Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Получение и характеристика моноклональных антител к трииодтиронину и создание тест-системы на их основе

ГОСКОМИТЕТ САГОПВДНАДЗОРЛ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МОСКОВСКИМ НАУЧНО-МССЛВДОВАТЕЛЬСКШ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ им. Г.Н. ГАБРИЧЕВСКОГО

На правах рукописи

ОКУНЕВА

Татьяна Олеговна

ПОЛУЧЕН® И ХАРАКТЕРИСТИКА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ТРШОЛТИРОНИНУ И СОЗДАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА ЮС ОСНОВЕ

I4.00.3S. Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата Отологических паук

МОСКВА - 1992

/

Работа выполнена на кафедре клеточной физиологии и иммунологии Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор М.В. Гусев.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В.М. Манько

доктор биологических наук Р.Г. Василов

Ведущее учереадение: Институт Эпидемиологии и Микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи АМН О06Р.

Защита состоится ^у" ¡¿сСс( г* в'/.Р часов на заседании Специализированного совета К 084.18.02 Московского научно -исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н. Габричевского по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского.

Автореферат разослал " 1992 года.

Учений секретарь Специализированного совета: кандидат биологических паук О.В. Котельпикова.

-з-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В наш дни стало обычной практикой проведение миллионов анализов с использованием радиоиммунологического анализа /РИА/, предложенного Ялоу и Берсоном в 1959 году. Данный метод анализа наряду с достоинствами / универсальностью, чувствительностью, избирательностью и специфичностью / обладает рядом недостатков. К ним относятся : 1/сравнительно короткий период полураспада изотопов, испускавших кванты, 2/ опасность для здоровья, которую представляет введение изотопных меток, подготовка и выполнение и проведение анализов, —3/-поврездошм-структуры меченых молекул, вызываемое излучением, 4/ необходимость разделения меченых и немеченых антигенов и 5/ обусловленная этим трудность автоматизации РИА.

Двенадцать лет спустя в 1971 году Бая Вееман и Щуурс ввели в употребление другой тип чувствительных меток - ферменты. Явные преимущества нового метода, получившего название иммуноферменпшй анализ /ИФА/, такие как : простота выполнения, доступность и стабильность реагентов, экспрессность и возможность автоматизации для -проведения массовых анализов - обеспечили ему прочное положение в клинической биохимии, при диагностике заболеваний растений и животных, в научных исследованиях.

Первостепенное значение тлеет внедрение методов ИФА для целей здравоохранения. В клинической н экспериментальной эндокринологии большое внимание уделяется оценке функционального состояния' щитовидной железа. Одним из наиболее информативных критериев диагностики дисфункции ситовидной келезн является количественное определение уровпей тнроксша / Т4 / и трииодтирогаша / ТЗ / в сыворотке крови человека. Эти гормоны представляют собой йодсодержащие а'яшокислоты, производныо тирозкпа. Широкое использование определения тиреоидшгх гор,таков в медицинской практике требует разработки простых и падегаых аналитических методик. В последнее годы такую возможность предоставил ИФА. На обхода,га создать методы иммуноферлентиого анализа как для детекции отдельных горюнов, так п для одновременного опроделения нескольких гормонов в одной пробе, причем определение различных

тиреоидгшх гормонов необходимо проводить различными методами иммунеферментного анализа в зависимости от природы тиреоидного гормона / конкурентный метод ИФА для тироксина, триюдтирошша и их свободных фракций, сэндвич метод ИФА для белковых тиреоидных гормонов, непрямой метод ИФА для измерения уровней антител против тироглобулина /. .-.■■'.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ, в нашей стране в настоящее время уровень ТЗ определяют лишь в крупных медицинских центрах методом РИА. Цель» данной работы являлась разработка безопасного, высокочувствительного- метода на основе- ' твердофазного иммуноферментного анализа для трииодтиронина с использованием моноклональных антител, способного заменить РИА.

Б- задачи работы входило получение гибридом, продуцкруадпх моноклональные антитела к трииодтиронину,. наработка, выделеняе и подробная характеристика этих антител, а также создание на основе моноклональных антител системы твердофазного иммуноферментного анализа для определения ТЗ в научных исследованиях и клинической практике.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. В данной работе, впервые в нашей стране были получеш гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к трииодтиронину человека, пригодные в качества универсальных агентов' для изучения функций щитовидной келезы. Моноклональные антитела' прошли, испытания., в НПО "Биотехнология" и получен акт ■ о .внедрении йх в производство. Полученные моноклональные антитела обладают высокой аффинностью, что дает возможность для создания шмуносорбентов для выделения ТЗ.

Впервые в нашей стране , была сконструирована чувствительная кммуноферментная тест-система на основе моноклональных антител для определения уровня ,ТЗ в сыворотке крови человека в субнанограммовом диапазоне концентраций. Данная тест-система прошла испытания в МП "Иммунотех" и готова к массовому производству. Получен акт с положительным ' заключением о внедрении тест-системы в производство.

ПОЛОКЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ: I.Способ получения кояьюгатов

Г

гормон-белок для иммунизации жиеотных и тестирования аптисывороток. 2.Способ получения гибридом, продуцирующих моноклональше антитела к ТЗ, не дащие перекрестной реакции с тироксином. 3.Разработка оптимальных условий для препаративной наработка моноклональных антител к ТЗ. 4.Выделение и характеристика моноклонэльных антител к трийодтиротшу. 5.Метод . количественного определения общего уроЕня ТЗ в сыворотке кроЕИ человека с помощью иммуноферментной одностадийной тост-системы на основе моноклональных антител.

- АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Диссертация была апробирована на заседания —кафедры . . клеточной . физиологии и иммунологии МГУ им. Н.В.Ломоносова и на мевдабораторном семинаре Филиала Института биоорганической химии им. Н.М.Шемякина.

ПУБЛИКАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИИ. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ и получены акты о внедрении моноклональных антител к трииодтиронину в производство, а также о внедрении тест-системы на основе данных моноклональных антител в производство.

СТРУКТУРА И ОББШ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа состоит нз . введения, обзора . литературы, экспериментальной части, результатов и их сЗсуздешш, выводов и списка литературы, вклотаюадго 99 работ. Работа изложена на 104 страницах, содержит 20 рисунков и 4 таблицы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

МАТЕРИАЛУ И МЕТОДЫ: I.Животные. Мыши линии ВАЪВ/с, самки, возраст 1,5-2 месяца, вес 18-20 г. 2.Среды. Среда на основе ш 1640. /Plow Laboratories, Scotland/ с добавлением 0.032 L-глутамнна, 0,01 М раствора незаменимых аминокислот, раствора антибиотиков /5 кг/мл/, 0,01 М раствора пирувата натрия /Plow Laboratories, Sootland/, раствора 0,02 U 2-меркаптоэтанола /Sigma, USA/, 0,01 M раствора витаминов /Biochron Germany/ и с добавлением 5% омбриональной телячьей сыворотки /Plow Laboratories, Scotland/. Среда ГАТ - на основе RPMI 1640 со nceirj добавками, 15« эмбриональной телячьей сывороткой и с добавлением 0,01 U раствора гипоксантина, аминоптерина, гладина /Plow

Laboratories, Scotland/. Среда ГТ - на основе крмх 1640 со всеми добавками, 5% эмбриональной телячьей сывороткой и добавлением 0,01 M раствора гипохсзнтина и тимидина /Flow Laboratories, Scotland/.3.Оборудование. Планшеты для культивировапия клеток и планшеты для иммуноферментного анализа /Nunc, Denraarok/. Пластиковые флаконы для культкыгровопия клеток /Plow Laboratories, Scotland/.

Спектрофотометрические измерения проводились на приборе "Beckman du-8B, /usa/, измерения поляризации флуоресценции проводились на специальном флуоресцентном ридеро TDx фирмы "Abbot" /usa/; работа с полистиролышми планшетами велась на приборе "Labsystem ííultiskan Plus" /usa/.

Синтез кигьюгатов гормон-белок.

К раствору 40 мг гемисукцинат-тршаодтиронина /ТЗ-HS/ в 10 мл даметилформамида /ДМФА/ добавили при перемешивании 40 мг 1-цяклогексил-3-х2-морфолино-4-зтил карбодиимида, перемешивала при комнатной температуро в течение 2-х часов, затем в реакционную смесь ввели 12 мг N-пцфоксилсукцкниАШДного &фира/ккз/, вновь перемешивали при комнатной температуре -в течение 2-х часов. Добавили порциями раствор 100 мг белка в 0.0IM натрий-карбонатном буфере, инкубировали 24 часа при комнатной температуре. Концентрацию антигена определяли

спектрофотометрически путем измерения оптической плотности раствора при 280, 300 и 325 нм, а такжо путем снятия спектра в диапазоне от 250 до 350 нм.

Иммунизация «квотных.

Для иммунизации животных использовали полученные ранее конгюгаты трииодтиронина с .гемоцианином /ТЗ-KLH/. В день 0 на одну мышь линии BALB/o /Ни J.-G., et.al., 1990 а,Ь,о/ брали 100 мкг иммуногена в 200 мкл ЗФР /0,15 М, pH 7,2/, добавляли 200 мкл полного адьюванта Фрейнда, смесь эмульгировали и вводили «ивотиому внутрибркшинно. Улмунизацшо повторяли на 30 и 45 дни, но использовали неполный адыовант Фрейнда . Через 10 и 40 дней после первого введения иммуногена проводили забор крови из ротроорбитального синуса по 0,1 nui. Полученные антисыворотки

исследовали на присутствие специфических антител в иммуноферлентном анализе, используя для скрининга конъюгат бычьего сывороточного альбумина с трииодтирошшом /ТЗ-BSA/.

Ведение клеточных культур.

Для получения гибридом использовали миеломную клеточную линию sp2/o-Ag 14, не продуцирувдую иммуноглобулины. Клетки выращивали в пластиковой посуде, поддерживали концентрацию клеток 5хЮ5 - Зх 10® кл/мл в полюй среде rpmi 1640 при 37° С и Ъ% концентрации углекислого газа /Köhler G., Milstein С., 1975/

Селекцию гибридных клеток вели в тех же условиях. Для заморозки

-клетки снимали___с . культуральной посуда резиновым шпателем,

центрифугировали в режиме 1000 об/мин 10 минут. Затем ресуспондировали 10% димотилсульфоксида и замораживали в режиме 1°С в (ящуту. Замороженные клетки хранили при -70° С /Ведение клеток животных, 1983/.

Гибридизация.

Слияние клеток проводили.по методу, описанному в работе /Köhler a., Milstein е.. 1976/. Для этого использовали 50S полиэтиленгликоль. ! Соотношение клеток селезенки из иммунной мыши и клеток миеломпой линии было б : I . После гибридизации клетки высевали в 96-луночшэ планшеты по Ю5 кл/лунку в среде ГАТ, в которые предварительно были внесены перитонеалыше макрофаги по I04 кл/лунку такте в среде ГАТ.

Скрининг гибридных клеток. Иммуноферментный анализ.

9б-лупочные полистиролыше планшеты для иммуноферюнтного анализа сенсибилизировали копъюгатом ТЗ-BSA в концентрации 50 мкг/мл в карбопатном буфере /0,05 u pH 9,6/ в точение 18 часов при 4° С. После сепсябилизации сайты неспецифической сорбции блокировали 0,5% раствором bsa в ЗФР в течение I часа при 37° С.

После каадой стадии иммуноферлэнтного анализа лунки планшетов про;,швали 0,92 раствором хлорида натрия с 0.05Ж твин-20 по три раза. Ферментативную реакцию проводили при следующих условиях : в 0,15 Ù фосфат-цитратном буфере pH 5,0 с 0,4 мг/мл о-фепилендаакина и 0,03« перекиси водорода в течение 20 минут при 22° С в темноте. Затем реакцию останавливали путем добавления

равного обьема 10Ж серной кислоты. Оптическую плотность измеряли

при 492 нм.

Клонирование гибридом.

Культуры гибридом, в супернатантах которых были обнаружены специфические моноклональные антитела к трииодтиронину, клонировали методом пределышх разведений из расчета 0,3 клетки в лунку в полной среде ГАТ.

Получепио а'сцитной жидкости.

Для получения асцитной жидкости кивотным вводили внутриСрюаинно по 0,5 мл пристана и через 14 дней вводили по 1-2 млн гибридных клеток, клонированных не менее 3 раз в бессывороточной среде. Через 10-20 дней у мышей с хорошо выраженной опухолью забирали асцитную жидкость, клетки из нее осаждали центрифугированием. Выделение моноклональных антител из асцитной жидкости.

Выделение моноклональных антител из асцитной жидкости проводили с помощью осаздения сульфатом аммония и ионообменной хроматографии.

Синтез конъюгата гормон-иероксидаза.

Синтез конъюгата проводили Н-гидроксисую щнимидпым методом. Копыогат очищали гель-хроматографией на колонке с сефадексом О-50, уравновешенной фосфатным буфером.

При обработке экспериментальных данных были использованы показатели, наиболее часто употребляемые в биологической статистике - среднее арифметическое, ошибка среднего и критерий Стысдента. В работо был выбран уровень значимости равный 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I.Получение и характеристика моноклональных антител к трииодтиронину человека.

Для повышения иммуногешшх свойств ТЗ, его коныогировали с гемоцианином. Как было показано рядом исследователей /Кетти Д. и др., 1991/, наличие в молекуле конъюгата спейсера, пространственно удаляет молекулу гаптона от белка носителя, что значительно повышает титр специфических к гаптену антител. Поэтому в молекулу трииодтиропина был предварительно включен гемисукцинат, который пространственно удаляет ТЗ от гемоцианина.

Как показали проведенные исследования, наличие такой своеобразной "ножи" /ТЗ-нб-кш/ повышает титр продуцируемых к тз антител / рис. I/, по сравнению с титром антител, которые были получены при иммунизации животных конъюгатом ТЗ-К1Л. Гемисукцинат был включен в молекулу ТЗ только в случае синтеза конъюгата для иммунизации животного.

разведение мышиных сывороток

Сыворотка от мышей, икмушзировэнных конъюгатом: I-1ТЗ-НЗ-КЬН I--1 тэ-кш

Рисунок I. Результаты анализа _ иммунных сывороток от групп мышей, иммунизированных разными конъюгатами, по сравнению с нормальной мышиной сывороткой.

На рисунке. I представлены результаты тестирования сывороток, взятых от груш животных, иммунизированных конъюгатами ТЗ-НЗ-КЬН и ТЗ-КШ, по сравнению с сывороткой от интактного хиеотного. Полученные сыворотки тестировали в иммуноферментном анализе, где в качестве сорбируемого на полистироловые планшеты антигена использовали, конъюгат ТЗ-вза. На рисунке I представлены средние значения оптической плотности пяти груш, содержащих по пять животных каждая. Очевидно, что титр антисыворотки кэулой из пяти групп животных, иммунизированных конъюгатом ТЗ-Ш-КШ, выае, чем

у животных, иммунизированных конъггатом T3-KLH. В качестве донора спленоцитов для гибридизации была выбрана мышь, иммунизированная коггьюгатом T3-HS-KLH, с самым высоким титром антисшоротки /оптическая плотность в иммуноферментном анализе при длине волны 492 им составила 3,1 ед./

В результате гибридизации спленоцитов мыши, иммунизированной конъюгатом трииодтиронина с гсмоцианином /ТЗ-hs-klh/, с миеломными клетками линии SP2/0 - А^ 14, были получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к трииодтиронину человека /табл. I/. Из 595 клонов, полученных в результате двух гибридизаций, 180 клонов продуцировали антитела к ТЗ, таким образом, эффективность гибридизации составила 30%, что хорошо коррелирует с литературными данными /Sohote A., et.ai., 1986/. Из 180 полученных первичных положительных клонов 35 клонов, обладающих высокой скоростью роста /при посевной плотности клеток Ю^кл/мл время субклонирования составляло 3-4 дня/, были отобраны в клонирование. После трехкратного клонирования 35 позитивных

слияние количество лунок количество лунок с выросшими клонами количество лунок с положительными клонами, тестированными в ИФА отобраны в клонирование

I 360 300 100 20

2 360 295 80 15

всего 720 '595 180 35

Таблица I. Результаты гибридизации спленоцитов мышей, иммунизированных T3-HS-K1H с миеломными клетками.

первичных культур-гибридом, только 30 клонов продолжали стабильно продуцировать антитела заданной специфичности, что, как известно.

обусловлено частичной утратой хромосом гибридными клеткам и в вместе с ними способность синтезировать иммуноглобулины.

Гибридомы, продолжающие синтезировать антитела к ТЗ, сохраняли продукцию антител на протякешш 20 пассажей в культуре с оптимальной концентрацией клеток 5 х Ю5 кл/мл. Посевная плотность составила Ю5 кл/мл, время субклоннрования 3-4 дня.

В шмунофермантном анализе исследовалось взаимодействие моноклональных антител к трииодтиронину с другим тиреоидным гормоном - тироксином. Было установлено, что моноклоналыше антитела 43/2; тЗ/4; ТЗ/8: ТЗ/Э; ТЗ/13,- ТЗ/17; и ТЗ/ЗО -взаимодействуют—только с трикодтиронкном. Остальные антитела имеют некоторое сродство и к тироксину. Все поликлональше кроличьи антисыворотки к ТЗ имеют некоторое сродство и к Т4.

поскольку

очень близки по химической

моноклоналыше вид взаимодей- Ксв, Ю9 конц способ

антитела антитела ствие с Т4 Ы антител мг/мл очистки

ТЗ/З 11 - 1.8 12,0 КОХ

ТЗ/4 71 - ■ 1.4 0,8 иох

ТЗ/8 т1 - 1.1 9.0 ИОХ

ТЗ/9 71 - 1.8 17,0 ИОХ

ТЗ/13 ■ 72а - 1.2 10,0 иох

ТЗ/17 71 - 1.6 11,0 иох

ТЗ/ЗО 71 - 1.2 1.1 ИОХ

ТЗ/2 - + - ■ - -

ТЗ/12 + - - -

ТЗ/19 - + - - -

ТЗ/20 - + - - -

ТЗ/24 - + - - -

ТЗ/28 - + - - -

Т3/31 + - - -

ТЗ/ЗЗ - + - - -

Таблица 2. Свойства моноклональных антител к трииодтиронину человека.

Поэтому перед наш была поставлена задача получить моноклональные антитела к трииодтиронину, которые не дают перекрестных реакций с тироксином.Таким образом, из 30 гибридом нами были отобраны для работы только 7, в суперштаптах которых содержались антитела, не даодие перекрестных реакций с тироксином /таблица 2/.

Супернатанты от 7 отобранных гибридом были сконцентрированы. Затем в роакции радиальной диффузии по Манчини был определен субкласс, содержащихся в них моноклональных антител. Сконцентрированные супернатанты использовались в разведениях' от исходного до 1/500, антисыворотку к субклассам иммуноглобулинов использовали в разведениях 1/600. Все протестированные моноклональные антитела принадлежали к 103 классу /таблица 2/.

В данной работе титр антител против гормона определяли методом гомогенного флуоресцентного иммуноанализа, используя для регистрации комплекса антиген-антитело молекулу флуорэсцеш изогноционага /ФИТЦ/, ковалентно связанную с молекулой трииодтиронина. Так же, как и в методе. РИА за титр антител принимали такое разведение, которое дает 50% связывания меченого антигена. Кривые титрования, полученные при анализе супернатантов от разных гибридом, представлены на рис.2. Титр, определенный подобным образом, позволяет качественно сравнить различные супернатанты, получить некоторые сведения о величинах констант связывания антител с антигенами и о их концентрации. Поэтому он был выбран в качестве критерия при отборе положительного клона гибридных клеток. Как видно из рис.2, наибольыий титр оказался у супернатанто *9.

Моноклональные антитела, не имещие перекрестной реакции с тироксином, были получепы .в препаративных количествах в паде асцита для 7 гибридом, привитых мыаам, примированных приставом. Количество асцитыой жидкости, подученной из одной мыши, составляло 5-10 мл с концентрацией антитзл 0,8 -17 мг/мл. Таким Образом, собирали по 100 мл асцитной жидкости для каждой гибридош.

Для выделения моноклоналышх аптител из асцитной жидкости использовали осавдепие сульфатом аммония с последующей

хроматографией на deae-52 /рис.3/. Фракция igt: элшровалась при концентрации хлорида натрия 0,17 М.

I I I II III I разведение 200 400 800 1600 3200 6400 I2S00 25600 54200 асцитной

жидкости

Рисунок .2. Кривые титрования, полученные при анализе асцитной жидкости от разных клонов гибридных клеток, №Э -обозначения клонов, от которых взяты супренатанты, ■ mP-миллиполяризация флуоресценции.

Концентрацию антител определяли споктрофо томе трите скя при длине волны 280 нм. При этом считали, что >1 мг/мл антител класса igG поглощает 1,42 оптических единицы. Данные о полученных значениях концентраций кагмуноглобулинов из асцитной жидкости различных гибридом представлены в таблице 2.

Определение равновесных • констант связывания антител к ТЗ проводилось методом гомогенного флуоресцентного иммуноанализа.

оптическая плотность при 280 нм

■ 1.0

0,5

10

.15

20

номера фракций

Рисунок 3. Профиль ашоции моноклоналышх антител с с£-52.

Концентрация хлорида натрия составила 0,17 М. Экспериментальная процедура состояла в определении равновесной концентрации свободного и связанного с антителом меченого гаптена при различных концентрациях добавляемого в реакционную смесь гаптепа". По этим экспериментальным данным были построены графика в координатах Скотчарда. Определош константы связывания для моноклональных антител равные от Ка=1,8 х 109для моноклоналышх антител от клона Я9. Ка=1,1 х Ю9 - для клона Х9. Константы ассоциации для остальных отобрщшых моноклональных антител определяли аналогично, . их значения приведены в табл.2. Представленные данные подтверждают возможность использования полученных' моноклональных антител для разработки тест-системы на ТЗ. Таким образом, получены моноклоналыше антитела к трииодтирошшу, не имевдио перекрестных реазщий .с тироксином, и проведена их характеристика. ^

2. Разработка тест-системы для трииодтиронина на основе

моноклональных антител. •

Для разработки тест-системы были отобраны моноклоналыше антитела от 9 клона гибридных клеток, так как эти антитола не реагировали с тироксином, имели самый высокий тигр и о$но из - самых высоких значений константы связывания.

Одной из важнейших стадий для разработки и оптимизации метода твердофазного иммуноанализа на трииодтиронин являлась стадия синтеза конъюгата гормона с ферментом /пероксвдазой хрена/. Необходимым условием такого синтеза является сохранение конъюгатом ферментативной и кялунологической активности. Известно, что ПХ имеет 4 химически активные а?дшогрупш, что п позволяет осуществить ковалентное связывание данного фермента с гаптенами, тлеющими активные карбоксильные группн. На первой стадии была проведена загдата ыганогругаш оптическая плотность

номер фракций

Рисунок 4. Профиль хроматография конъюгата третюдтиронзша с пероксвдазой хрена на сефадексе о-бО. Размер колонки 1,6 ч 60 см, элюент - ЗФР, скорость элюции 35 мл/час.

триаодтиропии а трифторацетилом. Затем провели активацию карбоксильной группа N-гидроксисукцимидным эфиром и па третьей стадии - собственно конъюгация гормона с ферментом. Далее необходимо разделение конъюгировапных молекул от несвязавшхся молекул гаптена и фермента.В работе очистка велась с применением гель-фильтрации на сефадоксе 0-60, так как метод прост и легко осуществим в отличии от других методов, например, аффинной хроматографии. Профиль элюции представлен на рис. 4. Концентрация коныогата устанавливалась спектрофотометрически, нутом измерения оптичоской плотности при 403 , 300, 280 нм /в области 250 легшт максимум поглощения ПК, в области 300 нм - максимум поглощения-ТЗ, в области 403 нм - максимум поглощения конъюгата ТЗ-ПХ/.

Была оптимизирована схема непрямого конкурентного твердофазного иммуноанализа для ТЗ. Метод основан па конкуренции трииодтиронина в тестируемом образце и конъюгата ТЗ-ПХ за ограниченное число мест связывания с антителами к ТЗ, сорбированными на полистироловом планшета. Образование иммунного комплекса, иммобилизованного на твердой, фазе, определяли с помощью копызгата трииодтиронина с пероксидазой хрена. Удаление избытка непрореагировавших компонентов /ТЗ и ТЗ-ПХ/ проводили простой промывкой планшета ЭФР, который содерхал 0.059G твина-20 рН=7,4. Детекцию ферментативной метки, пероксидазы хрена проводили спектрофотометрически с использованием в качестве хромогена ортофенилдаамин /01Щ/ /см. схему на рис.5/.

Реакция /1/ протекает бэз всяких видимых изменений. Визуализация достигается благодаря второй стадии - окислительному превращению красителя 01Щ из восстановленной формы в окрашенную . окисленную форму.Раствор ОПД готовили в 0,1 М цитратно-фоофатном буфере, так как в его присутствии наблюдается значительное сшокенко спонтанного ш индуцированного светом фонового окрашивания. Калибровочная кривая для определения ТЗ в сыворотке крови приведена на рис.6. Оптимизация велась по нескольким параметрам: I.Выбор концентрации ионоклональнш: антител /клоп 9/ /АТ к ТЗ/, . используемых для иммобилизации и отвочакдих условиям

/а/ /I/

/г/

/б/ /I/

определение __ Ферментативной активности

* * у2о2

/г/

2

J

-л/Н 01срааеш1ый продукт реакции

Рисунок 5. а/Схема образования иммунного комплекса, иммобилизованного на полистярольном планаете. б/ Реакция окисления ортофенилдавмина.

чувствительности анализа /константа связывания равна 1,8хЮ9 М/.

2.Выбор концентрации ТЗ-ГОС при проведении конкурентной стадий анализа.

3.Количество вносимых стандартов и аиализируег.ых образцов для проведения анализа.

Критическим фактором, определяющим успешное применение "твердофазного метода, является адсорбция антител на носителе. Условия для проведения сорбции били выбраны стандартные . Лучшие результаты получили при сорбции моноклоналышх адтитол в концентрации 5 ют/мл/по белку. Пра уменьненяп концентрации сорбируемых антител резко уменьшается чувствительность. а при увеличения не будет роализЬван конкурентный метод.

ТЗ нмоль/л

Рисунок 6. Калибровочная кривая для определении тршгодтмрошна в сыворотке крови при концентрации сорбированных антител 5 мкг/мл и концентрации коныогата ТЗ-ПХ 2,5 юсг/гл.

Послр проведения адсорбции ишуноглобулиповой G фракции остаются свободные активные центры связывания, которые могут неспецифически сорбировать конъюгат, что значительно повивает значения фона. Для предотвращения этого процесса планшет помотали на I час в раствор 0,5S BSA в SSP при комнатной температуре, при этом оказывались заблокированными оставииеся свободными актшиша центры связывания.

Концентрацию конъюгата выбирали таким образом, чтобы детектируемый сигнал от нулевого отличался на, 1,5-2 опт. ед. Оптимальной оказалась концентрация конъюгата 2,5 мкг/мл, что хорошо коррелирует с данными, известными из литературы /Кетти Д.

п др., 1991/, При больсзй концентрации конъвгата происходит его избыточное неспецяЗпческое связывание с носителем. В результате чего значительно повышается значение фона. Уменьшение концентрации конъвгата не приводит к увеличению чувствительности при увеличении разброса результатов. Поэтому умепьяенио концентрации конъвгата нецелесообразно.

Как следует из литературных данных, оптимальным является содержание сывороточных стандартов в пробе 9,2-125!. Увеличение сывороточных стандартов в пробо до 203 увеличивало и разброс результатов /Ереt,он O.A. и др., 1983/.

В результате была получена твердофазная пшунофермептйая тест-система, позволяющая определять обдий уровень трииодтпрошота d сыворотке и плазме крови человека.

Чувствительность тост-систе!.и определяли, как наимонызую концентрацию трпиодтярошша, достоверно отличасдуюся от "пулевого" контроля, по формуле: 0Джш=-Хср + 2о, где Хер -ерэдпэе значение оптической плотности "пулевого" контроля из 20 повторных из:-*ерений, d - среднее квадратичное отклонение. Чувствительность в данном случае составляла 0,2 нмоль/л.

Боспроизводилость результатов тест-системы определялась для трех гепцентраций тршгодтиронива. Коэффициент вариации не превышал 4$ при .допустимом значении до 1055 для тест-етстси такого типа /Описаний к тест-системе для. определения трпиодтаронина фяр.м "Fhamaola"/.

Kaie видам, метод, примененный для анализа ТЗ в сыворотке кропи, достаточно прост, имеет небольшое количество стадий я гозаадяат определягъ фгдаологичеекда ковдеатрвцгг тргмдифожтг.}, состЕВЛлхщие порядка 1-2 нмоль/л.

Было проведено сравнение созданной тест-систем с отечественной промышленной радиоюлмугологической тест-систеглой, в которой использовали политональную сыворотку кролика против ТЗ. Для этого сыворотку от групп больных по 20 человек /гипер- п гипотиреоз/, а такаэ от здоровых доноров /20 человек/ провяряля в РИА и КМ. Полученные данные были обработаны статистически, кз рисунке 7 представлена средние значения. Кз предстЕЕлепках

результатов видно. что созданная тест-система не уступает по чувствительности промышленной и с ее помощью можно достоверно наблвдать изменение трииодтиронина в сыворотке крови человека при гипер- и гипотиреоза* по сравнению с нормальным уровнем ТЗ в сыворотко. Коэффициент корреляции измерений составил 0,951.

ТЗ '

нмоль/л 10 9 В 7 6 5 4 3 2 I

шп

пшотиреой /ниже I нмоль/л/

норма /1-3 нмоль/л/

гш^эд/тиреоз

/вше 4 толь/11/

ш

РИА

ИФА

Рисунок 7. Сравнение созданной тест-системы на основе конкурентного иммуноферментного анализа с использованием моноклоналышх антител с промышленной радпоиммунпой тест-системой с использованном поликлоналыюй кроличьей антисывороки.

В результате проведенного исследования получены гибридогя!, продуцирующие моноклональдае антитела к тршюдтирошшу человека. Цоноклональние антитела выделены, охарактеризованы и изучена возшвпость их применения для опроделэпия уровня трииодтиронина в

сыворотхе крови человека в норме и патологии.

Наиболее важным результатом исследований явилось создание тест-системы основанной па пммунофермептном . анализе для количественного определения трииодтиропина в биологических гидкостях, пригодной для применения в клинической практике, не уступающей по чувствительности и превосходящей по специфичности применяемый в пашей стране дпагпостикум на оспоке Р11Л с использованием политональных штител. Кроме того, созданная тост-система проста в обращехши, доступна, не требует применения опасных для здоровья радиоизотопов и, поэтому, иояет пртленяться для проведения массовых анализов.

Тскит.1 образом,' в результате проведенных исследований получен набор уникальных бдатехнологичеекпх реагентов, а такка создапп игяяунофермептная тест-система на основе моноклоналышх антител для количественного определе!шя трянодтиронина в сыворотке чолегэка.

вывода

1. Синтезирован конъюгат-икмуиоген ТЗ-НЗ-Ш1, вызывающий образование специфических антител у гогмунизированных животных.

2. (йштезирован конъпгат ПХ-ТЗ. Кспъюгат очицеи и применен в тест-састене для определения трииодтиронина па основе конкурентного иммуноферментяого анализа.

3.Вггервые в пат,ей- стране получены 7 гибрцдсм.щюдуцпрупяих моноклоналыше оптитела к трииодтирошшу, не давдио перекрестных реакций с другим тиреоздшм торюпоп - тирокспном.

4. Нопокдоналыше аптитела наработаны в препаративных ксх7-?"?стЕах, Опттчлъними условия!®' препаративной парабо-пга лишись: концентрация ¡слеток 5 млн/мыпь и время образования опухоли 10 дней. Количество асцитной еидкости, полученной из одной ьашп составляло 5-10 мл с концентрацией антител 0,8-17 мг/мл.

5 Проведена характеристика полученных мопоклоиаяьннх антител. Все изученные антитела относятся к классу и якеэт значения

СУ а

констант связывания от 1,8x10^ М до 1,1x10 И. -

6. Разработана тест-система игялуноферкзнтлого твердофазного

одностадийного анализа для количественного определения трииодтиронина в сыворотке и плазме крови человека с оптимальной концентрацией сорбированных антител Б мкг/мл и конъюгата ТЗ-ПХ -2,5 мкг/мл; коэффициент вариации не превышал 4%; чувствительность составляла 0,2 нмоль/л.

7. Проведено сравнение полученной тест-системы с имеющейся в отечественном производстве тест-системой на основе радиоиммуного анализа. Статистически достоверно установлено, что созданная тест-система не уступает по чувствительности и превосходит по специфичности тест-систему на основа радиоиммунного анализа.

' СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1 .Yurovcky V.V., Oltuneva . Т.О., Ivanov В.В., Hafcarov S'.Mp Synthesis and. immunochemical study of antigenic determinanta of' the ooat proteins from tropical malaria parasite with help of opesifio antibodies. // Abstracts, 5th conference of young scientists socialiBt countries on bioorganio chemistry - Puohino august 2-10. 1983.-p.4S

2.Юровский В.В., Окунева Т.О., Гривдберг Л.Н. Использование иммуноферментного и иммупофлуоресцентного анализов для изучения ишунодоминантного эпитопа оболочки возбудителя тропической малярии.// Тезисы докладов, Симпозиум по структуре, биосинтезу и функции молекулярных элементов иммунной системы - Пувино 15-20 пкня, 1987.-стр.81

3.RaevsKaya M.Y., Olcuneva Т.О., Kondratyeva I.A., Belaya U.Y. Production of monoclonal antibodies against Salmonella thyphy K-antigen. // Abstracts, International conference on medical biotechnology, immunology and AIDS - Leningrad, USSR, June 12-18, 1991 - p.45

4.0кунева Т.О., ■ Еремин С.A.. Твст-сйстема для определения трииодтирошша на основе твлуноферйнтного анализа // Тезисы докладов, 5-ая конференция по современным проблемам биотехнологии - Пущино, 18-22 мая, 1992 /в начат/.

5.Окунева Т.О., Киркип А.С., Гусев Ы.В. Получение ыоноклоналышх' антител к тршюдтирошшу // Тезисы докладов, I Всероссийский

_________Подп ■ ¿ по/. 9г г_

Ромпркя! rim.. 'Косковский печати. '