Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Совершенствование лабораторных методов выделения и идентификация микобактерий туберкулеза у крупного рогатого скота

РГ Б ОН

2 2 МАЙ 15С5

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛ IСК0Х03Я ЙСТВЕШ ШХ НАУК ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ ОМСКОГО АГРАРНОГО УНИВЕРСИТЕТА

На правах рукописи УДК 616:613 ¿98 ;б79.873«21Т:636,22/.28.

Т А Л Л Ё Р . ЛЮБОВЬ АРКАДЬЕВНА .

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ МЕТОДОВ ВЦДШНИЯ И ИДЕНПШКАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ Г/БЕРОТЕЗА У ' КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

16.00.03 - вотергошрнея микробиология, вирусология.

эпизоотология, »«колотая и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Г* ОМСК - 1995 г.

Работа выполнена а лаборатории диагностики и микробио -логеи туберкулёза Всероссийского научно-исследовательского института бруцеллёза и туберкулеза животных

Научный руководитель! Кандидат биологических наук Д.Ц,Ходун

Официальные оппоненты: Доктор ветеринарных наук, профессор В.Г.Ощэокоб Доктор ветеринарных наук В.К.Паоитковский

Ведущая организация - Государственный научно-исследовательский институт коцтроля, стандартизации, сертификации ветеринарных препаратов.

Зщава состоится ^ ¿сс^с^ 1995 года в час. на заседании диссертационного совета К. 120.4В.01 ори Институте ветеринарной медицины Омского аграрного университета. 644007, Омск - 7, ул. Октябрьская, 92.

С диссертацией шашо ознакомиться в библиотеке Института ветеринарной медицины Омского аграрного университета.

Автореферат разослан & Ш^ичЛ 1995 г,

Учёный секретарь диссертационного совета

ОБУЙ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальности теми. Всемерное увеличение п улучшение качества продуктов животноводства в - значительной - степени зависит от----------------------

благополучие хозяйств по хроническим инфекциям. Одной из важнейших задач ветеринарной науки является разработка катодов про--филактики и ликвидация такого опасного заболевания, как туберкулез сельскохозяйственных отвотннх, наносящего оольшо;"! социальный и экономический ущерб 4 Успех борьба с туберкулезом во »»ногом зависят от правильной и своевременной диагностики. В комплексе диагностических мероприятия решающее значение тоет дактвряолота-ческре исследование биологического материала от убитых с диагноз •стической цель» животштх - выделение п последующая идентификации возбудителя.

В основе метода Енделения лекит способность уикобактерий размножаться на специальных'питательных средах. Наибольшее признание в ветеринарной.практике получили плотине яичные питатель-кие среды Левенштейна-Йенсена, Гельберга, Финн-2. Основным недостатком ятих и других используемых в ветеринарных лабораториях питательных оред являетгч длительные сроки культивирования я, как дравшго, очень скудный рост. Это побуждает ученых продолжать исследования по совершенствованию и созданию новых питательных сред.

Так, Е.Г. Мельник, Н.В. Плсскярев, В.М. Бозенблат / 1^70 / изготовили сухой аспарагино-глишшовый бульон, в котором ллгг стимуляции роста использовали сернокислый цинк. Э.Р. г-ттак /1973/ предложил безвспарагинЬиую среду, обладающую хорошей вчееяав-исстыо. Т.Е. Коронелли, Н.И. Фадеева /1РЦ6/ провели испытание агаровой среды, в которой единственным источником углерода являлся жидкий парафин. По сообщению авторов обильный рост мтаэд-бактерий удалось получить на 2-й день. А.Д. Ляпунова о соавт. /1984/ провели исследования по сравнению различных яктатель-!!н:с сред я пришли к выгоду, что для получения болей спирального результата при выделении М, бовио из биологического материала целесообразно' сочетать 2-3 среды разных ко составу.

Поиск более а'Мективннх питательных сред, поятюаотлх значительно ускорить валелоние мяясбаятеряй туберкулеза га Апологического материала, Предполагает и пршщпгшашю новый

подход дяа их идентификации, так как цзменяотоя главный таксономический признак - их медленный рост.

Оптимальным решением этой задачи может быть изыскание ыо-ноклоиельннх антител к разным ввдач микобактерий и о их помощью проведение зденифпсации иммуноферментным методом. Литературные даяние подтверждают преимущества этого метода

М.'ОеЬ<хш\е)Г1,ье]апгиъЩ?ЛЛатт, М.А.Сафии, 1965; ¡Л. А.Владимирский, 15В7 /. Высокая чувствительность ЖА позволяет разрабатывать методики обнаружения туберкулезных антигенов в секретах жппотных, в диалогическом материала и во внешней ореде. 1

Б последнее десятилетие о помощью гибрвдомной технологии получокн антитела к разнообразнш антигенам бактериального и вирусною происхождения. В сравнении йолиняональными антителами они обладает высокой специфичностью и, кроме того, их получают без каких-либо белковых примесей, в почти чистом виде. Линии гибридомннх клеток практически беоомертны и их можно попользовать для получения антител бесконечно длительное время /Я.Ы.К£пп.е1;Т.З,Л1с,Ке2 п.; 1981 /, Попытки получения монокло-нальных антител против антигенов микробактерий туберкулеза предпринимались как в нашей стране,*так и за рубежом /Т. ЛН.сл.51%щи,¿9X6; Б.Л.Ирин, Е.Я.Смирнова, 1987 /, однако практического Применения в диагностике туберкулеза онч пока не нашли,

Ц&лъ и задачи исследований, Целью исследований является разработка ускоренных Методов выделения и вдентификадия микобактерий туберкулеза бычьего вида иа биологического материала крупного рогатого скота. . ч

Для выполнения б1)ли поставлены следующие Задачи;

1. Газрйботать питательную среду, Позволяющую ускорить выделена микобактерий иэ биологических материалов больных туберкулезом животных,

2. Разработать методику идентификации микобактерий туберкулёза бычьего видй на основе моноклонаяыш*: интител й реакции твердофазного иммуноферментного Анализа.

Научнай люШШа. Влервыб рааработанй плотная питательная . среда, позволяющая сократить срок выделения шкобектйрий туберкулёза вща из биологических материален крупного

рогатого скота до 19 - 20 дней. Вяервпе разработана "отсджэ

цдонтификзшт возбудителя туберкулеза на основе_ моноклоналшяс — ----------

антител в ре^а®ш.иммунофермеят1юго~й1га.тн?а.

Практическая истюптъ. Сокращение сроков исследовали биологического материала от подозреваемых в зарэжетп! туберкулезом ясивотннх позволяет более оперативно организовать противотуберкулезные мероприятия при выявлении туберкулеза и предотвратить необоснованный убой ядорсянх животных п случае исключения диагноза на туберкулез.

Использование моноклснальннх антител для идентификации возбудителя туберкулеза значительно »энигаст .стоимость лрборя-Тогтгт етоЛОдовани#, тяк ках в <й»яип«т<?тм случаев отпадает надбходшосяь в постановке биологических проб на животных.

Результата исследований включены во■ "Временное наставление по применению набора да идентификации микобактерий бычьего вида методом ичмуиоферментного анализа", утвержденное Департаментом ветеринарии 1Ш РФ 20,05,54г.

Аггообаши работы. Материалы диссертационной работы доЛояа-:ш на научной конференции преподавателей ОЕВИ /1908/, на конференции молодых учетах'"ВКЙИБТЙ / 1Б50 /, матлабораторноч зовецанпи БНИК5ТЖ / /.

Публикации. По материалам диссертант! опубликовано пять печатных работ, получено'два авторских свидетельства на изобретение я подана заявка на получение патента.

Обьем а структура диссертации. Диссертация изложена на 113 зтрзшщвх машинописного текста я включает введение, обзор ла-гератури, результаты собственных исследований, заключение, вн-зоды, практические предложения и список литературы. Работа-ил-вострирована 13 таблицами, 15 рисунками. Список используемой титературц включает 148 источников, в т.ч. 21 иностранных.

¡1а. защиту выносится: I.. Питательная среда для ускоренного выращивания макобактарай губеркулеза из биологических материалов крупного рогатого окота. 2, Методика идентификация микобактерий туберкулеза на основе /юноюгонаяышх антител в яммуисфэрментном анализе,

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы иссло,товазия. Настоящая работа выполнена в лаборатории диагностики и микробиологии туберкулеза Всероссийского научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных, часть исследований выполнена в лабораториях иммунологии Московского НИИ туберкулеза Р® / д.м.н. М,А. Владимирский, к.б.н. Ы.В. Андросова / и олектронной микроско пип ВНИИ биологической промышленности г. Москва /к.в.н, Б.Е. Кле-хермак/.

Для исследований использовали биологический материал / лим£а-гичеокие узлы, кусочки легкого, печени, селезенки / от 15? голов крупного рогатого скота, 10 кроликов, о морских свн-яок, а также культуры микобактерий музейных штаммов: ,¿¿/

U/. fon'i А-К-е,; JJ. Uff Мj dS-Wu^n-^ JJ. /*ki

}ni^ajuíl¿dAjicL¿, ц культур« полевых штаммов микобактерий бычьего вида и атипичных микобактерий*

Посевы проводили на средах Левэнштейна-Йенсена / производство Тюменского 1ШКТИ / и Гельберга, В состав указанных оред вводили ряд предельных углеводородов и изучали их влияние на - скорость роста музейных и полевых культур микобактерий бычьего вида. За посевами.наблюдали ежедневно, обмечая появление первичного-роста и его иптекривность. Результаты оценивали по следу-» fcuiew схеме: Ó - нет роста; 1 - единичная пылевидная коловши 2 - до Б мелках или единичная, крупная /1-2 мм/; 3 - от 10 до 20 мелких дай одна крупная /2 - 5 ы/\ 4 - До SO мелких колоний ийя несколько крупных /более 5 мм/; б - сплошной рост»

Вадовач принадлежность ьоделенных культур мйкббйктерий во всех случаях устанавливалась или контролировалась путем по-Майовкй биопроба на лабораторных »шотмх.

йлектронно-мгасроскопичйскив исследования гшобактериальных меток в Динамике et poofa на питательных средах прободали путем Изучения интактиых препаратов й ультратонких срезов на электронном микроскопе ÜfcM ~ИЮЧ> / оЧпония У при ускоряющем напряжем» 60 кВ и aneptypftotf диафрагме ¿0 мкм, Дав исследований исподьэсвшм культуры М, бовис, выращенные йа вкоперименталь-- но? и öiceKBtaptfHofl ерёдах. .

Для постановки ИМ использовали стандартной оборудование и реактивы /гигтстеты пол?стироловме, спектрофотометр "Диагност"

для определения^оптической плотности, пипеточные дозаторы,-бу------------------------

"форнйё растворы, антитела против иммуноглобулинов мыши, 'Ученные пероксидазой хрена, моноклонатагше антитела.

Б качестве положительного контроля использовали культуру М. ¿>ошл пт. 8, отригаталышп контролем служили атипичные мя-кобактерии или Ул.±и£с.-гси£о^с^

Всего 'методом №!>А было изучено 180 культур мякобактерий /музейных и выделенных от больных животных/.

.Цифровые данные обрабатывали методом математической статистики о использованием таблицы Стыодента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Влияние смеси Н-алканов на рост микобактегшй. На первом стане мы изучали-влияние смеси предельных углеводородов на рост музейных и полевых культур мякобактерий бычьего вида на средах Леэенштейна-Иенсена и Гельберга. Смесь включала в. себя следующие углеводороды: увдекан, лодекая, тридекан, пентадекан, гек-садекан. Их смешивали в равных частях и после автоклавирования прибавляли к яичным питательным средам в дозе 0,2 мл на пробирку в двух вариантах: непосредственно перед посевом и .за сутки до посева. Контролем служили пти же среды без углеводородов. За посевами наблюдали ежедневно до появления первичного роста, а затем каждые 7 дней,

На таблице 1 представлены результат!! проведенных исследований. В ходе наблюдений за ростом музейных культур установлено, что смесь углеводородов сокращает сроки появления первичного роста на 2 - 3 дня по сравнения с контролем. Причем, на ербде Левенштейна-Йексенй С углеводорода™ отвечали более ранний рост /на 11 день/, чем пз контрольной /на 14 день/.

Половые культуры лучше развивались на среде Гельберга п добавление углеводородов вызывало значительной сокращение сроков появления первичного роста. На испытуемых средах рост 1 начинался на 21 день, на' контрольных в 1,5 раза позднее, на 33 день.

Наряду с оок.рапеняо.м сроков роста на средах с углеводородами происходэдо интенсивное накопление бакмассы. Через 3-4

. Таблица I

Етаянпа смеси углеводородов на рост лузейннх д полевых культур М- боЕИС на яичных питательных средах

Питательная среда '. Срока появления первичного роста ( дни ) . Интенвивность накопления бакмассы ( баллы ) : н е я е я ж

: М+м . : Р í I 2 3 4 5

МУЗЕЙНАЯ КУЛЬТУРА Гатаберга 1. контрольная 16,6+0,9 2. ислнауемая 13,8+1,1 <■0,05 1Д 3,1 1,9 3,9 2,4 4,9 2,9 5,0 3,2

Левенштейна-Йоясана •

•I. контрольная 14,4±0,5 2. гспшуемая П,1+0,9 ев - НОЯЕВЕЕ КУЛЬТУРЫ -£0,05 2,1 3,9 3,2 - 4,9 3,8 5,0 4.1 4,9

Гельберга

I» контрольная 2. испытуемая 33,6±Р,5 а ,6+0,9 <0,05 . 1.2 зд 1.5 4,2 1.9 4,8 2,1 5,0 2,В

ЛзЕзнатейна - Йзнсена

1. контрольная . 2. левытувшя 36,1*1,0 24,4±1,5 <0,05 1.1 2,6 1.5 3,2 2,6 3,8 ЗД 4,1 зд 4,1

недели культивирования интенсивность опеяивалэсь в 4-5 баллов, ка контрольных средах в эти сроки интенсивность, не превышала

2-3 баллов. ___ _ ;__■-------------------------------------------

Таким образом бня подтвержден 'Такт ускоренна роста тасо-бактерий туберкулеза бычьего ввда на плотных яичнпх питательных ■ средах, наиболее значительно это влияет на ускорение роста долевых культур.

Изучение влияния различных углеводородов на рос? музейных я полевых кульууп микобактерий. Для выяснения, какие углеводороды являются наиболее эг'Шктквными стимуляторами роста микобактерий, было решено исследовать отдельно взятие углеводороды о различным угледоднш числом: ундекан 0-И, тетрадекан С-14. гекса-декан С-16. КауднА из указанных углеводородов добавляли к пита-тельнш средам Левансттейна-Йонсена и Гельберга в разных дозах : ПО 0,1; 0,2; 0,4 «я на пробирку. В результате било установлено, что наиболее аффективной является доза 0,2 мл.

В таблице 2 представлены результаты влияний исследуемых углеводородов на рост музейных и полевых культур микобактерий туберкулеза бычьего вид.а4 ~

При добавлении к среде- Гельберга тетрадеканв рост музейных культур появился на 12,1± 1,8 день, при добавлении гексадэ-кзна на 10,5±1,1 день. На среде Левенштейна-йенсена эти сроки еще короче: на 1С,5±0,5 tt 9,8±1,0.дни соответственно. В то яе вре.м!я на среде с ундеканом рост микобактерий- не наблюдался в течение всего срока наблюдения.

При изучении влияния »тих углеводородов на полевые культуры установлено, что на среде Гельберга с тетпадекаиом реет появился на 16,2±0,-S день, э на среде с гексадеканоч на 15,8±0,8 день, что примерно в.1,5 раза ранние, чем на контроле. С этими йй углеводородами на среде Левенштейна-Йеисена рост полевых культур микобактерий появлялся на 18,1±0,9 - l«,f>iO,& дни. При добавлении уццекана рост микобактерий также не наблюдался.

Обращает на себя внимание, «о вод влиянием углеводородов усиливается интенсивность роста микобактерий, особенно на яре-де Гельбеога, от 3,6 до 5,0 баллов, при 2 - 4 баллах на itöR*p<vte.

9

Таблица 2

Влияние углеводородов но рост цузейшк и полевих культур и. бошо

Нитаг&льная среда

Срока появления первичного 'Интенсивность накопления

5

роста ( да )

бакыассы ( баллы ) к о д е л и

$— : Ц + м 1 Р I 1 2 3 4 5

М У 3 В ¿1 Н Ы Б КУЛЬ • ТУРЫ

Гельберга

Контроль 1Ь,3+1,5 ** • 2,4 3,7 4,0 4,0 4,0

1'идекан - -

'Гсградекан 12,1+1,8 <0,05 4,В 6,0

Гекоадаквн 10,6+1,1 <0,05 3,7 4,9 5,0

свеиштайиа-йеясеиа

Контроль 15,5^0,7 2,6 3,4 3,7 4,0 4,0

Ундекаа . - -

Тетраддкаы 10,5^0,5 ¿0,05 3,9 4,7 5,0

ГоНсодекш ■ 9,6*1,0 <0,05 3,5 4,В 5,0

П 0 Л Е В Ы £ К У £ Ь Т У р и

Гельбэрга

Коп трема 27,310.8 1,1 1,6 2,1 2,4 2,4

Ундокаи . , -

ТоТргЗДвКЕН 16,2+0,9 ' л0,05 3,6 4,8 5,0

Гексадокан к.в^.е <0,05 3,7 4,6 5,0

¡йёяштвйна - ¿¡вноена

Контроль 30,5+1,2 - 1,0 1,6 1,6 2,1 2,1

1'идокан - ы

Тетрйдекан 19,6*0,9 «0,05 3,2 3,0 4,5 5,0

Гпксвдэкая 16,140,9 <0,05 3,8 4,1 4,6 5,0

II:r::го влп/тштя .углорсдопод.ов о;'

йкобактернй туберкулеза ::з б:гологдпеского-^тяпяялр, i!<vio-------------------------

ятодошо результата уклзяшшт пселсдокш::;* no'Viy.-ct-fit on»--, v для изучения влияния тотррдекана к ги:садшздш poos хуль-УГ """'сбгктг,~*.гй туберкулеза при видедомип из ¿полог зчсллго -лорчала у;.вот>1чт, заражениях мпкобакт^рi; Cwaoro ьши'.

При посеве оиоматеризла от г-ооолаг: пячнок и »pfl.nwo? ¡•••••'«.•к. о/ п-.'/олое раннее нояктен ff. з»>очч-п.г к«-;» от -сяп сред« Г«по>'*рга с : ь ».«сдал hi.

3,lil,G день, с /готрадеканом чуть позднее, на 23,8^,3 - ¡¿5.2-

in, т.е. примерно в 2 раза позднее, а момент появления першч-зго роста в контроле на среде Гельберга с гексаденсном пнтен-iHHocTb накопления бактериальной массн оценивалась а 4,9 баяла.

На основании этих данных ореда Гельберга с гоксадеканом uia избрана как оптимальный вариант для дальнейшего испытания з бно,материале от крупного рогатого скота.

На таблице 4 представлены результаты. Наследования прове>:::; ка биоматориалс от 26 голой кпиг.ипт wru^™ ei'.c-s. v.cnr::-¡sassmx на туберкулин, j кглори? кч ьскрктяк уагг.'.гаъг.сж »-y.v-T<-

(Л*>№.Л ЛОрЯЯГвКИЛ ЛИ'»." >ТИЧевКЯХ S4SOS .4 7Г.НС!!», >'•

г :2 Т'},"ОЕг pr-nrupofrfiKTWr на ТуОб|12фЛГ.£, ,V 1Ю70ГЖ ГфЯ ¡4 туёеряулеэтй: поражений re

гя епеда о reKcaserw»« poo? мжебади'тяй чт» ¡!гс»"П7&ггя--1 о тусеркулозкши першениями устият?"1 уте з;?. дча>,

> сред«» с тстраде/аном на 24,1 Л),4 , я го ¡время кяк на коде« vmios'l сродо 5&з углеводородов на 43,3il,4 дел.:,, т.p. t 2 репа )зднве. »¡менсивнооть роста культур микобакторий на испитуе-а орвпях к ято^у «ог»вч»» девтяуа?® 3,3 « А,*? ?гл„~п..

Пря исследовании бяомтсрааяов без зацепе "губерлуяозкяя культура мж&дехгьрий были выделены в ¿-х случаях. < среде с гексадйкадам рост появился на 20,5ii,l день, о тетра-жаном - на 22,iii,d день, на контрольной сродй без углоаодо-ljto» "я 4Я 5il j0 »«и а 2 zsztp's., ImTp^ns^octk >«т« но пепитуо/их средах и в йтсм случае бнм - 4,0 балла. 1ЬУЧ^И:10 лухыдаотруутурн щ МОРЮЛОШ* *!. бота в,

> кэлмкниромпвд щ щщц г^царта о- говсстг>гапоу.

таблица 3

Выделение шкобактариЗ туберкулеза из биологического материала ох лабораториях животных

Питательная среда

I

I Сроки появления первичного

! роста ( дад )_

I п ! Ыш

I

I Интенсивное?* I накопления бакмассы *1 ( баллы )

А; Еиоматериак

1, Гельберга

контроль + тетрадакак + гексадвкан

2, Лаввкштейна -Ионовна -

контроль + тетрадвкан + гвксадэкан

Б. Биоматериал о»

1. Гельберга '

к онтроль + твтрадэкен + гокоадакан

2, Леввнштвйаа -йенсваа ■ .

контроль + терадокая + гексадвкан

от мороких овинок

12 12 12

12 12 12

41.7+1.1 25,2+0,3 19,1+1,0

46,3+1,7 27,0+1,3 26,6+1,2

кроликов

24 24 24

24 24 24

40,5+1,5 23,8+1.3 19,6+0,4

39,3+1,0 25,8+1,3 19,1+0,5

<0,05 <0,05

<0,05 «0,05

<0,05 <0,05

«0,05 <■0,05

1.0

4,1'

4,9

1.0 3,5 4,0

1.0 4,2 4,9

1.0

3.1 4Д

Наделение шяобакторзй туберкулёза на среде Гельберга с углеводородами из биоматериала' ог крупного рогатого скота

таблица 4

Питательная среда

Количество проб

басштсриала

ПолоЕательнке пробы

Появление -первичного роста

!

I кол-во !

!

ттттг

±

Интенсивность накопления бакмассн ( баллы )

А. Биодатерпад с туберкуайзшллг: изменениям! Гельберга

контроль 25 24

+ ТЭТрадекан 26 25

+ гаксадакак 26 25

л

Б» Биоматзрзал баз видимее туборнулёзнш: изменений Гельберга

контроль 12 . 2

+ тетрадекан 12 2

+ Гвксадекая 12 2

92*3 96 Д 96 Д

16.6

16.5

16.6

43,3+1,4 24,1+0,4 20,5+0,4

42,5+1,0 22,1±1,3 20,5+1,1

: 0,001 -0,001

- 0,001 .0,001

1,0 3,3

4,7

1,0 3,9 4,0

Представляло интерес изучить, особенности морфологии и анатомии мик^обактериальных клеток в связи с ускорением их роста на питательных средах о углеводородами. С этой целью мы провели электронно-микроскопическое исследование культур микобактерий на 7; 14; 30-й дни после появления первичного роста на испн- ; туемой среде и на 30-й день после появления роста на контрольной среде без углеводородов. ' ,

В результате нами установлено, что 'уже к 7-14 дням после появления первичного роста на испытуемой среде культура ми-кобактерий содержит большинство морфологически и анатомически полноценных клеток. На контрольной ореде без углеводородов аналогичная картина наблюдалась лишь к 30 даю культивирования. К этому сроку в культуре на испытуемой среде мы наблюдаем дегенеративные изменения в цитоплазме и деструкцию клеточной стенки у большинства клеток.

Таким образом, использование углеводородов тетрадекана и гексадекана о яичной питательной средой Гельберга позволило значительно сократить сроки выделения первичных полевых культур и значительно уоилить интенсивность их роста.

В дальнейшем проводилось систематическое использование ореды Гельберга с углеводородами при исследовании биоматериала от крупного рогатого скота, реагировавшего на туберкулин. Всего было исследовано 157 проб биоматериалов и выделено 90 культур микобактерий туберкулеза бычьего вида. . .

Разработка методики идентификации микобактерий. выделенных из биоматериалов животных на основе мо'нокяональннх антител в лммуночБерментном анализе* Для идентификация микобактерий туберкулеза бычьедЪ вида нами, совместно с МД. Владимирским и М.В. Авдросовой /г. Москва/, проведены исследования по изысканию гибрвдомных лини», способных продуцировать соответствующие моноклональные антитела.

В результате были отобраны две гибрвдовдше линии, проду-цируюшие моноклональные антитела против М. бовис БЦЖ /2А5/ и против В. бовис /2А1/, которые были испытаны с музейными и полевыми культурами микобактерий, всего было исследовано 180 культур.

Для проведения идентификаций нами отрабатывалась методика 14

йммуно^ерментного анализа, lia первом этапе исследований был разработан режим-инактивации бактерчальной массы испытуемых ___ культур микобактерий, который обеспечивает сохранение антигенных свойств. С этой целью использовали хлороформ. Затем били отработаны а оптимизированы компоненты реакции ИФА /количество бакмассы для отрицательного и положительного контроле^ и испытуемых образцов суспензировали 1 мг/мл; моноклонаяьные антитела разводили из расчета 5 мкг на лунку; в качество конь-'югата использовали антитела против иммуноглобулинов шеи, меченные пероксидааой в рабочем титре 1:1000/ и разработана схема ее постановки /табл. 5/.

Таблица б Схема иммуноферментного анализа для идентификации микобактерий

Этапы исследования

Режим исследования: Отмывание

1. Инкубания 1-2 колоний

микобактерий о хлороформом 4 часа, 22 О

2. Приготовление гомогенной бактериальной суспензия и стандартизация но мутности

3. Обработка планшета поли-Л-

лизином 0,5 часа, 22 С

4. Сенсибилизация планшета анализируемыми суспензиям! и контрольными образцами 2 часа, 37 С

5. Блокирование неспецифического связывания 10 % раотвором яичного белка в ФСБ 1 чао, 22 С

6. Инкубация о моноклональ-ными антителами 1

7. Инкубация о коньгага*ом 1 б. Внебеняе субстратной смееи 5 9. Остановка ряакцин 505?

серной кьслотой

чао» 37 О чао, 37 О

MtfHj 22 С

Водопроводная вода-Зраза и водопроводная вода о С ,05$ твтш "20 - i мий. »•йов повторить трехкратно

Вначале методику ИМ отрабатывали с но но кло налышмл антителами 2А5, полученными против М. бовис ЕЦ£. В качестве испытуемых были взяты культуры, выделенные от больных туберкулезом лвдей / 3 / и тавотных / 11 /, а также культура, выделенная с места прививки ЕЦЕ. Результаты им му но фер мен т но го анализа представлены в таблице 6.

Таблица 6

Идентификация шкобактеряй ыоноклональ -нш.ш антителами 2А5 и 2AI б реакция ISA

Шташы 'Показатель омической плотности Мш

михобакторяй . ьзоноклоналышо антитела

: 2А5 (к М.боаисБЦй ): 2Л1 (к М.бовис)

М. бовис БЦ£ М. бовис шт. 8 ц; Ьи&смм&з^Ь Нь + Иг

Культуры М,: бовис от больных коров . Культуры М, ЬЖши&>и1 от больных ледой Культуры М, бовис от лабораторных животных Культура, выделенная о места прививки БЦ2

0,81+0,01 -

0,44t0,0X 0,96+0,01

0,03+р,02 0,05+0,01

0,00 0,93+0,03

0,00 0,06+0,02

О.Ш 0,85+0,02

0,75¿0,02

Моноклональные антитела 2А5 активно взаимодействовали о вакцинным штаммом БЦЖ / оптическая плотность 0,81 / и с культурой, выделенной о места прививки / оптическая нлотиооть 0,75 /. ГЪраздо слабее они реагировали ó культурой музейного штамма М М, бовио - оптическая плотность вдвое ниже / 0,44 / и практически но реагировала о музейной культурой человеческого вида и культурами микобактерий, выделенными от больных лвдей а животных. .

В дальнейшем были получены клоны гибридомннх клеток,

продуцирующие моноклональные антитела против М. бовио, и так как они значительно отличались.друг от друга по специфичности, из них был выбран клон 2А1, продуцирующий монюиональные" эи-титела, преимущественно реагирующие с микобактериями бычьего я не вступавшие в реакцию с микобактвриями человеческого вида и атипичными микобактериями. В качестве положительного контроля в реакцию была взята культура М. бовио шт. 8, отрицательного - М. "и'Лк/'&'/Л'цЦ ( >у Всего- исследовано 70 культур Ы. бовио, выделенных от крупного рогатого скота, 7 культур М, бовио от лабораторных животных и 12 культур, выделенных от людей, больных туберкулезом / табл. 6 /.

В результате било установлено, что все культуры, выделенные от крупного рогатого скота и лабораторных животных, положительно реагировали о моноклональными антителами 2А1, оптическая плотность 0,93 - 0,85 ад. и отнесены к М, бовио. Музейные культуры шкобактерий человеческого вида и культуры, выделенные от больных людей,о моноклональными антителами 2А1 не реагировали.

Таким обраэом, культуры М. бовис, выделенные после ускоренного выращивания на средах о углеводородами, а также культура ЩН могут быть о высокой специфичностью идентифицированы моноклоньльнымп антителами в реакции иммуноферментного анализа.

11а основе этих результатов бйла разработана иммунофермен-тная тест-система для идентификации мякобактерий бычьего вида и проведено ее комиссионное испытание в Государственном НИИ контроля стандартизация и сертификации ветеринарных препаратов. Департамент ветеринарии МСХП РФ рекомендовал тест-систему для широкого производственного' испытания.

ВЫВОДЫ

1. Предельные углеводороды оказывают стимулирующее действие па рост микобактерий туберкулеза бычьего вида на яичных питательных средах. Йод их воздействием жизненный цдал тко*° бактерий сокращается: черед 7-15 дней после появления йор-вичного роста наблюдаем максимальное количество ьюрфологически л анатомически полноценных клеток.

2. Добавление предельных углеводородов с длинной углеродной

цепью к яичной питательной среде Гельберга позволяет получить первичный рост микобактерий туберкулеза бычьего вида из биологических материалов животных на 19-20 день шале посева^

3. Предельные углеводороды с длинной углеродной цепью слсссбствуют значительному увеличению интенсивности роста и накоплению бактериальной маосы на яичных питательных средах. К 15-20 дню после появления первичного роста интенсивность наквп> ления бактериальной массы оценивается 3,8 - 5,0 баллов, в то время как на стандартных яичных питательных средах накопление бактериальной массы не превышает 1,5-2,0 баллов.

.4. Получены клоны гибрвдомных клеток, продуцирующих мо-ноклональнне антитела, специфически реагирующие с микобактери-ямя туберкулеза бычьего вида и микобактериями вакцинного атамма БЦЕ.

5. Разработана йммуноферментная тест-сиотема на основе шноклональных антител, позволяющая проводить идентификацию выделенных культур микобактерий туберкулеза бычьего вида.

6. Комплексное применение питательной среды Гельберга

о добавлением предельных углеводородов для ускоренного выращивания микобактерий туберкулеза из биоматериалов животных к тест-система иммувоферментного' анализа на основе моноклональ-ннзе антител позволяет сократить сроки лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого окота до 20-25 дней. •

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРВДГОКЕНИЯ'

1. Для лабораторной диагностики туберкулеза использовать яичнув питательную'среду с добавлением предельного углеводорода о целью ускоренного ввдеяения возбудителя туберкулеза бычьего вида из биологических материалов крупного рогатого скота.

2, Временное наотавление по применению набора реагентов для идентификации »шкобактерий туберкулеза бычьего вида метолом иммуноферчентного анализа.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ильиных Л.А.. Сравнительное изучение модификаций яичной питательной среды для выделения и культивирования микобаяте-рий туберкулеза // Сб. науч. тр. ВНШБТЬ - Новосибирск,

1390. - С. 4Ь~4Й.

2. И.№'нгог Л.Л. Ускоренный способ бактериологической диагностики туберкулеза // Сб. науч. тр. /-РАСШ СО. ШЭДЬТл -Новосибирск, 1ЕС1. - С. 30-34.

3. Андросова М.В., Владимирский М.А., Илг.инте Л.А. и др. Штамм гибрэдомных культивируемых клеток животных ^¿¿^ использусмкх для получения моноклональных антител к

£1£Ж // Авторское свидетельство на изобретение № 1445183 от 15.08.88г.

4. Ходун Л.М., Ильиных Л.А., Погуляева Л.В. и др. Моно-клональнне антитела для идентификации микобактерий туберкулеза у животных // Сб. науч.' тр. / РАСХН СО. ВНИИБТЖ - Новосибирск, 1992. - С. 12-15.

5. Ильиных Л.А. Иммунологический метод идентификации микобактерий туберкулеза // Сб. науч. тр. / РАСХН СО, ВНШВТЖ, Новосибирск, 1992. - С. 63-65,

6. Адаросова М.В., Владимирский М.А., Ильиных Л.А. и др. Штамм гибридных культивируемых клеток животныхЛ1иаМизеи1и$ продуцент моноклональных антител к <Л1- Зомл

П Авторское свидетельство на изобретение ,'5 1742326 от 22.02.92г.

7. Ходун Л.М., Погуляева'Л.В., Овсянов 15.11., Ильиных Л.А.

Я др. Выделение атипичных микобактерий от животных благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйств // Сб. науч. тр. ВАЗХНИД, ВНИИБТЖ - Новосибирск, 1990. - С. 124-132.