Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Использование моноклональных антител к IgE для изучения антигенной структуры молекулы IgE человека и определения уровня общего IgE и аллергенспецифических IgE антител

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР

МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ им, Г. Н. ГАБРИЧЕВСКОГО

На правах рукописи

СМИРНОВА Елена Яновна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К 1дЕ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ МОЛЕКУЛЫ ЧЕЛОВЕКА И ОПРЕДЕЛЕНИЯ

УРОВНЯ ОБЩЕГО 1еЕ И АЛЛЕРГЕНСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ

14.00.36 — Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена в лаборатории гибридом НПО «Биотехнология» Министерства медицинской промышленности СССР.

Научный руководитель —

кандидат химических наук Р. Г. ВАСИЛОВ

Официальные оппоненты —

профессор, доктор медицинских наук И. С. ГУЩИН кандидат биологических наук Т. С. КОТО В А

Ведущее учреждение — НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова АМН СССР.

Защита состоится » . . 1991 г. в .^час-

на заседании Специализированного совета К-084.18.02 Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г. Н. Габричевского по адресу: 125212 Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского

Автореферат разослан « »....,, 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета: кандидат биологических наук

О. В. КОТЕЛЬНИКОВА

Актуальность проблемы. Иммуноглобулин Е ( 1еЕ ) является ключевым компонентом реакций гиперчувствительности немедленного типа,-Приводящих к патологическим сдвигам в организме и развитию аллергических заболеваний. Широкая распространенность и возрастающее количество аллергических заболеваниий делает все более актуальным изучение этого вида патологии и разработку методов диагностики и лечения. Изучение молекулы 1вЕ имеет большое теоретическое значение, так . как связано с выяснением механизма возникновения и развития данного явления. Работа с 1гЕ до недавнего времени была затруднена в связи с чрезвычайно мальм его содержанием в организме человека и слабым накоплением в организме лабораторных животных. Получение и использование моноклональных антител (мкАт) класса 1гЕ, а,также анги-1еЕ-антител, как к целой молекуле, так и к отдельным фрагментам и синтетическим пептидам, отражающим строение отдельных участков молекулы 1гЕ, успехи в генной инженерии позволили начать глубокий анализ структурно-функциональных отношений в молекуле 1гЕ и механизма развития гиперзргических реакций.

В лаборатории гибридом ВНИИ биотехнологии (впервые в стране ) были получены мкАт к 1еЕ человека, и на их основе разработаны тест-системы для определения уровня общего 1вЕ.

Для более углубленного изучения системы 1дЕ представлялось актуальным провести исследование тонкой антигенной специфичности полученных мкАт, а также исследование антигенной структуры молекулы 1дЕ. Важной задачей представлялось также выяснение возможности применения полученных мкАт для препаративного выделения 1дЕ и разработки новых тест-систем для определения уровней общего и аллергенспецифического 1еЕ.

Дели данной работы.

1. Отработка условий получения 1еЕ в препаративных количествах на аффинных иммуносорбентах из различных источников и характеристика полученных препаратов. 2. Характеристика тонкой антигенной специфичности мкАт серии 1еЕ/И и изучение антигенной структуры молекулы 1еЕ с использованием антител, протеолитических фрагментов и синтетических пептидов. 3. Изучение процесса биосинтеза 1гЕ и роли гликоэили-рования в процессе синтеза и секреции. 4. Разработка ка основе мкАт серии 1гЕ/11 полуколичественного варианта тест-системы для визуального определения уровня общего 1еЕ в сыворотке крови человека б. Разработка на основе мкАт серии 1еЕ/11 тест-системы для определения уровня аллергенспецифического 1кЕ.

- 2 -

Научная новизна и практическая значимость Данная работа проводилась в рамках исследований, предусмотренных отраслевым планом Минмедпрома СССР ( номер государственной регистрации 01.86.0043366 )

В данной работе впервые проведено изучение антигенной структуры молекулы 1еЕ человека с помощью мкАГ, протеолитических фрагментов и синтетических пептидов и установлена локализация антигенных детерминант, распознаваемых мкАт серии 1еЕ/11. Разработан метод сравнительного изучения тонкой антигенной специфичности мкАт, основанный на использовании ограниченного прогеолиза и иммуноблоттинга; метод может быть использован для паспортизации мкАт,

Впервые с использованием[ трансфектомы исследован биосинтез молекулы 1еЕ человека и роль гллкозшшрования в процессе синтеза и секреции. Установлено, чте гетерогенность 6-цепи молекулы 1еЕ человека обусловлена М-гликозилированием» а полное ингибирование И-гликозили-рования с помошью туникамицина ( 1М ) не блокирует секреции 1еЕ.

Впервые в отечественной практике разработан полуколичественный вариант тест-системы, позволяющий визуально оценивать концентрацию 1ёЕ в сыворотке крови человека. Разработанная тест-система не требует дорогостоящего оборудования и предельно проста в использовании. По своим характеристикам тест-система не уступает аналогичным наборам зарубежных фирм. Предложенная тест-система прошла испытания в лаборатории клинической иммунологии Института Иммунологии МЗ СССР, лаборатории клинической аллергологии 2 ШЛГМИ им.Н И.Пирогова и в центре "Иммунопрофилактики" АШ СССР.

Исследована возможность использования мкАт серии 1дЕ/11 в тест-системах для измерения уровня аллергенспецифических 1гЕ антител. Проведен сравнительный анализ мкАт с антителами, применяемыми в коммерческих тест-системах.

Разработан метод препаративного выделения на аффинных сорбентах с поли- и мкАт серии 1еЕ/11 из 1еЕ содержащих жидкостей,

Положения выносимые на ващиту; 1. Использование мкАТ серии 1еЕ/11 для выделения 1еЕ в препаративных количествах на аффинных сорбентах. 2. Использование мкАт серии ГеЕ/11 для изучения антигенной структуры молекулы 1еЕ. 3. Изучение процесса биосинтеза 1еЕ и роли гликозилирования в процессе синтеза и секреции с помощью трансфектомы. 4. Метод полуколичественного определения уровня общего 1еЕ в сыворотке крови человека с визуальной оценкой результатов анализа 5. Использование ыкАт серии 1еЕ/11 для определения уровня аллергенспецифических 1еЕ антител.

Апробация работы. Диссертация апробирована 12 сентября 1S90 г. на коллоквиуме отдела медицинских диагностикумов НПО "Биотехнологии" Минмедпрома СССР

Материалы диссертации представлялись на;1 съезде иммунологов в г. Сочи 198Эг. , республиканской конференции "Иммуноферментный анализ в медицине "г. Харьков 1989 г., школе по молекулярной биологии г. Тарту 1988 г., 6-ом международном конгрессе по быстрым • методам иммуноанализа - "RAMI-90" г.Хельсинки 1990 г.. международном симпозиуме "IgE: регуляция синтеза и клиническая значимость" г. Москва 1990 г.

Публикация результатов исследования. Но материалам диссертации опубликовано 10 работ .

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертационная работа изложена на 155 страницах машинописного текста , включает 11 таблиц и 30 рисунков. Список литературы содержит 189 источников.

Результаты исследования и их обсуждение.

Одна из основных задач данной работы - иммунохимическое изучение антигенной структуры молекулы IgE и определение тонкой антигенной специфичности моноклокальных антител серии IgE/11, полученных ранее в НПО " Биотехнология Краткая характеристика антител представлена в табл. 1

Для выполнения этой работы было необходимо большое количество высокоочищенного препарата IgE.

Выделение IgE в препаративных количествах рассматривалось нами кау важная самостоятельная задача, так как этот белок используется в тест-системах для определения уровня общего IgE в качестве стандартных растворов. Кроме того, высокоочищенный препарат IgE необходим в исследованиях по регуляции синтеза IgE in vitro. В этих исследованиях определенный интерес представляет сравнительное использование наряду с миеломным белком политонального и рекомбинантного IgE . В работе мы ориентировались на иммуноаффинные методы.

1. Выделение IgE методом иммуноаффинной хроматографии с использованием моноклональаых антител и характеристика выделенных препаратов.

Моноклональные антитела IgE/11-1, IgE/11-3, IgE/11-4 IgE/11-5.

в одинаковых условиях связывали с ВгСМ-активированной сефарозой. Затем эти сорбенты использовали для выделения 1еЕ из суперкатанта клеточной линии Концентрацию IеЕ в образцах измеряли иммунофермент-ньгм методом (ИФА ), а содержание белка - спектрофотометрически на всех этапах работы. Все 4 сорбента имели примерно одинаковую степень пришивки мкАт и практически полностью связывали присутствующий в пробе 1еЕ. Однако, содержание ¡еЕ в образцах, элшрованных с сорбентов, оказалось различным. Выход 1еЕ варьировал от 80 до 20 процентов: наибольший выход давали сорбенты с 1еЕ/11-4 (73 X) и-1еЕ/11-5 антителами (80 %), а наименьший - 1гЕ/11-3 (20%). Полученные образцы анализировали методами электрофореза 'в полиакриламидном геле ( ДСН-ПААГ электрофорез ) и >иммуно(?лоттинга.

Следует отметить возможность более полного высвобождения связанного 1дЕ, при более" жестких условиях элюции, однако анализ методами ДСН-ПААГ электрофореза и иммуноблоттинга показал, что при этом происходит частичная деградация молекулы. Мы же стремились подобрать условия элюции, обеспечивающие максимальное сохранение свойств ин-такткого 1еЕ.

Исходя из полученных результатов для препаративного выделения 1еЕ бьиш выбран иммуносорбент на основе мкАт 1еЕ/11-5.

Для синтеза иммуносорбентов на основе поликлональных антител использовали антитела кролика к 1еЕ человека (" ОАКО-РАПЭ". Дания ) . истощенные на сорбенте с человека.

На синтезированных иммуносорбентах были выделены и охарактеризованы препараты миеломного 1еЕ ( Ю ), поликлонального 1дЕ из сыворотки крови , рекомбинанткого 1вЕ ие супернатанта клеточной линии ДО, а также препарат поликлонального 1еЕ, элюированный с иммуносор-бента после процедуры экстракорпоральной плазмаиммуносорбции. Для каждого случая проанализирован выход препарата и потери на всех этапах выделения.

Анализ методом ДСН-ПААГ электрофореза препаратов, подученных на сорбенте с поликлональными антителами выявил высокую гомогенность выделенного белка - наличие единственного компонента с мол. массой 180 КД. Анализ методом иммуноблоттинга не выявил примеси кроличьих иммуноглобулинов и их фрагментов .

Аналиэ выделенных препаратов методами двухсайтового твердофазного иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга показал, что в про-

цессе выделения JgE на аффинных сорбентах при выбранных нами условиях сохраняется антигенная структура молекулы и набор антигенных детерминант, распознаваемых мкАт серии IgE/11 .

Таким образом, полученные нами препараты IgE пригодны для изучения антигенной структуры молекулы IgE, а разработаный метод выделения IgE с помощью иммуносорбентов на основе моноклональных и полигональных антител позволяет получать препараты, сохраняющие мол. массу и антигенные свойства нативного IgE. '

2. Изучение антигенной структуры молекулы IgE с помощью монок-лональных антител, протеолитических фрагментов и синтетических пептидов. " ' Эксперименты по характеристике тонкой антигенной специфичности моноклональных антител серии IgE/11, и локализации антигенных детерминант , распознаваемых этими антителами, на &-цепи молекулы Igt человека проводили с использованием миеломного IgE (Ю ) и рекомбинант-ного IgE ( JW/ ).

Для решения задачи был выбран метод ограниченного протеолиза. Молекула IgE под воздействием папайна, трипсина и пепсина образует ряд высокомолекулярных фрагментов, при этом антигенные детерминаты .&-цепи ( DjO. D61, D62 ) оказываются расположенными на разных фрагментах молекулы. Образовавшиеся в результате ограниченного протеолиза фрагменты молекулы разделяли с помощью ДСН-ПААГ электрофореза и, затем, методом иммуноблоттикга оценивали взаимодействие исследуемых мкАт с фрагментами молекулы. Для идентификации фрагментов использовали данные по молекулярной массе, а также коммерческие антитела со специфичностью к Dgl детерминанте ( расположенной в СН2 домене ) и антитела к легким цепям иммуноглобулинов человека

Ниже кратко представлены результаты, полученные при использовании папаина:

Анализ фрагментов на основе данных по молекулярной массе и их идентификация антителами с известной специфичностью позволяет выявить: Fc-фрагмент молекулы IgE. С 92 КД ) , Fab- фрагменты молекулы IgE ( 45-60 КД для IgE ( JW ) и 60 КД для IgE (Ю ). FC- фрагмент ( 35-40 КД ), легкие цепи молекулы ( 30 КД ) ,а также выбрать оптимальные условия протеолиза Так, в случае использования папаина для проведения дальнейшего анализа были выбраны 30 минутная и 24 часовая

Табд. 1. Свойства моноклонапьных антител серии 1еЕ/11

Антитело Вид антитела взаимодействие с КсГ1 способ очистки антител

подиилоналъ ным 1дЕ миеломным 1бЕ (Юс) 10 м

№/11-1 1. к + + 1.8 ЙОХ

1еЕ/и-2 1. к + + 1.8 ЙОХ

1ВЕ/11-3 1. К + + 1.1 ЙОХ

1бЕ/11-4 1, к + /+ 1.4 ЙОХ

1ВЕ/11-5 1. К л + + 1.2 ЙОХ

1еЕ/и-5 2а, к. + + - белок А

1ВЕ/11-7 ,1, к + - белок А

1ВЕ/11-8 2а. к + + - белок А

1ВЕ/11-9 • 1. к - + - ЙОХ

1ВЕ/11-10 1. к - + - ЙОХ

Табл. 2. Взаимодействие мкАТ серии IеЕ/11 с протеолитичес-кими фрагментами молекулы 1гЕ.

фрагменты молекулы 1«Е антигенные детер минанты цепи взаимодействие с антителами

мкАт серии 1вЕ/11 поликлональные

1 2 3. 4 5 6 к легким цепям к 1ВЕ (Ой1 )

1еЕ Dl.DS.Do + + + + + + + +

Го- папаин 01,02 + + + + + + - +

ГаЬ-папаин йо - + - - - - + -

Гс' -папаин 01 - - + - + + - +

Гс*-трипсин - - + - + 4 - +

Г(аЬ)2 пепс Э1 Оо + + + + + +

Оо - идиотипическая детерминанта

инкубации с ферментом.

Анализ специфичности мкАт методом иммуноблоттинга в невосс-танавливаюших условиях ДСН-ПААГ электрофореза выявил следующее: антитела IgE/11-З и IgE/11-5 дают сходную картину и взаимодействуют с Fc- и Fc'- фрагментами, антитела IgE /11-4 и IgE/11-l взаимодействуют только Fc- фрагментом. Антитело IgE/11-2 взаимодействует с Fc-фрагментом, и , наряду с этим, с Fab-фрагментом .

Анализ взаимодействия мкАТ с папаиновыми фрагментами молекулы IgE ( ¡0 ) в восстанавливающих условиях ДСН-ПААГ электрофореза показал, что антитела IgE/il-3, IgE/11-5, IgE/11-6, и кроличьи антитела к IgE выявляют одни и теме фрагменты молекулы IgE. Точная идентифи-цикация этих фрагментов требует дополнительных исследований.

По описанной выше схеме был проведен анализ с использованием трипсина и пепсина.

Данные по взаимодействию антител ( IgE/ll - 1 - IgE/11-6 )с протеолитическими фрагментами молекулы IgE представлены в табл. 2.

Таким образом, о помощью методов ограниченного протеолиза, последующего электрофоретического разделения образующихся фрагментов, и дальнейшего иммунохимическсго анализа с использованием иммуноблоттинга было проведено исследование тонкой антигенной специфичности моноклональных антител серии IgE/ll.

Установлено, что антитела IgE/11-3, IgE/11-5 и IgE/11-б взаимодействуют с Fc' фрагментом молекулы IgE и распознают эпитопы, расположенные в СН2 домене; антитела IgE/11-l и IgE/11-4 взаимодействуют с Fc фрагментом, но не с Fc' фрагментом молекулы IgE, и распознают детерминанты в области СНЗ-СН4 доменов .

Для продолжения работы по изучению тонкой антигенной специфичности моноклональных антител серии IgE/ll, а также для изучения локализации детерминант, распознаваемых мкАТ. на&-цепи молекулы IgE целесообразны исследования с использованием сиквенса отдельных фрагментов молекулы.

Для определения антигенных детерминант, распознаваемых IgE/11-l и IgE/11-4, и локализованных предположительно в области 3-4 доменов были использованы синтетические пептиды.

Участки аминокислотных последовательностей £-цепи в области СНЗ -СН4 доменов , предположительно включающие возможные антигенные

11-1

11-3

11-4

11-5

*T3R№ >*g If1» Д

■^ssasssr^

ЖД

Ш PS-ljE-BGC ЕЭ PS-lgE ЕЗ ген i-4 E2J Г-СН 2-4 О rCH 3-4 E3 fCH 4

20 40 60 B0|

Рис.

Взаимодействие антител о клонированными фрагментами молекулы ТкЕ.

Данные предоставлены доктором A. L. de Week (г.Берн, Швейцария )

Г

Г 1

г

jq

г

г

. I

1 J

V J

—

v

} >

Рис. 2.

Расположение антигенных детерминант, распознаваемых ыкАт IgE/il

на молекуле IgE. |-

П' Г

D tl

-г Т,Е/п-3 &/H-S

Xhe/n-e

детерминанты, отбирались на основании анализа данных по гидрофобнос-ти, амфифильности, амфипатичности и расположения ^-изгибов на£-це-пи. Выбор участков основывался на результатах работ с крысиным и человеческим IgE .В результате теоретического анализа было отобрано 11 последовательностей и для четырех из них в Институте особо чистых препаратов ( Ленинград ) были синтезированы пептиды П1-П4 (включающие последовательности 331-347; 362-381; 498-511; 517-536), которые были исследованы в реакциях ингибирования связывания моноклональных. антител ( IgE/11-l - IgE/11-5 ) с молекулой IgE и прямого взаимодействия с мкАТ, Было установлено, что исследованные пептиды ( П1 - П4) не ингибировали связавание мкАТ с IgE ( Ю ) и указанные мкАТ не взаимодействовали с пептидами. В тоже время, антитела, полученные к пептидам взаимодействовали как с соответствующим пептидом, так и с интактной молекулой IgE.

Изучение специфичности некоторых мкАТ серии IgE/11 было проведено в институте Иммунологии ( г.Берн, Швейцария ) с использованием клонированных фрагментов молекулы IgE С PS ), включаюших домены £-цепи в разных комбинациях. Результаты любезно предоставленные A. L. de Week представлены на рис.4. Антитела IgE/11-З и IgE/11-5 взаимодействовали с фрагментами, в состав которых входил СН2 домен. Антитела IgE/11-4 взаимодействовали с фрагментами, включающими СН2-СН4 и СНЗ-СН4 домены в большей степени, чем с фрагментом, включавшим СН1-СН4 домены. Антитела IgE/11-l взаимодействовали с целой молекулой IgE ( PS ) и очень слабо взаимодействовали с фрагментами включавшими СН2-4, СНЗ-4 И СН4.

Эти результаты коррелируют с данными, полученными нами с применением протеолитических фрагментов молекулы IgE и подтверждают сделанные нами выводы об антигенной специфичности мкАТ IgE/11.

Таким образом, с помощью моноклональных антител, протеолитических фрагментов и синтетических пептидов была исследована антигенная структура молекулы IgE человека и установлена топография антигенных детерминант, распознаваемых б моноклональными антителами серии IgE/И ( рис. 2 )

3. Изучение биосинтеза IgE и роли гликозилирования в синтезе и секреции.

Уникальная особенность молекулы IgE - высокий уровень гликозилирования, причем, роль углеводных остатков в иммуноглобулинах окон-

чательнс не выяснена Предполагается, что олигосахаридные боковые цепи 1дЕ поддерживают конформацию доменов, необходимую для их функции, защищают молекулу от деградации, экранируя места, чувствительные к протеолитическим ферментам, и принимают участие в транспорте и секреции молекулы I дЕ.

Для выяснения рот гликозшшрования в биосинтезе иммуноглобулинов используются ингибиторы гликозилирования. такие как туниками-цин, свейнсанин , кастачоспермин и г. д., которые блокируют процесс гликозилирования на различных стадиях. Наиболее широко используется туникамицин ( ТМ ). Данные о влиянии туникамицина на синтез 'и секрецию 1дЕ противоречивы. Так, 11<^ата 3. (1985/г.) показал, что ТМ не ингибирует секрецию 1еЕ клеточной линией и-266 , тогда как 0. бгапаЬо (1986 г.) показал, что ТМ блокирует секрецию 1еЕ из клеток мышиной гибридомы. „

Представляло интерес выяснить, связано ли это различие с особенностью молекулы* 1«гЕ или с особенностями клеточных линий. -С этой целью для изучения синтеза 1дЕ мы использовали клеточную линию трансфектомы, полученную путем трансфекции гена рекомбинанантного 1еЕ человека в мышиную миеломную клеточную линию (Не^Ьегдег М. 1985 ). Одновременно был исследован механизм процессинга 1бЕ, в частности роль углеводной компоненты в секреции и гетерогенности молекулы 1еЕ.

Было использовано мечение клеток с помощью а" 5-метионина иммунопреципитация и ДОН-ПААГ электрофорез для анализа меченого белка. Наряду с долговременным мечением .для изучения деталей процесса был использован метод импульсной метки. После инкубации клеток в присутствии з5-3 метионина в течение 5 минут, в среду вносили избыточное ( 100 кратное ) количество холодного метионина Через определенные промежутки времени отбирали и анализировали аликвоты суперна-танта и клеток и, таким образом, следили 8а появлением предшественников и зрелых форм молекулы 1еЕ внутри клеток и в кудьтуральной среде. Опыты проводили параллельно в присутствии и отсутствии в среде ТМ.

Было установлено, что внутриклеточный пул предшественников молекулы 1еЕ выделенный из клеточного лизата занимает широкую диффузную область с мол. массой 80 к. Д. Молекулы 1дЕ, выделенные из супернатанта, также гетерогенны и представлены на электрофореграмме компонентами с мол. массой в области 85-90 к. Д. Внесение в среду инку-

бации ТМ резко снижает гетерогенность молекулы IgE: как из клеточного лизата , так и из супернатанта выделяется одна гомогенная форма молекулы представленная на электрофореграмме дискретной полосой с мол. массой 65 кД. Следовательно, гетерогенность молекулы IgE, выделенной из клеточного лизата и из супернатанта, выявляемая при анализе с помощью ДСН-ПААГ электрофореза, обусловлена N-гликозилирсза-нием; эта гетерогенность устраняется при ингибировании биосинтеза с помощью ТМ.

В опытах с импульсной меткой было установлено, что секреция молекулы IgE начинается спустя 30 минут после инициации трансляции и достигает максимума спустя 120 минут. Присутствие ТЫ не оказывает влияния ни на начало секреции, ни на ее кинетику. Таким образом, ту-никамицин, полностью ингибируя гликозилирование молекулы IgE, не блокирует других этапов биосинтеза ( сборка, внутриклеточный транспорт ) и не препятствует секреции молекулы. Следовательно, гль<ози-лирование не является необходимым фактором синтеза и секреции полноценной молекулы IgE.

Этот результат совпадает с данными S. IksJama,полученными на клеточной линиии U-266, продуцирующей миеломный IgE человека В тоже время в сочетании с данными D. Granato об ингибировании ТМ секреции IgE мыши полученные нами данные указывают на то, что влияние ТМ на секрецию молекулы IgE определяется не клеточной линией, а особенностями молекулы, конкретно ее константной частью, участвующей в про-цессинге.

Известно, что М-гликозилирование гликопротеинов происходит по следующей схеме: присоединениеикоровыхбогатых маннозой олигосаха-ридов, затем, последовательнное отщепление остатков маннозы ( тримминг ), затем присоединение галактозы, и. наконец, присоединение концевых остатков N-ацетилнейраминовой кислоты непосредственно перед секрецией или экспрессией на клеточной мембране.

Для выяснения того, реализуется ли данный механизм в случае IgE, нами было проведено исследование молекулы IgE. выделенной из внутриклеточного пула и молекулы IgE, выделенной из супернатанта с помощью гликозидаз: Эндогликозидаэы Н ( ЭндоН. ЕС. 3.2.1.96 ) и N-ацетилнеЙраминидазы ( ЕС.З. 2.2.18) Известно, что нейраминидаза отщепляет концевые сиаговые кислоты, такие как 5Н-ацетилнейраминовая кислота ( NANA ) и 5Ы-глкколилнейраминовая кислота (NGNA ), тогда

как Эндо-Н осуществляет гидролиз гликозидных связей только в глико-протеинах, богатых маннозой и не содержащих концевых сиаловых кислот

Было установлено, что обработка IgE, выделенного из суперна-танта с помощью Эндо-Н не приводила к изменению кажущейся молекулярной массы в ДСН-ПААГ электрофорезе, в то время как в лизате большая часть пула IgE подвергалась гидролизу и при этом происходило снижение мол. массы до 62 КД Это может являться следствием гидролиза богатых маннозой олигосахаридов у предшественников молекулы IgE во внутриклеточном пуле. Обработка нейраминидазой молекулы IgE из „суперна-танта, в отличие от воздействия Эндо-Н, приводила к снижению мол. массы у части пула молекул IgE : ( с 85^87 до 80-82 КД ) т. е. до положения предшественника .

Молекулы IgE, выделенные из клеточного лизата, и нечувствительные к действию нейраминидазы содержат концевые остатки сиаловых кислот. Таким образом, секретируемая форма молекулы IgE, в отличие от внутриклеточных предшественников, содержит концевые остатки сиаловых кислот.

Полученные данные свидетельствуют, что процесс бисинтеэа молекулы IgE человека в трансфектоме JV происходит по схеме, описанной для IgD и других иммуноглобулинов в шеломах игибридомах. Наблюдаемые различия и особенности процесса биосинтеза обязаны скорее аминокислотной последовательности тяжелой цепи, чем особенностям клетки-продуцента

4. Использование мкАт серии IgE/11 для определения уровня ал-лергенспецифических IgE антител.

Возможность использования мкАт серии IgE/11 для измерения уровня аллергенспецифических IgE антител выясняли путем сравнения исследуемых мкАт с антителами фирмы Pharmacia Для проведения анали-ва мкАт uemuai*!, остальные компоненты (контрольные сыворотки и диски с аллергеном пыльцы березы) были взяты из набора RAST ( "Pharmacia" Швеция') Для подбора оптимальных условий ( соотношение величин "F* , "Z связывания" и "Во" ) было исследовано влияние величины добавленной активности ( Во ) на разрешающую способность тест-системы. Было обнаруженно, что значения Во-3- 8x10 являются оптимальными, так как несмотря на рааличия в абсолютных вначениях "В", для поли- и мконоклональных антител значения величин )(Х связывания '

Рис.3 Влияние величины В^ во второй ступени RAST процедуры на форму -.алибровочной кривой. Использовались референс-сыворотки и диски с иммобилизованным аллергеном пыльцы березы ( Pharmacia ), по оси абцисс концентрация аллер-генспецифических IgE-антител (PRU/тл ); по оси ординат - величина связанной активности В ( в имп/мин.); 1 - 6 величина добавленной активности Вв ( в имп/мин): 1 - 5 IgE/11-l [ 300 кБк/мкг ( 8.7 мкКи/мкг)];

6 - поликлональные антитела ("Pharmacia") [ 444 кВк/мкг,( 12 мкКи/мкг )]; 1 4,0х10\ 2 8,0x10 . 3 5 3,5x10 , 4 т l.OxlCf 5 - 1,3x10е, 6 - 4,0x107

OD • • •

2fl • • • •

е t,o - • • • •

0,2 • • •• • • • •• ••••••• ---- • •

0 / 2 э-ч

Рис.*1 . Определение IgE специфических антител к тимофеевке в сыворотке крови 67 пациентов, проведенное с мкАТ lgE/11. Использованы аллерген пыльцы тимофеевки (Ставрополь) и IgE/11-J антитела. Ш оси абцисс - классы RAST ("Pharmacia"); По оси ординат - значения ОД для соответствующих сывороток, полученные в ИФА-процедуре.

при высоких концентрациях специфического IgE ( 17,5 PRU/мл) практически совпадали . Важно отметить, что полученные величины " 7. связывания" и "В" укладывались в диапазон контрольных значений в системе RAST ("Pharmacia").

С учетом подобранного соотношения поли- и мконоклональные антитела были использованы для измерения концентрации специфических IgE антител в индивидуальных сыворотках с различным содержанием антител к клещевым аллергенам и компонентам домашней пыли-в системе RAST. Распределение сывороток по классам проводили по результатам, полученным с контрольными сыворотками и конъюгатами соответствующих антител. Оказалось, что результаты распределения сывороток по классам при использовании поликлональных антител ( RAST "Pharmacia" ) и мкАТ IgE/11-l в основном совпали ( 93% случаев). Но в трех случаях ( 7% от общего числа сывороток, использованных в данном опыте ). сыворотки попали во 2 класс в тест-системе RAST, тогда как по результатам тестирования с моноклональными антителами могли быть отнесены только к 1 классу.

Факт занижения результатов тестирования при низких концентрациях специфического IgE имеет принципиальное значение,так как именно граница 1-ого и 2-ого классов является диагностически значимой.

Проведенное прямое сравнение исследуемых мкАТ с антителами из RAST-наборов (" Pharmacia") с использованием референс-сывороток и индивидуальных сывороток дало представление о поведении мкАТ в системе RAST.

При создании собственной тест-системы мы ориентировались на иммуноферментный плашечный вариант анализа, и использовали аллергены пыльцы березы и тимофеевки производства НПО "Аллерген'Ч г. Ставрополь) , и мкАт, конъюгированные с пероксидазой хрена. Для подбора оптимальных условий анализа использовали аллергены пыльцы березы ( НПО "Аллерген") и контрольные сыворотки из набора RAST.

Для характеристики конъюгатов мкАт мы заменили поликлональные iji-

антитела, меченые I. (Pharmacia ), на мкАт, конъюгированные с пероксидазой хрена в наборе RAST. Оказалось, что наилучшая разрешающая способность наблюдалась при использовании антител IgE/11-l. Смешивание антител IgE/11-l и IgE/11-4, а также всех исследуемых антител не повышало чувствительности системы. Выяснилось, что мкАТ IgE/11-З дают линейную калибровочную кривую, но чувствительность этих антител

значительно ниже, чем остальных . Для дальнейшей работы были выбраны антитела IgE/11-l и IgE/11-З.

С учетом полученных результатов, мы провели серию экспериментов, в которых использовали два препарата пыльцы тимофеевки, обозначенные ВМ и KIL Препарат КП - это серийный препарат с концентрацией ЮООО PNU/ мл: , препарат ВМ был приготовлен из маточного раствора пыльцы тимофеевки путем диализа и лиофильного высушивания. В этих опытах оценивали влияние времени инкубации с сыворотками и чувствительность IgE/11-l и IgE/11-З антител. Оказалось, что IgE/11-l антитела обладают большой чувствительностью, как при короткой 3 часа ), так и при длительной ( 12 часов) инкубации с сыворотками. Препарат ВМ давал тест-систему с большей чувствительностью и лучшей разрешающей способностью, причем при использовании препарата КП величины ОД были значительно ниже, чем при использовании препарата ВМ. Эта разница особенно отчетливо проявлялась для сывороток с высоким и промежуточным содержанием специфического IgE, и только в случае очень высокого содержания специфических IgE антител, значения ОД при использовании препаратов КП и ВМ были одинаково высокими. . Таким образом, препарат ВМ более пригоден для создания тест-системы, позволяющей работать во всем диапазоне концентраций, тогда как препарат КП дает систему с очень низкой разрешающей способностью.-

Используя препарат ВМ и индивидуальные сыворотки больных с различным содержанием специфических IgE к пыльце тимофеевки, отобранных по результатам RAST и PRIST анализов, мы попытались создать вариант тест-системы, основанный на применении мкАт IgE/11.

Полученные данные в единицах оптической плотности относительно результатов анализа в системе RAST представлены на рис.Ч. Только 4 сыворотки положительные в RAST, в нашей тест-системе дали отрицательные результаты. Все эти сыворотки относились к 1 классу RAST. Таким образом, можно отметить следующее: 1. В нашей тест-системе не получено ни одного ложноположительного результата Даже сыворотки с очень высоким содержанием общего IgE С 1000 ME/мл ) давали в нашей тест-системе значения, не превышающие фоновые. 2. Сыворотки с очень низким содержанием общего IgE ( 20 - 50 ME/мл), принадлежащие к 3-4 классам RAST в нашей системе давали высокие значения ОД. что свидетельствует о высокой чувствительности системы. 3. Сыворотки с высоким содержанием специфического IgE (2, 3, 4 классы DAST ) давали в

- 16 -

нашей системе высокие значения (ОД >1,0).

Так как ИФА не позволяло строго количественно сопоставить результаты с данными, полученными в системе RAST, по такому параметру как " X связывания", представлялось целесообразным сравнить результаты ИФА и RIA вариантов нашей тест-системы, используя мкАТ,меченные mI и пероксидазой хрена. Сравнение ИФА и РИА вариантов разработанной тест-системы было проведено на 19 сыворотках с различным содержанием специфических IgE антител к аллергену пыльцы тимофеевки и выявило хорошую сопоставимость результатов: высокие значения "X связывания" соответствовали высоким значениям ОД в ИФА.

Сравнение результатов ИФА и RIA вариантов разработанной тест-системы на основе мкАт IgE/11 с результатами RAST позволяет отметить, что надежность тестирования сывороток 1 класса RAST является проблематичной. Использование моноклональных антител, меченных|251 в пределах тест-системы RAST, показал, что чувствительность моноклональных антител в ряде случаев уступает поликлональным антителам, что выражается в некотором занижении результатов при низких концентрациях специфических IgE антител. Выявляются отдельные случаи, когда сыворотки 2-ого класса в системе RAST по результатам тестирования с поликлональными антителами «о результатам анализа с мкАТ IgE/11-l могут быть отнесены только к 1-ому классу RAST. Таких случаев немного, но они важны, так как именно граничные значения 1-ого и 2-ого классов являются диагностически значимыми.

С аналогичной проблемой столкнулись J. Grassi при изучении возможности использования мкАт BS17 и Le27 в аллергодиагностике. Несмотря на то , что чувствительность этих антител в PRIST-анализе (<0,5 ME/мл ) не уступала поликлональным антителам, кривые титрования сызороток, полученные в RAST процедуре с мкАт отличались от кривых, полученных с поликлональными антителами. Наблюдалась картина, аналогичная описанной выше с мкАТ IgE/11-l. Как выход из ситуации авторы предлагают использование более емких матриксов для иммобилизации аллергенов, а также использование смеси двух мкАт для выявления IgE. Но смешивание двух антител BS17 и Le27 по данным самих авторов приводило к незначительному повышению результатов только при значительном увеличении величины Во. В наших опытах использование смеси антител ( серии IgE/11 ) не приводило к увеличению чувствительности системы.

Полученные результаты позволили сделать следующие заключения:

1. Моноклоналъные антитела серии IgE могут быть использованы в конструировании тест-системы для определения аллерген-специфического IgE. Наиболее перспективными для этой цели являются мкАт IgE/11-l.

2. Моноклоналъные антитела не могут быть использованы для простой замены поликлональных антител в пределах тест-системы RAST (Pharmacia) с сохранением ее стандартов и граничных значений нормы. Для разработки тест-системы с использованием мкАт необходимо разработать собственные стандарты и граничные значения нормы.

3. Наиболее перспективной, с нашей точки зрения, является разработка полуколичественного скринингового теста, на выявление сенсибилизирующего агента, основанного на ДОТ-варианте иммуноферментного анализа. Такие тест-системы уже выпускаются зарубежными фирмами . Работа по созданию аналогичной системы начата и результаты показывают, что igE/11-l антитела позволят сделать этот тест достаточно чувствительным.

4. Использование мкАт IgE/11 в резработке метода мембранного ИФА для визуального полуколичественного определения IgE.

Развитие методов иммуноанализа на основе мкАт позволило сразу нескольким фирмам ( "СМЗ", Швецария; "Quldel". США; ) разработать и выпустить принципиально новые тест-системы, основанные на визуальной оценке полученных результатов. Для использования этих систем не требуется дорогостоящего оборудования, такого как ^-счетчики, спектрофотометры для планшет и пробирок, что значительно расширяет возможности их использования. В качестве твердой фазы в этих тест-системах использованы мембранные носители ( целлюлоза, нитроцеллюлоза и т. д.)

Представлялось целесообразным оценить возможность создания аналогичных тест-систем с использованием отечественных реагентов и моноклональных антител IgE/11.

Не стремясь к достижению максимальной чувствительности , мы поставили задачу сконструировать систему, обеспечивающую визуальную оценку результатов в диапазоне от 0 до 1000 ME/мл IgE, поскольку этот диапазон перекрывает значения нормы и наиболее широко распространенных случаев патологии.

Для разработки лабораторного варианта тест-системы мы выбрали точечный вариант анализа на нитроцеллюлозных фильтрах. На стадиях нанесения мкАТ на твердую фазу и инкубации с образцами испольвовали

48 луночную камеру Minlfold ("Bio-Rad" США ).

Были подобраны пары моноклональных антител, дающие наилучшие результаты в описанном варианте анализа Для сенсибилизации твердой фазы были выбраны антитела IgE/11-4. В качестве проявляющих использовали антитела IgE/11-l и IgE/11-З, конъгагированные с пероксидазой хрена

Следует отметить, что антитела IgE/11-4, сорбированные на полистироле, не образуют функциональной комбинации с антителами IgE/11-З , тогда как при сорбции на нитроцеллюяозную мембрану такая тест-система образуется. Это указывает на зависимость структурно-функциональных свойств сорбированных мкАт от особенностей твердой фазы. Указанную особенность, присущую только мкАт, полеэно учитывать при конструировании тест-систем на их основе.

Выли подобраны следующие оптимальные условия проведения анализа: концентрация сенсибилизирующих антител - 5 мкг/мл при объеме вносимого образца - б мкл, время инкубации с образцами и с проявляющими антителами 45 минут для каждого этапа при 20 вС.

Показана также возможность проведения анализа в одну стадию, т.е. одновременная инкубация исследуемых образцов и проявляющих антител, при сохранении основных характеристик тест-системы, что принципиально важно при массовых исследованиях, так как сокращает общее время анализа и значительно снижает трудоемкость.

Использование мкАт IgE/11-l и IgE/11-З и миеломного IgE ( Ю ) позволяет получить калибровочные кривые, дающие возможность проведения полуколичествекного определения IgE в сыворотках. Результаты тестирования 16 индивидуальных сывороток с различным содержанием IgE показывают, что интенсивность окрашивания полосы на мембране прямо коррелирует с содержанием IgE в сыворотке. Эти величины могут быть оценены полуколичественно путем визуального сравнения с калибровочной кривой.

На рис. S. представлены результаты анализа сыворотки с очень высоким содержанием IgE ( > 10000 ME/мл ). В качестве стандартов для построения калибровочной кривой использовали миеломный IgE ( Ю ). Оценка интенсивности окрашивания проводилась с помощью денситометри-рования. Из представленных данных следует, что разработанная тест-система имеет наилучшую разрешающую способность в диапазоне концентраций 0 - 1000 ME/мл. Следует также отметить, что несмотря на

Рис. Б.

Определение общего IgE методом ИФА на нитроцеллюлоаных фильтрах.

1 - миеломный IgE ( Ю )

2 - поликлонаяьный IgE

то, что в диапазоне 1000 - 10000 МЕ/мл линейность нарушается, не наблюдается выраженного " Хук"-зффекта, это позволяет проводить анализ без предварительного разведения образцов.

Один из варианов тест-системы прошел клинические испытания в ряде лабораторий г. Москвы, В настоящее время разрабатывается линейный дозатор для нанесения твердофазного реагента, что позволит перейти к серийному выпуску наборов для полуколичественного определения уровня общего № Разработанное приборное обеспечение будет использовано такяаэ для нанесения аллергенов в тест-системах для измерения уровня аллергенспецифического 1дЕ. Таким образом:

1. Равработан мембранный вариант иммуноферментного анализа позволяющий проводить как количественное ( при наличии денситометра) . так и полуколичественное визуальное определение концентрации 1&Е в сыворотке крови.

2. Разработанная тест-система имеет широкий рабочий диапазон (0 - 1000 МЕ/мл ), что позволяет проводить анализ образцов сыворотки без их предварительного разведения. Это является серьезным преимуществом разработанной тест-системы по сравнению с некоторыми тест-системами зарубежных фирм (" (Зи1<Ы " США ).

Разработанная тест-система может найти широкое применение в практическом вдравохранении

ВЫВОЛЬк

1. С помощью моноклональных антител, протеолитических фрагментов и синтетических пептидов исследована антигенная структура молекулы IgE человека Установлена топография антигенных детерминант, распознаваемых 5 моноклональными антителами серии IgE/11

2. О помощью трансфектомы JW, методов импульсной метки и ингибиторов гликоэилирования изучен процесс биосинтеза молекулы IgE и роль гликозилирования. Обнаружено, что гетерогенность - цепи молекулы IgE обусловлена N-гликозилированием; секреция молекулы IgE не блокируется при полном ингибировании N-гликозилирования с помощью туника-мицина.

3. Синтезированы аффинные сорбенты на основе моноклональных антител серии IgE/ll и отработаны условия выделения и очистки IgE ив различных источников с помощью иммуноаффинной хроматографии.

4. Разработан полуколичественный метод определения IgE в биологических жидкостях, основанный на мембранном иммуноанализе с использованием моноклональных антител, позволяющий проводить визуальное определение IgE в диапазоне концентраций 0 - 1000 МЕ/мл.

5. Исследована возможность применения моноклональных антител серии IgE/11 для определения аллерген-специфических IgE антител. На основе аллергена пыльцы тимофеевки и антител IgE/11-l разработана иммуноферментная тест-система для определения концентрации аллерген-специфических IgE антител.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. моноклональные антитела к иммуноглобулину Е человека // Э. Н. Цыциков , И. Ю, Втюрина ,0. А. Таланта и др. / - Биотехнология, 1988, т. 4. N 3, С. 357-359.

2. Использование моноклональных антител к IgE человека для определения аллергенспецифического IgE в сыворотке крови.// Е.Я. Смирнова, О. А. Сердюк, !й С. Лебедин, Р. Г. Василов/ 1урн. Микроби-ол. эпидемиол. и иммунобиол., 1990, т. 7, С. 93 - 97.

3. Препаративное выделение IgE человека методом аффинной хроматографии с использованием моноклональных антлтел // О. А. Сердюк Е.Я. Смирнова , Ю.С. Лебедин, Р. Г. Василов / - "Успехи в биотехнологии": сборник трудов ВНИИ Биотехнологии 1990 г. 2. С. 87-89 .

4. В. ЛЮрин, Е. Я. Смирнова //ДОТ-иммуноферментный анализ для определения концентрации IgE в сыворотке крови человека / "Успехи в биотехнологии": сборник трудов ВНИИ Биотехнологии 1990 т. 2, С. 98-101.

5. Смирнова Е. Я., Василов Р. Г. Изучение антигенной структуры IgE человека с помощью моноклональных антител серии IgE/11 и протеолитических фрагментов молекулы IgE.// Мат. 1 съезда иммунологов - г. Сочи, 1989 . С. 295.

6. Оценка аллергенов из'клещей рода Dermatophafgoides иммуно-

Грментным методом. // Бержец Е М.. Емельянова 0. А. , Смирнова я., и др. /Мат. конференции "Применение И4>А в медицине" - г. Харьков 1989 .с.97-98 L

7. Smlrnova Е. Ya , Vastlov R. а. / Study of blosynti&sis of human IgE using transfectoma cell line JW.// International Sytrr poslum on Allergy and Clinical Immunology " Regulation and Clinical Significance of IgE" p. 65, Moscow, 1990 .

8. Vasllov R.G., Tsltslcov E. N.. Smlrnova E. Ya / Immunoglobulin E: Antigenic structure, biosynthesis and regulation.// International Symposium on Allergy and Clinical Immunology " Regulation and Clinical Significance of IgE" p. 3, Mdscow, 1990 .

9. Serdyuk 0. A., Smlrnova E. Ya , Lebedin Yu. S.. Petrova /Е. A. Purification and partial characterisation of human polyclonal IgE from single donor. // International Symposium on Allergy arid Clinical Immunology " Regulation and Clinical Significance of IgE" p. 62, Moscow. 1990 .