Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Получение и характеристика моноклинальных антител к трийодтиронину и создание тест-системы на их основе

ГОСКОМИТЕТ САНЭ1ВДНАД30РЛ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МОСКОВСКИЙ НАУЧНО- ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКШ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ им. Г.Н. ГАБРИЧЕВСКОГО

На правах рукописи

ОКУНЕВА Татьяна Олеговна

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ТРИИОДТИРОНИНУ И СОЗДАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМУ НА ИХ ОСНОВЕ

14.00.36. Аллергология и иммунология

Автореферат диссортации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

МОСКВА - 1992

Работа выполнена на кафодро клеточной физиологии и иммунологии Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор М.В. Гусев.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В.Ы. Манько

доктор биологических наук Р.Г. Василов

Ведущее учореадение: Институт Эпидемиологии и Микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи АМН 0ЖР.

Защита состоится 1992 г. в /очасов на заседании

Специализированного совета К 084.18.02 Московского научно -исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н. Габричевского по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского научно-исследовательского института эпидемиология и микробиологии им. Г.Н.Габричевского.

Автореферат разослал "Ои^/гЛССС^ 1992 года.

Ученый секретарь Специализированного совета: кандидат биологических наук О.В. Котелышкова.

-3-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В наши дни стало обычной практикой проведение миллионов анализов с использованием радиоиммунологического анализа /РИА/, предложенного Ялоу и Берсоном в 1959 году. Дагашй метод анализа наряду с достоинствами / универсальностью, чувствительностью, избирательностью и специфичностью / обладает рядом недостатков. К шил относятся : I/сравнительно короткий -период полураспада изотопов, испускающих кванты, 2/ опасность для здоровья, которую представляет введение изотопных меток, подготовка и выполнение и проведение анализов, —3/-повреждение-структуры меченых молекул, вызываемое излучением, 4/ необходимость разделения меченых и немеченых антигенов и 5/ обусловленная этим трудность автоматизации РИА.

Двенадцать лет спустя в 1971 году Ван Веемая и Щуурс ввели в употребление другой тип чувствительных меток - ферменты. Явные преимущества нового метода, получившего название иммуноферментный анализ /ИФА/, такие как ; простота выполнения, доступность и стабильность реагентов, экспрессность и возмозхность автоматизации для -проведения массовых анализов - обеспечили ему прочное положепие в клинической биохимии, при диагностике заболеваний растений и животных, в научных исследованиях.

Первостепенное значение имеет внедрение методов ИФА для целей здравоохранения. В клинической и экспериментальной эндокринологии большое внимание уделяется оценке функционального состояния ситовидной железы. Одним из паиболее информативных критериев диагностики дисфункции щитовидной келезы является количественное определенно уровней тироксипа / Т4 / и трииодтиронина / ТЗ / в сыворотке крови человека. Эти, гормоны представляют собой йодсодеркаэде аминокислоты, производные тирозина. Широкое использование определения тиреоидных гормонов в медицинской практике требует разработки простых и надекшх апа-татических методик. В последнее годы такую возможность предоставил ИФА. Необходимо создать методы иммунофермептного анализа как для детекции отдельпых горюнов, так п для одновременного определит нескольких гормонов в одной пробо, причем определение разли-ашх

тиреоидкых гормонов необходимо проводить различными методами иммуноферментного анализа в зависимости от природы тиреоидного гормона / конкурентный метод ИФА для тироксина, тршмдтиронина и их свободных фракций, сэндвич метод ИФА для белковых тиреоидных гормонов, непрямой метод ИФА для измерения уровней антител против тироглоОулина /.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. В нашей стране в настоящее время уровень ТЗ определяют лишь в крупных медицинских центрах методом РИА. Целью данной работы являлась разработка безопасного, высокочувствительного- метода на основе- твердофазного иммуноферментного анализа для трииодтиронина с использованием моноклональных антител, способного заменить РИА.

В- задачи работы входило получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к трииодтиронину, наработка, выделение и подробная характеристика этих антител, а также создание на основе моноклональных антител системы твердофазного иммуноферментного анализа для определения ТЗ в научных исследованиях и клинической практике.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. В данной работе, впервые в нашей стране были получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к трииодтиронину человека, пригодные в качестве универсальных агентов' для изучения функций щитовидной келезы. Моноклональные антитела прошли испытания в НПО "Биотехнология" и получен акт -о внедрении йх в производство. Полученные моноклональные антитела обладают высокой аффинностью, что дает возможность для создания иммуносорбентов для выделения ТЗ.

Впервые в нашей стране ,была сконструирована чувствительная кммуноферментная тест-система на основе моноклональных антител для определения уровня ,ТЗ в сыворотке крови человека в субнанограммовом диапазоне концентраций. Данная тест-система прошла испытания в МП "Иммунотех" и' готова к массовому производству. Получен акт с положительным ' заключением о внедрешм тест-системы в производство.

ПОЛОККНКЯ, ВШОСИШЕ НА ЗАЩИТУ: I.Способ получения коныогатов

гормон-белок для иммунизации кявотных и тестирования антисывороток. 2.Способ получения гибридом, продуцирующих копоклоналышэ аптитела к ТЗ, не даодие перекрестной реакции с тироксином. 3.Разработка оптимальных условий для препаративной наработки моноклональных антител к ТЗ. 4.Выделение и характеристика моноклональных антител к трийодтиронину. 5.Метод количественного определения общего уровня ТЗ в сыворотке крови человека с помощью иммуноферментной одностадийной тест-системы на основе моноклональных антител.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Диссертация была апробирована на заседании -кафедры - клеточной.. физиологии и иммунологии МГУ им. Н.В.Ломоносова и на кеклабораторном семинаре Филиала Института Оиоорганической химии им. М.М.Шемякина.

ПУБЛИКАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИИ. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ и получены акты о внедрении моноклональных антител к трииодтиронину в производство, а такие о Епедрепии тест-системы на основе данных моноклональных антител в производство.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора . литературы, экспериментальной части, результатов и их оЗсугдания, выводов • и списка литературы, включающего 99 работ. Работа изложена на 104 страницах, содержит 20 рисунков и 4 таблицы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

МАТЕРИАЛУ И МЕТОДЫ: 1.Еивотные. Мыши линии влъв/о, самки, возраст 1,5-2 месяца, вес 18-20 г. 2.Среды. Среда на основе КР!П 1640 /Flow laboratories, Scotland/ с добавлением 0,03% L-глутамина, 0,01 М раствора незаменимых аминокислот, раствора антибиотиков /5 i.rr/нл/, 0,01 М раствора пирувата натрия /Flow Laboratories, Sootland/. раствора 0,02 М 2-меркалтоэтанола /Sigma, USA/, 0,01 М раствора витаминов /Biochrom Germany/ и с добавлением 555 эмбриональной телячьей сыворотки /Plow Laboratories, Scotland/. Среда ГАТ - на основе. ПР!Я 1640 со всеми добавками, I5X эмбриональной телячьей сывороткой и с добавлением 0,01 Н раствора гипоксантина, амипоптерина, тагидша /Plow

Laboratoriee, Scotland/. Среда ГТ - на основе RPMI 1640 со всеми добавками, Ъ% эмбриональной телячьей сывороткой и добавлением 0,01 M раствора пшоксантина и тимидаиа /Plow Laboratories, Scotland/.3.Оборудование. Планшеты для культивировапия клеток и планшеты для иммуноферментного анализа /Nunc, Denmarok/, Пластиковые флаконы для культивировапия клеток /Plow Laboratories, Scotland/.

Спектрофотометрические измерения проводились на приборе "Beckman du-8B, /usa/, измерения поляризации флуоресценции проводились на специальном флуоресцентном ридоро tdx фирмы "Abbot" /usa/; работа с полистирольпыми планшетами велась на приборе "Lab syst era bíultiskan Plus" /usa/.

Синтез кеш.югатов гормон-белок.

К раствору 40 мг гемисукцинат-трииодтиронина /ТЗ-HS/ е 10 мл диметилформамида /ДОФА/ добавили при перемешивании 40 мг 1-циклогексил-3--х2-морфолино-4-этил карбодиимида, поромешивали при комнатной тешоратуро в течеше 2-х часов, затем в реакционную смесь ввели 12 мг N-гадроксилсукцинимкдного эфмра/HHS/, вновь перемешивали при комнатной температуре - в течение 2-х часов. Добавили порциями раствор 100 мг белка в 0.0IM натрий-карбонатном буфере, инкубировали 24 часа при комнатной температуре. Концентрацию антигена опроделяли

спектрофотометрически путем изморения оптической плотности раствора при 280, 300 и 325 нм, а тагам путем снятия спектра в диапазоне от 250 до 350 нм.

Иммушзация животных.

Для иммунизации животных использовали полученные ранее конъюгаты трииодтиронина с .гемоцианином /ТЗ-KLH/. В день О на одну мышь линии BALB/o /Ни J.-G., et.al., 1990 а,Ъ,о/ брали 100 мкг иммуногена в 200 мкл ЗФР /0,15 М, pH 7,2/, добавляли 200 шел полного адьюванта Фрейпда, смесь эмульгировали и вводили животному внутрибршинно. Иммунизацию повторяли на 30 и 45 дни, но использовали неполный адьювант Фрейнда . Через 10 и 40 дней после первого введения иммуногена проводили забор крови из ротроорбитального синуса по 0,1 мл. Полученные антисыворотки

исследовали на присутствие специфических антител в иммуноферментном анализе, используя для скрининга конъюгат бычьего сывороточного альбумина с трииодтирошшом /ТЗ-bsa/.

Ведение клеточ!шх культур.

Для получения ' гибридом использовали мпеломную клеточную лилию sp2/OAg 14, не продуцирующую иммуноглобулины. Клетки выращивали в пластиковой посуде, поддерживали концентрацию клеток 5хЮ5 - Зх 10® кл/мл в полной среде kpmi 1640 при 37° С и 5% концентрации углекислого газа /Kohler G., Ullstein С., 1975/

Селекцию гибридных клоток вели в тех же условиях. Для заморозки

-клетки -снимали___с . культуральной посуды резиновым плателем,

центрифугировали в режиме 1000 об/мин 10 минут. Затем ресуспондировали I0X димотилсульфоксида и замораживали в режиме 1°С в минуту. Замороженные клетки хранили при -70° С /Ведение клеток животных, 1983/.

Гибридизация. . .

Слияние клеток проводили.по методу, описанному в работе /Kohler a., iiiistein е.. 1976/. Для этого использовали 50% полиэтиленглиноль. i Соотношение клеток селезенки из иммунной мыши и клеток миеломпой линии было 6:1. После гибридизации клетки высевали в 96-луночные планшета по I05 кл/лунку в среде ГАТ, в которые предварительно были внесены перитонеальные макрофага по I04 кл/лунку также в среде ГАТ.

Скрининг гибридных клеток. Кммуноферментный анализ.

96-лупочпыо полистиролыше планшеты для юялуноферментного анализа сенсибилизировали копъюгатом ТЗ-BSA в концентрации 50 ккг/мл в карбонатном буфере /0,05 M pH 9,6/ в точение 18 часов . при 4° С. После сенсибилизации сайты неспецифической сорбщш блокировали 0,5% раствором BSA в ЗФР в течение I часа при 37° С.

После каждой стадии иммуноферлентпого анализа лунки планшетов промывали 0,9% раствором хлорида натрия с 0,05% твия-20 по три раза. Ферментативную ре акцию, проводили при следующих условиях : в 0,15 Ù фосфат-цитратном буфере pH 5.0 с 0,4 «г/мл о-фенилендаачяна и 0,03% перекиси водорода в течение 20 кинут при 22° С в темиото. Затем реакцию останавливали путем добавления

равного объема 10% серной кислоты. Оптическую плотность измеряли при 452 нм.

Клонирование гибридом.

Культуры гибридом, в супернатантах которых были обнаружены специфические моноклональные антитела к трииодтиронину, клонировали методом предельных разведений из расчета 0,3 клетки в лунку в полной среде ГАТ.

По-лученио асцитной жидкости.

Для получения асцитной жидкости животным вводили внутрибршинно по 0,5 мл пристана и через 14 дней вводили по 1-2 млн гибридных клеток, клонированных не менее 3 раз в бессывороточной среде. Через 10-20 дней у мышей с хорошо выраженной опухолью забирали асцитную жидкость, клетки из нее осаждали центрифугированием. Выделение моноклональных антител из асцитной кндкости.

Выделение моноклональных антител из асцитной жидкости проводили с помощью осаждения сульфатом аммония и ионообменной хроматографии.

Синтез коныогата гормон-пероксидаза.

Синтез коньюгата проводили н-гадроксисукцинимидным методом. Конъюгат очищали гель-хроматографией на колонке с сефадексом 0-50, уравновешенной фосфатным буфером.

При обработке экспериментальных данных были использованы показатели, наиболее часто употребляемые в биологической статистике -- среднее арифметическое, ошибка среднего и критерий Стьюдонта. В работо был выбран уровень значимости равный 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I.Получение и характеристика моноклональных антител и тркиодтиропину человека.

Для повышения иммуногошшх свойств ТЗ, его коныогировали с гомоциашшом. Как было показано рядом исследователей /Кетти Д. и др., 1991/, наличие в молекуле коньюгата спейсера, пространственно удаляет молекулу гаптена от белка носителя, что значительно повышает титр специфических к гаптену антител. Поэтому в молекулу трииодтиропина был предварительно включен гемисукцинат, который пространственно удаляет ТЗ от гемоцианина.

Как показали проведенные исследования, наличие такой своеобразной "нокки" /ТЗ-НЭ-КЪН/ повышает титр продуцируемых к ТЗ антител / рис. I/, по сравнению с титром антител, которые были получены при иммунизации кивотных коныогатом Т3-кьн. Гемисукцинат был включен в молекулу ТЗ только в случае синтеза конъюгата для иммунизацш! животного.

разведение мышиных сывороток

Сыворотка от мышей, иммунизированных конъюгатом: I-» ТЭ-ИЗ-КЬН I-/,I■ .. I ТЗ-КЬН

Рисунок I. Результаты анализа иммунных сывороток от груш мыией, иммунизированных разными конъюгатами, по сравнению с нормальной мышиной сывороткой.

На рисунке I представлены результаты тестирования сывороток, взятых от групп кивотных, иммунизированных конъюгатами Т3-нз-кьн и ТЗ-кьн, по сравнению с сывороткой от интактного хивотного. Полученные сыворотки тестировали в иммуноферментном анализе, где в качестве сорбируемого на полистироловые планшеты антигена использовали конгюгат ТЗ-ВЗА. На рисунке I представлены средние значения оптической плотности пяти групп, содержащих по пять швотных каэдая. Очевидно, что титр аптисыворотки каздой из пяти групп животных, иммунизированных коныэгатом ТЗ-нб-кхн, выяе, чем

у животных, иммунизированных конъюгатом ТЗ-К1Н. В качестве донора спленоцитов для гибридизации была выбрана мышь, иммунизированная конъюгатом T3-HS-KLH, с самым высоким титром антисыворотки /оптическая плотность в иммуноферментном анализе при длине волны 492 им составила 3,1 ед./

В результате гибридизации спленоцитов мыши, иммунизированной конъюгатом трииодтиронина с гемоцианином /ТЗ-HS-KLH/, с миеломными метками лмки SP2/0 - Ад 14, были получены гибридомы, продуцирувдие моноклональше антитела к трииодтиропину чоловека • /табл. I/. Из 595 клонов, полученных в результате двух гибридизаций, 180 клонов продуцировали' антитела к ТЗ, таким образом, эффективность гибридизации составила 30%, что хорошо коррелирует с литературными данными /Schots A., et.al., 1986/. Из 180 полученных первичных положительных клонов 35 ¡слонов, обладаниях высокой скоростью роста /при посевной плотности клеток Ю^кл/мл время субклонирования составляло 3-4 дня/, были отобраны е клонирование. После трехкратного клонирования 35 позитивных

слияние количество лунок количество лунок с выросшими клонами количество лунок с положительными клонами, тестированными в ИФД отобраны в клонирование

I 360 300 100 20

2 зео 295 80 15

всего 720 595 180 35

Таблица I. Результаты гибридизации спленоцитов мышей, иммунизированных ТЗ-hs-klh с миеломными клетками.

первичных культур-гибридом, только 30 клонов продолжали стабильно продуцировать антитела заданной специфичности, что, как известно.

обусловлено частичной утратой хромосом гибридщми глоткам и в вместе с ними способность синтезировать иммуноглобулины.

Гибридомы, продолжавдге синтезировать антитела к ТЗ, сохраняли продукции антител на протяжении 20 пассажей в культуре с оптимальной концентрацией клеток 5 z Ю5 кл/мл. Посевная плотность составила 10^ кл/мл, время субклошгрования 3-4 дня.

В иммуноферментном анализе исследовалось взаимодействие моноклональных антител к трииодтиронину с другим тиреондкым гормоном - тироксином. Било установлено, что моноклонолыше антитела ТЗ/З; тЗ/4; ТЗ/8; ТЗ/9; T3/I3;' T3/I7: и ТЗ/ЗО -взаимодействуют—-только с трииодтиропином. Остальные антитела имеют некоторое сродство и к тироксину. Все поликлоналыше кроличьи антисиворотки к ТЗ имеют некоторое сродство и к Т4.

моноклоналыше ВИД взаимодей- Ксв, Ю9 конц способ

антитела антитела ствие с Т4 м антител мг/мл очистки

ТЗ/З т1 - 1.8 12,0 иох

ТЗ/4 71 - 1.4 0,8 КОХ

ТЗ/8 71 - I.I 9,0 иох

ТЗ/9 71 - 1.8 17,0 КОХ

T3/I3 • 72а - 1.2 10.0 ИОХ

T3/I7 71 - 1.6 11,0 ИОХ

ТЗ/ЗО Ti - 1.2 I.I иох

ТЗ/2 - + - - -

T3/I2 г + - - -

T3/I9 - + - - -

ТЗ/20 - + - - -

ТЗ/24 - + - - -

T3/2Q - + - - -

T3/3I - + - -

ТЗ/ЗЗ - + - - -

Таблзща 2. Свойства моноклональных антител к трииодтиронину человека.

Поэтому перед наш была поставлена задача получить моноклональные антитела к трииодтиронину, которые не дают перекрестных реакций о тироксином.Таким образом, из 30 гибридом нами были отобраны для работы только 7, в супернатантах которых содержались антитела, не дающие перекрестных реакций с тироксином /таблица 2/.

Супернатанты от 7 отобранных гибридом были сконцентрированы. Затем в роакции радиальной диффузии по Манчини был определен субкласс, содержащихся в них моноклональных антител. Сконцентрированные супернатанты использовались в разведениях' от исходного до 1/500, антисыворотку к субклассам иммуноглобулинов использовали в разведениях 1/600. Все протестированные моноклональные антитела принадлежали к классу /таблица 2/.

В данной работе титр антител против гормона определяли методом гомогенного флуоресцентного иммуноанализа, используя для регистрации комплекса антиген-антитело молекулу флуорэсцеин пзотиоционата /ФИТЦ/, ковалентно связанную с молекулой трикодтиронина. Так же, как и в методе, РИА за титр антител принимали такоо разведение, которое дает 502 связывания меченого антигена. Кривые титрования, полученные при анализе супернатантов от разных гибридом, представлены на рис.2. Титр, определенный подобным образом, позволяет качественно сравнить различные супернатанты, получить некоторые сведения о величинах констант связывания антител с антигенами и о их концентрации. Поэтому он был выбран в качестве критерия при отборе положительного клона гибридных клеток. Как видно из рис.2, наибольший титр оказался у супорнатанта Х9.

Моноклональные антитела, не имеющие перекрестной роакции с тироксином, были получепы .в препаративных количествах в пжде асцита для 7 гибридом, привитых мышам, примированных пристаном. Количество асцитной жидкости, полученной из одной мыши, составляло 5-10 мл с концентрацией антител 0,8 -17 мг/мл. Таким образом, собирали по 100 мл асцитной жидкости для каждой гибридош.

Для выделения ыоноклональных антител из асцитной жидкости использовали осаждение, сульфатом аммония с последующей

хроматографией на DEAE-52 /рис.3/. Фракция ige элюировалась при концентрации хлорида натрия 0,17 М.

III I I I I I I разведение 200 400 800 1600 3200 6400 12800 25600 54200 асцитной

жидкости

Рисунок 2. . Кривые титрования, полученные при анализе асцитной жидкости от разных клонов гибридных меток. № -обозначения клонов, от которых взяты супренатанты, mP-милляполяризация флуоресценции.

Концентрацию антител определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм. При этом считали, что .1 мг/мл антител класса igo поглощает 1,42 оптических единицы. Данные о полученных значениях концентраций иммуноглобулинов из асцитной глдкости различных гибридом представлены в таблице 2.

Определение равновесных • констант связывания антител к ТЗ проводилось методом гомогенного флуоресцентного кммуноанализа.

оптическая плотность при 280 км

1вС

1.0

0,5

5

10

15

20

номера фракций

Рисунок 3. Профиль элодии моноклоналышх антител с ЮЕ-52.

Концентрация хлорида натрия составила 0,17 М. Экспериментальная процедура состояла в определении равновесной концентрации свободного и связанного с антителом меченого гаптена при различных концентрациях добавляемого в реакционную смесь гаптепа'. По этим экспериментальным данным были построены графики в координатах Скстчарда. Определены константы связывания для ыопоклоналышх антитол равныо от Ка=1,8 х 109для моноклоналышх антител от клона Ю, Ка=1,1 х Ю9 - для клона Хв. Константы ассоциации для остальных отобранных моноклональшх антител определяли аналогично, их значения приведены в табл.2. Представленные данные подтверждают возможность использовашш полученных' моноклоналышх антител для разработки тест-системы па Т3. Таким образом, получены моноклональные антитела к трииодтиронипу, но имевдио перекрестных реакций .с тироксином, и проведена их характеристика. 1

2. Разработка тест-системы для трииодтирошша на основе

моноклональных антител.

Для разработки тест-систеш были отобраны моноклоналыше антитела от 9 клона гибридных клеток, так как эти антитела не реагировали с тироксином, имели самый высокий титр и орга из самых высоких значений константы связывания.

Одной из вазшейших стадий для разработки ц оптимизации метода твердофазного иммуноапализа па трииодтиронпн являлась стадия синтеза конъюгата гормона с ферментом /пероксидазой хрена/. Необходимым условием такого сиптеза является сохранение конызгатом фзртаднтатквной и иммунологической активности. Известно, что ПХ имеет 4 химически активные аминогруппы, что п позволяет осуществить ковалентное связывание данного фермента с гаптенами, имевдвми активные карбоксильные группы.

На первой стадии била проведена защита амтогруппы оптическая плотность п

Рисунок 4. Профиль хроматографа! конъвгатэ трииодтиронина с пероксцдазой хрена на сефадексэ 0-50. Размер колонки 1,6 ч 60 см, элюент - ЗФР, скорость элеции 35 мл/час.

100

200

300

помер фракций

трииодтиропина трифторацотилом. Затем провели активацию карбоксильной группы и-гадроксисукцимидным офиром и на третьей стадии - собственно конъюгация гормона с ферментом. Далее необходимо разделение конъюгированных молекул от несвязавшихся молекул гаптена и фермента.В работе очистка велась с применением гель-фильтрации на сефадексе 0-50, так как метод прост и легко осуществим в отличии от других методов, например, аффинной хроматографии. Профиль элюции представлен на рис. 4. Концентрация конъюгата устанавливалась спектрофотометрически, путем измерения оптической плотности при 403 , 300, 280 пм /в области 250 лежит максимум поглощения ПХ, в области 300 им - максимум поглощения-ТЗ, в области 403 нм -' максимум поглощения конъюгата ТЗ-ПХ/.

Была оптимизирована схема нопрямого конкурентного твердофазного иммуноанализа для ТЗ. Ыотод основан на конкуренции трииодтиронина в тестируемом образце а конъюгата ТЗ-ПХ за ограниченное число мест связывания с антителами к ТЗ, сорбированными на полистироловом планшете. Образование иммунного комплекса, иммобилизованного на твердой фазе, определяли с помощью конъюгата трииодтиронина с пороксидазой хрена. Удаление избытка непрореагировавших компонентов /ТЗ и ТЗ-ПХ/ проводили простой промывкой планшета ЗФР, который содержал 0,0525 твина-20 рН=7,4. Детекцию ферментативной метки, пероксидазы хрена проводили спектрофотометрически с использованием в качестве хромогена ортофенилдиамин /ОПД/ /см. схему па рис.5/.

Реакция /I/ протекает без всяких видимых изменений. Визуализация достигается благодаря второй стадии - окислительному превращению красителя 01Щ из восстановленной формы в окрашенную . окисленную форму.Раствор ОДД готовили в 0,1 Ы цитратно-фосфатпом буфоре, так как в его присутствии наблэдаотся значительное снижение спонтанного или индуцированного светом фонового окрашивания. Калибровочная кривая для определения ТЗ в сыворотка крови приведем на рис.6. Оптимизация велась по нескольким параметрам: 1.Выбор концентрации моноклоналышх антител /клон 9/ /АТ к ТЗ/, . используемых для иммобилизацга и отвечающих условиям

/а/ /I/

/2/

/б/ /I/

-17-

инкубация^

определение ^ ферментативной активности

НА

/2/

А/Н Л/И

окрашенный продукт реакции

Рисунок 5. а/Схома образования иммунного комплекса, иммобилизованного на полистпрольном планшете, б/ Реакция окисления ортофепилдиамина.

чувствительности анализа /константа связывания равна 1,8x10 И/.

2.Выбор концентрации ТЗ-ПХ при проведении конкурентной стадия анализа.

3.Колиэство вносимых стандартов и анализируемых образцов для проведения анализа.

КрстяческЕм фактором, определяющим успешное применение твердофазного метода, является адсорбция антител на посителэ. Условия для проведения сорбции были выбраны стандартные . Лучшие результаты получали при сорбции моноклоналышх антител в концентрации б ют/мл/по Солку. При умепьизши концентрации сорбируемых антител резко уменьшается чувствительность, а при увеличении по будет роализйван конкурентный метод.

ТЗ нколь/л

Рисунок 6. Калибровочная кривая для определении трииодтиронина в сыворотке крови при концентрации сорбированных антител 5 мкг/мл и концентрации конъюгата ТЗ-ПХ 2,5 мкг/мл.

Лослр проведения адсорбции иммуноглобулиновой о фракции остаются свободные активные центры связывания, которые могут веспещфзчески сорб1фовать конъюгат, что значительно повшает значения фопа. Для предотвращения этого процесса планшет помещали на I час в раствор 0,5% взд в 3$Р при комнатной температуре, при этом оказывались заблокированными оставшиеся свободными активные центры связывания.

Концентрацию конъюгата выбирали тшсим образом, чтобы детектируемый сигнал от пулевого отличался на 1,5-2 опт. ед. Оптимальной оказалась концентрация конъюгата ¡2,5 мкг/мл, что хорошо коррелирует с данными, известными из литературы /Кетти Д.

и лр., 1991/. При большей концентрации конъюгата происходит его избыточное неспецифическое связывание с носителем. В результате чего значительно повышается значение фона. Уменьшение концентрации конъюгата не приводит к увеличению чувствительности при увеличении разброса результатов. Поэтому уменьнение концентрации конъюгата нецелесообразно.

Как следует из литературных данных, оптимальным является содержание сывороточных стандартов в пробе 9,2-1255. Увеличение сывороточных стандартов в пробе до 20$ увеличивало п разброс результатов /Еремин С.А. и др., 1983/.

В результата била получена твердофазная пммупофермеппгая тест-система, позволяющая определять общий уровень трииодтпронипа в сыворотко и плазме крови человека.

Чувствительность тест-системы определяли, как наимзньпуп концентрации трииодтпронина, достоверно отличающуюся от "пулевого" контроля, по формуле: 0Дчин=-Хср + 2о. где Хер -среднее значение оптической плотности "нулевого" контроля из 20 ситсрашс пзмэрзпий, о - среднее квадратичное отклонение. Чувствительность в данном случае составляла 0,2 пмоль/л.

Воспроизводимость результатов тест-системы определялась для трех концентраций трииодтиронина. Коэффициент вариации пз прзвызал 455 при допустимом значении до 10% для тест-систем такого типа /Описаний к тест-системэ для. определения трииодтиронина фирмы "Pharnaoia"/.

Как видим, метод, примененный для епализа ТЗ в сыворотке крови, достаточно прост, имеет пебольпое количество стадий и позаоляэт определять физиологические хоЕцеятрациЕ тркяодтироямы, составляйте порядка 1-2 нмоль/л.

Было проведено сравнение созданной тест-системы с отечественной промышленной радиокммупологической тест-системой, в которой использовала поликлональную сыворотку кролзка против ТЗ. Для этого сыворотку от груш больных по 20 человек /гппер- я гипотиреоз/, а такзе от здоровых доноров /20 человек/ проверяла в РИА и USA. Полученные данные была обработаны статистически, на рисунке 7 представлены сродпиэ значения. Из представленных

розультатов видно, что созданная тест-система но уступает по чувствительности про машинной и с ее помощью можно достоверно наблюдать изменение трииодтиронина в сыворотке крови человека при гипер- и гипотиреозах по сравнению с нормальным уровнем ТЗ в сыворотко. Коэффициент корреляции измерений составил 0,951.

ТЗ . '

нмоль/л 10 9 8 7 6 Б 4 3 2 I

Ш

1

гипотироой /ниже I нмоль/л/

норма /1-3 нмоль/л/

втиреоз /выше 4 нмоль/л/

РИА

ИФА

Рисунок 7. Сравнение созданной тест-Чяютеш на основе конкурентного иммупоферментного анализа с ' использованием моноклопалышх антител с промышленной радиоиммунпой тест-системой с пспользованиом поликлопалыюй кроличьей антисывороки.

В результате проведешюго исследования получены гибридами, продуцирующие моноклопальные антитела к трлиодтиропину человека. Цоноклоналыше антитела выделоны, охарактеризованы и изучена возможность их применения для определения уровня трииодтирошша в

сыворотке крови человека в норме и патологии.

Наиболее важным результатом исследований явилось создание тест-системы основанной па иммуноферментном анализе для количественного определения трииодтиропина в биологических жидкостях, пригодной для применения в клинической практике, не уступащей по чувствительности и превосходящей по специфичности применяемый в нашей стране дкагпостикум па основе РИА с использованием поликлональпых антител. Кроме того, созданная тест-система проста в обращении, доступна, не требует применения опасных для здоровья радиоизотопов и, поэтому, может применяться для проведения массовых анализов.

Тсквм образом, в результате проведенных исследований получен набор уникальных биотехпологических реагентов, в также создана юялуноформептпая тест-система на основе моноклональпых антител для количественного определения трииодтиропина в сыворотке человека.

ВЫВОДЫ

1. Синтезировал конъюгат-икмуногон T3-HS-KLH, вызывающий образование специфических антител у иммунизированных животных.

2. Синтезирован копъюгат ПХ-ТЗ. Кспъюгат очищен и применен в тсст-системэ для определения трииодтиронина па основе конкурентного шялуноферментного анализа.

3.Впервые в пеней стране получены 7 гибрщдом,продуцирующих мопоклопальные антитела к трииодтиронину, не дающие перекрестных реакций с другим тпреовдшм горюпем - тироксином.

4.!.'опоклопалыше антитела наработаны в препаративных кеяетзетвах. Оптимальными условиями' препопотивпой плработкя яеплзсь: концентрация клеток 5 нлп/кышь п время образования опухоли 10 дней. Количество асцитной жидкости, полученной из одной мши составляло 5-10 мл с концентрацией антител 0,8-17 мг/мл.

5 Проведена характеристика полученных мопоклонзльннх ентнтел. Вез изученные антитела относятся к Ige классу и имеют значения

q а

констант связывания от -1,8x10* M до 1,1x10 М. .

6. Разработанз тест-система кгслунофермэнтного твордефазпого

одностадийного анализа для количественного определения трииодтирошша в сыворотке и плазме крови человека с оптимальной концентрацией сорбированных антител 5 мкг/мл и конъюгата ТЗ-ПХ -2,5 мкг/мл; коэффициент вариации не превышал 4Ж; чувствительность составляла 0,2 нмоль/л.

7. Проведено сравнение полученной тест-системы • с имещейся в отечествешюм производстве тест-системой на основе радиоиммуного анализа. Статистически достоверно установлено, что созданная тост-система не уступает по чувствительности и превосходит по специфичности тест-систему на основе радиоиммунного анализа.

' СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАН!ШХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1.Yurovsky V.V., Olcuneva .Т.О., Ivanov В.В., Kakarov S.&j Synthesis and iranunochemical study of antigenic determinanta of the coat proteins from tropioal malaria paraeite with help of spesifio antibodies. // Abstracts, 5th conference of young scientists socialist countries on bioorganio chemistry - Puohino august 2-10, 1983.-p.48

2.Юровский B.B., Окунева Т.О., Гриндберг Л.Н. Использование иммуноферментного и иммунофлуоресцентного анализов для изучения иммунодоминантного впитопа оболочки возбудителя тропической малярии.// Тезисы докладов. Симпозиум по структура, биосинтезу и функции молекулярных элемёнтов иммунной системы - Путципо 15-20 июня, 1987.-стр.81

3-Raevskaya U.Y., Oimneva Т.О., Kondratyeva I.A., Belaya U.Y. Production of monoolonal antibodies against Salmonella thyphy K-antigen. // Abstraots, International oonferenoe on medical biotechnology, imnunology and AIDS - Leningrad, USSR, June 12-18, 1991 - p.45

4.Окунева Т.О., ■ Ерешш С.A.. Тест-система для определения трииодтирошша на основе шмуноформзнтного анализа // Тозисы докладов, 5-ая конференция по современным проблемам биотехнологии - Пуицшо, 18-22 мая, 1992 /в печати/.

5.Окунева Т.О., Киркпн А.4>., Гусев Ы.В. Получение моноклоналышх антител к трииодтирошшу // Тезисы докладов, I Всероссийский