумасси С-250). Стрелкой обозначена тирозил-тРНК-синтетаза. .

Иммунохимически-й перекроет моноклональных антцтел Т3 к тнро-зил-тРНК-сиптетазе из печени оыка с аналогичным Ферментом из других объектов определяли методом иммуноблотинга, используя очищенные препараты из Е.соИ и Г. ЬЬегторЫ1из и гомогенат^плаценты человека после частичной очистки на СЕАЕ-Тоуореаг1. Моноклинальные антитела Т3 связывается только с тироэил-тРНК-синтетазол из нланонты человека. Из-множества растворимых белков гомогеиата ткани плаценты после хроматографии (рис. 56, 2) только один, тлектрофоретическая подвижность которого совпадает с- подвижность» полипептиднои цепи тирозил-тРНК-синтетазы связывается с полученными антителами (рис. 5а, 2). Это говорит о еысокол специфичности моноклональных антител к тирозил-тРНК-синтетазе.

Моноклональные антитела Рб и Р^2 к фенилаланил- и Т3 к тиро-зил-тГНК-синтетазам влияли на активность ферментов как оыка, так и человека в реакции аминоацилирования.

Все полученные нами моноклональные антитела относятся к классу

. Разработка иммуноферментного анализа для выявления аутоантител к фенилаланил-. тирозил- и триптофанил-тРНК-синтетазам в сыворотках больных СКВ и РЛ На основе полученного гомогенного высокоочищенного препарата Фенилаланил-тРНК-синтетазы, тир.озил-тРНК-синтетазы, выделенной из печени быка и лгбезно предоставленной А.Д.Волъфеоном (Институт биохимии- им. А.Н.Баха АН СССР) И триптофлнил-тРНК-синтетазы, выделенной из поджелудочной железы быка и лобезно предоставленной Г.К.Ковалевой (эта лаборатория) разработана тест-система ИФА для выявления специфических аутоантител к этим ферментам в сыворотках больных СКВ и РА. '

Основные параметры, которые необходимо было определить при создании тест-системы ИФА явились: 1) доза антигена; 2) pll буферных рлстпороР: 3) время и температура фиксации антигена на полистероло-mix плэдшетах.

Пройденные опыты позволили предложить следуИшио оптимальные условия реакции: доза антигенов (аминоэцил-тРНК-синтетаз) - 5-10 мкг/мл; рН фиксирующего буферного раствора - 7,2; время и температура фиксации -антигена 14 часов при 4°С или 1 чао при 37°С.

Для описания результатов, полученных в ИФА, характеризуйте .содержание специфических аутоантител, был выбран метод стандартных кривых. Для построения кривых доза-ответ использовали по 12 сывороток больных СКВ, РА и здоровых доноров. Полученные кривые характеризовались выраженной линеянои зависимостью, которая наиболее четко проявлялась в зоне, разведения сывороток от 1/100 до 1/1(500. При дальнейшем изучении сывороток методом ИФА целесообразно использовать разведения начиная с 1А100, т.к. при этом разведении у здоровых доноров аутоантите.ча he выявлялись.

Исследуемы« сыворотки больных РА имели титр аутоантител для трех ферментов 1/16О0 (рис. 6а). Аналогичные результаты получены при Iитрованш* сывороток больных СКВ. Лишь для триптофанил-тРНК-синтетазн титр имел значение 1/3200 (рис. 66). Зарегистрировано четкое повторение результатов показателей содержания аутоантител в исследуемых сыворотках. Чувствительность ИФА охарактеризована нами при определении минимального количества специфических аутоантител к амшюацил-тРНК-синтетазам в сыворотках больных. Минимальная концен-рапия выявленных ау.тоантител составляла нг/мл. Содержание спе-

цифических аутоантител к трем синтетазам варьировало от 16+0,03 до 35*0,05 мкг/мл.

Наши данные показывают, что ни четвертичная структура спите газ (а, или «2В2-тип), ни размеры Ют 120 до 270 кДа), ни прочность ассоциации в мультифермснтном комплексе в цитоплазме клеток не влияют на способность этих аминоацил -тРНК-синтетаз индуцировать появление аутоантител при таких аутоиммунных заболеваниях, как СКВ

и РА.

Влияние аутоантител на ферментативную активность изучали в реакции аминоацилирования тГНК. Поликлональные антитела из сывороток больных СКВ и РА ингибировали ферментативную активность фннил-аланил- (на 71,6±2,3% и 66,7*1,6*), тирозил- (на 65,5±1,С>£ и . .71,1+2,25) и триптофанил- I на 62,1+2,3?- и 76,7±1,87.) тРНК-синтетаз соответственно.

A40d

1 4-2 ' -#-3 —4 - h" 6 а

Г 3

—-1 4-2 —4 -4-5 -Ж- е

. 6

Рис. 6. Зависимость величины экстинции от степени разведения сывороток у больных ревматоидным артритом (а, каждая точка -среднее из 10 определении) и системной красной волчанкой (б, среднее из 11 определений) - Сплошная линия и здоровых доноров (среднее из 12 определений) - пунктирная линия при выявлении аутоантител к тирозил- (1, 4), фенилаланил- (2, 5) и триптофани) (3, 6) тРНК-синтетаэам.

-г / I

Разработка иммунофермеитного анализа ;иы ¡цщ.;к ;;и>| дни

идиотипических антител к аутоатителам претив -кчщлаланил-,

тироэил- и триптофанил-тГНК-синтетаз

Тест-система разрабатывалась на основе получениях гис-ри-

домнои технологией моноклональных антител к фенилаланил- 11',. и

ь

Р]0), тирозил- 1Т3) и а та^же имеющиеся к триптофанил- (Ам1 ) тРПК-синтетазам. В случае с моноклональнымп антителами Р^ и Р12 использовали смесь (Р6+]0), т.к. из результатов иммуноблотинп видно, что они направлены против различных антигенных детерминант.

Оптимальные условия для проведения реакции были аналогичны первой системе. В качестве контроля-на специфичность антиидиотипических антител к моноклональным антителам против сиитетаз использовали моноклоналыше антитела мыши к интерферону-1 человека. Титр антиидиотипов к интерферону-1 был. на уровне контроля с сыворотками здоровых доноров. Для выражения результатов полученных в ИФА, характеризующих содержание антиидиотипических антител был также выбран метод стандартных кривых. Для построения кривых доза--от-вет использовали по 12 сывороток больных СКВ и РА,, а также 12 сывороток здоровых доноров. Полученные кривые характеризовались выраженной линеиноп зависимостью в зоне разведения сывороток от 1/100 до 1/3200 для больных СКВ и от 1/100 до 1/1Ьио для больных РА. В дальнейшем целесообразно использовать разведения, начиная от 1/400, т.к. у здоровых доноров при этом разведении антиидиотипические антитола не выявляются. При исследовании сыворсу^ок больных РА титр антиидиотипических антител к трем моноклональным антителам имел значение 1/3200 (рис. 7а). В сыворотках больных СКВ выявлялись ан~ тиидиотипы к моноклональным. антителам в титре 1/1600 (рис. 76).

Зарегистрировано четкое повторение результатов показателей содержания антиидиотипических антител в исследуемых сыворотках. Минимальное количество антиидиотипических антител выявляемых г сыворотках больных составляет 1,1-4,5 нг/мл. Содержание антиидиотипов в сыворотках больных СКВ и РА варьирует от 32+0,04 до 41±0,06 мкг/мл.

Для доказательства специфичности антиидиотипическн:; антител к моноклональным антителам использовали метол торможения ИФА. Максимального значения процент торможения (80±2,2£) достигает при концентрации антиидиотипических антител 25 мкг/мл.

,v405

1 ч- 2 3 4 -t- 5 -Ж- 6

а

А405

б

Рис. 7. Зависимость величины экстшшии о? степени разведения

ывороток у больных ревматоидным артритом (а) и сисюмнои крпснип

олчанкоя (б) (сплошная линия, каждая точка среднее из 11 определении1

•■здоровых доноров (пунктирная линия, среднее из 12 определении) в

еакиии иммучоферыентного анализа по обнаружении антиидиотш1ич<-с><.их

нтител к моноклональним антителам РСа10, (1 и 4 I, Т.. (2 и Ь) и Дм1

ь +11 ,)

3 и 6). «

«

выводы

1. Гаэраоотан быстрый метод'выделения из печени быка гомогенного пр'.парата фенилаланил-тРНК-синтетазы, очищенного в 5000 раг с удельной активностью 8 ед/мг белка.

2. Методом гибридизации иммунных спленоцитов с миеломпыми клетками получены два клона клеток, секретируюших моноклональные антитела против фянилаланил-тРНК-синтетазы (Pg и Р^2 ' • Моноклональные антитела не влияли на активность Фермента, перекрестно реагировали в реакции дот-блотинга с ф^нилалаиил-тРИК-синтетазоя из плаценты Человека. Антигенная детерминанта для антител Pg находится н; а-субъединице и, по-видимому, линейного типа, т.к. сохраняется при денатурации фермента.

3. Методом гибрцдомиол технологии получен клон клеток секре-тирумлх моноклональные антитела к тирозил-тРНК-синтетазе (Т^). Моноклональные антитела Т^ не влияли на ферментативную активность ти ропил-тРНК-cmmгазы, перекрестно реагировали с ферментом из гомо-гемата ткани плаценты человека в реакции иммуноблотинга. Антигенна детерминанта для моноклональных антител Т3, по-видимому, линейного типа, т.к. сохраняется при денатурации Фермента.

4. Газработана чувствительная, специфическая, хорошо воспроиэ водимая диагностическая-тест-система (ИФА) для выявления аутоанти-тел к фенилаланил-, тирозил- и триптофанил-тРНК-синтетазам в сыворотках больных СКВ и РА. Минимальная концентрация выявляемых ауто-антитеп составляет 0,009-0,0045 мкг/мл.

5. Разработана чувствительная, специфичная, чорошо воспроизводимая диагностическая тест-система для выявления антиидиотипи-ческих антител к аутоантителам против трех синтетаз в сыворотках больных СКВ и РА на основе' моноклональных антител против этих синтетаз. Минимальная концентрация выявляемых антиидиотипов, составляла 0,009-0,0011 мкг/мл.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Monoclonal antibodies against tnamaallan amlnoacyl-tRHA synthetases / Beresten S., Volfson A., Motnrln Yu., RlbUlnska N., Vartanyan O. ot al // 13th International tKNA Workshop, Abstracts - Vancouver, Canada. - 1369. - F-R-Vi.

IS

•2.Быстрый метод выделения фенилалаиил-тРНК-ешшпази из жопитающих и получение моноклоналышх антител к этому зменту / Вартанян О.Л., Машзиов-Голиков A.B., Влльфсон А.Д. и . // Мол. биол. - 1990. - Т. 24. - Вып. 3. - С. 700-701.

3. Метод селекции гибридом, секретируюашх моноклопалыше гитела к тирозил-тРНК синтетазе, основамныя на определении зиматическои активности / Рибкинска Т.А., Вартанян O.A., тоненко В.В. и др. // Биополимеры и клетка. - 1990. - Т. б. -I. - С. 97-101.

4. Вартанян O.A. Выявление в сыворотках больных аутоиммунен заболеваниями аутоантител против ффшлаланил-, тирозил- и штофанил-тРНК-синтетаз и антиидиотипических антител к ним // 1. биол. - 1991. - Т. 25. - Вып. 4. - С. 1033-1039,

5. Stelnfierg 3., Yartanyan О. and Klsselev L. Mammalian tlWA ithetase pairs: prediction of identity in tRNA and lmmurio logl-

l studies of the synthetase // 15th International Congress of ¡chemistry, Abstracts. - Jerusalem, Israel, 1991.

6. Monoclonal antibodies to the components of the liißh-Lecular-mass synthetase complex / Fllonenko V.Y., Wolfson A.D., ■tanyan O.A., Beresten 5.F.. // Blomed. Scl. - 1991. - V. 3. -289-292.