Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Антигенная и энитонная характеристика основных протективных белков наружной мембраны менингококка серогруппы В как необходимых компонентов менингококковых вакцин

ii\>iiii(>ii¡:('jii'joi¡\tI':jiI)(K'iiii институт пакции и смпоюток им. II. И.

мг/шикорл l'wiii

! hl Il[t¡ll!(l\ |l>kOIIIIC!l

Л К .1 I) Ii II I'

\. iiw .кп д. П'хслидрони1!

AIITUI'KIIIIAÍI II :)IIIIT()llll\íl XAI'AkTKI'lICTIIKA ШЮИПЫХ lll'OTIXTIIIÜil.lX l.l'JIK'OI! ММ'УЖИОМ Mi:MI)l'AIII.I \li;i IUI II ТЖОККЛ ОТОГГУМИЫ В КАК' I U X jl .XC ). ШММХ К'ОМПОИГ.! Г rot» Ml .11111 irOKOk'k'OliUX КЛК'ЦИП.

14.00.36- ¡1.i.ic|h'(i. i01ï1h ii iim\i\ iiojdi iui

Л и т о |) с, (|) с р м т ,|||С(Г|)т:ш1ш на coiickmiiiic укчюп степени доктора медицинских ii;t> к'

Москна — 1997

•2 me:

lu

C.1Ï

CM

РаПота выполнена и 11аучио-шг.1едопате.песком институте- вакцин и сывороток имени И. И. Мечникова Российской Академии медицинских наук

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ: : --

академик РАМП.

доктор медицинских наук, профессор Ь.Ф. Семенов

ОФИЦИАЛЫ 11.11'; ОИНОПКНТЫ:

академик 1'ЛМН

доктор медицинских паук. и|н)фесш|) К.П. К'ашкин. члеи-корресиондепт РАМН.

докт(>|> медицинских наук, профессор .1.1). Ко.«1.и." доктор медицинских наук, профессор И.П. Петрова;

Недущап органи-кишн — Кафедра микробиологии Московской медицинской академии имени И.\1. Очеши«! Министерства :иравоо\рапении РФ.

Защита состоитси 25 декаори 1997 г. к 14 часов на :иседании инчнш.чинцнтннип) сонета Л 001.38.01 при Научио-псследошпельсмш институте вакцин и сывороток имени И. И. Мечникова Академии медицинских наук РФ по адресу: 103064. г. Москва. Малый каленный переулок, дом 5а.

(1 диссертацией можно о.шакомити:!! п оиодиотеке 11;!учп<>-иесдедоватс.д1,екот институ га вакцин и сьикцюток имени II. II. Мечникова РАМН. но ад|>есу: 103064, с. М<к:кт!а. Малый Ка.пшмй переулок. -I. 5а.

А|!ГО|)ефсрат разослан « »_19'-. г.

Ученый секретар!.

сиениалшироишнот ученого сонета. П.Г. Ку дрявцева

кандидат медицинских наук

ouiiui хлглктглкгппа кшли

Актуальности щмб.юш.

Штаммы Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae типа I? п Streptococcus pneumoniae нн.ниотсн основными ппо. юшческими atептамп. iiM.il,iiKtiomiiMii око. 10 75% нсех c.isnaeii оактерпадиюго менингита (J.D. Romero, l.M. Oulschoom, 1994). ("]кии .kioo. lenniinii мешшгококкоиим мешштгом и р;ши\ странах мира нрио. пиите, ».по 90% пшмиаегса штаммами N. meningitidis tjh'x основных ceporpsiiii Л, В ii С (С.Е. Frasch, 1989). ^а последние 10-15 дет аарегиетрирокаи отиоситедиши рост ааоо. юиаемосгп. oosc.ioiueiiimn ннрудентимми штаммами менингококка ceporpsi(j(i.i В к (1IIA. странах Скандинавии к других европейских странах, а 1 акас и датно-американских сгранах - Аргентине, lipa.tiuiiii. К'о.пмоии. k'soe. п Ур\гиае (G. Bjune, 1991; А. Lystaü. S. Aasen, 1991: С.Т. Sacchi. 1992; С.Е. Frasch, 1989). И России иреоо.мдаиие штаммов менингококка ceporpv ним Alt ПТ10.ЮГ1Н1 менпнгококкоиоп ппфекпии сохрани, loci, с 1969 но 19X5 mi. носи; чего era.I n|ieiiH,iiiponaTi. шноудпте.н, серогрушш В (13.11. Покровский. A.A. Демина, 1987; A.A. Демина, 1989). Согдасио данным российских псс. к;, юна те. teil (А.\. Демина. 1986, 1988:11.11. Девигкпиа, 1989). .ia иосдеднеё деопидетие lipoiuoiu.io относите, м.ное снижение .¡аоодеваемостп меиипгококковой инфекцией грмшы В в России при сохранении нреоо.lajaiiiiii его и качестве iui:io\.nne.iii меппнгококковой ппфекпии. 'Гак. по |кму.п,гагам нос.кинет aiw.itt.ta в г. Москве. додн штаммов серогруииы В состав,in.ia годько 56%' (I.S. Korolcva, 1996), хоти в 1984 году ног показа к!, к, с.остпвднд 76,8% (15.11. Покровский. A.A. Демина, 1987). Огпоспте. ii.uoe нреоП. lajaiilie штаммом менингококка ceporpsiini.i В аи.шетса тревожным фактом, носко, и,кл меппнгококконан ппфекпии. нп.таннам штаммами ceporpsним В, и 64% е. is чаги притекает \ детей с cepi,e.',in,iMii naps Tiieiiitiisiii ненро.логического стаг.уса. s вдрос. шх в 47,7% c. is чаев греоует iipiisienenini реанимационных siepoitpmmin (H.II. 11окрош:кнн. A.A. Демина, 1987), а также сопровождаете;! выраженными п.шепениамн Ппохимпческпх покааатедгй кропи (H.H. Покровский. H.H. 1'ос.шп, 1993). lio.iee того. .юта. ti.Hi.ie исходы при генера. пытанной sieiiniiroKOKKoiion инфекции. оои:.кш.денной titiasisiasnt серогруним В, наодюдакпен в 3-5 рад чаше, чем при иифскцпмх. видианпой i:ерогру ннами А, С и Y (H.H. Покровский. A.A. Демина, 1987; Н.И. Покровский, 1987).

-4Wiim tifonmi. jimiiuc и1илсмио:к>|-ичош>т анализа ишдсгодиггоукгг

о ныцгжешюм колеоашш отостизыюй Bi пгппгогж—менишхцожкц. ceporpyшил В и Iтрукг\[к' заПолеиаемости мешшткоккоши инфекнией it России и |шпмс годы. что он|>еде.;шет акг.уалыюсгь создания лффсктиинои менингококкопой иакшшм группы В.

I! отличие от k;iiii;j.ii,iiu\ подисахаридои (ПС.) других серогр.мш 11(1 групим В оказался m;i.:ioiimm>ikii4:iiiii,im для людей. сносоПным ипдунироиап. ныраПогку аутоиммунных антител и потепниадыю |>азпнтие аутоиммунных заоодсиаиии (J. Finnc, 1983, 1987). Таким оо|>азом. ие!1ол|.зоиапне ПС серогрунпы В при раз|>а0откс меиипгококкоиых какими нуждается и проведении -iiim г<;. ii.tii.ix исслсдонаппн с иелыо получения серьезных доказательоти Пезоиасиосш его ннедеиня людям. Лдьтернатимпмм иащшшепием создания менинпжоккопоп иакиииы (х^инрушм В яиляется ииюль'.юнание пекансульпых аптигепон менингококка и, н нериую очцииь. оснонных оелкон наружной мемПранм менингококка (OI>-MVI\l). Одним n.i паиоолее ие|х:пскти1ших иодходои и пом панраилешш яиляется ш,целение иатишюго комплекса Оелкок наружном мемораны (Kill l\l) it пиде иезикулярпых оО|шоиаинй с номощыо щадящих методон жстракнии. Основными незикуляриими накцмпамн. показавшими высокую иммупогешюеп, i; полевых испытаниях. являются п|)опараты. |ш|>аГ>отапн1,1е норш'жскнмп и клПиискими псе. кмоиателями (G. Bjune, 1991; G.V. Sierra, 1991). I> |х:зультате ряда полевых испытании Пило показано п|х;иму1пестш> норвежской над куПинскои вакнипои. Норвежская вакцина ооладала нротективпои активностью дли детей в возрасте 4-5 лет и младше. (J.T. Poolman, 1996). обеспечивая более высокую <;mu:tu> еероконве|)син мри T|iexk'paTiioM введении и более выраженную способность вызывать выработку антител, обладающих бактериологической активностью не только но отношению к вакцинному штамму. но и к штаммам с другими антигенными ха|1актеристиками. I !ри|х>да различной ¡ффективпости менишококковых накипи может ощх-делятьси различиями в антигенном составе. а также, и технологическом процессе, примененном нрп создании вакцинных аппаратов, что делает исследования но созданию »ффектиши ift нысоко-охарактеризовапнои мепинткоккоиой вакцины насущной необходимостью.

Несмотря на достигнутые \снели. но мнению ведущих специалистов J. Т. Poolman (1995, 1996), W. D. Zollinger (1991) и С. Е. Frasch (1989). и проблеме создания менишококковых вакнии cepoi рушил В не|х!шенпыми остаются следующие вопросы: (1) оцюделение koiik|>otiiux нротективпых

аншгелюи. учасгнуюншх it формировании устоичшюго и намрижеииого иммунитета iijxn>ш мепмнгококконой инфекинп; (2) характеристика (k:ii<iiiiii,ix антигенных деп'рмнпннт. расположенных ни протектипных Пачках наружной мемП|>апы II расшшапаемых антитезами (В-кдоточные шитони) и специфическими Т-к.лотками (Т-кдет<ишие шитоиы). Попому актуальной чадачей инлиетен шучемно н|кггект111!ных антигеном наружной мемПраиы менингококка ci'iMirpyiuiu В, а также, их антигенных детерминант с нельм сочданин fío. км; лффекччшпой ii Оечонасной мешшпжоконой накиины СерОГруШШ В.

Hü.IlíJUiUil?)ll,

Иммунологическнн характеристика оснопных Подкоп наружной мемораш.1 менингококка серпгруины В как нажчшх накциппмх антигепо». ичучение их антигенной. а также Т- и В-к.четочпой .шитонной структуры, срапнительпый аналид гуморального и клеточного иммунного отпета на .чанные антигены п шнгопи у людей п лабораторных жииотпых носче иммунпчапии иориежскон 1Кеиерииепта.чыюн менипткокконои нечикулирной накипной се|И1груиш,| В.

Дли líi.iiio.iHeiiiiii мостанленпоп цеди необходимо |ичнение следующих чадач:

1. Подуит, синтетические пептиды на тнердои фаче. не|>екрыиак!1цие кем перпичную посдедонателыюегь ам1И1окнс.дот оедка класса I (РогА бедок) штамма 44/76 менингококка серигрупны В, н ичучить шитопнум панрапдешметь РогА-специфических антител у иакннниропанпмх .too|x)iio.n,nei! носче плкипнаиии порнежской мешшгококчшой пакшшой ее|к>групны В. Помести срашштелмюе исследопаиие иммуногенпости оспоиных В-кдеточим\ шигошш. ¡шшчнапаемых челокечсскнми антителами (PI.7 и P1.I6), на данном ое.чке методами иммупоблота и иммупофермепгпого анадича с синтетическими пептидами. Оценить пкдад РогА-сненмфических антител н общую бактерицидную акгмшюсть иммунных сьшороток.

2. Пол) чип. чедокеческие моноклопальпые антитела нропш РогА белка п изучить их иимунохнмические и иммунобиологические сиойстиа как модельной системы оцепкн РогА-специфических нротектииних антитед.

3. Получить синтетические пептиды на тнердой фаче (мимотоны) и щюиосчи картиронапие В-кдеточных литопон на белке клаи;| 2/3 (PorB оедка) норпежского нашитого штамма 44/76. расночнакаемих че.донеческмми

"'»"""""чи от какшннпишанных людей и бо.жных мешннчжоккчшой

4. 11|кшести колнчестненное он|>еделе1ше антител к. i.icni ¡¡¡kj и|>шш иммунодоушнантнот . шитоиа па РогВ белке » сы1Ю|>отках цакпишцкмкшных доброполышк и пе|)ебоденнн1Х мепишчжокоиоп инфекцией ti исследонать нротектнипые сиоистиа РогВ- и мштоп-сш'.пифических антите. i.

5. картирован. В-клеточнме шитопы иа белке класса 4 (Rmp белке), распо.шаиаемые человеческими антителами. и мучить пмхгуиобиологическую актиииосп. специфических антител. оГ)|к1.<> niimixt:íi после вакцинации нориежской мешинчжоккокой пакнипой се|х>грунш,| В.

6. Il|xmw:ni ¡шалил линейных мштопон на белке класса 5 (Орс белке) иакипшют штамма 44/76, расшшаиаедшх специфическими антителами, обралукинихен после иакципации. Пронести количественную опенку антител, направленных к Орс белку. после вакцинации норвежской мепиигококковой вакциной ce|>orpyiiiiu В.

7. Оцепить относительную имчуно доминантность Т-клеточпого отпела па Opa, Орс, РогВ и РогА белки. Сиитешцктать растворимые пептиды и щншести ана.ш Т-клеточных шиччикш па РогВ белке. распознаваемых человеческими и мышиными Т-клеткамп. Ощнмелить |>ес:грикци1о Т-клегочпого отнега щютив шптопов на РогВ Полке по мышиному основному комплексу гнстошнмес™ мости МНС на модели кошенных мышиных специфических Т-клеток.

Ilayjiimu_iiui!iuim,

Впервые и полет« пиитах но нин.ггашпо норвежской мепипгококковой нгаикулирнон вакцины серогруппы В покапана высокая иммупогеппость РогА и Орс белков наружной мембраны. Наши жеперимеитальпые данные также подтвердили |м'лул1.таты ншдемиологнческого опыта и высокой протективной бактерицитой активности антител данной специфичности, образуюшихеи в с1,|Н()|(отках доб|(онолы1ев после Ч'|к:хк|>атш>й иммуци.йпши.

Впервые получены человеческие мон(Ж'лоналы1ые антитела (МАТ), специфичные к Pl.7 (VR1) серосубтишшой детерминанте Рог А бедка ирои.шодсгвенного менипгококковот штамма 44/76 (B:15:P1.7,16:L3,7: Орс++, ЕТ-5 комплекс), использованного дли приготовлении мепингококковых се|к>грунны В жеперимептальных вешкулирпых вакцин в Норвегии п Голландии. На модели человеческих МД'Г щютив Pl.7 серосу битового

)iutroua, а также ма основе шитонного aiia.uua человеческих иммунных сывороток докапана шпкая. но сравнению с Pl.16 (VR2) сс|юсубтиновой детерминаптои. нммуногенносп, Pl.7 (VR1) шнтопа .lui люден п высокая нммупогешюсн. данного mmoiia для mi,пнем. Покалшо. что в отличие от мышиных че.кшечеекие Р1.7-сшч1Нфические МЛ'Г не. обладали бактерицидной активпостио. хотя выбывали активную онсошшнию штамма 44/76 менингококка tкiffi.vfiiii.i В. стимулируй фатцшхм бактерии человеческими пентр(к|)плами.

Ипериые. щюиедеио определение В-кдеточних шнтошт на РогВ белке, расно.шиаелшх человеческими специфическими антителами, образующимися в iнму.плате, вакшшашш. Ныло пока.мпо. что мышиные ееротишнше МАТ распознают конфирмационные шитоны. а человеческие РогВ-специфические антитела от вакцинированных и не|>ебодеиших менингококковой инфекцией |и'агируи>т щнлшутесгпенно с единственным иммунодоминантпым линейным шнтоном. На модели норвежской вакнины нокааано. что 2-х н 3-х кратное введение препарата стимулировало у г вакцинированных людей выработку РогВ-снеиифическнх антител преимущественно субклаил IgGl. с)ти антитела |)еагировадп с иммуводомннаптмым митоном. состоящим ii.î 14 амннокисют ('^S-T^O) н н|к',де.лах петли ¡V 1 (VRI). Дока:шю. что РогВ белок ¡тлается важным иротекпшиим антигеном, так как афнпиоочшцепные человеческие РогВ-моносиенифическне IgGl антитела, а также специфичные к 17д_т30 щнейному пштону IgGl антитела обладали высокой онсонн.шруюшей активностью.

На модели человеческих и мышиных МАТ протон РогА белка, а также специфических антиген к РогВ белку нока.кшы существенные |шличия в формировании ту морального иммунного o rne ra у люден и лабораторных животных. Iii.nm.ienn. что мышиные, РогА-снецифпческпе антитела являются бактерпшшжш. но не обладают онсонширу »»ними июшггапш. и то н|х:ш как человеческие антитела той же специфичности являются выеокоопсопшируюшимн. но не бактерицидными. Докахшо. что мышиные РотВ-спенифические, антитела распознают конформашюпные шитоны и являются пнлконрпгектнвиыми. тогда как человеческие антитела реагируют с линейными детерминантами и обладают высокой онехнишрующеп актшшосп.ю. Пияндеии сходств;! в Т-к.кточном ответе на РогВ белок у .нолей и мышей.

Ннерш,«: н|К11«!дено карги|н>ил1ше В-к.ют1>чпих ингашон на белке класса 4 (Rmp белке), распознаваемых человеческими антителами, и изучены

-шшупоПиолот'мскио ' сшпиггиа специфических антител • к оыио|)отках 1йкшн1и|ки«1шых людей! Ilnkaxiii» птпутпгшс—ниочншй—Гиикицуиттп актиипости очищенных Ктр-онснифических aimmvi. что докалыиает относительную По.ш|х;дность присутствия данного Полка и накнинных п|>епа|>атах.

Оперные щюнсдоно ощюдоление В-к.теточних .жнтшкш на Орс Полке. 1>асш>:ша1>аемых человеческими антителами, м пока.кш конформаииоппо-.¡анисимый характер данных антигенных детерминант.

11роисде,п < .раиннтедьпый ана.тт иммунодомипантиоот Т-к. юточного отпета на оспошшо Полки наружной мемП|ши,1 менингококка (РогА н РогВ Полки и Полки класса 5: Opa и Орс Полки) и помшпа относительно Поле»; пышкам иммуппогенпооп. Т-клеточных иштопок на Opa Полках но срашюшно с другими Полками.

I Ipomuoii срашштельний апалш иммуподомипаптности Т-кдоточиого отпета на осиоши.нг Полки наружной мемПраиы менингококка (РогА и РогВ Полки и Полки класса 5: Opa и Орс Полки) и ш>ка;«ша относительно Полос нышкаи иммушюггашоаь Т-клеточных шитошш па Opa Полках но сравнению с другими Полками.

11|х>ш!лош> картирование Т-клогочных .шнпикж на РогВ Полке. |ш:но:шиае\шх мышиными и человеческими антителами носи: накнннании. Иьпшлоно 3 линейных иммупогеиных фрагмента данной молекулы, располагающихся и оПласти траисмомПраипых участков. 2 ш которых |моно:шаналио|, как мышиными, так и чсдонсческимп иммунными Т-клеткамп. Оп|юдолопа |к'(.трикния Т-клоточиого отпета по основному комплексу гистоооиместимоош па модели кошенных мышей.

Докажшо расположение Т-клсточных шитонон на раде осшшпых Полков наружной мемПраны (РогА, РогВ, Opa и Орс Полки) и консервативных, неимущественно трапомемПрапных, оПласмх молекулы. оПщих дл» штаммов менингококка, что лплиетсл оПосповапиом использовании вариаПельных антигенов (Opa Полки) с консервативными Т-иммуногенными участками как компонентов монипгококконои вакцины.

Ниакиис^канлиошмосгь.

1. 'Гоо|к:тичоски и жепериментальпо оПопювапа необходимость 11клн)чени!1 и мопиигококкоиую вакцину серогруипы В основных Полков наружной момПранм [Полком класса 1, 3 и 5 (Орс Полка)], ответственных :sa формирование напряженного и нрододжитолыют Т-дависимого иммунного

отпета протип тми.юшчпот к гете|)одоп1Чпых штаммои менингококка се.|)огруш1Ы В.

2. Покачана необходимость гпцпч;.иаюго ana.iu.ki антигенного м шигоппого и клина и|зедполагнемого накцпнпого штамма с помощью мышиных и человеческих МАТ рачличпоп специфичности дли опенки пригодности его ИСНОЛЬЧОИаШШ при |1|)0||.ШОЛГП№ МеШШГОКОККОНОЙ накцины се|мгрунпы В.

3. Модифпцироиапы и стандарчичонапы имму нофермептний апалич и иммупобдот. исподьчонаниие для опенки антигенного акта на мешшгококкчжых накипи се|югрунны В, что способетшшало нокышеншо надежное!п. ноепроичкодимосш и ннформатшшостн методой иссдедонаппн.

4. Дли опенки >ффект1шносги и качестиа меппмгококконы.х пакнин па модели лабораторных жипотпых и при киедении .подам усопершепстионапы иммунологические методы [иммуноферментиий анадпч (ИФА). имм.ммбдот. ii|K).iii(|ie|>ariH¡Hi,iH тест. бактерицидный тест]. ипюльчи'мые при иииедонаиии обрачцон человеческих и мышиных сыиороток п Т-клеток.

5. Уеонершеистпоцаны и стамдаргшопаны мак|к1- и мик|мметоды определении бактерицидной акпшноетп сынорогок от пакшшпроианпих добронольнен.

6. 1'ачработап тест он|и'деле,ння оншжшрующем актинпостп иммунных еыпо|«)ток методом проточной цигоф.чкицкшетрии и покачана необходимость ичучепин онеоиофагоиптирумшей актинности ныборочиых сынщюток при прочерке (ффектинпосш М(Ч|Ипгококкопых накшш. Описанные методы могут быть иснольчонапы для определении »шлемио.мшчеекчш »ффектшшости мепингошккопьгх накшш группы В.

7. Покачано рачличие н формпронанип аптительного отпета у людей и лабораторных жинотпых. а также сходстно клеточного отнеча па ime/teiiiie отдельных накииппых антигешж (на п|жме|>е РогВ белка), что иеоПходичо учптыпать при опенке >ф(|>екти1!Посгн мепингококконых накиин на мышиной модели.

11од|)жеп11н,,д1ыпо1д1м1чед|а защиту.

1. РогА белок янляетса пышкоиммуногепным компонентом пориежской мепиигококконой накшшы серогруниы В; нрн itovi большей иммуиогенностыо обладает дипеиный нариабодьиый участок VR2 (Р1.16) по с|Ш!11еиии> с VR1 (Р1.7).

2. Чедонеческпе. и мышиные мопок. тональные антитела, специфичные к Р1.7 се|К1суПтппо1!(1му .шитому. расшшают частично тчм'.крьшнющпеея линейные посдедоиателиюети » |>амкн\ одного VRI |кчиона па РогА

__белке_)| обладают различными тшмюхнмическмми и |1ммунобио.юпг1еёктпГ^_____

3. РогВ Полок наружной мембраны. как компонент норвежской ,мешнпококкопой вакцины серогрупиы В, у большинства вакцинированных людей стимулирует синтез высокого уронил специфических lgGl антител, направленных п|к)пш иммунодомишштпого В-клсточного шитона (•7sVFHQNGQVTEVTT3°). Ипдуш1|>о ванные вакцинацией РогВ-специфическис антитела обладают выжженной протективнон активностью, появляющейся в стимуляции комнлемент-иезависимон опсоннзир) ютей активности н фагопипш ме.пипгококка человеческими пейтрофилами.

4. Антитела к белку класса 4 пан|>авлеш.1 против копформационпых яипчшов и не вызывают блокирующего воздействии на бактерицидную активное», антител к РогА Пслку.

5. На модели норвежской мешшгококконон вакцины серогрупиы В у большинства вакцинированных добровольней вынклепа стимуляция щюдукции бактерицидных антител к белку класса 5 (Оре белка), нан|)авлсш1Ы\ прогни копформанпоцшшвисимььх шитонов.

6. Ныражеппосгь Т-клеточпого ответа па РогА, Opa и Орс белки наружной мембраны менингококка серогрупиы В ощи-деляетея иммуподомпнаптностио Т-клеточных лаптопов. которая может Пип. |ш:110.южепа в следующем порядке: Opa (B&5d)>PorB>Opc>PorA Пелок.

7. РогВ Полок содержит три иммунодоминантпых Т-клеточпых шитона. дна из которых |>аспознаются как мышиными, так и человеческими Т-к летка м и.

Апробация работы. Апробации диссертации сосшядась на заседании Ученого (jHie/ra Научно-исследовательского института иакшш и оыво|юток им. И.И. Мечникова l'AMH 23.10.97.

Материал!,i диссертации были доложены: па T|ie.x научных семинарах института молекулярной генетики им. VI. Планка (lîep.inn. Германии, 1991, 1992, 1993), на научной конференции института медицинской иммунологии университета мм. Гумбольта (Гордин. Германии. 1993), па т|юх к'опфе|«пниях норвежского Национального института здоровья (Осло. Норвегия, в 1994 г.), па IX Междупа|>одпой конференции но патогенным нейссерням (Винчестер. Великобритания. 1994), на научпо-иеслсдогатедьском семинар; норвежского Национального института здо|н>вья "Разработка вакцин: сонремеппый статус и дальнейшие, перспективы" (Ocio. Норвегия.

1994), на ежегодном сычи: общества пммчпо. юти Норвегии (Осло. Норвегия. 1994), па .тух заседаниях отдела вакншюлоши норвежского Национального института здоровьи (Осло. Норвегия. 1995), на четы^х пбьедннеппых симпозиумах школы микробиологических. вирусологических и иммунологических паук медицинского факультета \Ш1пе|к:птета г. Ньюкасла (Педикобрптанпм. в 1995-1997 ir.), на ХХХ11 биохимической контактной кпп(|)е|)енпии (Лило. 1 lopiiernii. 1996), на открытом дне научных исследований медицинского факультета у|1нне|к:птета г. Пьюкаоа (Великобритании. 1997).

15 1990-1997 гг. финансирование работы |]|юнзводи. юсь .Западно-Гермаиеким министерством но исследованинм и технологии (программа BMFT/03I9005A), н рамках Глобальной программы ПОЗ по разработке вакцин (программа GPV/V23/181/52), а также британским фондом им. Г. 1!е.ллко\м (программа М/94/2290).

Нуб.шкашш. По материалам диссертации опубликовано 26 -печатных работ.

ÍItpSJtTypa—Н—ййлм_ШСССртацШ!. Диссертации изложена на 232

страницах машинописного текста, состоит из введения. обзора лнТе|>агуры. главы материалов и методов исследования. четы|х:\ глав собственных Исследований. обсуждении результатов И выполов. Слисок литературы содержит 278 работ отечественных и .«рубежных авторов.

i Л И РЖ \lllli: РЛЬОТЫ.

.\!а1ч_'1Н1а.н,1Л1_.\1ет<1Л1.ти1С.1ед<)ванни.

Для ¡жжения поставленных п работе задач были использованы следующие материалы и методы:

• щкшш.нтиешшй. штамм 44/76 (В: 15.Р1.7.Kv.L3,7;Ope++,ET-5 комплекс) для приготовления норвежской мепиигококковой вакцины серогруппи В, мутанты вакцинного штамма: 44/76-1 (В:15:Р1.7,16: Орс++), НИ1-5 (B-.PorB-.Pl.7,16), M14-2 (В:15: РогА-:Орс"), отобранные из коллекции Е. Roscnqvist. Национальный Институт Здоровья. (Ocio. Норвегия). Кроме того в работе, были использованы 446 штаммов N. meningitidis различных серогрупн (А, В, С, X, Y, 29Е, W135 и потипируемые штаммы), отобранные из глобальной коллекции репрезентативных штаммов M. Achiman, институт молекулярной генетики им. VI. Планка (liep.iiin. Германия).

--•—w>m«|xwMJ_nr .иЯртшт iiocm; накцинашш норвежской

менипгококкошщ накипной серогрунни В, а также от бгсжтх—инсле-здПолеванин менингококкокой инфекцией. 15cm > Пыдо гцюгссгщмнншо 135 сывороток ас 27 вакцинированных людей, а также 495 а.шороток от J32 По.дин,ix мепмш ококковои ниф^кцчсй.

лаоо|>аторпые животные. 15 раооге Пыли нсно. паованы мыши линии BALB/c, а также три лиши кошенных мышей: В10.М (Н-21), BIOS (H-2S) и B10.D2(H-2<J).

• монок.тональные антитела. Ii |Х1Поте Пыло нсно.п.:«>иапо 33 клона мышиных VI AT. включан 3 клона, полученных нами п|<онт а нп ценного кцшитп РогА Пелка 13а (PI. 13а), и itjxmm варианта серттишшого PorB Пелка 15 (PI.15). Получен один клоп человеческих МАТ ii|xrruu РогА Полка.

• мик|К1оио.1огические методы исследования: культипщктти; штаммов менингококка на твердых и жидких питательных с|х:дах. выделение клоналыюй культуры, он|к:деление <х'|х)гр.унпы. серотипа и серосуПтппа ноаПудители. хранение штаммов.

различные спосоПы им.чу шпации мышей (впутриПрюшипио, подкожно и в подушечки .дан). :мПор крови. • получение оГ>|Ш!кш лимфатических уалов и селезенки.

получение мышиных и че. ювеческих моноклинальных антител против Пелконмх антигенов наружной мемПрпиы менингококка, кудьтнинрованпе клопов гиоридом в Полыннх ооьемах. аффиппан очистка антител.

• органический сиптеа олигопептидои на твердой фа:«:, испольаун наборы по мимотонпому синтеду (неискап). а также на синтетических смолах с применением пептидного г.имтеаато|>а AB1MED Analysen-Technik (Langenfeld, Германия), депротекнин. отщепление пептида с твердой фаты, анетмлиронанпе к очистка пептидного п|к)дукта методом хртптоцмфнч высокчит) давлении в оП|»нценой фа.«.: (RP-HPLC) с иснольаонапием градиента анетонитрила н 0.1% трифторуксусной кислоте. I) |>аПоте Пыли применены как короткие (до 14 аминокислотных остатков) одпгопентиды на твердом фа:«: (мимотопы). так и Полее. длинные растворимые пептиды |Шди'Шом длины (всего 8 пептидов) дли карти|>о11апия В-к.деточпых дпнтоион. При карти|>оваиин Т-клеточиых шитонов Пыли иепольтоваии цк.тноришо пептиды длиной до 20 аминокислотных остатков. 15сего в рпооте Пыли применены 13 наПо|)он синтетических пептидов. оПтее количество которых составило 527.

Пнохимичсомю методы: очистка антител. препацттов . Полков пар\ жной меморапы и получение накнпппого п|>енпрата. включая ионообменную. аффинную и гель-хроматографию. 1.|октрофоре.1 в нолпакридамндцом геле. методы жсгракипн. щюцшшташш и центрифугирования. а также получение липосомальпых ii|x'iiapaion Пелкои наружной мемПраны.

иммунологические методы раПоты с человеческими поликдопальпымн сыворотками и моноопецпфическтшн антителами: определение иютипа антител, класса и оуПкласеа IgG антител, а также определение >кси|>еоепн легких ценен тшушгдооу.тишш методом нммупофермептпого аиа.иш. количественное определение РогА и РогВ-сиеннфическнх антител в сыворотках дооровольнек после вакцинации и мепнпгококкопои ип(|)екнип. а также получение моноопецифичеоких антител методом аффинной х|юматографии сывороток на сорПептах с иммоПили.шронаппыми синтетическими пептидами и очищенными Полками наружной мемПраны менингококка.

• иммупохпмпческие методы исследования антигенной активности антител: варианты иммунофермептного анализ! (с исполь.юванием цельных Пактериальпых клеток, вакцинных препаратов. очищенных Полковых антигенов и синтетических пептидов в качестве оепеиПндшнрутощего антигена), иммуноолот. нммунощюпнниташи!. оцюдоление аффинности и авидмтота антител.

методы изучении щютектишмй активности человеческих и мышиных нолик.тональных и моноклинальных антител. Ныл ралраПотан Пакторпцидпып тост в микро- и мак|к>варпаптпх. а также тест на ощхме. leniio ппсошшруюшеи активности специфических антител методом проточной цнтофдюорометрии. основанный па |хтпотранпи фашшгшру кипой спосоПнос'ти человеческих нейт|х)филов в присутствии антител и источника комплемента.

методы шученпл мышиного и человеческого Т-клеточпого иммунного ответа: получение иммунных лимфоцитов ш но|)И1|)орпческой кропи. |и;гнона.1Ы1ых лимфатических у.гюв и селе.юнки. проведение Т-клеточпого щюлнферативпого теста с мышиными и человечески ми Т-клетками, ироводенио теста ингиПицин аптиичмишсимой пролиферации Т-K.IOTOK с помощью мышиных моноклопальных антител протии молекул основного комплекс! гиотошвместпмоотп класса II (МНС-П).

• компьютерные, методы статистического ана.ига.

~--Ош^шцшолиажщаша.

I. Изучение 11л1м>1!стп1>.1()гич(м:ки\ скопсп: шгшпм против белка класса

1 (Рог А бедка)

15 настоящей работе, мы впервые применили человеческие парные иммунные <:ыно|>отки. полученные от доб|ншоды1ев до вакцинации и на разных сроках после введении норвежской менингококковой вакцины серогрунны В. и женериментах с применением ИФА и пептидов

II еи1 и. 1 и (Пезо к класса I)

Рисунок 1. Реактивность парных сыво|Х)Ток доб|хжолы1а N"1333 с. синтетическими пептидами РогА белка. А: активность сыворотки до иммунизаинн В: |>сактивиос.'п> сыворотки после иммунизации

С: |к1'.)ници в |>еакти11ИО(ГГ!1Х (В-А). Ст|«дка указывает па В-кдеточнын Н1ИТ0П. располагающийся в шрнабедыюй об.нети (УЯ2).

м.1 твердой фазе было отмечено. ч1'о сыворотки до вакцинации |1еа|'ируют с целым набором отдельных пептидов. соответствующих п основном тран(.мембранным участкам молекул белка класс! 1 (Рисунок I А).

Наличие В-клеточного лпитопа. распознаваемого после вакцинации норвежской менишококконой вакциной. было выявлено при сравнении профиля реактивности сывороток до и посте иммунизации с

У

Сыворотки после 1

вакнипаиии

0.1

3,01,1 0,1 1

Оптическая плотность

0 1 2 3 , 4 у геактшиюгп. и иии^ноиюте л

У

С.ы воротки посте

вакцинации

Онтичй'кап плотность Римспииисп. в н\ш>?«Д-1оге X

Сыво|ютки до вакцинации

Рисунок 2. Анали:! |«1Ктивпости парных сыво|юток ноете двукратной какцинации с УРН и УЯ2 тчпидами РогА белка в ИФА (А и С) и против РогА белка в пммупобдоте (В и О). По осям Х- ^активность сыво|ктток до вакципанин. по осям У- ноете вакцинации. Линии, помеченные (х2), обозначают двукратный прирост антител.

)tn»4imiunu-M)A г синтетическими пепшдами на niepioo фазе (Рисунок I

С). Аналогичный фрагмент |>а спознавался шйоротспт—от—2—ш—'М. тестнроианпых .«хТровольцев.

Для цхтедепия более цюпнцкчшого шитошюго анализа РогА-спенифических антител и парных сыворотках нами Пыли отобраны дне группы накциш1|хя1анпых, сопоншпие из 19 и 30 доб|кшод1,нев. I] иммунных сыво|х>тках mix люден Пило за|хТ11(:1'рнровано значимое парастапне бактерицидной активности после вто|х>й иммунизации норвежской вакциной серогрупны В. И данных женериментах мы использовали Полее длинные растворимые пептиды, покрывающие вариабельные участки РогА Пелка [Рисунок 2А, В (VR1) и С, D (VR2), соответственно]. Как видно ни надставленных данных, в 2/19 (10,5%) иммунных сыво|х>тках Пыло отмечено значимое налипание количества пептид-специфических антител против Р1.7 (VR1) сер1к:уогиионого |кч'иона. хоти в 11/19 (57,9%) сыворотках выпилило значимое нарастание интенсивности связывании IgG антител с РогА Пелком в иммупоблоте. IS случае с PI.16(VR2) пептидом. сероконве|х:ию наПлюдалп в 4/30(13,3%) сыворотках н ИФА. и в 19/30(63,3%) сышцюток в иммупоблоте против РогА Пелка.

Полученные данные позволили заключим,, что вакцинация норвежской вакциной серогрунпы В способствует выработке антител прошв линейных участков РогА Пелка только у неПолыпого патента доП|ювольц(!в. Основная же часы, специфических антител Пыла иаищвлепа н|х>тив конфирмационных яштонов и могла fii.ru, выявлена с помощью нммупоблота.

Таким образом, полученные данные свидетели птаям ли о высокой иммупогеипости РогА Пелка в составе норвежской меиипгококковой вакцины серогрунпы В, выявленной методом иммупоПлота. что подчеркивает важную ]к>. и, данного теста при он|х:делспии РогА-сненифических антител после вакцинанин. Кроме того. Пыла показана относительно Полыная иммуногеппость VR2 (Р1.16) варпаПедыюго участка молекулы РогА Пелка но сравнению с VR1 (Р1.7) участком, однако данная тенденция не Пыла статистически значимой. .Далее |1|х'д<хавляд<х:ь важным оценить функциональную роль РогА-спецпфических антител. оПразующичси посте вакцинации.

Эксперименты по оценке вклада РогА-специфических антител в общую Пактернпидную активность иммунных сыш>|>оток проводились в контексте анализа лффоктншюсти норвежской мешшгококксвой вакцины шиле т|н:хкратного введения с применением сывороток, полученных че|х:з 6 недель

после TjKvrM'fi жшупнзапии от 27 добровольцев. Пыла отмечена значительно большая бактерннидпость сывороток но отношению к варианту вакиишют штамма 44/76-2 (Орс", РогА+), >ксп|>еееируюнито РогА белок. чем к варианту M 14-2 (Орс", РогА"), который потерял

'Pad.шна I.

Характеристика штаммов менингококка для определения специфичности человеческих мопокдонадьпых антител SS269 по сравнению с мышиными МАТ той же. специфичности.

(г|югруппа ! 1 (гаммы Человеческие Мышиные Мышиные

(с\ fil ру lina) Au них MAT MAT MAT

Pl.7" SS2691' MNI4CI 1.6е A'daml'1

А 300/236 143(60,7%) 235(99,6%,) 235(99,6%)

(1) 23/0 - - -

(И) 2/0 - - -

(111) 18/0 - - -

UV-I) 143/143 141(98,6%) 142(99,3%) 142(99,3%)

(1V-2) 13/0 - - -

(V) 8 I/SI 2(2,5%) S 1(100%) 81(100%)

(VI 6/0 - - -

(VII) 12/12 - 12(100%,) 12(100%)

(V111) 2/0 - - -

В 1 14/69 22(31,9%) 69(100%) 69( 100%)

С 26/7 6(85,7%,) 7(100%) 7(100%)

Лр.м не - 15/2 2(100%) 2(100%) 2(100%)

cepoi р.\ Min.i

(л мма 446/314 173(55%) 313(99,7%) 313(99,7%)

>' показано общее число тестированных штаммов менингококка метолом цельноклеточнот варианта ИФА и число штаммов. жснрессируюших Pl.7 .шитом.

h показано оошее количество Pl.7 штаммов, распознаваемых человеческими Р1.7-специфическими МАТ. и процент от всех тссгп|кшанных штаммов серосубтипа Pl.7.

реактивность двух мышиных МАТ со всеми Pl.7 штаммами и нроиент от всех Pl.7 штаммов.

—шцыу^тмт!, '"ч^батынать данный антиген. Таким обрачом. данные жсперимопты подтвердили. 'чт" Р<тД MiHf'i'ii iimm'-'^' мсггектииним

антигеном. способствующим формированию .шшппых бактерицидных антител после вакцинации норвежской медшигококкоши вакциной серогрупиы В.

Исходи ил мжноетп РогА белка дли еочданип н|х>тектнвпого иммунного ответа. (бедующим >таш>м пашей работы ¡шилось получение человеческих МАТ к РогА белку, как молельной системы изучении ичмучюхимических свойств человеческих РогА-оиенифических антител. IJ |к:чу.плате спиши» лимфоцитов периферической к|кти. полученных от одного n.i вакцинированных добровольцев. с ге1('|и)миедомной линией К6Н6В5 Пыл получ(ч| kvioii SS269, который стабильно н|м>дуниро|!а.ч мопок.чонадьпые lgG3(A) ашчггела против штамма 44/76, шмндешшх в целы юк легочном варианте ИФА. С. целью оценки специфичности данных антител Пыли протестированы 446 штаммов меиппгококка с ручным набором антигенов наружной мембраны (таблица 1> Мдинственным антигеном, наличие которого корредировадо с |>еакт1тпостыо с антителами SS269, Пыл Р1.7 серосубти новой шитоп. I !<к„ кмх кмцсч; карти|юинние В-клеточного иппопа. цюючиаваемого мышиными и человеческими MAT SS269. выявило наличие |1ммуно|>оакт1ншого участка н области вариабельного |>егнопа РогА белка (VR1)—ANGGASGQ, к то «(к'.чи как мышиные МАТ той же специфичности (клопы Adaml и MN14CU.6) (мсночнавади более; короткий шитоп ASGQ.

Изучение протективпых свойств мышиных и человеческих РогА-специфических МАТ нока:м:ю. что человеческие МАТ. в (rr.itпне от мышиных МАТ той же специфичности, не обладали бактерицидными свойствами, но выбывали опсошшцию бактериальных клеток с их посдеду ютим комплемспт-чавиенмым фагоцнточом человеческими пейтрофи.чами. '1'акнм обрачом. н |к'ч\льтате проведенных иссдедовапий мы докчыали наличие бактерицидной активности человеческих РогА-снецифнчсскнх нолнкдонадьпых антител, ннду цпроваппых вакципаиией пориежской менингококковой вакциной ое|м>групны В. 11|нмставдаетс)1 индексным. что чедовеческие моноклинальные антитела н|хтш линейного Р1.7 (VR1) житопа не обладали бактерицидными свойствами. по вычывали опсошшцим и фагопиточ менингококка фагоцитами периферической крови.

II. Изучение miMyiioíTim.kiik'iccktiv cimficni (имка класса 3 (l'or В ííc.iKa)

til l I- 1 III..... i H.'I tu :t IWm i tl.-i m Г| 11.1 m r, 1||-|m r lin m )!

Ilninciu

Рисунок 3. Рсакпшпосп. н ИФА парных ci,iho|kitok доПроко.и,на 1085 до накнппакии (А). и после иакпппании (В) норпежской мепипгококкоиоп накипной серогрунпи - В. (;||юдка укааыпасг па В-клсточный .шитом, расншианаоммй иммунными сыворотками на РогВ оелке.

-'- '/(.,1я ка|гги|ктании В-клоточнш шитопов на РогВ белке; шшмсмых

человеческими антителами после ПакППШШШП били—отобцшц_иащые__

сыворотки от 3 доб|х>вольцев. вакцинированных норвежской менипгококковой накипной серогруины В. Результаты проведении сравнительного анализа (х'-активиости пеиммупных и парных иммунных сыво|х)Ток. полученных че|х:з 6 недель после введения т|хгп.ей дозы какнинм. методом ИФА е. синтетическими метилами РогВ белка па твердой фа.«: подставлены па рисунке 3 дли одного из дт^вольнев ((N"1085). Обращает па себя внимание, что |)еактивпоеп1 неиммуннои и парной иммунной сыво|нггок с РогВ пептидами характеризовались большим сходством, за исключением иепшодепетвии с единственным пептидом помер 4 ('УрНС^СОУТЕУТТ3") (па который направлена ст|>елка на рисунке 3). Аналогичный участок рас-.низшим лен также и сыворотками, полученными от пс|х:болевших менипгококковой инфекцией, что позволило ощкиелить данный фрагмент молекулы РогВ белка как нммуиодоминантный В-клеточпый .житии.

(1 целью более топкого картирешиин участка молекулы РогВ белка, распознаваемого сыы>|х)тками после вакцинации и менипгококковой инфекции, были сннте:ш|х>внпы пептиды, покрывающие нариабельный участок содержащий и выявленный лннтон '^НдКСдУТЕУТТМ. Данные жеперименти позволили ощх'делить точные границы В-клеточпо1 о шитопа па РогВ белке, который состоял из 14 аминокислотных остатков: I ^ УРНОМСО УТЕУТТЗ». (! целью проведения более |х;п|К'зепгатпвпого исследовании частоты житоп-снецифических антител, образующихоя посте вакцинации, а также дли ана.иш кинетики накоплении РогВ- и шитон-специфических антител был с:иптези|хтап растворимый пептид ф63Ь2) ('2уЕТ5К5УРНдМС0УТЕУТТАТС134-СОЫН2). который покрывал весь УК1 |х:1'иоп. Далее были отобраны 161 серийные парные сыворотки от 27 вакпишцхжшпых добровольцев и проведено колич( ствепнсх: оп|н;деление пеитид-063Ь2-специфических антител, а также РогВ-снеипфических антител в иммуиобдоте. (х-зультаты кото|х>п> учитывали полу количественным визуальным методом по шкале от 1 до 4 (Рисунок 4).

Анализ данных, подставленных па рисунке 4, позволил оприелить патент с :е|х ¡конверсии к РогВ белку в сыво|х>тках вакнииировапых доб|Х)во.тьиев в иммуноб.тоте. который составил 96,3%. (1ерокоиве|х;ин к пептиду 1Х>ЗЬ2 наблюдалась у 20/27 дш|х>вольнев (74%). Из надставленных данных следует. что нарастание пептид-063Ь2-

• О • |н'актИ1Ш()1:ть )i мммушЛлптс - - В HV'IVril.l'Cll01lll<|ltl<U4'.kiiv иштнчм»

Риеиюк 4. Кинетика емнтеаа РогВ-спенпфпчееких антител после накнинании норнежской менишококконой накипной.

(a'ixuKauit. расио.ложешшми на оси X (it|x'.\iti после нерпой накнинании). пока.йиш инлипндуап.пые нактншании.

кинетика пептид 063Ь2-сненифическт1,\ антител н ИФА. О- кинетика РогВ-сиеиифичееких антител и иммуподлоге.

снеинфнче.скнх антител шло на^лдельпими темпами i: нарастанием всей совокупности PtnlfrmrttHtH'imiiv ¡щтпп'ч mitnrmniMV к имму шя'.штс (колффиниент корреляции /—0,82; Р<0,05). Это «tiuert'jiun'wiSBnKm значительная доли РогВ-снецифических антител Пыла направлена п|югив единственного выявленного нами иммунодоминаптпого В-кдеточпого яштопа 1 7svFHQNGQVTEv«30. входящего it состав синтетического пептида D63H2.

С целью изучения иммуиоПиодошчееких свойств человеческих РогВ-снецифических антител мы пропели очистку РогВ белка ил варианта tWKUUHiiom штамма 44/76-М14, иотерявшет способность жслресснровать РогА Пелок. и дальнейшую химическую «пивку данного белка с активированной агарозой че|к;з свободные аминогруппы. Аналогичная Н|>оцедура Пыла также проделана при приготовлении со|>бспта на основе пептида D63b2. При очистке специфических антител Пыли получены следующие аптитсльиме и|)енараты: (I) IgGl антитела. специфичные, против нентида D63b2 (одна колонка с пептидом D63b2); (2) IgGl антитела, специфичные против РогВ Пелка (одна колонка с РогВ Полком); (3) IgGl антитела, специфичные против иных участков молекулы РогВ Пелка, не покрываем!,1\ нентидом D63b2. Дли получения данного препарата Пыли использованы две аффинные, колонки, соединенные в цепочку пептид D63b2-> РогВ белок. Э.'шшмю антител производили в данном случае со вго|юп колонки.

На рисунке, 5 (линия 2) предегавлепы |х;зультаты тестирования Iактивности сыво|к>тки добровольна N"1085 с вакцинным препаратом методом иммуноблота. После очистки специфических антител на обеих аффинных колонках мы наблюдали избирательное удаление РогВ-снецифических антител ври сохранении ¡«активности с другими белками (линия 3). Очевидно, практически все РогВ-сиецифические антитела ллюировались после аффинной очистки на колонке с пептидом D63b2 (линия 4). и в меньшей степени задерживались на колонке с очищенным РогВ белком (линия 5). Подставленные, данные позволили сделать вывод, что пептид D63b2 абсорбировал подавляющую часть антител (около 80% но данным депснтометрического анализа), специфичных к РогВ - белку, как показано на профиле («'.активности на последней линии (номер 6), где представлена остаточная |>еактивпосгь РогВ-специфических антител, направленных к другим участкам молекулы.

1 2 3 4 5 6

l'ut aim ik 5. Реактивность РогВ-онецифичоских антител. очищенных ni <:i.n«i|((iгк11 доПри-,ольпа IY'1085. . Iiiiihh 1: смесь MAT щютив PorA (3-1-PK16. 1:10 000). PorB (3-1-PI 5, 1:5000) По. im in. а также Пе.тков класса 4 (АЕЗ, 1:10 000)н S (279-5е, 1:50 000); (линии 2): cum »ротка 1085 ,ю очистки: (.пиши 3): itioar с колонок с PorB Пелком и пептидом D63b2; (лпшш 4): очищенные антитела против пептида D63b2; (линия 5): очищенные антитела против PorB Пелка; (линии 6): очищенные антитела щютив PorB Пелка. не покрываемые пептидом D63b2.

(! не. м,ю iмучении протектиииои активности очищенных щюпаратов антител, п ио<ледуюших жснериментах мы пропели определение опсошшруюшей активности пр'наратов специфических антител, вы деленных и.! иммунной сыворотки доПртольна 1085. регистрируя интенсивность «Î- лор-сцепнин иейтрофилон мосле фапщнпиа Пактерий. меченых ФИТЦ. п ирису тствии комплемента и антител (Рисунок 6). Ныло нока.ишо. что после оншш мамин Пактерий специфические антитела споооПстиовадп поглощению (фагощтму) менингококка фагоцитами перш|н'рпческой крти. При >том. интенсивность ответа не зависела от присутствии комплемента.

Мы также оценили Пактеришипую активность выделенных нрчиратов РогВ-специфических антител. Препараты не оПлалалп значимой Пактерицн.шосгыо но отношению к вакцинном} штамму 44/76. Однако мы паПлюдали некоторое снижение числа колонии при использовании максимально возможной копнен триши антител (около 1,0 мкг в мл), что

-,-J-,-1-r

0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1,0

Концентрации Ig01 (¡им it мл)

I'iicyiiok 6. Онсопичиру киши активность щгнаратов очищенных PorB-снециф! носких антител i¡ тесте опсоиофагоииточа.

По пси Х- концентрация специфического IgGl (мкг/мл), но осп Y-отноеителитн интенсивность ф.чнк1|кч:ценц1н1.

|юактпвносп, антител ii|xmm пептида D63b2. О-|н;акгниносп. антител против РогВ белка.

свидетельствовало о том. что РогВ-снецифпческне антите. ia могут обладать бактерицидной активностью в больших концентрациях.

Таким обрачом. нами было шжчыаио. что т|юхкратнан иммушыацпа норвежской мопиигококковой вакциной сорогрунны В стимулирует uihtw высокого у|кинш IgGl антител прочна РогВ бедка наружной мембцшы и его оеношмго В-кдеточного иштона (l^svFHQNGQVTEvi^O) у 96% и 74% добровольцев. соответственно. Пынвдено. что РогВ-спецмфмческие антитела обладали выраженной комндемент-ноланисимой онсоничируютей ак'птносн.ю и стимудщювади фагоцито.! менингококка чсдокеческнми нейтрофидами. К')к)ме того, данные антитела и больших конценпшшнх могут обладать бактерицидными свойствами. что свидетельствует о высокой иммучкмхмшоетп и 11|ютект1Н1Ных свойствах РогВ белка в составе норвежской менишококковой вакцины.

iiirumuaou пи MiNi'ay odo ш.иаклЫф ariima.iouAiviui аминаиш.- ч.шшичи огигошш au попинан auiiaiiaiuidii л'м-нч»пм|| | 'шшн.шаи i с i\11 м: >r»i 11 i.i.; >.i,i 11 r. > \/(|)|,j и aruvoiiiTiKiMii an 'пио.иин апшюшшшМ'По.ч ипчу аж.чн.1. •uomm.'-mi тшомо.чо.иинких xtiiiiiihioiIiuiAYihi vh.uuih.' чн.чааьнфннан:) -odO опнанпт iub 'ormwoii гшипмта ноио.чтчо.шинап i.ioN.waiuloii кннаганя ().ю11.|.1!||.ч\л'|1Г ai ■-.юн нанчгояЫооГ чА'ш' .i.o luvi'iiiiiaïAï'oii 'mimín.mxIoíiit) xnivaMirairoini.'d -а.чгао odo ни аоно.шш хмиыиаг.ч-д auiiwiodii.ulnx|

'f tr.v.)i!r.N А'.чгау

m i/a.uuiii! хинчгнноии.чнА'фан ттмА) (»du (нличгчши.пюи 4.i.wiodiirAHiu,:i j,a.r.oi\ tioKiiA'i") anid я g i'iuiiAVI.ioda.i iioiiiihnwi ионо.ч.тчшшшаа ш>.ч:»кож1ои кинниничин o.i.ii чии. o нпкюя.пчга.ыпш:) aniimir aniinaiiAVo|| "ANl-ao V'j<4 n гашиш хгшиничк u.Doiimu.mi: ijfnn'iilhkUí.i.nt:o m oiHiiaiiion.i.o on ш.маффг o.iaiii(H<diiNory пличгпмо an аж.чш. i: •utuai.i.auoiD imniiioi\diií'iim>:mo мп -мш'шгншкКимну un гпгнгуо an аж.чн.1. .1,Ыни;к1|| ■р ir.)-.)i:r.4 н.чгао нгА'.чант ио.ч.гнм.А' xTinm:d(ji\aiv>UMl.i. шишиништЫ

0 оп:!1ош.:>чга.1.ап1!1л o.u> чпчимхагм uiuiiHriütda.wüy :> (шоншм.мн.х! i.ioiunmi

1 iiniiiixlii au г.шши! хпипачнн.о ,i,wli:ii;xlii g¿/pp lumiun.iii m уф|,| a.uiiüidiüi i\0iiii0.i.ai'Moii'irau и i:.i.i«Iimi,xIii o.ioiiiiiii' шш»кк1и.1:>а.1. i к If | -(оирэтьщл] "V JQ ,UI11 |_|141ша1'и|!.1.:и»';м||| oiiraooir) o[9( lUNrosiodoor iiN.i.odoiim ijoiuiA'iuui ni vriiiiiaiiiiu.o > iïxidi'n ANi.ao м iai.ii.uii> хи.чстпнфинапаопоп iiidiuiadii кагигохни аж.чш. ишмжшкнсш) катин iidiiiu.iiiii чмшюшннЫофном muodii ra.i.u.ini! \iiN:),)iaH»iniaua-dniy 4.i;x)iiiiaiTii:diii:ii oKnuauiaaiiiAmiadii .i.aiMWoin'.xlii o.i.i, Tiir.txoirou пмхшьа oaoiiijainir' 0.10111*0 шл>г;х1и н |\и1111!жг>к •ivimuiiaii iviiN4i:'0N:iaii uru А'понГо м îuaii.i.o o.ioiuhhüiv v»iтл.:vt..v.>.i.(> uns iinoii .muxloiim VTiiium' iiiiiiinKKln.LUi. агшш.у 'нотшии хмныиагм -g oiniiMKxliudüN n.i.A'n.Klaíii'on пгпо 'nra.ui.i.in: аихланифипат гшажМииоо iiiriy okkIoxon aN.i.odoiii'i:) i.ioitnViuuiau a •MnroiKxIyoi' o.ioiiro а.г.чгч i; "(0191 11 80SI„M) наичгожи1цог хЛ'нГ xitm'acioii .1,0 и.ч.шЫгп амипА'ккц •А'.чгау А'конпнг .ч I'íuiuiii: auiHuai.'dnii iiiiHKxliid.nii.l.xlis-. опчо чаш v и MUoiyoiiAiuut luH'o.i.aiv штшшп.чнн or. к hi ii or чн.ч.юИонп:) и ппаж úlwioo т ещ wa.uuni: aiiM:);)iiiH|)ii]iau.i-duiy чип ш tuaaiii д -g ruin vi ноинП.чнн uoiioNNOND.iiiMiiaiv i.ioMa.Y.aiidoii xrimiiüiixliininiMi.'ii •нанчго'.имМо! 8 .i.o iismdoiim i'lin.'dyo.i.o ui:no а.иа:]/' hon.p.hlkí уишш-цнщшш: i ни iraaiiHioiMirid.n.Klaii u.oi-.hinoiiuiu: p\ uoniirr rinuiiau runr.uidH'.-.iinu > i и по (Noray duiy) p iraani'M a.mi'ao ни шно.шш чсншаниг iniii.n mi .«Ino nr|'

g и p iMaiii'M номгау iiinijoii:) хи.чмыиопшоои úmmi ошмь иц 4j{

- U -

IgG » смноротках до r.;ikioiikiiiiiii Iiiki d мл)

Рисунок 7. Сравнительный аналш концентрации IgG антител прогни Ope белка и сыво|ютках. полученных от 21 добровольцев до вакцинации норвежской мсппигококковои вакциной се|кнр.\пмы В (ось X), и чс|к'д 6 педель после введения пто|х>н долы (ось Y).

Линия, помеченная (xl), показывает |>еактинн(к:ть тех парных сыш)|хл'ок. и которых не, выявлялось нарасгапия антите,i к Ope белку после вакцинации. Линия. помеченная (х5), показывает |Ю1ктивпость парных сывороток, характеризовавших!:!! 5 и более кратным иарасганием специфических антител.

себе задачей оцепить иммупогеппость цельной молекулы данного белка н ИФД с очищенным Орс белком. заключенного нами н лииоеомы с целью снижения неепепнфичеекого снизывания с п.мешком при нропелении ИФД.

Данные тестирования парных сыво]юток от 21 добровольцев после вакцинации норвежской мешшгококконпй внкшпюй серогрунпы В с Орс оелком н ИФД. представленные на рисунке 7, доказывают, что антитедьный отпет большинства вакпнпи|ишпных (.16/21, 76,2%) характеризовался 5 и более кратным нарастанием Орс-пюцифических IgG антител, что свидетели ггвовало о том. что Орс белок ивднетен нысокоиммуногеипым компонентом норвежской вакцины. Нами были также получены доказательства того, что Орс-специфические антитола вносят значительный вклад в бактерицидную активность сыво|юток посте вакипании. Дейсгвительио. при тестировании бактерицидной активности иммунных сывороток от 29 лоб|кшоли|ев после двухкратной вакцинации была показана значимо более выцеженная бактерицидноеп. в ответ на вариант штамма 44/67-1, .жар-еоирутошего Орс белок (Оре+, РогА+), чем на штамм 44/67-2, который не. обладал данным антигеном (Орс-, РогА+).

Полученные ¡«¡ультатм ешиетелытвовали о том. что вамшплпня норвежской менннгоктжковои вакциной у болышшетва людей способствует нарастанию специфических антител 11|ютив Орс белка, ншцмнлепных против коп(|)Ормацпоп11ых ииггоиов и обладающих выраженными бактерицидными свойствами.

IV. Изучение Т-кдсгочных »питонов па пешшных белках наружной .мембраны менингококка серогпрупнм В

Эксперименты по выявлению относительной нммуподомипантноеш РогА, Ора и Орс белков наружной мемб|мпы менингококка проводились на лимфоцитах периферической кропи (.11 IK.') группы нормальных допо|>ов. состоявшей из 18 человек, в анамнезе которых не было случаев .¡аболевапия менингококковой ппфекиией. Доноры были тишцижапы по HLA-DR и HLA-DQ локусам основного локусл гнеп ¡совместимости (HLA). Дли картировании Т-кле.точпых шитопов в нашем распоряжении находились как синтезированные нами синтепвнч.кие пептиды, так и очищенные и|>о.иараты белков класса 5 (ОраВ, Opa5d и Орс белки) (любезно недоставленные нам Dt. М. Achtman). белок классл 1 (РогА белок) (любезно предоставленный Dr. W.D.Zollinger), а также полученный памп РогВ белок. К" >тим белкам был

изучеп совокупный Т-клеточпый ответ с:не.imii t;i,i.ii!.ii'iiiiii iтиicinr.ihiKii'i нччужч"чтки1тжмчн 1-Н"питт—ч№"4"" н;Г питых Гимкач наружной мемП|Ш1ы менингококка.

Qxvuiiic iKiK'aiüt ixí. и i индексов стимуляции (ИС.) мри отшме на ОраИ. Opa5d, Ope и РогА Полки Пыли оп|х;делепы па уровне 20, 17, 8.5 и (>. соответственно. Далее относительная нммунодомипаптпость исследованных 11|хл11а)шо1> очищенных белков ) ia j »ч жной мембраны оценивалась с применением критерии t (л'ыодонта дли парных поименных при Р ранним 0,05. Ныли нолучешл следующие значении ,\|х>вня значимости Р дли разных гипотез:

1. ОраВ>РогА; Р=0,007

2. Ора5с1>РогА; Р=0,009

3. ОраВ>Орс; Р=0.04

4. Opa5d>Opc; Р=0,046

5. ОроРогА; Р=0,31

Данные ш> стимуляции п1К1лифе|>апин человеческих Т-клетк п|х^па|)атом очищенного РогВ Пелка. подученные н дальнейших опьпах с применением Т-клеток от т|«х доПронольнен. позволили выявить. что величина с додаст индекс! стимуляции данным Педком состоавля.та 13,3.

Таким оП|кгзом. •относительна и Т-кде.точнан нммупо.юмпнапииидч, мешшгококкоиих Пслкон наружной мемПрапы может быть ¡мсноложена н следующем порядке:

Opa (B&5d)>PorB>Opc>PorA белок

Данный вывод был подтиерждеп также при тестн|х)вннни Т-кдс.ток с синтетическими пептидами. перекрывающими нею первичную последовательность аминокислот осшишыч белкон наружной мембраны мепипткокка (Opa, Орс п РогА белки). ( лкттнетстнующие сопокунные данные ндодставлены н таблице 2. Видно. что общий процент всех положительных нролифе|>ативпых omero« (И(!>3) от всего количества использованных пептидов находился н ii| «делах от 21% до 36% в зависимости от копкдотпого белка. Вместе с тем. наивысший патент выраженных щмдифератинных ответов (И(Ь 10) был xa|UkTC|>ei¡ для пептидов : ОраВ белка но с|>авпеии1о с. остальными белками. '1'аким (хбразом. па уровне коротких фрагментов молекул Opa, Орс и РогА Полков нами Пыли

ПОДТПерЖДеНЫ основныс ВЫВОДЫ. ПОЛУЧеНПЫе раНСС И|)М исс 1едОВЛПИИ очищенных п|хч1арнтов данных индивидуальных белков. о сущптвовапии относительной иммунодомнпантносш Т-кдеточвых шитонов па основных бедках наружной мембраны менингококка.

Таблица 2.

Сравнительный ана.пп Т-кдеточпого нролиферативного ответа па синтетические пептиды Ора, Орс и РогА белков.

1х-дки Общее число 1с(л<1в^ Позитивные отпеты3 ИС=3-5а ИС=5-10а ИС>Ц)Ь

ОраВ 765 37 19 10 8

Ора5<] 666 24 12 8 4

Орс 720 21 14 6 1

РогА 782 23 15 6 3

:| Общее количество лунок 96-луночного планшета. использованных при цхтедении щхинферативпого теста с синтетическими пептидами данного белка.

Ь П|хшеит пептидов. вызнавших значимую антиген-зависимую пролиферацию Т-к. илчж от всех пенользогапних и данных опытах пептидов. выраженную в виде индекс! стимуляции (ИГ.).

В ходе работы были картированы Т-к.легочные яппоны па всех основных белках наружной мембраны менингококка, на исключением белка классл 4. Так оказалось, что наиболее важными участками РогА белка, выливавшими выраженную пролиферацию Т-клегок. были траисмембранпме по< ледова гели юсти аминокислот, находящиеся между поверхностными петлями №2-3 (аминокислоты 94-117), N"4-5 (199-222), N"6-7 (291-314) и N"7-8 (330-351) (Рисунок 8). Стимулирующую Т-кдеточную активность имели также участки поверхностных петель N"5 (223-253), N"7 (316-329) и N"8 (352364). Н аналогичных женерпчептах с пептидами, соответствовавшими другим белкам наружной мембраны, нами было также выявлено, что большинство Т-кдеточиых .шнтопов ОраВ бедка, индуцировавших Т-кдеточпыи ответ, располагал«:!, :<а пределами

'8 i я-'

i .m i'iiiumxl.mA'WKlii п пиши" vi'iii'ii ümii.mI,)ü огпшииш :> I'iiiwüxoii чшЮ.чЛНп iirnimlooar.iaii 1\|'ш.|.:)(ш\<1.11кш ;>ii)iioi\ai.:>,r,mt>i>:> 'мгЛ'хатк iin.i.:>i;ii.ç

•<'1*Х> 1!П1Г1Г1!МИ.1.<1,)!1) m il.l.lKHI UI'lll'll'lïAVlKlMl'IlH

ni mxloiii»' m'iiiinniotlit.ckm. \a:m ('i:«) iiiüi'ii'iuhdiiiiIo.i) (inumi'a'iui.i,:) шшогии i:uiU':>) ,l.an.i.o нп1ШШ.Ыафппк1и t.i 1*1 ntn i, i.if i " Ч'|л Л'м ii.)niw.:rto<lii а.чпфЫ.1 i'| | t:Mi:ay vj'M шип/ниш инимлиии.ахшп :> iiodoiior M'liririMvloii Я1 iiiiixI.n H()M:iai,ii<l,i<|iit(laii шшшофииг 'i.i;>oimtUNiM(| '8 noii\:>ii(|

iiiiiiinriiuii:) :>N.)nm imir.nuitir\t\¡ j

гинериариаПе. м,iii.i\ участков: пептиды N"6-12 (аммшжис«m.i 31-84) и lV'24-29 (115-148) п. таким оПразом. Пыло оПшим ,i.ia многих Opa Подков. 15 соответствии i: iiini предположением мы выявили значителен}ю прппфергппшую активность пептидов N"19-23 (аминокистоты 109-150) на Opa5tl ríc.ikc. mío ciiii.icne. ».ствовало о наличии иммупогенпого Т-клеточпого Минина и данном y част: молекул Opa Подкоп. 15 иодом, пептиды Орс Полка оПладали меньшей «ггнмч.тр\ниисн активностью но отношению к человеческим Т-клеткам. Наивысшую пролиферацию ш,мыкали пептиды N" 2 (аминокислоты 10-26), 1\"12-)6 (67-108), l\"26 (151-168) и N"32-33 (аминокислоты 186-209). Картирование Т-клеточпых »штопок па РогВ Полке производилось с помощью Т-клеток. полученных от дооряюльцев. вакцинированных норвежской мепипгококковой вакциной сернрупны В. lícero Пыло вакцинировано 10 человек. 15акппна вводплас!. внутримышечно трехкратно с интервалом в 6 и 46 недель. Из 10 вакнпниропаииых Пыли выорапы 3 доорово.и.па с нзиестпым HLA-DR гаплотппом, лимфоциты которых Пыли тестированы с синтетическими пептидами РогВ Полка. Iím.i выявлен ря .i имм.унодоминантных .участков молекулы. вызывавших выраженную пролиферацию человеческих Т-клеток (ТаП.нша 3).

ТаПдииа 3.

Прмифергпшпый orner Т-. шмфонитов. полеченных от дооржольнов носи: иммунизации норвежской М(Ч1нпгококконой вакциной серогришы В.

Донор HLA-DR Т-клеточпын ответ на пептиды РогВ Полка

га плотнп

MSL 11LA-DR1,! 3-4,9,11,13,19,21-23,25-27,29-30,34,

1R HLA-DR4.4 4, 19, 27

АМ HLA-DR3.4 18-19, 23 32

Из приставленных данных следует, что Т-димфоннты от всех тршх вакцинированных доПровольцев стпмулироиались метилом N"19, который располагается в трапсмомПраппой ооласти между петлями N"4 и N"5 РогВ Полка (аминокислоты 163-180). Т-клотки допоров MSL и АМ отвечали на пептид 23 (аминокислоты 199-216, между петлями 5 и 6). а лимфоциты допорм! MSL и 1R про итерировали в orner lia пептиды 4 (аминоктилоты 28-45, между петлями 1 и 2) и 27 (аминокислоты 235-252, между петлями 6 и 7).

На последнем папе работы мы пропели картирование Т-клеточиых лпитопов па РогВ^такг^т:позшишшщ__щш1пымн Т-клетками. Данные лкснерименты проводились с целью проведет , и;е

отпела мелопечееких и мышиных Т-клеток. а также, для акали:«! |кч:трикиии ¡мышиного Т-клеточиого ответа по главному комплексу' гиегосовмеешмосш (МНС). Мы uMoixi.il) три кошенные линии мышей B10.D2 (H-2J), В10.М (Н-2^) и В 10.S (H-2S), полученных па основе общей генетической линии В10., с целью исключения влияния иных. К|ю\гс МНС, гаюв на формирование Т-клеточиого иммунного ответа. Полученные данные свидетельствуют. что максимальной стимулирующей активностью на Т-клетки обладали пептиды, соответствовавшие консервативным Т|шк:мембраппым участкам молекулы РогВ белка: аминокислоты 55-72, (пептид 7); аминокислоты 163-180, (пептид 19); аминокислоты 226-261', (пептиды 26-28). Нами было отмечено, что величина ответа зависела не только от копк|х:тпого пептида, но также и от ганлотипа mi,иней. 'Гак. лимфоциты мышей линии BALB/c (Н-2^) отвечали более высокой нролифе|к1ЦЦен на иснолыованпые пептиды, чем лимфоциты от мышей двух других линии. Основываясь на информации но iKcii|ieccmi Н-2 ганлотипа разными по|юдами мышей, использованных в данных опытах, мы пришли к :к!КЛ1очепшо. что пептиды 19 (аминокислоты 163-180), и 27 (аминокислоты 235-252) приставлялись в контексте молекул МНС класса 11 ганлотипа Н-2^, в то В|х;мя как пептид 7 (аминокислоты 55-72) мог тео|х:тически щхжнтироватьсн как Н-2', так и H-2S (хоть и менее лффективно).

Iloc.ie выявления |х;етрикции T-к.теточиого ответа по Н-2 гап.ютипу мышиного комплекса гиегоеовчесшм(к:ти МНС, мы также исследовали рестрикцию данного ответа по I-A или 1-Е локусам с помощью мышиных МАТ причт различных аллелей данных локусов (Таблица 4). Полученные данные позволили заключить, что связывание пептида 19 было онос|х;довано молекулами в то промн как пениi.i 28 связывался как 1-А1, так и I-As. Анти-1-Aa МАТ НВ4 вызьпили 73.6% ингибииию в том случае, если пептид 7 находился в контексте молекул H-2S, но лишь 22.1% ипгибипию при связывании данного шитопа 1-А1, что п|х:днолап!Ло большую аффинность данного пептида но отношению к I-A1. Н дополнении к >тому. мы наблюдали ингибииию СВЯЗЫВаПИЯ и

Таодица 4.

Рестрикции Т-к.лоточного отвеса но 1-А и.ш 1-Е локусам мышиного комплекса гнсгосовмесшмосш МНС

Порош МНС/ 1 к'нтнл Амнно- Фон 1 >ез Нпгнбпння

мышей Н-2 кЛИЛОТЫ (срш)а М\Т |||х).111(|х?|пши1 (%)с

пшлотин (ерш)11

1-А 1-Е

В1().02 Н-2^ 19 163-180 1021,7 4903,0 73,8 -15,6

27 235-252 297,5 1643,7 8.4 12,9

ВЮ.М Н-2' 7 55-72 950,2 3408,0 22,7 13,4

28 244-261 679,7 2524,7 51,2 -7,9

В 10.5 Н-2* 7 55-72 1110,5 4047,0 73.6 23,9

28 244-261 1584,2 3499,3 70,0 0,1

аФоновые значения цлдиоактивпости (ерш).

Ь('|хиние значения продифератипного опила и отсутствии МАТ.

с 1-Аа-снеинфические МАТ Н84 шАЬ (разведение 1:100) использовали для ннгиПипни 11|юлпф|'рлмш1 лимфоцитов мышей линий В10.М и ВЮ.Э, и МАТ т!22 (разведение 1:100) использовали нри работе г. мышами ВКШ2. 1-Еп-спецпфнческие МАТ Н81-208-22.6 (разведение 1:100) использовали при работе со всеми Т|х-М!| неролами ковгеппич мышей.

представ.«'Нин пептида 7 лимфоцитами гаплотина Н-2*. которые Пыли инкубированы с анти-1-Ёа-спе,пифнчпыми МАТ. Это наблюдение. возможно, отражает известный факт оП остаточной лкп)|нг.г.пи 1-ЕР пеней у мышей линии Н^. Мы Ш' получили значительной пнгионпии продифе|>анип на пептид, 27 (аминокислоты 235-252), который вызывал высокие пролпферативные ответы у мышей 'линии ВКШ2, что свидетельствует о формировании высокоаффипнмч комплексов между пептидом '27 и молекулами 11-2^. Таким образом. Т-клс,точный титоп РогВ белка (аминокислоты 163-180) распознавался как мышиными Т-клетками линий ВАЬВ/с и ВНШ2 (Н-211), так и человеческими Т-клетками. Т-лимфоциты доио|х)в МЭЬ и II* про. шфериронали в ответ на пептид N"27 (аминокислоты 235-252), который распознана, лен также, и мышиными Т-клетками.

____________________II U К О Л 1>1

1. Выявлено. что основными нротекгивпымн комйошШТаШ—но|ммьижий__

МеНИИГОКОККОВОЙ ВаКШШЫ СС|И>Гру|1ПЫ В ЯВЛЯЮТСЯ í)O..IKII ПаруЖПОЙ мембраны класса 1 (РогА бедок), 3 (РогВ бедок) и 5 (Орс белок), способствующие стимуляции разных механизмов иммунного ответа у люден. Антитела к белкам класса 1 и 5 являются бактерицидными, в то прем и как антитела к белку класса 3 обладают высокой оисопизирующип активностью.

2. Нокаааип. что определение РогА-снсцифнческих антител методом иммупоблота не кор|к:лируот с антителами. выявляемыми методом ИФА с синтетическими пептидами. что свидетельствует о поимущественной направленности данных антител щхяив конформацнонных участков молекулы.

3. Доказана разница в иммупогеппости и иммунобиологических свойствах антител против РогА и РогВ белков для людей и лабораторных животных. Мышиные антитела к РогА белку являются высоко-аффинными и бактерицидными, в то И1х;мя как чед<«¡еческие антитела могут быть пнзкоаффинными и не обладать бактерицидными свойствами к зависимости от антигенного варианта белка. Мышиные антитела к РогВ бедку распознают копформациоппые житопы и |хико являются бактерицидными и нротективными. Человеческие антитела |х'ашрутот с линейным иммуподомнпантпым шнтоном и обладают высокой онсонизируюшей активностью.

4. Выявлено сходство Т-клсточного ответа па РогВ белок у мышеи и людей, появляющееся н ¡(аспознанании сходных иммуногашых участков молекулы. что является обоснованием применении мышиной модели при оценке лффективности клеточного иммунного ответа па менннгококковые вакнины.

5. 0н|Х2делена относительная нммуподомпиаптшк.ть Т-клеточных шитонок па белках наружной момб^шы менингококка серогрунны В: Ора>РогВ>Орс> РогА, что имеет большое теоотичеемк! и практическое, значение для разработки нового поколения мешшгококковмх kikühh.

6. Отмечена w,цеженная тенденция локал1ыацин Т-клеточных шитопов на белках наружной мемб|<апы менишококка (РогА, РогВ, Орс п Opa Пелкн) в консервативных трансмембранных участках молекул, что шметелилкует о возможности применения ряда антигенов с вариабельной антигенной

< -Ч|>\ к"'!> }М)й » качестве вакцинных антигенов с цедыо сочдании >ффсктпвного Т-чависнмого иммунного ornera.

7. Покачано. что вакцпнашш норвежской менингококконой вакциной (:с|х)Г|>уяим В стимулирует синим антител к Пелку класса 4 у небольшого процента добровольцев. Данные антитела направлены против конфирмационных шитонон и не обладают иметпой блокирующей актившхпыо но отношению к РогА-специфическим антителам.

8. Проведено исследование B-клеточных шнтонов на Ope белке, покачавшее, что данные антитела рашшают конфирмационные шитопы.

спиаж гд|,от. oiividiiimiiAiniux по пли: лисштлшш.

1.HiimaiTmomx^^

from peripheral blood lymphocytes from healthy carriers. European Research Conference "Molecular Pathogenesis of Infectious Disease: Bacterial Meningitis", Obernai, France, 1992, 36 (li соаит. с John S., Achtman M.).

2. Identification of an unique human linear В cell epitope on the class 3 outer membrane protein of Neisseria meningitidis recognized in the course of vaccination. Annual meeting of the Norwegian Society for Immunology, Oslo, Norway, 1994, 26 (II mil нт. с Wedege E., Caugant D. A., Dalseg R„ Kolberg J. et al.).

3. A comparison of human and murine monoclonal IgGs specific for the PI.7 PorA protein of Neisseria meningitidis. Molecular Immunology 1У94, 31, 1257-1267 (li сомит, с Jahn S., Kusecek В., Heckels J. E„ Rosenqvist E. et al.).

4. Emergence of a new virulent clone within the ET-5 complex of serogroup В meningococci in Norway. Annual Conference of the National Institute of Public Health (FOLKEHELSA), Oslo, Norway, 1994, 48 (и сшит. о Wedege E„ Kolberg J., H0iby E. A., Hoi ten E. ctal.).

5. Emergence of a new virulent clone within the ET-5 complex of serogroup В meningococci in Norway. NATO Advanced Studies Institute Conference "Vaccines: New generation immunological adjuvants", Cape Sounion Beach, Greece, 1994 (li соаит. с Wedege E.. Kolberg J., H0iby E. A., HoJlen E. et al.).

6. Identification of human linear B-cell epitopes on the class I and 3 outer membrane proteins of Neisseria meningitidis using synthetic peptides. Abstracts of the 9th Pathogenic Neisseria Conference, Winchester, England, 1994, 78-79 (li сшит, с Rosenqvist E., Tolnies G. E., Wedege E„ Caugant D. A.et al.).

7. Comparison of human and murine monoclonal IgGs specific for the PI.7 meningococcal porin. Abstracts of the 9lh Pathogenic Neisseria Conference, Winchester, England, 1994, 52-53 (ll coaiiT. с Jahn S„ Kusecek В., Heckels J. E„ Rosenqvist E. et al.).

8. Emergence of a new virulent clone within the ET-5 complex of serogroup В meningococci in Norway. Abstracts of the 9th Pathogenic Neisseria Conference, Winchester, England, 1994, 361-362 (H coaiiT. с Wedege E„ Kolberg J., Hffiby E. A., HoltenE. et al.).

9. Anti-bacterial specificities in the human fetal В cell repertoire. Human Antibodies and Hybridomas. 1994,5,91-95(11 соант. с Settmacher U„ Jahn S.).

10. A continuous В cell epitope on the class 3 outer membrane protein of Neisseria meningitidis is recognized after vaccination and in the course of meningococcal disease.

Proceedings of ihe 9th International Congress of Immunology, San Francisco, CA, USA, 1945, 3499 (It со,лит. с Wedege E„ Caugant D. A., Dalscg R„ Kolberg J, et al.).

11. Comparison of three human-murine heteromyeloma cell lines for formation of human hybridomas after eleetrofusion Iniman with peripheral blood lymphocytes from meningococcal cases and carriers. Human Antibodies and Hybridomas. 1995, 6, 42-46 (It соант. с Koumare В., Jalin S„ Glaser R. \V„ Wang J. F. et al.).

12. A linear B-cell epitope on the class 3 outer-membrane protein of Neisseria meningitidis recognized after vaccination with the Norwegian group В outer-membrane vesicle vaccine. Microbiology-UK, 1995, 141, 1593-1600 (It coaitT. с Wedege E„ Caugunl D.A., Dalscg R„ Kolberg J. et al.).

13. Emergence of a new virulent clone within the electrophoretic type 5 complex of serogvoup В meningococci in Norway. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 1995,2.314-321. (li соапт. с Wedege E„ Kolberg J., H0iby E. A., Holten E. eta!.).

14. Human antibody responses to meningococcal outer membrane antigens after three doses of the Norwegian group В meningococcal outer membrane vesicle vaccine. European Monitoring Group on Meningococci, 3rd Meeting, Bad Gleiehenberg, Austria, 1995. (It сшит. с Rosenqvist E., H0iby E. A., Wedege E., Kolberg J. et al.).

15. Human antibodies to the class 3 outer membrane protein in. Neisseria meningitidis can promote complement-dependent opsonophagocytosis. 32 Norwegian Biochemical Contact Meeting, Geilo, Norway, 1996. MT38. (it coaitT. с Rosenqvist E., Aase A., Michaelsen Т. E., H0iby E. A.).

16. Epitope specificity of monoclonal antibodies to outer membrane proteins from Neisseria meningitidis analysed by the pepscan method. 32 Norwegian Biochemical Contact Meeting, Geilo, Norway, 1996, MT37 (It coaitT. С Rosenqvist E., Kolberg J., Wedege E., Tolrncs G. E.. Frpholm L. O.).

17. Epitope specificity and functional activities of human and murine antibodies against class 4 outer membrane protein from Neisseria meningitidis. Abstracts of the IOth Pathogenic Neisseria Conference, Baltimore, Maryland, USA, 1996, 52 (It coaitr. с Musacchio A., Aase A., Dalseg R„ H0iby E. A. et al.).

18. IgG antibodies specific to the linear B-cell epitope on the class 3 outer membrane protein can promote opsonophagocytic killing of Neisseria meningitidis. Abstracts of the 10th Pathogenic Neisseria Conference, Baltimore, Maryland, USA, 1996, 44 (is сшит, с Wedege E., Michaelsen Т. E., Aase A., Dalscg R. et al.).

19. T cell responses to outer membrane proteins of Neisseria meningitidis: comparative study of the Opa, Ope and PorA proteins. Infection and Immunity, 1996, 64, 298-304 (it coaitr. с Wiertz J. H. J., Donders E. M. L. M„ Brugghe H. F„ van Unen L. M. A., et al.).

,,« (he PorB protein ol" Neisseria 20. Immune responses to Unear c^ ™ ^ ^»ogy-UK. IW6,

"meningitidis * P— T- e! ft* E. A.,

142 (9) 2491-2498 {V <'.oa<U. <• WcdcfcL b„

M.ehaelSenT.E.,AaseA.,H0ibyE.A.,»1stE ^ ^ ? ^

. 22. Mapping of T cell epitopes from the № Mccting

protein recognized after vaccination with ^^^^o^Norvvay 1997, 63; oHsG.utkouano h PoHhe Scandinavian Society for ^ , KorsvoW G. E„ Oftung

Scandinavian Journal of Immunology. -

F., Nsss L. M., Aase A., Wetzler L.ct a).). mcmbrane protein

T cell epitopes from «he memngou,^ - ^

^ after ^ with the Non^o^ - ^ ^

im European " ^old G- F"NXSS

u Immunology Letters, 1997, 56 (1-3!,

L.M., Aase A., Wetzler L. et al.>. g Nelsseria memngitidis in

- s—** - —-,997'85,2) 01

BIO congenic strains ov mice. .......

..............

Comcwwum U. (ID. MciiimioKoKV-owifi I«KI«ihm

- ..............-..............-.....•

—-............"*■'