Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Получение и характеристика моноклональных антител против активационных антигенов лимфоцитов человека

г- .

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР им. Е Е Блохина

На правах рукописи УДК 616-003. 446-09?

ПАЛКИНА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ АКТИВАЦИОННЫХ АНТИГЕНОВ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995 г.

Работа выполнена в лаборатории экспериментальной диагностики опухолей (руководитель - доктор медицинских наук, профессор А. Ю. Барышников) Онкологического научного центра им. ЕЕБдохина (директор - академик РАМН Е Е Трапезников)

Научный руководитель - доктор мед. наук, профессор А. Ю. Барышников

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Е Е Гупицин

доктор биологических наук, профессор Л. А. Локшина

Ведущее учреждение - Научно-исследовательский институт

онкологии имени П. А. Герцена МЗ России г. Москва

Защита еостоитсяХ/"^' 1995 г. на заседании специализированного Ученого Совета (К 001.17.01) Онкологического научного центра РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24)

С диссертацией южно ознакомиться в библиотеке Онкологического научного центра РАМН

Автореферат разослан/^"//" 1995

Ученый секретарь специализированного Ученого Совета доктор медицинских наук, профессор В. С. Турусов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Иммунная система организма играет решающую роль в противоопухолевой защите организма С Г. И. Абе-лев., 1982 ; Г. И. Дейчман и др. ,1983]. Оценка состояния иммунной системы у человека стала возможной с 1972 г. когда G. Jondall обнарушл специфический маркер Т-лимфоцитов - рецептор для эритроцитов барана. Этот рецептор определялся методом Е-розеткообразования. В-лимфоциты человека определяли по экспрессии поверхностью Ig. Обнаружение рецептора для эритроцитов барана открыло новое направление в иммунологии - оценка иммунологического статуса. В течении десятилетнего периода проводились исследования иммунной системы у онкологических больных, показавшие снижение иммунного ответа у больных, коррелирующее с тяжестью заболевания [ Кадагидзе 3. Г. и др., 1979; Барышников А.Ю. и др., 19893. Оценка иммунного статуса также использовалась для мониторинга проводимой иммунокоррекции СКупин В. И. и др. , 1990 ; Трапезников НЕ и др. , 1978 ].

Революционный переворот в клинической иммунологии произвела биотехнология, в частности гибридомная технология. С помощью методов гибридомной технологии, предложенной в 1975 г. ныне Нобелевскими лауреатами Koller и Meistein, можно производить моноклональные антитела (ША), которые по своей надежности не уступают чистейшим химическим реагентам [Абелев Г. И., 1982]. Исследования по гибридомной технологии развивались очень бурно и за полтора десятилетия разработано большое количество МКА против различных дифференцировочных и опухолеассо-циированных антигенов. МКА против некоторых групп антигенов исследованы международным сообществом ученых и они объеденены

б группы сцепления, так называемые кластеры дифференцировки. Хорошо изучены МКА против дифференцировочных антигенов гемопо-этических клеток человека, которые используют для иммунофено-типирования лейкозных клеток. Эти МКА и антигены включены на международных рабочих совещаниях в кластеры дифференцировки CD. Создание кластеров дифференцировки помогло лучше ориентироваться в многообразии МКА против дифференцировочных антигенов.

В России работы по получению МКА против опухолеассоцииро-ванных антигенов были начаты в конце 70-х годов сотрудниками Онкологического научного центра РАЖ За короткий срок были получены МКА против альфафетопротеина, раковоэмбрионального антигена, различных лейкозоассоциированных антигенов. Полученная панель МКА постоянно пополняется новыми МКА, разрабатываемыми в различных учревдениях страны.

Исследования по получению МКА против специфических антигенов Т-лимфоцитов и субпопуляций Т-клеток начаты в России лишь в конце 80-х годов. Были получены МКА против обще-Т-клеточных антигенов CD5, CD7, CD2, CD4 антигенов Т-хелперов и CD8 Г-суп-рессоров [Барышников А. Ю. и др., 1988, 1989; Филатов А. В. и др., 1988, 1989].

Важным показателем состояния иммунной системы является определение активированных лимфоцитов. Это также возможно сделать с помощью МКА, т. к. на поверхности активированных клеток появляются рецепторы к интерлейкинам, трасферрину, факторам роста и г. д. В связи с этим актуальным является получение МКА к активационным антигенам.

Диссертационная работа выполнена в рамках темы ГКНТ.

Целью настоящей диссертационной работы было получение и характеристика МКА против акгивационных антигенов CD71 и CD25.

В соотвествии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Провести отбор МКА к антигенам CD25 и CD71.

2. Определить молекулярную массу антигенов.

3. Определить экспрессию антигенов на различных клетках крови и перевиваемых клеточных линиях.

4. Провести сравнительное изучение полученных МКА и их известных аналагов.

5. Исследовать МКА в функциональных гестах.

6. Оценить возможности применения полученных МКА в онкологической практике.

Научная новизна.

Впервые в России получены и охарактеризованы МКА против рецептора интерлейкина-2 (антиген CD25), экспрессированного на активированных интерлейкин-2-зависимых клетках. МКА выявляют новый эпитоп антигена CD25, Показано, что МКА ICO-105 не отличаются по своей реактивности от зарубежных аналогов, однако в большей степени блокируют связывание с рецептором интерлейкина -2, чем другие МКА. МКА иммунопрещгаитируют антиген с молекулярной массой 55 ООО дальтон. МКА ICO-105 блокируют пролиферацию интерлейкин-2-зависимых клонов, а также реакцию бластрансформации лимфоцитов на ФГА.

Получены МКА ICO-92 против антигена CD71 (рецептор трансферрина). МКА IC0-92 иммунопреципитируют антиген с молекулярной массой 95 ООО дальтон. МКА реагируют с активированными лимфоцитами и не взаимодействуют с другими типами клеток.

- 6 -

Научно-практическое значение:

В результате проделанной работы создана панель отечественных МКА, позволяющая оценивать состояние иммунной системы организма человека. Охарактеризованные МКА переданы для промышленного выпуска в Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ PCíCP и в ЕПЦ "МедБиоСпектр". Выпускаемые этими предприятими МКА ICO-105 и IC0-92 широко используются в различных научных и клинических учреждениях СНГ. Создание и внедрение в практику МКА позволило отказаться от закупки дорогостоящих импортных аналагов, что имеет огромное экономическое значение.

Апробация работы: полученные результаты доложены на II Всероссийской конференции по'направлению "Генная и клеточная инженерия" , г. Пущино-на-Оке ,1992 г., и на III Всероссийской конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия ", г. Москва , 1993 г. Апробация диссертации состоялась на объединенной конференции лаборатории экспериментальной диагностики опухолей , лаборатории по созданию нетоксичных иммуномодулято-ров НИИ ЗДиТО ОНЦ РАМН , клинико-радиоиммунологической лабора-' тории НЖ КО ОНЦ РАМН 7 апреля 1995 года.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация изложена на 110 стр. машинописного текста Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 3 глав собственных исследований, обсуждения, выводов. Библиографический указатель включает 111 источников литературы. Диссертация иллюстрирована таблицами и рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и Методы. Моноклональные антитела. Для характеристики полученных МКА бы-

ла использована панель МКА зарубежного производства : коммерческие МКА фирмы "Becton Dickinson", МКА , полученные с 5 Международного рабочего совещания по дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека.

Непрямая реакция поверхностной иммунофлуоресценции. 500 ООО клеток инкубировали с 20 или 100 мкл МКА в течении 30 мин. при 20 С, после чего клетки отмывали средой IFA. Затем клетки инкубировали с 20 мкл F(ab)2 фрагментов или изотип-специфичес-кой сыворотки, коньюгированной с FITC или РЕ, 30 мин. при 4 С .затем отмывали двазды средой IFA и ресуспендировали в физиологическом растворе, содержащем 1% формалина

Реакция двойного мечения клеток. Реакцию двойного мечения проводили в три или четыре этапа. Постановка трехэтапной реакции: 500 ООО клеток сначала икубировались с МКА . После 30-минутной инкубации и двух отмывок средой 1FA к клеткам добавляли изотип -специфическую сыворотку, коньюгированную с FITC или РЕ. Затем после ЗО-минутной инкубации и двух отмывок средой IFA на третьем этапе клетки окрашивались МКА, меченными FITC или РЕ. Постановка четырехэтапной реакции двойного мечения клеток, реакцию проводили аналогично трехэтапной с добавлением четвертого этапа , который представлял собой инкубацию со второй изотип-специфической сывороткой.

Конкурентная ингибиция связывания МКА. В экспериментах по блокаде связывания с клетками МКА клетки преобрабатывали насыщающей концентрацией МКА , а затем после инкубации и двух отмывок к клеткам добавляли меченные FITC или РЕ МКА. Контрольные клетки до добавления меченых МКА ничем не обрабатывались. Проточно-цитометрический анализ. Экспрессию антигенов на клетках учитывали на проточном цитофлуориметре FACScan (Becton

Dickinson). Анализ реакции проводили с исполбзованием гейтов "лимфоцитов", " гранулоцитов", "моноцитов", "тромбоцитов" на основании комбинации светорассеяния и размера клеток.

Программное обеспечение. Анализ данных, полученных с помощью проточного цитофлуориметра FACScan, проводился с использованием программ "FACScan". Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы " Stats". Рисунки выполнены с помощью программы "Boeing graph".

В работе были использованы клетки крови здоровых доноров , полученные из отделения переливания крови ОНЦ РАМЕ При характеристике МКА использовали образцы крови гематологических больных, находившихся на лечении в отделении гематологии ГНЦ РАЖ

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Моноклональные антитела ICO SZ против рецептора трансферрина. (антиген CD71)

Гибридомную линию клеток получили при слиянии спленоцитов мышей линии BALB/c, 3-х кратно иммунизированных активированными фитогемагглютинином (ФГА) лимфоцитами периферической крови здоровых доноров, с клетками шеломы линии NS1. Скрининг продуцирующих гибридом проводили в непрямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции на лимфоцитах, активированных ФГА. После двукратного клонирования получили гибридому, стабильно продуцирующую МКА IgSl изотипа, названные IC0-92.

На первом этапе характеристики МКА IC0-92 сравнивали гистограммы интенсивности флюоресценции различных клеток, окра-

шенных МКА ICO-92 и МКА к различным антигенам кластеров CD. Было обнаружено, что МКА ¡CO-92 по образцам реактивности были похожи на МКА против антигена CD71. При дальнейшей характеристике МКА ICO-92 в качестве контроля использовали МКА против антигена CD71.

МКА ICO-92 реагировали с активированными лимфоцитами и не связывались с покоящимися клетками крови. МКА ICO-92 реагируют с клетками всех тестированных Т-клеточных линий, некоторых B-клеточных линий и не взаимодействуют с клетками других типов клеточных линий (Табл. 1, 2). Сравнение образцов реактивности МКА IC0-92 с МКА BA120g и CY1G4 против антигена CD71 выявило похожие, но не идентичные образцы реактивности

Таблица 1

Реактивность MKAIC0-92 и BA120g с клетками периферической крови здоровых доноров

Клетки Количество Количество МКА

положительных тестированных IC0-92 BA120g' случаев случаев

Лимфоциты 10 Активированные 5 лимфоциты Моноциты 10

Гранулоциты 10

10 5

10 10

62* О О

67 О О

О

о

Таблица 2

Реактивность МКА 1С0-92 с перевиваемыми клеточными линиями

Клетки Характеристика линии клеток МКА: 1С0-92 ВА120е

НРВа11 Т-клеточная 64,2* 16,0

УТ Т-клеточная 75 49,3

УТ2С Т-клеточная 38,2 н. т. **

Мо1Ь-4 Т-клеточная 50,8 н. т.

JFP В-клеточная 39,0 н. т.

Л В-клеточная 34,4 11,7

БаисН В-клеточная 0 0

В-клеточная 21,9 13,3

К562 Эритробластоидная 0 0

НЬ-60 Шелоидная 0 0

1)937 Монобластоидная 0 0

Примечание: * - процент антигенполокительных клеток,

** - не тестировали

МКА 100-92 также реагировали с тимоцитами детей, выявляя около 26 % антигенполоштельных клеток. Нами было проведено исследование зависимости экспрессии антигена, выявляемого МКА 100-92, от степени дифференцировки тимоцитов. Изучались тимо-циты эмбрионов 17 - 25-недельных плодов и детей . Однако, не было выявлено изменений в проценте антигенположительных клеток.

МКА 100-92 реагируют также с 1Ь-2-зависимыми клонами

Т-клеток. Процент антигенпсложительных клеток был невысокий и не зависел от иммунологического фенотипа клеток. Инкубация этих клеток без 11-2 приводила к снижению экспрессии рецептора транеферрина.

Методом радиоиммунопреципитации показали, что МКА 1С0-92 преципитируют из лизата клеток НРВаИ, меченных 125 I, одну полосу белка с молекулярной массой 95 ООО дальтон.

Изучение МКА 100-92 методом двойного окрашивания показало, что МКА 1С0-92 и МКА против рецептора транеферрина (1тшгк*еск) реагируют с одной и той же популяцией клеток среди антигенположительных клеток Т-клеточной линии УТ, ж-кле-точной линии ¡п и активированных в РБТ лимфоцитов (рис.1).

Рисунок 1

и. д .

1 в

^ 4

13"

ГС2

ш*

Нп клеток» ократанних МКА Апи-ТгапзГег-

пп гесерЪог, конъюгированнши с РИС.

^г^гг^^," рас2Р0ДОЛеш'"а клеток, окравенных МКА 1СО-92, конь-игироваикык с феюэрихршнш ^^

~ 1С '

МКА ICO-92 были таюке.исследованы методом конкурентной ингибиции на 3 линиях клеток. Было обнаружено, что преобработка клеток немеченными МКА полностью блокировала присоедиение этих же меченных фикоэритрином (РЕ) или FI1С МКА. Преобработка клеток МКА BAl20g частично блокировала присоединение меченных МКА ICO -92. В 2 из 4 опытов блокада была приблизительно на 50 Z, а в остальных - слабая. Аналогичным образом, МКА IC0-92 блокировали на 50 X связывание МКА BA120g в 2 из 4 опытов, а в остальных - слабо. МКА CY1G4 блокировали связывание МКА BA120g и Anti-Tranct. гее. во всех случаях на 3 линиях клеток. Однако эти МКА полностью блокировали связывание МКА IC0-92 только на клетках линий NK1 и HPBall, а на клетках инии YT - только на 50 Зти различия, мокно объяснить различной плотностью антигена на различных линиях клеток, хотя клетки преобрабатывалиеь избыточным количеством МКА. МКА IC0-92 не блокировали присоединение МКА Anti-Tranct. гес. в 2 из 3 опытов. В одномопыте, когда было слабое связывание МКА Anti-Tranct. гес., МКА IC0-92 полностью блокировали их реакцию. Аналогичные результаты получили при блокаде этих МКА Anti-Tranct. гес. МКА. Таким образом, результаты опытов по конкуретной блокаде показали, что МКА ICO -92, BAI20g и CY1S4 определяют 3 разных эпитопа.

Изучали экспрессию антигена, выявляемого МКА ICO-92, на лимфоцитах периферической крови доноров, активированных ФГА, IL -2, их сочетанием, а также аллоангигенами в смешанной культуре лимфоцитов. Исследование экспрессии антигена, выявляемого МКА ICO-92, на активированных лимфоцитах показало, что антиген максимально зкспрессирован на 3-5 день после начала ативации ФГА или сочетанием ФГА и IL-2 и на 5 - 10 дни после активации IL-2 или ашюантигенаш (Рис.2).

Таблица 3

Ингибиция связывания МКА IC0-92 другими анти-CD?! МКА

Вариант Линия клеток NK1 HPBall YT обработки _

клеток N опыта 1 2 1 2 1 2

NS1+IC092PE - - H. T. - -

IC092+IC092PE + + H. T. + +

BA120g+IC092PE +/- +/- +/- H. T. H. T. +/-

CY1G4+IC092PE + + + H. T. +/- +/-

Tranof. reo. +IC092PE +/- +/- +/- H. T. H. T. +/-

NSl+BA120gPE - - - - - H. T.

IC092+BA120gPE +/- H. T. +/- +/- +/- H. T.

BAI20g+BAl20gPE H. T. + + + H. T.

CY1Q4+BA120gPE + H, T. + + + H. T.

Trancf. reo. +BA120gPE H. T. +/- H. T. H. T. H. T.

NSl+Trancf. reo. F - - - - H. T. H. T.

IC092+Trancf. "rec H. T. - + - H. T. H. T.

BA120g+Trancf. rec. F H. T. - + H. T. H. T. H. T.

CY1G4+Trancf. rec. F H. T. + + + H. T. H. T.

Примечание: - МКА не блокируют, +/- - МКА частично блокируют, ' + - МКА полностью блокируют связывание других МКА.

Рисунок 2

Экспрессия антигена, выявляемого МКА 1СО-92 на лимфоцитах, активированных ФГА, 1Ь-2 или их сочетанием

дни после начала активации

МКА 1С0-92 были затем охарактеризованы на V международном рабочем совещании по дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека (Бостон, США, ■ 1993 г.). Они были включены в Слепую активационную панель. Все МКА незначительно различались мевду собой по образцам реактивности. Однако компьютерный анализ объединил все эти МКА в кластер 0071.

Таким образом, наши собственные и международные результаты исследований показали, что МКА 1С0-92 направлены против антигена СО?1, являющегося рецептором трансферрина.

- 15 -

Ионоююнальные антитела ICO-105 против рецептора интерлейкина-2 ( антиген CD25 ).

МКА ICO-105 были получены при слиянии клеток миеломы NS1 с клетками селезенки мыши, иммунизированной лимфоцитами, активированными ФГА.

МКА ICO -105 не реагируют с лимфоцитами, моноцитами, гра-нулоцитами, тромбоцитами и эритроцитами. Исследование МКА на большой панели перевиваемых клеточных линий показало отсутствие реакции с большинством клеток (табл.4). Исключение составляют клетки линии YT, экспрессируюшде рецептор IL-2. Следует подчеркнуть, что МКА не реагируют с клетками субклона этой линии YT2C, не зкспрессируювдми рецептор IL-2-с молекулярной массой 55 ООО дальтон (CD25), но имеющие рецептор IL-2 с молекулярной массой 75 ООО (CD25R). Тестирование МКА IC0-105 на IL -2-зависимых Т-клеточных клонах выявило их реактивность со всеми тестированными клонами, независимо от их фенотипа .

Исследование экспрессии антигена, выявляемого МКА IC0-105, на активированных клетках показало, что антиген появляется на клетках через 24 ч после начала активации ФГА, достигает максимума на 3 - 5 дни, а затем снижается. При активации лимфоцитов IL-2 обнаружена максимальная экспрессия антигена на 5 день после начала активации. При комбинации ФГА и IL-2 экспрессия антигена на 3 и 5 дни не отличалась от экспрессии на клетках, активированных только одним ФГА, однако, на 7 и 10 дни была значительно выше. При активации клеток аллоантигенами в смешанной культуре лимфоцитов, максимальная экспрессия антигена, определяемого МКА IC0-105, была на 5 - 7 дни.

Таблица 4

Реактивность МКА 1С0-105 с тимоцитами, клетками периферической крови человека и перевиваемыми клеточными линиями

Клетки Характеристика линии клеток МКА: ICO105 ВС96.9

Тимоциты 0 0

Лимфоциты 0 0

Моноциты 0 0

Гранулоциты 0 ■ 0

НРВаЦ Т-клеточная 0 0

YT Т-клеточная 60* 38,7

YT2C Т-клеточная .0 0

Molt-4 Т-клеточная ■ 0 0

JFP В-клеточная 0 0

0Z-EBV В-клеточная 0 0

JY В-клеточная 0 0

Daudi В-клеточная 0 0

DZ-EBV В-клеточная 0 0

К562 Зритробластоидная 0 0

HL-60 Миелоидная 0 0

U937 Монобластоидная 0 0

Примечание: * - процент антигенположительных клеток,

МКА ICO-105 характеризовали методом конкурентной ингиби-ции. Было показано, что немеченные МКА ICO-105 и Anti-CD25 полностью блокировали присоединение к клеткам, активированным

ФГА, этих же МКА, меченных FITC или SPE, в 3 из 3 опытов. Однако МКА ВС96. 9 не блокировали связывание с активированными ФГА клетками МКА Anti-CD25 и лишь в 1 из 3 опытов блокировали присоединение МКА IC0-105. МКА IC0-105 блокировали соединение с клетками линии YT биотинилированных МКА ВС96. 9. Это указывает на то, что МКА ICO-105 и Antí-CD25 распознают те же самые или близко расположенные эпитопы, которые отличаются от локализованного рядом эпитопа, выявляемого МКА ВС96.9

Определение молекулярной массы антигена методом радиоим-мунопреципитадии показало, что МКА IC0-105 иммунопреципитируют из лизата клеток JAF43, меченных 1251, одну полосу с молекулярной массой 55 ООО дальгон (рис. 3).

Наш была изучена способность МКА IC0-1Q5 блокировать присоединение интерлейкина-2 к рецептору. Для этих целей был использован меченный фикозритрином интерлейкин-2. Клетки линии YT инкубировали с асцитом непродуцирующей миеломы NS1, МКА ICO -105 и МКА ВС96. 9, направленными против рецептора интерлейкина-2. Было обнаружено, что МКА ICO-105 и ВС96.9 полностью блокируют связывание IL-2, конъюгированного с фикозритрином, с клетками YT (рис.4 ).

МКА IC0-1O5 были исследованы методом двойного окрашивания. Лимфоциты периферической крови, активированные МКА IC0-90 против антигена CD3, были преинкубированы с МКА IC0-105, затем с F(ab')2 фрагментами кроличьей антисыворогки, меченной FITC, и затем окрашены МКА МКА Anti-IL-2 Receptor, меченными фикозритрином (РЕ). Было обнаружено, что оба МКА окрашивают одну и ту жв популяцию клеток (Рис. 5)

Рисунок 3

Определение молекулярной массы антигена, выявляемого МКА IC0-105, радиоиммунопреципитацией из лизага клеток JAE43, меченных 125-1

5Ж

-«-200 ««-60

•^—30 иг

1 - ICO-105

2 - IC0-92

3 - NS1

Рисунок 4

Блокада о помощью МКА IC0-105 присоединения конгюгированного о фикоэритривом

иитерлейкика-2,

В".

а - клетки окрашены фикоэритрином, конъюгированным о ин-терлайкином-2 (ИЛ-2РЕ); б - клетки преинкубированы о непроду-цирувдей миеломой NS1 и окрашенные ИЛ-2РЕ; в - клетки преинкубированы с МКА ВС96.9 и окрашенные ИЛ-2РЕ; г - клетки-преинкубированы с ЫКА IC0-10S и окрашенные ИЛ-2РЕ.

Рисунок 5

ДВОЙНОЕ ОКРАШИВАНИЕ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, АКТИВИРОВАННЫХ С Ш&ОДЫО ANTI-CB3 UKA ИК0-90

ИГО-105-F АВ

Была'-исследована способность МКА IC0-105 блокировать пролиферацию интерлейкин-2-зависишх клеток. С этой целью клетки линий 016 и LS0 инкубировали с 300 мкл МКА ICO-105 или ВС96.9. Степень пролиферации учитывали по включению ЗН-тимидина. Изучение способности МКА ICO-105 влиять на пролиферацию CD25+ клеток показало, что МКА ингибировали пролиферацию клеток С1б и в меньшей степени пролиферацию клеток LS0. Следует отметить, что включение ЗН-тимидина клетами LS0 было более интенсивным, что свидетельствует о более сильной пролиферирующей активности этого клона клеток. МКА ВС96.9 также ингибировали пролиферацию этих клонов, но в меньшей степени, чем МКА IC0-105, МКА ICO-105- также угнетали пролиферацию лимфоцитов на ФГА. Степень ингибиции активации лимфоцитов на ФГА имела дозозависимый характер и была статистически значимой при концентрации МКА от 300 до 0,3 мг/мл.

МКА ICO-105 также были охарактеризованы на V международном рабочем совещании по дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека на секции "Рецепторы цитокинов" (Бостон, США, 1993 г.). В результате МКА IC0-105 были включены в кластер CD25 tShaw S. et al. , 1993].

Оценка возможности использования моноклональных антител 100-105 и 100-92 в иммунофеиотигофаваним лейкозных клеток у больных хроническим миелолейкозом.

С этой целью были исследованы образцы периферической крови крови 11 больных хроническим миелолейкозом в стадии бластного крива и 7 больных хроническим миелолейкозом в хрони-

ческой фазе. Иммунологический фенотип опухолевых клеток определяли с помощью панели моноклональных антител против диффе-рейцировочных антигенов лейкоцитов человека, позволяющей определить направление и стадию дифференцировки лейкозных клеток.

Иммунолофенотипирование бластных клеток у больных хроническим миелолейкозом позволило отнести их к миелоидному, примитивному и смешанному подвариантам (Табл.5 )

Было обнаружено, что МКА ЮО-Ю5 против антигена 0025 реагировали с властными клетками 7 (63,6 %) из 11 больных хроническим миелолейкозом, выявляя 48,3+7-10,2 % антиген-положительных клеток.

МКА 1С0-92 против антигена С071 реагировали с бластными клетками 7 (63,6 %) из 11 больных хроническим миелолейкозом, выявляя 32,5+/-8,1 %. антиген-положительных клеток.

Антигены С025 и СБ71 бьши экспрессированы у большинства больных Смешанным вариантом бластного криза хронического мие-лолейкоза и только у 1 из 3 больных Миелоидным вариантом и отсутствовали у больного Примитивным вариантом.

Исследование полиморфнояденых лейкоцитов у больных хроническим миелоидным лейкозом в хронической фазе выявило экс-прессиию СБ25 и/или 0071 в 4 из 7 случаев. При этом мы не обнаружили коореляции между экспрессией ГО25 и СБ71 антигенов. Более того, только в 1 случае оба маркера были представлены на клеточной поверхности одновременно. Следует подчеркнуть, что антигены С025 и С071 не экспрессированы на гранулоцитах здоровых доноров.

Таблица 5

Иммунологический фенотип властных клеток у больных хроническим миелолейкозом в стадии бластного криза

Иммунол. N Иммунологический фенотип

вариант б-ного CD34 CD10 CD22 CD15 CD14 CD13 CD25 CD71

Миелоидный 1 0 0 12 32 4 17 0 7

2 68 7 1 30 8 23 42 31

• 3 4 0 0 53 2 2 0 0

Примитивный 1 16 0 0 0 0 0 0 0

Смешанный 1 ' 21 25 56 61 - 27 27 56

2 89 17 0 56 70 97 80 67

3 34 8 17 0 0 9 13 10

4 13 10 5 3 0 2 6 4

5 70 88 74 64 68 82 87 32

6 30 42 0 53 22 53 51 19

7 7 48 0 19 21 28 38 13

Антиген СБ71 тестировали только у 2 пациентов хроническим лимфолейком и в обоих случаях не обнаружили экспрессию антигена.

Таким образом, проведенное исследование показало, что МКА 1С0-105 и ЮО-92 пригодны для иммунофенотипирования лейкозных клеток. Априори можно предположить, что эти МКА пригодны для оценки иммунного статуса у онкологических больных, т.к. выявляют рецепторы на активированных клетках, содержание которых

- 23 -

изменяется в течение заболевания .

ВЫВОДЫ

1. Получена гибридомная линия клеток, продуцирующая МКА ICO-105 против антигена CD25, являющегося рецептором интерлей-кина-2.

2. МКА I00-105 реагируют с активированными клетками, ин-терлейкин-2-вависимыми Т-клеточными клонами и не взаимодействуют с лимфоцитами, гранулоцитами и моноцитами. МКА ICO-105 реагируют с клетками линии YT и не связываются с другими линиями клеток. МКА ICO-105 реагируют с той же самой популяцией клеток и той хе самой молекулой, что и другие МКА, направленные против антигена CD25. МКА иммунопреципитируют антиген с молекулярной массой 55 ООО дальтон, которая соотвествует антигену CD25. МКА ICO-105 полностью блокируют присоединение к рецептору интерлейкина-2.

3. Получена гибридомная линия клеток, продуцирующая МКА IC0-92 против антигена CD71, являющегося рецептором трансфер-рина.

4. МКА ICO-92 реагируют с активированными клетками и не взаимодействуют с покоящимися лимфоцитами, гранулоцитами и моноцитами. МКА ICO-92 иммунопреципитируют антиген с молеклярной массой 95 ООО дальтон. МКА IC0-92 реагируют с той же самой популяцией клеток и той же молекулой, что и другие МКА, направленные против антигена CD71.

5. МКА ICO-105 и IC0-92 блокируют пролиферацию Т-клеточ-ных клонов клеток и активацию лимфоцитов ФГА.

6. На V Международном совещании по дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека МКА IC0-92 внесены в кластер CD71, а МКА ICO-105 - в кластер CD25.

СПОСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Получение и организация промышленного выпуска моноклональ-ных антител к активационным антигенам лимфоцитов человека. Барышников А. Ю., Балкина Г. Е , Фролова Е. А. / Тез. докл. Всероссийской конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия", г. Бущино-на-Оке, 1993, стр. 48.

2. Индукция активации лимфоцитов моноклональными антителами 1С0-90 против антигена СЭЗ. / Палкина Т.Е , Ленева ЕВ., Донская О. Е / Тез. докл. конференции стран СНГ к юбилею Витебского мед. института. / г. Витебск ,1994 г., стр. 27.

3. Получение новых моноклональных антител к активационным антигенам лимфоцитов человека. У Ленева Е В., Палкина Т. Е , Лобанова В. В,, Барышников А. Ю. / Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, N4, 1994 г., стр.17.

4. Мзноклональные антитела Ю0-Ю5 к рецептору интерлейкина-2 (антиген СВ25) ■ / Барышников А. Ю. , Фролова Е. А. , Ленева Е Б., Палкина Т. Е , Кадагидзе 3. Г., Гуттефангес С., Достот Е. , Шмид М., Корвая Е, Манзур И., Бонсуссан А., Боумселл Л. /Вестник ОНЦ, N4, 1993, стр. 7-12.

5. Моноклональные антитела 1С0-92 против рецептора трансферри-

на (антиген С071). / Барышников А.Ю., Фролова Е. А., Ленева Е В., Палкина Т. Е , Кадагидзе 3. Г., Гуттефангес С., Достот Е. , Шмид М. , Корвая Е, Манзур И., Бонсуссан А. , Боумселл Л. / Доклады Академии Наук, N4, 1993 , стр. 524-528.