Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Теоретический и экспериментальный анализ иммунопатогенеза инфекции вирусом иммунодефицита человека (СПИД)

РГ8 О Л

С "/ МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правам рукописи

ИГНАТЬЕВА ГАЛИНА АЛЕКСЕЕВНА

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ИММУНОПАТОГЕНЬд.» ИНФЕКЦИИ ВИРУСОМ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА (СПИД)

14.00.Si» - Аллергологии и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА МЕДИЦИНСКИХ НАУК В ФОРМЕ НАУЧНОГО ДОКЛАДА

Москва 1993

Hvuoi« шмюпнана в Институте иммунологии Министерства едиавооиранвния Си, с nil t) Москве.

Научные консультантам Члэн-ксрреспондент РАМН, академик РАЕН P.M. ХАИТОВ ,

Доктор медицинским неук И.Г. СИДОРОВИЧ

>

Официальные оппоненты! Академик РАМН, мсоФоссое Б.Ь. МОРОЗ Доктор медицинских наук, профессор Л.П. АЛЕКСЕЕВ Доктор медицинских наук, профессор A.C. НОВОХАТСКИй

Ьадущая организация - Российский государственный модицинский Университет ин. Н.И. Лироговв

Зашита диссертации состоится __1994г. в_____часов на

»аседвнии диссертационного совета И 074.09.01 при Институте иммунологии Минздрава России по адресу 115478 Москва, Каширское шоссе, 24-2, кон«врвнцвал.

С диссертацией но«но ознакомиться а научной библиотеке Института иммунологии Минздраве России по адресу 11547В Москва, Каширское шоссе, 24-2.

" Si.. ••..

Диссертация разослана ".'.т.. ". . yr.. . 1993r

Ученый секретарь диссертационного совет», доктор медицинских наук

Л.С. СЕСЛАВИНА

D 5 U (I П ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Состаа работы.

работа состоит из двух частей - теорвтичаской (написан и издан учебник/ научная монографии "СПИД") и еобстяэнных вкспоримвнтальных иселядований по мвианиомам иммунопэтогенооа и диагностики инфекции ВИРУСОМ иммунодефицита человека,

Актуальность Работы. Понятия синдрома ЛРИоврэтенного иммунного дефицита (СПИД) еыло ввряено В США а 1901г. з качестве новой для соврэменной медицины ноаолог-ичэской вдиницы.

К концу 1-ой декады регистрируемого наблюдения за втим зайолевзнирм »ксморты ВОЗ охарактгриэоаали СПИД как первую а известной истории чоповочяства истину» пандемию инфекционного заболевания. Инфекция признана как киллерная и неконтролируемая (по крайней меря до текущего момэнта) медициной, г?слм под контроле?« понимать возможность подицинскпй профилактики iivtom вакцинации или радикального лечения, итг мотп зы гюреапда патологического процесса в долготекущий хронический соамастимый с трудоспосовной лианьш. С 1901г. и по настоящее оррмя лидером па абсолютному числу иньицирооанных оирусом иммунодефицита (ВИЧ) зитвлрй яаляитсп CUJA - сама« богатая в срэднэм в экономическом отношении а наш век страна! к 1993г. а США инфицированным ВИЧ оказался примерно один и» каждых 30 человек а оснопной популяции населения. Сароятно потому, что СПИД прямо затронул национальные жизненные? мнтпрвсы США, стран западной Езропы и за ними всего остального мира изучении СПИД была <и прояотаэт быть) отдана значительная часть материальны* м интоллактуальным ресурсов западной мэдицинской науки. Я результате oatcm знаний по СПИД з настоящее ярвмя огромен. Сущэстоенных особенностей накаплиааамык знаний о ВИЧ и СПИД д«в< 1) Вмстрая смена наших представлений о данной инфекции по мере выполнэмил новых научно-исслгдоаатильских работ (только для так специалистов, который екгдгсг «а новыми работами) и 2) эполюция научным представлений о панной инфекции от прмяычных традиционных постулатпя о вирусных имфэкцийч к п»и^мянищ действительной ноэизны свойстр Furt м ему полосных рчтрозирусоп о роли аозбуяитолвй патологических процессов у чоловекя и к-иотннх. Другими словами, по прошествии 1-ой декады впидвмим остается ясв меньше оснований думать, что СПИД «ыл

' всегда, или выл давно, но не выделялся медицинской наукой иа множества других болезней в отдельную. Наоборот, есть основания думать, что СПИД как впидемическая болезнь о человеческой общество появился только в нашей веке, хотя возбудитель - ВИЧ -впали* типичный па свойствам среди немногих известных на сегодня рвтровирусов животных. Таким образом, конец XX века стал началом рвтровирусных впидемических оаболеваний человеческого общества. Биологические и впидемические свойства ретровцрусных инФекций гаковы, что по крайней мере на данном втапе взаимной еволюции (вирусы-чалоаак) во-первых нет признаков спонтанного разрешения конфликта, т.е. пыделв-нии из популяции людей генетически резистентным к ретровирусам индивидуумов и им потомков, и во-вторых, инфекция приняла марашмр пандемии (первой истиной пандемии о истории) и угрохает вдцроаыв основных популяций населения во всех.странах мира. Повтому па крайней пере в течение нескольких ближайших десятилетий (или вольте) ее я медицина вынуждена стать нариду с любой /акип специализацией врачаи в цехах еще и СПИДологией во-первых аатем, чтобы перестать быть, как она есть сейчас, одним иа-путей трансмиссии инфекции от человека к чяпааину (заражение при медицинских процедурах) и, во-вторых, чтобы врачи умели правильно диагностировать ВИЧ-инфекцию при самых разнообрааных «ормйх клинической манифестации сопутствующих СПИД болезней и назначать патогенетическое лечение и корректно консультировать пациентов и связанных с ними лиц в целям нераспространения инфекции на послемних. В западных и отечественных (меньше) научных периодических журнала» ежемесячно публикуется более 100 оригинальных научных работ гю БИЧ, СПИД и родственным ретровирусам. Однако до настоящей работы в Гпс.сии отсутствовали аналитические обобщающие труды по данной прибиами, которые могли бы служить руководством для врачей и студентов медицинских и биологических специальностей. Между тем повскпвс(мыв наблюдения за деятельностью практического здравоохранении покапали (и продолжают показывать), что большинство отечественных доктрин и средний и младший медицинский персонал продолжают работай, без учета существования ВИЧ и ему подобны:: вирусов, в силу мь-дистаючности доступных знаний, или руководствуются знаниями, устаревшими ■ 1905-89гг К 1990-91 гг. наконец-то накопилась такая масса знаний о ВИЧ и СПИД, которая • отличие от имеющейся в предыдущие годи, ножвт позволить, с нашей точки зрения сделать ряд заключений и обобщений, которые не рискуют скоропостижно устареть в ближайшие месяцы и даже годы. Поэтому мы расценили текущий момент как исторически подходящий для написания аналитической работы, которая могла Бы послужить в

качи шв учасника/научнай монографии по СПИД для врачей всех ме/тнппмскии спвциальностой и студентов в целях приобщения рускояэычми:< мвдикпв к глобальной статвгии противостояния пандемии СПИД, в котоппп участвуют под координациер* BD3 все цивилизованные страны мира. Повтому нами выли поставлены следующие цели и еадачи.

Цз/ш и вадачи исследования.

1. Проанализировать как можно вольшее количество научных

первпис. тпчников по провлемам ВИЧ и СПИД как в историческом аспекте, гак п новейшие, а такжв обобщить совственные вксперимантальные исследования механизмов иммунопатогвне»а, вовлеченных в действие при инфекции ВИЧ, и написать учвбник/научнум монографию по проблеме СПИД в lie л он

2. Задачи собственны;! экспериментальных исследований включали! получение панели гибридоммых монаклональниж антител против различным аишгенпв вируса ВИЧ-1| исследование свойств их иммунологической реа>о иинасти в иммуноввривнтном и иммунаФлиоресцентном

анализах, а так*» виологичоских свойств на культуре ВИЧ-1 инфицированным клеток In vltrol раиравотка неинвавианого метода сиропогичаской диагностики ВИЧ-инфекции по определении» cnsnw»v\4pci-w* антител в моче человека.

Раадвлы работы.

Теоретическая часть райогы вклмчает следующие разделы, составившие содор жанир учеьника/мсногра»ии«

1. Введение.

Определение. История предмета. Выделение вируса-воэбудитепя.

2. Состав и строении вируса иммунодефицита человека. Морфология вирусных частиц. Балки. Геном.

3. Происхождение вируса СПИД человека. Разновидности ВИЧ. Родств»'" "■>» вирусы животных.

4. Биология инфекции ВИЧ на уровне отдельных клеток. Клетки-мишени для ВИЧ. Латентная стадия инфекции. Репликация вируса. Цитоплтогвнно» действие ВИЧ.

3. Патологии инФакиионмасо процесса в организме человека. Иммунопатогвнеэ СПИД. Иммунный ответ на ВИЧ. Закцины против СПИД. Влияние ВИЧ на нервнуи систему. Патологические процессы а коже. Ь, Клиника СПИД.

Стадии инфекционного процесса. Классификация стадий и форм манифестации СПИД по CDC и WR. Клиническая картина острой первичной

ин4<вкцми. Критерии клинической диагностики СПИД. СПИД у детей. Ко-Ф«»кторы в развитии СПИД.

7. Методы лабораторной диагностики инвакцим ВИЧ. Олиеделвмпв антител к ВИЧ методами иммуноаналиаов. Определенна отдельным антигенов ВИЧ методами имиуноаналивов. Высев реплицирующегося вируса In vitro. Определение генома ВИЧ е клетках человека методами цепной полимвраеной реакции и гибридизации нуклеиновых кислот.

в. Лекарственные средства против ВИЧ.

Экспериментальный поиск. Клинические испытания. Генетическая твРвпи* инсекции ВИЧ.

9. Эпидемиология СПИД.

Пути варахения вирусом иммунодефицита. Правовые аспекты СПИД.

10. ДевинФекция вирус-содвр«ащих материалов и объектов.

Правила работы, обеспечивающие беаспасность, для медицинского пшрсшшпа пациентов.

Собственные вкспсримвмтальные исследования по проблеме ВИЧ/СПИД включают следующие рабдвльн

1. Получена панель из 1й гибридомныи моноклональных антител проти« антигенов вируса ВИЧ-1 (волков лигat а натиеного вируса ипамма HIV-1 HIB, синтетических пептидов ис последовательности аминскислот оболочечних белкое ВИЧ-1, антиидиотипическмк антител протиа анти-СБ< антител - 0КТ4, 0КТ4А) . Охарактсриисаани свойства иммунаг»еоктмзмост1? моноклональных антител и биологические свойства енти-идиотипическия антител о культуье ВИЧ-1 инфицированных клеток in vitro.

2. Разработана методика определения специфических анти-ВИЧ антитцг, с пробах мочи - как вариант ноинвавивной процедуры /шСордторной диагностики ВИЧ-инФмциРооанмости.

Научная новиана работы. 1. В ре»ультате работы написана dopdcr с России научная монограФия/учвбник по проблеме СПИД. При работе над книгой автором проработано более 1000 литературных первоисточников. Собственная книга при втом не является компилятивным сборником отрывков и« варувежной научной литературы, но представляет ив себя (по отвизам специалистов) самостоятельный систематизированный и концептуальный анализ широкого круга медицинских и биологических вопросов,

касающихся ВИЧ и СПИД, и имеет черты энциклопедического руководства по проблеме СПИД/ВИЧ для специалистов,

2. В ходе сойственной экспериментальной работы автором лично получено 15 ртпммоэ клонированным культур гибридомных клвток, продуцирующих моноклональныв антитола к антигенам вируса ВИЧ-1.

3. Автором впервые получвни опытныо даннью, показавшие Феномен усилении течения инфекции ВИЧ-1 о культуре чувствительных клеток в присутствии споци<гических антител (в данном случае моноклинальных знтиидиотипичэски емти-ан"ги-СВ4). В ходе выполнения этой части работы автором впервые предложена мэтодика предварительной оценки функциональных свойств антиидиотипических антитол (слвдоватэльно, предварительного скрининга)

в тосте микроцитоолюоромеэтрии по выполнения

инФвкциинно-апасных для персонала и окружающей среды экспериментов с культурами инфицированных вирусом ВИЧ клеток.

4. Предложена новая методика, поаволпгащая достоверно определять анти-ВИЧ антитела а криопреципитате мочи человека в тест-системе "Пептоскрин-2" (Институт иммунологии Минздрава России) и в методе ВИЧ-Вестерн-елот...

Практическая значимость работы.

1. Учабник/научнап монография "СПИД" издана в конца 1992г. Народной академией культуры и общечелопеческих ценностей и доступна практикующим □рачам, студентам, научным райотникам, заинтересованным представителям других специальностей, что предоставляет отечественной медицине на профессиональном урооне противостоять распространению эпидемии СПИД.

2. Впервые наблюдаемый автором Феномен усиления вирусной инфекции антителами оо-пзрвых, призлекает научное внимание соей новизной и дя®т повод к переосмыслению представлений об иммунопатогенезе и, во-вторых, Обяэыпает к специальной проверке на отсутствие усиливающего дэйстрип антител всех разрабатываемых вакцинных препаратов, традиционно предназначенных для индукции в организме усиленного гуморального и клеточного иммунного зтоота на вводимый антиген. Описанный автором экспериментальный Факт свидетельствует, что такой Фактор иммунного отпета как антитела (по крайней мврэ) может не только не препятсвовать развити» вирусной инфекции о организме, но наоборот способствовать прогрессии инфекции.

3. Разработка по определения специфических анти-ВИЧ антител в моче еривнтирозана а практических целям на неинваяивнуга серодиагностику

в дэтеких коллективах, во всех случаях, при которых нежелательно или кзэоэмагнэ инструментальное проникновение э кроэь человека (например, 0 полевик условиях), а также а перспективе - нг домашнее самотестирование ех 1етрого сексуальных пар.

-а-

Апробация райоты.

Результаты экспериментальной работы докладывались на 1) IX вгегодной конференции скандинавского иммунологического ссщестоа в Uppsale, 19В7г. (устный доклад на секции и стендовый доклад) 5 2) всесоюзной конференции по иммунобиотехнологии в г.Таллин в 1987г.Суетный пломарнай доклад) ) 3) международном симпозиуме New gencretion on monoclonal antibodies In diagnosis and therapy, Genoa, Italy, aprtl 12-1S, 1992 (устный доклад)¡ 4) VII Mesдународной конференции по СПИД, Амстердам, 1992г. (стендовый доклад) ; 5) Международной конференции "СПИД, рак и ретровирусы человека", С.-ПатеРИУРГ, 1D-22 ноября 1992г. (устный пленарный доклад) } ó) VIH Ме*яуиарадной конференции по СПИД, Берлин, 6-12 июня 1993г. (стендовый доклад). 7) 2 Международной конференции "СПИД, рас и ретровирусы чэлоасгка"» С.-Петербург, 30 нояврп-2 декабря 199.4г. '(пленарный доклад).

Мать-риалы учебника/научной монографии "СПИД" cnpociv-'osa/llicb с преподавании студентам Государственного Российского Мэдмцинского университета мм. Н.И. Пирогова и слушатыльи каесдры уссссркснстоси«™«-врачой при Минздраве России (заведующий академик Р.И. Хаптсэ).

Пуйликацим» по материалам диссертации «втором спусяикооамо 10 раеат па исследованию ВИН-инФекции и 19 раеат по гибрмясм^ой еиотоинологиу;. Общее число публикаций — S3.

Вклад автора« в представляемую к вавдлте месту екгшчеим только эксперименты, выполненные автором лично. Едкмстбсмниз созмасткыа егглти - культивирование инфицированных ВИЧ-1 HIB пзямгамим клетск с специализированном вирусологическом аоксс Институте ci'^yconofizi tat. Д. И. Ивановского в лаборатории pepnocEi/jpycHU»: (ссзса^^й

профессор И.Ф.Багинский). Монография "СПИД" малмглмв о ссшзтсрстео с академиком P.M. Хситовым.

Положения, выносимы:? на иащ.тту.

1. Написана и издана книга "СПИД", отвечающая критериям учебника/научной монографии и предназначенная для врачей, студентов, научны* работников. Собственный опыт paboru и сойственныа тосрвтичсс!«ДЛ концепции автора в наибольшей мере представлены в гласи ос иммунопатогенеае при данной вирусной инфекции. В настоящее еяомя

инфвкция вирусом иммунодефицита признается инфекцией практически всего организма, так как втот(эти) вирус в той или иной стспени и на той или иной стадии раввитип золозни способен инфицировать различные гистологические типы клеток-тшвнвй, но клетки иммунной системы пораваютсп птим вирусом в каждом случао заразившегося человека и с самый начальных стадий развития инфекции в организме. При этом иммунная система нэ только оаьякт, на который направлено разрушительное действие ВИЧ, но и активноа завно в общем патогвнвзе заболевания организма как полого. В »том эакшвчаетсп одна из концепций автора (главная), детально изложенная а монографии.

2. Экспериментально показан впервые о мировых исследованиях по ОИЧ-инфякции и СПИД Феномен усиления вирусной инфекции антителами (антиидиотипическими анти-анти-СИ*», перекрестно-реагирующими

с 0ИЧ).

3. Предложена собственная методическая разработка, позволяющая достоверно определять специфические анти-ВИЧ антитела в моче человека как вариант нэинзапивной лайораторной диагностики ВИЧ-инФекции. Цель разработки - насопг»пжемноэ с риском заражения при медицинских инвазия.; обследования датей, беременных женщин и других уязвимых групп населения, а такжа в перспективе домашнее наглядное самотестирование сексуальных партнеров.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ,

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МЕХАНИЗМОВ ИММУНОПАТОГЕНЕЗА СПИД.

Имеющиеся но сегодня знания о ВИЧ говорят о том, что этот вирус по своей природв является в первую очередь иммунотройным. Это первенство равделявт в какой-то мерв и по-своему нервная система. Вслед эа ними воалэкамтся другие органы и ткани. У отдельных конкретных людей первым во времени и преобладающим по вкладу а общем патогенезе может стати повреждение ВИЧ какого-либо ростка кроветворения или купгочника или других кляток, тканей, систем органов. Взаимоотношения ВИЧ с иммунной системой активно двусторонние Со свозй стороны вирус оказывает, во-первых, гуморальной иммуносуге'ессианоо действие.и, во-вторых^ прпмоя деструктияное действие на Т4-лимеоц1лты-хвлпгРы, на предшественники '(-лимфоцитов р тимусе,

-iO-

на B-лимфоциты, дендритные лимфоциты; макроФаги. С другой стороны иммунная система кроме того, что яалпзтсп мишенью для ВИЧ, сама реагирует на антигены ВИЧ оыр&баткой специфических антител и сенсибилизированных лимФоцитов-вофекторов. Однако с течением времени ВИЧ как бволюционирукиий биологический объект не поддается контролю со стороны нормальных иммунных мвханиомов и возникает и нарастает со временем дисфункция иммунной системы. Это означает, что начинают включаться и преобладать патологические иммунные механизмы (типа а утаим! «уьних и другие), которые вносят ухе свой самостоятельный оклад в рйврушани клеток и тканей организма. Во времени иммунопатогеноз СГС1Д иогно разделить на три периода« 1) первичное оваимараспазмаиамий £i14 и иммунной системыj 2> клиничоски бессимптомный период точиыя инФакции (истино латентный и ватцм скрытая прогрсссия имзекции)5 3) клинический СПИД.

В самом начале инфекционного процесса с раоной по продолаытильнагт озаой задержки и с разной инганс№г>остыа у разных людей происходи репликация ВИЧ, накопление вирусной uaccu s организма о ¿¡zi'tztl..-..! «акторов специ^иЧЕгсксгс и;:п>! ;нтстя (о ни ещ» на ус поли вдоацотаться ВИЧ ухе в ото время начинает воздействовать подавляющим сСРааон ни иммунную систему - "сводным наркозом" с лзрвьш шагов посредством растворимых форм некоторых своих йоп«оп. Известно, по крайней мере, две гуморальные субстанции, кодмруемих гснами ЕЛЧ, или вавискщиз каким-то образом от В11Ч, kotcpus eaiiii по себа екапыиа^т супрессорное влияние на иммунную систему и о&егатоксичоскоэ илияние на другие клетки (нейроны и пр.). Это, ео-первш, растворимая Форма самого наружного ездка осолочки оирионой ЕИЧ - с Во-втсрых, ото некий но вполне охарактерисозанмый оа^тор с молекулярной массой 65 или 67 !<D, который ойраауотся о инфицированных клетках. Гуморальный "вводный парков" со стороны ВИЧ обеспечивает иммуносупрессиш задолго до Физического раврушенлп самим вирусом иммунной системы. Таким обрасом, нарсстаниэ собственной оирусной массы в организма идет с самого начала на Феи нарастающей со временем иммуносупрессии. До 50% синтозироааннаго о инфицированной клетке белка др120 уходит ив клетки с кровь в вида растворимой формы. Растворимый др120 способен с высокой еФвинность

свявываться с рецептором CD4 на неинФицированных Т4-хелперам и других иммуноцитам. Биологические аФФекты растворимого др120 проявляются в культура* клеток in vitro при концентрациях др120 мкг/мл. Сапвываниа растворимого др120 с молекулами CD4 на клетках приводит, по крайней мере, к трем невлагоприятным последствиям. Первое! др120, свивавшийся с CD4, является для клетки "бессмысленным" сигналом" <"пре-актмвацией">. После втого связывания активируется ассоциированная с цитоплаоматичвским доменом CD4 протеинкпнаэа pSA-Ick, которая катализирует фосфорелирование самой молекулы CD4. Фосфорвлированная Форма CD4 влмминирувтся с поверхности клетки. D результате такой клетке становится просто "нечем" взаимодействовать с антигенами II-го класса главного комплекса гистосовместимости П1-ГКГС) и с роцрптором для антигена. В результате такая клетка становится неспособной участвовать в нормальном иммунном ответе, хотя она и не инфицирована вирусом. Особенно выраженный иммуноаупрес-сорный вФФект оказывают агрегированные формы белка др120. Агрегаты его образуются, например, в результате сшивки специфическими антителами CHabeshaM J. A. et а)., 19903. В иммунологии известно и в более общем виде, что пре-активация Т-лимФоцита, в частности, хелпера, приводит-к ого реФрактерности в отношении восприятия адекватного стимула и, следовательно, к невозможности правильного отввта на сигнал. Пре-.-активация и реФрактерность возникают, например, при быстрой модуляции такой молекулы мембраны клетки как С03 CDavis L.S. et al., 19893. Кроне того, в молекуле др120 имеется, по крайней мере один участок, гомологичный по последовательности аминокислот <NN 261-270) антигенам II-ГКГС DR, DP и DO (номера аминокислот 142-151). Это теоретически может вносить свой вклад в патогенез дисфункции мммуноцито Второе вредное последствие связывания gpl20 с CD4 состоит в том, что будучи чужеродным вирусным белком-антигеном, др120 "метит" родную для органивма клетку, как чужую. Тем самым клетка становится мишенью для уни\тожения иммунными механизмами защиты от вируса (АЗКЦТ, UT/1 и др.). Экспериментально показано, что ВИЧ-специФичная АЗКЦТ у инфицированных лидей в клинически бессимптомный период болезни выражена весьма аначитвльно CJewett A. et al.,.19903. Еще один механизм иммуносупрессии и повреждения клеток вне иммунной системы - аутоиммунитет, связанный с ВИЧ инФекиией, но объяснимый не сорбцией вирусных белков на клетках, а перекрестной реактивноетьм собственных антигенов клеток и вирусных антигенов. Природа ВИЧ такова, что в его геноме и, соответственно, в белка» много общего с человеком. То есть, существует гомологичные (одинаковые

лли пичти одинаковые) последовательности нуклеотидов в гкнах 1 аминокислот в белках, которые при »том являются и иммунологически шракрестно реагирующими впитопами. В частности, гомологии выявлены •«ежду последовательностью аминокислот NN 254-26В в молекуле gpl20 и тоследовательностью аминокислот NN 141-153 в молекулам П-ГКГС DR, DQ, DP. Veljkovlc у. and Metías R. C19923 экспериментально показали, что в гене др120 существуют вломенты »екомбинации, которые гомологичны влементам рекомбинации, а именно Chi-промотеру, характерному для генов V-области тяжелой цепи иммуноглобулинов человека. Эти гомологичные влепенты рекомбинации локализованы в тек ie последовательностях нуклеотидов, которыа ранее вили известны как гомологичные между последовательностями, кодирующими 2-й консервативный домен ер120 и 1-й каркасный домен вариабельной Области тяжелых цепей IgQ человека 3-й подгруппы <VhIII). Соответствующие гомологичные последовательности аминокислот о gpl2ü и в IgB представлены V-O-L-tN/V)-Е-В. Выявлены также гомологии между последовательностью аминокислот NN 824-ВЗО в молекула др41 и NN 19-25 в последовательности молекул П-ГКГС. Причем, (экспериментально покааано, что существуют антитела, полученные против вирусного белка gp4i (как моноклональные, так и рыделеннмо из сывороток больных), перекрестно-реагирующие с антигенами 11-НСГС, и способные эффективно угнетать Функцию антиген-првдетавлпющих клеток. Следовательно, и иммунный ответ CBolding И. et al., 19Q93. Косвенным признаком выраженности аутоиммунных процессов при ВИЧ-инФекции является tdiu возрастания концентрации в крови больных комплексов "антигеи-антигело". В периоде бессимптомного течения инфекции после сероконверсии иммунная система начинает играть ees более активную роль в общем патогенезе заболевания. Вирус иммунодефицита тем временем продолжает размножаться и оказывает супрвссорнов и даструктианое давление на иммунную систему.

Какую-то часть противовирусных иммунных механибмоа ВИЧ начинает "испольаовать в своих интересах". Что же происходит? Гуморальная иммуносупрессия вирусными белками др120 и р67 продолжается. Цитонекро» инфицированных ВИЧ Т4-хелперов и других инфицированных клеток продолжается. Но в начальные сроки течения инфекции, пока еще значительная часть иммунной системы не разрушена ВИЧ, идет выработка противовирусных антител, в том числе и антител, способных нейтрализовать вирус. Какую-то часть вирусного пула такие антитела имактивируют. Но имеющийся опыт показывает, что нейтрализующие вирус антитела не способны остановить прогрессии!

di

X I-

А i U s X

с. X X X X 1- 3

о 'S 2 E û. I о ffl

1- ö œ X ч t. 0 с

s; □ с г □ a. X

IS E X X r S Cl

в 1 а Ш l: 2 X I ai z и X

s: к Г EL m 0 m и m а CL

1- в я Н I œ I X 1 It

2 к с 0 It ■ X h 0 L ü □ a. X

« i С. и 0 b S U a С II

I к a с и m X » X 5 0 Gl о » с

S о X ш ■í та rï <e 0 u h X t

т X X в с ZS с a. с X y ш S и a.

Л! О 15 с ш 0 й X Cl r s с l- n X

X b X a н а. h 0 h s аь h s I s es IS

U 0 ь S С lt m s 01 0 0 X ni с ^

'S >3 С s ь IB <0 K L u а. Cl s L. а Cl

с Cl V ь I о 0 ÍL I С 0 С с X •U t-

а СС X ч с_ а 1X1 <5 1- s Cl в с s

ь J « Ci а D Z X u s t-

s X X э с S S 0 2 X I с E X

н sc I г s ч и Z 3 а (- m CI m

X л f- s a а s s 2 I с 1С а. U

« с z g ь g — X ta С! 01 Ç n : С 3-

о а Е X m s m t> M э EL 4 1« <0

(!) if с X а te f- X et El О I С" a

S и X в 5 ' 3 n t. в h 3 с

X □ а. S с О z • S о X в Q С X ÜJ s

<в с s с а 3 c¡ tu t с X S X S CI j

1 н а ■а «. J> ь Ci «a о Cl ч о X е 3

ю M «. 1- с и X a. 1- a X JB X X с s:

а-» К а № к •S а £ JD 1- и u H s с с Е (!) 0

1 0 и в в 0 О V с s в о 0 ■D в

L »4 с е X 10 а z u Q s с С >2 С X

О t 0 z 0 IS X X CI X и О ь s

h s та X X о о T s X S I X a

а s г А 0 X и. 2 s X « s П; и Ol Cl

0 It) 3 О е I в c. I S 3 и X •о s

ffi "X I I а X X с X 3 s X О в. 1 X

С о I i а X S S X >. X CL X s > ta

о л л « X X а » t а о S El Е •о с

m с 1- ь s s в! u X -i Iii О о 2

0 s 0 V 0 О s X 5 5 с С а U

а С H va Р н s а x t а ■3 Û a 1— X

« 2 а 0 X s а о s 1- в. в. 2 а I AJ

и о В г. ta 3 с 4 D 0 С h L и С; С X

и а «a f- X u s л 0 и с <х с

о л •s X & X X с h 12 « Ol ь а s s

3 b s я et X b 1 а I X О я u 1 X

0 е 3 к а S в о s а r * 0 X Г5

0. Q u S в Ë к a> IL ш (3

с о £ Г Я X s t- a M 4 с « С 0 с с

в с a с S ц □ с C- «1 œ с Cl t- с с;

с а о в X m гз к u 0- 1- a. s О Q С;

•- с. о s S s в e> 0 V L X ь с

0 « т 3 с L X 2 с i? с X г. и

— о а IS 0 с a e e t- a- I и X U

X r- 0 о 5 3 H 0 X X D 1- 5

0 S t- s s X X 0 D ^^ а 2 j; о Q ч

s s » u » а «и n £ X fil 1- EL с tt S т.

я 1- 4 У Ç; 3 Г4 S <s 0 0 U a о 3

V х В. V. Г" X X X (- t. u 2 ¥ L 0¡ т

s Cl □ at ч n L в s ¡; Cl m s ч О Li S. г

в в « X 0 « n к X U! и s. ( n в n ® >.

X в К s: с в <0 а □ t (8 3 о X С ш о

s в 0 а U * L Z L. С n с с >9 s 0 я т

X S

>3 a с '5 n

С i 0 Î- S в с

• • * s X ь I о

!_ а M я X с «s X M 3 I к. а с * 1; м I О S

is 1 M с • a 0 Я е X • 1 f-

а ••ч а Q X с с С п е i. e 1 s О 0 X

ш 1- л e s SI □ ч с 3 ». s X K b ч

л r-t X m н с X X s n л u О и

к 01 1 т m s о О ,«г л u> X с № 1- 0 X

(В (L T Ü 2 X )- ttr в г С б с 0 >i 0 T с 2

т X т t 0 X X s X ¥ I a l С £. >5 S X

Г H а >- 0 t- <8 ь T О т X с и b X а 0 Л

X X с 1- ■e 15 с 0 G X 0 о X X 2 X с

u cr X О o я № X а е. X О ь с a и о в X ч

0 с y S 2 h С а. X 0 Y X X

a K с X X S S 1 О a в ■» a «1 С

L. ¡C а> » J □ h 0 G <х с X Cl И с 2 с

U В с S а 1» и t; i- X X t О V- s Ь" ь а. X

-0 □ 3 <L с «s □ « с С (- X X y с h b U 0

ш с n "л с а ■ X 1- с. * с о s и О s X

1 L. S X Ь- 1- n □ c X С 3 о a « a (ti 1- 5

Г) 4J S S с e 2 2 1 о » s О T в I 2 X

Q -a. X « □ с X 3 X Cl S «г н в a с q С

0- > X I m 0 SI О s С р с V i в X в и »

X u с; « X X X X s X X 5 t; b n 5 a

С X 1- а e о t u «в с « t Si л a 5 2 u

В ■и в 5 h ei e- ^ s s s и f- X S (

D К s 3 r о s и с с ► S. ш а I J S

5 0 X 1- I 0 J u X I X s « X h X m ч С 0 b

3 с IL II X X X t- « с а D с X и и « b X

1- m S в о b s и I- * О ■ <x s X т «

0 и Л S er X T X X и ч а X u. с О i

u г S 2 5 te X T « а « b U u 1- « с _ 5

в с в I □ L r с s X с s с 1 л e е X Q b

L а I X. u «1 t 0 Cl s с s a u ю S a о 0 О X

IB s с: 1 S ai с L s s с и и с 5 E « X X я

»j X « s 1- » к а ft. £ X s м <B № JS О s

О a» X h 0 0 С с X о. в и с г с «

X I 0- 0 I e X С X u e « LÜ J □ 0 X SS

I Ci X с ■3 И X с 0 X X S е с 3 « s С 1 в et

Q X X X ß s Cl в с с «т £> Ci + с и О

ч 0 s о в D X А t н 4 1- L X a s X с а

X s X s X s t- s X 3 1 Ь- s: С u s X 3 u X

£ Hl X О J> s в s с b !£ о 1£ ft. и с X О X

а e s X 0 e e r X О ¡5 « S 0 с X в J X e

(L с c. О u а 1 Ь © t X С b с X t.

□ t- s t 1- «» и s a в X X с л К 5 S m X s

c Ü с § « X « • 0 с: X L »- X X

ta о к e> e TI t. ч с e « X « • X С •r о s X

«0 »- m s о s ta X X L а X S Л с о

i с ï K « 61 л я X L S t Г X a

а a с Zi и ? a h n • X i h 0 г L X б u О

X n X t E il 0 к X ч л X s Q о h э X и с

X 0- с T с a к □ с с X L В о X О «

с tc X u E г I» и X в X X b « * т X с s

m и X с X â. ce а b Y ^ e в> s 0 X b

h « X с s с a 3 i S s X с h X «1 и

X С. t- a J Й s s и h В 0 С ч 2 в 2 X a

e « « Б c С 3 X о X u L s с X и X

X a н X 5 s о 0 s 1 с: 4 г 0 « о 3 Л у

s b S 1' a с ь .X X X s S с e с K S с о S

L a 3 н S a S L L a b b ^ а с e s 0 е О L С

¡SI я с и 1 с. H 0 S i C1 ^ Sí »- • b «1 Si s L О s

С □ S s s a X t- 1 о в s 0 s X 1- Í- L э

u u X u u с t S û (- fr • к b m 0 X X В

ü s n X f- о s с с и » X s X T S: а. о «. С

il и с Q O С с « * D о s « 3 « S I С X q u

S испытанных показали парадоксальный (относительно ожидаемого) Рее ультвт*. они не тушили, а усиливали а 2-4 раза 0КТ4А-иммуноФлюоресценци» клеток Н9. Оба усиливающих антитела относятся к классу IqM. Именно вти 2 антитела при добавлении в культуру клеток Н9, инфицированных ВИЧ, усиливали имфвкцию. В присутствии таких антител хронически текущая инФекция превращалась в острую летальную« На меинФицироьанныа клетки Н9 вти моноклональные антитела не оказывали никакого влиянии. На клетках Н9, с которыми проведены вти вкспвримэнты, Fe-рецептор не обнаружен. Следовательно, в данном случае Феномен усиления инфекции БИ' антителами не связан с использованием дополнительного канала проникновения вирионов в клетки черев связывание с Fc-рецвптором комплекса вируса с антителом и интерналиоации его. Вероятно, и рецептор для комплемента в »том случае не задействован, поскольку, по крайней мере, усиление Флюоресценции-проходит ■ среде, не содержащей комплемент. Корреляция между усилением (ЖТ4А-Флмаресценции и усилением инфекции ВИЧ одними и теми же антителами позволила авторам представить себе механизм усиления таким образом. Поноклональное антитело анти-амти-СВ4 класса IgM связывает от 2тх до 4-х молекул 0КТ4А или по перекрестно-реагирующей детерминанте (именно на вто вели отбор гибридомных антител) от 2-х до 4-х smpít^íss ВИЧ. Природным свойствам втих антител оказалось то, что их связывание с антителами QKT4A и также с ВИЧ не препятствует ни 0КТ4А, ни ВИЧ взаимодействовать с рецептором CD4 на клетках. Таким обравом, моноклональное условно говоря анти-идиотипическое антитело связывает в "пучки" от 2 до 4 молекул СКТ4А или также 2-4 вириона ВИЧ. Такие "пучки" вместо единичных лигандо связываются с рецептором CD4. Происходит мультипликация либо дозы 0КТ4А на один рецептор CD4, либо дозы ВИЧ. В Результате - усиление либо 0КТ4-Флюоресценции, либо ВИЧ-инФекции.

СИСТЕМА ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ИНФЕКЦИИ ВИЧ.

Какие еще кроне нейтрализующих и усиливающих бывают антитела в инфицированном организме человека, или при искусственной иммунизации лабораторных животных? Что вообще происходит с В-лийФоцитами и иммуноглобулинами в ходе ВИЧ-инФекции? Какова динамика гуморального иммунного ответа на ВИЧ?

Начнем с самых общих наблюдений на популяционном и организменном уровнях. Специфические антитела к ВИЧ вообще можно обнаружить только у пгимерно 90Х всех инфицированных людей, если считать в целом пациентов на всех стадиях заболевания. То есть, у каждого десятого инфицирован-

ного человек« антитала обнаружить не удается. Следовательно, такие инфицированные люди не выявляются методами серодиагностики. Почему и у каких пациентов не определяются антитола? Во-периых, антител еще нет в периоде латентной инфекции, корда вирус в организме уже присутствует, но спрятан в собственный геном человека и на распознай иммунной системой. Во-вторых, трудности с выявлением антител могут возникнуть в периоды массивной виремии и антигенемии, когда наличный пул антител в крови израсходован на связывание в иммунные комплексы, и наработка новой вирусной массы обгоняет наработку новых противовирусных антител. У разных индивидуумов такая ситуация возникает с разной частотой и продолжительностью периодов. Бывают пациенты с исходно ослабленным здоровьем и, а том числе, со слабой иммунной системой. У них виремия и антигенемип начинаются рано по срокам и стойко держатся до исхода заболевания. У таких больных антител мало, и чтобы им определить нужны тест-системы с повышенной чувствительностью, а также модификации методов анализа, предусматривающие этап высвобождения антител из иммунных комплексов. У многих пациентов антигенэмия/виремия существуют в начале инфекционного процесса и предшествуют появлении в кроэи свободных антител, и затем возвращаются на поздних стадиях заболевания, когда иммунная система уже основательно разрушена. Динамика гуморального иммунного ответа на ВИЧ в организма человека зависит от дозы вируса при ааражении, входных ворот инфекции, наличия ко-Факторов, определяющих длительность истинно латентного состояния вируса. Если заражение происходит малой дозой и со слизистых, то специфические антитела как диагностические маркеры инвекции можно зарегистрировать не скоро. Никто из специалистов но скажет конкретному человеку, обратившемуся аа консультацией с вопросом! когда ему можно ожидать сероконверсии» после, например, однократного случайного сексуального контакта -Солее точно, чем через 1 месяц - 10 лет. Если заражение произошло достаточно большой дозой вируса с попаданием в кровь, то динамика гуморального иммунного, ответа на БИЧ напоминает таковую при ■экспериментальной иммунизации лабораторных животных. Это и отражают графики динамики содержания в крови антигенов ВИЧ и анти-ВИЧ антител, на которые ориентируются коммерческие диагностические тест-системы. Антигены ВИЧ могут быть зарегистрированы иммунооерментным анализом через 2 недели после заражения и продолжают еыть в крови до 8-й недели. Свободные анти-ВИЧ антитела появляются, начиная с 8-й надели и их уроиень выходит на плато еще через 2-4 недели, на котором может держаться в точэние месяцев и лет. В редких случаях -

«сего 0.4% CBarnes D.M., 19683 - описаны наблюдения -тек навывесмой обратной свроконверсии, то есть исчезновения определимых аити-СИЧ антител из крови после достоверно документированного периоде. сероконаерсии (то есть наличия анти-ВИЧ антител в крози». №и »том вир) однако, остается в органиеме и может Кыть определен по наличию'его генома методами ЦПР или гибридизации нуклеиновых кислот. Один такой случай спонтанной серонегативвции описан ftmaiton <3.-С. at el. С19Е93. Сороконвезрсия била зарегистрирована у клинически сесеимлтсжней пациентки методами ИФЙ, РИПД и Вестерн блота и персисти-оэал^ в течение 4.3 месяцев. Затем антитела к структурным белкам ВИЧ исчезли из крови (перестали определяться) и не появились, по крайней мере, о течение 3-х месяце;: наблюдения. При етом, однако, определялись антитела к Ыяг-елку и была положительной ЦПР на B¿i4. Ноивниамы евроногатиевция НЙИгЗЕСТНЫ И, ПО-ВИДИМОМУ, MOCHO продствсмть севе, что они расличаютсп в равных конкретных случаи«.

Прехдо, чем разобрать подробное, к¿кис антитела существует при иневкции ВИЧ, отмстим ецв один айдай с1г.мптомЕ вернее сиввйть тенденции в сдвигая е В-подсистемс цкмунитсто, i' «зольных C'.VAÍi и у клинически бессимптомных инфицмрозьихмк <нс в дсн;чсм спучга, к an и всякий симптом, то о чем идет речь рссоиссотсп во upmiени), как правило, еызавт гипергаммаглобуликешш - прывнак лаликлезмальмей актиоа-ции В-лим«оцитоо. Что бто оа иммуноглобулины, уровень которых eospacTüs в крови? Состав их гетерогенен и на нормален, v тс.ч смысле», что »то не eco ^нтитела, выполняющие защитны:? Функции, » скорее последствия дисфункции иммунной системы, как цалаго. Robert С. Dallo и ere сотрудник» высказызают идею о том, что ассоциированная с ЕИЧ поликлональнам активация В-лимФоцитос яглпатея етиэ-плтоггнатмчяской предпосылкой развития В-клеточных лимсом при СПИД. На еаме нги^астек^аго Т-клеточного иммунодефицита, БИЧ и его отделеныэ велкм, а твкже присоединившиеся мнФекцми создают с оргсмсине непрерывную и мьссироаанную антигенную стимуляция Е-лпмФоцлтоз к гдоолиФб^ащъз. Геном В-лимФоцитов согласно своей ддаФсрс-иидеоаке япмамичен и реактивен. Их гипврстимуляцип в услоамг.« Т-ю-здунодсвиците кооет сеть причиной малигнпоации п?о nucspií.p>';sy iix клснос Е-лимооцитсз. Картине,°вероятно, аналогичная патогеневу лимфспы

Burkitt, ассоциированной с малярийной инфекцией [Gallo R.C., 1^321. По антигенной специфичности иммуноглобулины у вольных СПИЛ олигоклональны и большая их часть является антителами к ВИЧ и сопутствующим инфекционным микроорганизмам (цитомегаловирусу, вирусам г-ерпеса, пнпвмоцистам и др.).

Ееть среди иммуноглобулинов и аутоантитвла, реагирующие с есгстегнкккл D- vt Т-лим»оцитами, причем из Т-лимфоцитоз - извиратвльно с Т4, но нэ с ТВ. Для части, по крайней мэре, антилимФоцитарных аутаат ми^аныв- яэлпзтся антиген с молекулярной массой 13 kD, который ©кспрвссируэтся на стимулировянмых ога или инфицированных БИЧ Т4 -- ni/u i »оцитлх, но отсутетэуэт на нестимулироэанных лимфоцитах. Вероятно, вто кэлрэтся ewe одним механизмом ассоциированной с ВИЧ супрэссия мнм>гкной систамы. В экспериментах такие с и т •„! ,-.-¡4 5 с у м тар кыэ ентитела цитотоксичны о присутствии комплемента. Исслядсзат??лп ма Королевского клинического медицинского колледжа в Лондсмэ tD-slglaish A. ot al., Sel. va AIDS, June 18, p.4] осра»:;,эт анимзную на сильное подобие компьютерных моделей третичной структуры аи,»усного золка gpl20 и антигенов ГКГС 2-го класса чолсаэка. Если компьютерные модели верно отражают природу вещей, то такое подозие может выть а основе подобия патогенеза СПИД патогенезу ~ГПХ ÍGVHD).

Что касается распределения иммуноглобулинов по субклассам при СГГИД, то достоверное других от нормы отличаются з сторону увеличения и процента и абсолютных концентраций иммуноглобулины класса А <IqA) CMo-f л>апп Со, 19913.

D рабств Bernard С. et al. С19901 на группе инфицированных ОИЧ паииентоа в клинмчаеки йессимптомной стадии заболевания определили содеразн-пе иммунегловулимзз в сызоротке крози основных классов как еледум^л Ig3 - 24ч-7 q/l, Igll - 3+1 g/1, ItjA - 3+1 g/l. У 26S neiiBfifíia »«язвим антитала, реагирующие с даусгадральной ДН!<, у ЬОУ. — г, оДноспиральксй. У СОЙ э кроэи повышено содерзание иммунных ксмпя&ксоо.

Lueay D.R. et ai. С19903 на материала от 622 пациентов с ВИЧ-ин»Е>кцией пекаsели, что о мк сиэоротках сууостэекно оызе нормы кенцямтрация IgSi сна тем выше, чем мл ж о содеразиие э крови Т4-лим<8с>ц*1т0г..

У С04 клинически» йопькая СПИД сыпэлпются антитела к тимоцитам, розгиру.{1уиа с амтмгегкан 23 kD, а такав к Ооссолипидныи амтигемац м/итя bhtvitotia «5 сритроцытсм с омтикоагулгнтией активность« cstric^'.r Л.З. at al., 1Т072.

O-ÍTl^SOSWiVTB ОТ ЕОЛЬНЫК НМОЕКЦИГГЙ ВИЧ, будучи Э СОСТОЯНИЯ поликлональ"' ¿•¿чТГ.эаШ"! in vivo, пг>м пь.яэлемим п культуру in vitro оказывается иг? спзгвевдз-wí. к »Dí'CECMV прол'.ч^гратиянсму ответу ил митоген a tf ч

к продукции мммуноглобулимсо. 3-лимФоцигн от зйоровых аснассв а составе амо'льнной пепуляиии моненукяеармык клеток из пери«сри«сскси>

-ie~

крови при добавлении в культуру in vitro малых дов лизата ВИЧ реагируют -галиклональной активацией на PWM, но большие дозы лизата ВИЧ вызывают супрессию пролиферации B-лимфоцитов на PWM CHofmann Во, 19913. Функционирование B-лимфоцитов контролируется Т-лимФоцитами (Т4 и Т8). Повтому, вероятно, дисфункции B-системы в целом могут быть вторичными по отношению к гипофункции Т4-хелпвРОВ и к дисфункции ТВ-супрессоров. Кроме того, ВИЧ способен прямо инфицировать, по крайней мере, часть В-лимФоцитоз с вытекающими отсюда патологическими последствиями.

СПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА К ВИЧ.

В крови инфицированных людей обнаруживаются антитела ко всем известным белкам ВИЧ - как структурным, так и регуляторным. Немногочисленные исследования, например, того же Ameisen J.-С. et al. С19893, людей из групп повышенного риска ааражения показывают, что встречаются лица, у которых не выявляются ни антитела к ВИЧ (по крайней мере, в стандартных коммерческих диагностикумах), ни вирусный антиген р24, но в то же время могут быть обнаружены антитела к одному только регуляторному белку БИЧ — Nai. В цитируемой работе антитела к Nef выявлены методом Вестерн блота у 7 из 17 исследованных серонегативных лиц из групп риска, методом радиоиммунногс анализа с рекомбинантным антигеном Nef - у 10 из 17. Появление определимых количеств антител к Nef может предшествовать полной свроконверсии в течение, по крайней мере, одного года. Около половины пула антител к Nef имеют субклассы Igßl, IgA и Ig04. Khalifa J. et al. C19B83 ne елодавa ли распределение по классам иммуноглобулинов антител против различных белков ВИЧ у IIS инфицированных мужчин-гомосексуалистов в стадии отсутствия видимых клинических симптомов. Нашли, что антитела к белкам группы Gog представлены субклассами и классами IgM, Igßl, XgG3, IgA. Антитела к белкам Env - только IgBl. Антитела к Nef - JgM, Igßl, IgA. Антитела к белкам Бед субклассов 1дВ4 и 1дЕ есть только у внутривенно зараженных гемофиликов, и не определяются у сексуально Зараженных гомосексуалистов. 1дЕ и 1д(34, как известно, имеют рппоаитные Функции при паразитарных инФекциях! 1д£ опосредуют антитело-зависимую деструкцию паразитов, IgG4 блокируют такую деструким Особенностью всего набора сывороточных антител к ВИЧ (вернее, системы "ВИЧ-анти-ВИЧ") является то, что комплемент сыворотки человека, связываясь с комплексами "ВИЧ-антитела к ВИЧ", не мнакгивигуют вирус. Никто не зарегистрировал в"эксперименте также комплемент-зависимый

цитолиз клеток, инфицированных ВИЧ, в присутствии антисывороток к ВИЧ и комполемвнта чвловвка ClicCheoney М.В. et al., 1999D.

АНТИТЕЛОЗАВИСИМАЯ КЛЕТОЧНАЯ ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ - АЗКЦТ (ADCC).

Специфическая АЗКЦТ, осуществляемая моноцитами или NK/K-клвтками в

присутствии специфических анти-ВИЧ антител в отношении

клеток, на которых вкспрвссирозаны или сорбированы антигены ВИЧ,

Достаточно выражена и легко может выть зарегистрирована в тестах

In vitro у 40-05У. клинически бессимптомных серопозитмоных пациентов г

ВИЧ-инФекцией CJewsjtt A. et al. , 1V90J. Однако защитное значение

ВИЧ-специФичоской АЗКЦТ неизвестно. При этом не исключен

вклад АЗКЦТ в патогенэз общего заболевания» по механизму АЗКЦТ,

например, иппт рг^руиенма меинФицированных С04-положительных клеток, в

тон числе Т4-хелперов, на которых сорбирован вирусный белок

0р120. Кроме того, а какой-то ме?ре АЗКЦТ способствует высвобождению »

кровь зрелых новых вирионов ВИЧ ио клеток, особенно макрофагов, в

которых накапливается много вм»усных частиц во внутренних

объемах клетки [Sinclair A.L. et al., 19883. По мере

прогрессирооанип волязни к СПИЛ АЗКЦТ снижается как и все лрояилг«.«»! деятельности иммунной системы. Антигенные эпигоны, антитела к которым опосредуют АЗКЦТ, имеются, вероятно, в молекулах разных белков Ьи.Ч. Такие впитспы есть, no крьпнии мере, в белках оболочки - др120 и gp4l. Tyler й.З. et ai . ClV?o!l в опыта» с использованием 7 сингетици^к.и пептидов и панели человеческих монокломальных антител определили один из таких апитопоэ в молекуле gp41l моноклональнов антитело, маиволве вФввктиэноэ а АЗКЦТ реагирует с пептидом с последовательность« аминокислот NN 644-663. Антитело, направленное к 1Хмунодоминантному эпитолу gp41 - NN 579-604 - оказалось наименее эффективным в опосрвсоэании АЗКЦТ.

Вероятно, здесь уместно привести информации о нескольких известных антигенных впитопах в молекулах структурных аелков ВИЧ, на которые идет выработка антител при естественном течении инФекциш а организме человека или при искусственной иммунизации лабораторных животных антигенами ВИЧ. Известно на так много эпитопсь. Как и/.

идентифицируют а вкспзриментак по исс ледов аник реак чч'.впе..: от инфицированных людей с отдельными ск.нтмгк.часкиии пептидами. У г йены;: ¿бгэгш ncii^iii ¿.'шилилл oi и пьпгидах' немного отличается друг от ь>-уг* влево или/'и вправо, так как в разных

пептид« несколько разной ллины. Мы приведем

свидения по МсСИвепеу М.В. аЪ а1. С17893 и по НаЬеаИам Л.А. е! а1. птои, но они по существу совпадают с данными и ряда других авторов. И сковках укахвм процент лиц иа группы исследованных 33-х сероповитивных пациентов, сыворотки которых четко реагируют с тем или иным чистым пептидом«

0Р12О1 NN 81-125 (6%), 113-126 <4Х>, 221-233 или

233-244 (4у.) , 310-333 <»то УЗ-пвтля, к которой направлены

и«олят-специ<вичнь'е нейтрализующие антитела! процент реагирующим

сывороток сильно варьирует), 368-377 (2Х>. Неиммуногвнны для

человека о молекуле др120 отрезки 125-171, 233-273, ЗЗВ-400, 415-433.

Вр41» NN 579-609 (100Х, иммунодоммнантный впитоп), 603-614

(607.) , 609-620 (357.), 653-667 <47.), 737-749 <4Х>.

Белок Ро1 (полимераоа)! 720-730 <6Х>, 699-913 (З.бУ.), 923-937

(27.) „ 942-954 (47.) .

Р241 22-29 (77.), 228-235 (77.), 439-446 (4Х> , 466-473 (4Х>. Отсюда видно, что практически у осой инфицированных людей имеются антителе только к одному епитопу, который локализован в молекуле трансмемвранного гликопротоино др41 - ММ 379-609. За вто ск назаан импунадоминантным В-клэточным епитопом* Он относительно консервативен у разных иаолятов ВИЧ-1 и имеет следующую первичную структуру! 1_еи-01у-11е-Тгр-01у-Сс-й-Вв1—01у~1-ув-|_еи-11 о-Сув. У ЕЯЧ-2 и гомологичный ипитоп имеет отличный от ВИЧ-1, но совпадающий наеду совой состав! NN 592 - 603 - 1_вц-Аяп-Вог-Тгр-(31у-Сув-А1е-РИ8-Агд-в1п--Уа1-Суе.

Следует иметь в виду, что пептидное картирование имеет свои и весьма значительные ограничения в плана недополучения информации, хотя бы потому, что линейные пептиды далеко не всегда имитируют впитопы вторичной структуры, и практически никогда на имитируют слояные коиФормационные впитопы.

Из работы Ро1квг Т. 1!. в! а!. С19373 известен еще один впитоп, локализованный в самом С-конце молекулы др120, и вызывающий на совп образование антител у 45Х инфицированных ВИЧ лмдей. Этот впитоп имитируется синтетическим пептидом, который наввам ЗР-22. Он инаот следующую первичную структуру» NN 304-310 -А1а-Рго-ТЫ—1_ув-А1а-1.ус -Агд-Агд-Уа1-Уа1-Э1п-Агд-31и-1-ув-Агд. Последний аргинин находится в сайте протволиза молекулы др160 на компоненты - др120 и др41. Антитела к пептиду 5Р-22 реагируют с натминым белком вируса др120, но не нейтрализуют инФекционность вируса и синцитиооброаованиа в тест-культурах.

НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ АНТИТЕЛА.

Необходимо договориться о понятии "нейтрализующих антител", ого отличии от " влокирующих антител" и о том, на основании применении каким методов исследования делают выводи о нейтрализующей вирус активности антител. С нашей точки зрения антитела мохно наяывать нейтрализующими, если они полностью (практически) инактиншрутот инФакционный и/или рапликативный потенциал вируса. От понятия ►ЯЙТРализуиип/м антител следует отличать понятие блокирующих антител, если под последними понимать антитела, блокирующие собой связывание сирусhopo аалка c¡pl20 с рецептором на клетках - белком CD4. Пвчвпу эти понятия пег совпадают? Хотя бы потому, что из опыта слрлуст, что в *?ВХ случаев сыворотки от инфицированных лмдей на всех стадиях вайолваамия (после того, как произошла сероконверсия) способны алокировать, причем в значительной мере, связывание др120 с CD4. Однако это никак но когралиругт с нейтрализацией вируса, так как препарат вируса, обработанный сколь угодно большой дозой таких алокирупетля антитэл, оетаотся заразным, то есть сохраняет свой инфекционный потенциал при переносе в организм подопытного животного или в культуру чувствительных клеток CSchnittman S.M. et al., 19881. Поэтому, когда в какой-либо работе в качестве теста при оценке Квйтрализуюияй активности антител используют тест на

симцитиообразование (таков встречается в литературе) мы для севг, и то se рекомендуем асам исследователям, ограничиваемся при интерпретации ревультатоп заключенном об анти—fusion эффекте антител, который частично или полностью может сыть обязан блокировке связывания gplZO с CD4. Для выводов о нейтрализующей активности антител нужны совсем други» эксперименты.

Мэтодсз оценки нэйтгализуивих свойств антител всего два - in Vitro и in vivo. In vitro культивируют перевиваемые линии восприимчивы!; К БИЧ клеток или используит свежевыделенные в культуру Т-лимфоциты из периферической крови здоровых людей. Препарат инФекционмо-—конпэтентного вируса обрабатывает испытуемыми антителами до введения в культуру (например, инкубируют в пробирке препарат вируса с антителами при 37оС в течение часа) или антитела вносят п культуральную среду одновременно с препаратом вируса. Через некир интервалы времени, которые? экспериментально подбирают эвторы (н.чттл.р, 7, 10, 14, 21 и вольте дней) оценивают в тест-культуре наличие.1 тнмии репликации ВИЧ (по активности обратной тракскииптазы в спстнягачгн, ее экспрессии антигчноз вируса на клетках, по с?кррции белков рирусл

<9 супарнатант). Оценивают также наличие о клеткам интегрированного провирусв или неинтегрированных нуклеиновых кислот вируса методами ЦПР или гибрдиоации нуклеиновых кислот. Роге, чем того трейуот логика, выполняют последующие опыты с переносом материале ив вышеописанной культуры т свежую неинициированную культуру дли проверки остаточной иншекционности, или испытание остаточной инФекиионности в опытах по варажению восприимчивым вивотных (шимпанае или GCID-hu-мышвй).

Эксперименты по оценке нвйтраливующих свойств антител in vivo могут выть двух типов« 1) животное иммуниаируют антигенами вируса (вакцинируют), после чего пытаются варааить кивым инфекционным вирусом! 2) животному в кровь сводит препарат готовых испытуемым антител (пассивная иммуниаация), после него пытаются ааражить ¡¡иаын вирусом. Или препарат вируса обрабатывают антителами в пробирке до введения виаотному, о остальном - осе так же. В работах с ВИЧ—1 в качестве чувствительных аиэогным испольсунт либо шимпанло, либо BCID-hu-мышей. В работам с ВИЧ-2 и SIV могут быть испольаованы макаки, которые дошеоле шимпанзе. В случае если антитело нвйтраливуют вирус, то ив организма подопытного животного не удается высеять в культуру киоой вирус, или варааить другое интактное животное кровью подопытного. На удав г сп такве определить наличие нуклеиновых кислот вируса о лимфоцитах опытного яивотного ив*! одами ЦПР или гибридизации нуклеиновых кислот. К сожалению, интерпретация реаультатеш всегда не на 10и7. определенная ив-ва суперивменчивости ВИЧ. Конкретный антитела миг/т быть истинно нейтрализующими против некоей цас.сы вируса а uprunuane, но мутантные варианты вируса не будут нвйтралиаовамы данными анти типами. В ходе реальной инфекции ВИЧ у человека, как и понтизирусных ин-оцкций у киеотным (caev, EIAV) сто соотношение "сил" мьжду нейтрали»уншимл антителами и резистентными к ним мутантными вариантами вирусоа au времени имеет одновначную тенденцию смешаться в пользу вируса как вида. Более того, аналиа инфекционного процесса в динамике показываю, что вирус испольауат нейтрализующие антителе к своей "выгоде" как «актор отбора -реаистентных и более вирулентны* квави-видов. "Быстрые и сильны«! ("rapid/high") вирусы-потомки, резистентные к ужо наработанным против исходных вариантов ВИЧ нейтрали»укицим антителам, in vivo возникают очень быстро и в организме человека, и в организме аивотных» достаточна всего одного naccaza на обеаьянах, чтобы доминирующим

ква*и-видом степ именно резистентный к нейтрализующим антителам CQoodemit J., 19903. Итаммы вируса, выделенные из того ici органиама и поддерхиваемьш параллельно в культурах in vitro по сравнению с оставленными in vivo представляются весьма консервативными, so всяком случае в отношении свойства резистентности к нейтрализующим антителам.

Что представляют иэ сейп молекулярныэ механизмы нейтрализации -неизвестно. Рероятно только, что это но один какой-то механизм, а нисколько разных. Хотя вы потому, что на сегодня известно несколько эпитсппв на разных молекулах белков вируса (др120, др41, р17>, антитела к которым спосоены нейтрализовать инФекцмонность ВИЧ. В молекуле наружного йалка оболочки ВИЧ - др120 имеется один главный эпитоп, вызызамщий на севп овразование нейтрализующих антител как в организме инфицированных людей, так и у экспериментально иммунизировании i животных. Этот эпитоп назван принципиальной датерминантой нейтрализации, п английской аббревиатуре PWD -Principal neutralizing determinant. PND ОИЧ—1 локализован в третьем гипероариаеельнон домене молекулы gpl20 - а так называемой УЗ-петле. . V3 9 буквальном смысле является по оторичной структуре петлей, которая Формируется при замыкании дисульфидной связи между цистеином в Позиции N 303 и цистеином в позиции К 337. Изменчивость аминокислотного состава УЗ-петлп неравномерна! она максимальна по зокам и меньше в верхушке пэтли, которую считают полу-кснсероативной областью. В самой верхушке пятли есть консервативный мотив из А аминокислот, а именно GPBR0F, Лнтисыворотки или мококлональныэ антитела, полученные против пггптидоэ, содержащих этот катив, обладают перекрестной нейтрализующей активностью в отноипнии дивергентных изолнтов ВИЧ-J tBalogneai O.P., 19923. Однако значение этого эпитопа для перекрестного протоктиэного иммунитета я популяции людей и Вирусов только предстоит эыяснить. Есть эксперименты, показывающие, что единичная вамгнд аминокислот п верхушке УЗ-пг-тли можвт приоодмтъ к утрате вирусом инФакиионности, или к >тратк способности вызвать овравованиэ синцития мегду инфицированными и нсинФицир os энными кяоткгми. МоисклоноЛ1,н1.!(» .^чтитала к PND могут сслектгано î-тнгиЗиреааТь ли£0 ин^екнич! зияуса о клетки, либо процесс слиянии клзток на стадию гксле евг^ызанил вирусного qpl20 с клрточным С04, По »тему гдаоду существует гипотеза, что именно о верхушке? пэтл1" лакалязоиан сайт, па которому работает та или иная клеточная

~л

пнотеава и протеолиэ по данному сайту необходим для реализации слиинии мембран (вируса и клетки-мишени или инфицированной и неинФицированной клеток). Возможно даже этот протболиз является триггврным сигналом длг. процсссои слияния (-fusion). Опыт пока&ыаает, что в некоторых случаях замены аминокислот в аариушка петли измвнкмт тропизм вируса к разным клвткам-мищаням. Объясняющее предположение состоит в том, что если верно, что сто - сайт для протеаз, то в разных клетках разные протеавы с резной эффективностью могут" использовать его как субстрат. На рисункю 20 показана схематично первичная и вторичная структуре УЗ-потли ВИЧ-1 иаолята UN и диаграмма генетической вариабельности различных участков этой пытли. Опыт показывает, однако, что, несмотря на полуконсерватиам верхушки петли, емрус как популяция очень ввсрктмано уходит от иммумологичы.нш зашиты со стороны нейтрализующих ентител. Вероятно, гипЕ-рвариасельность боксоых участков петли имаст следствием существенные изменении конформоции оерхуаки и, соответственно, утрет,-восприимчивости к иммунной нейтрализации.

В пределах PND идентифицирована такхо впнтопы, распознаваемые цитотоксическими Т-лимФоцитами »«¡«октсрсми (CTL), а также впитопы, no kotopum работают антитела, опосредуваио АЗКЦТ. Matsuehita S. et al. C19GQ3 получили кииинзз моноклональнае антитело, направленное к УЗ-петяе лабораторного агатш ВИЧ-1 HID. Антитело названо "0.3-!eta". Это антитело в концентрации ЪО мкг/ил in vitro эффективно нейтрализует иеолят IIIB, но совсеь не нейтралиауе! изолят I1IRF. Антитело вФФективно мнгибирует также синцитиообразоааниэ, индуцируемое изолятом 11IB CSklnner И.A. et al., 19883. Если клетки, инфицированные вирусом ВИЧ-1 III8, культивируют в присутствии антитела О.З-beta (в виде асцитной жидкости в конечном разведении П300), то всего через несколько пассажей доминирующими с культуре становятся устойчивые к нейтрализации мутанты вируса, насупив замены аминокислот в одной из 4-м позиций в петле V3 (или их сочетания)I Авп-308 (на Lys), Аьп-309 (на Не), Рго-320 (на Gin), Ala-323 (на Thr). Антитело О.З-beta, как и поликлональные сыворотки к УЗ-доману, не препятствует рецепции вируса молекулой CD4.

Из мышиного моноклонального антитела О.З-beta Eminl Е.А. et al. С19923 сконструировали Рекомбинантное антитело, заменив Fc—конец молекулы на одноименный Фрагмент иммуноглобулина G1 человека. Препарат

рекоивинантного мышино-человеческого антитела назван C-beta-1. Это реконйинантное антитело испытали на шимпанзе. Препарат вводили обеэаьпнам а дозе 36 мг/кр Kate да (за 24 ч.), так и после (через 10 мин.) ркспериментального заражения эирусом ВИЧ-1 IIIB. Заражающая доза - 75 инфэкционния для иммпанэо до®. Если антитоло зводипи до заражения, то черев сутки, на момент заражения з сызоротке создавался титр антитела, разный 320. За шимпанзе наблюдали о течение послрдумших 52 или 32 недель. Антитело проявляло гзыражонный противовирусный вФ«ект. В случая его профилактического введения до заражения из организма подопытной озеоьяны а течение псех 52-х недель не удавалось высеять реплицирующийся аирус и была отрицательной ЦПР. В случае.- введения антитела сразу после вируса (через 10 мин.) в течение 32-х недель наблюдения из организма оёезьаны также не аысевалсп реплицирующийся вирус In vitro итакяэ была отрицательной ЦПР. Иммуногенность УЗ-пэтли, если она находится в составе цельной молекулы gpl20, для животных невелика. Nara P.L. et al. C19B8D

иммунизировали аФФимно очи'-цэнным белком др120 коз, лошадей и шимпанзе. Нейтрализующие антитела иа 3 шимпанзе попзились только у двух, только после 3-й ьчммунивацюп и а крайне низких титрах (всего В). Нейтрализующие антитала у kos появились после 3-й иммунизации и титре 100, и у лошадей - посла 6-й иммунизации в титре 16. Выделено и челэасческоо мемокланальноо антитоло к эпитопу из петли V3 [Scot.t C.F. et al., 19903. Оно названо "701.96". Антитело нейтрализует 4 исследованных мэолята из семейства MN, но не н13йтрели»уэт иаолятм IIIB и I1IRF.

3 37-93?! сыаороток имфикдерсяанмых людей также можно обнаругить антите/ы к вермугмэчному эпитопу УЗ-патли, который предстоя лен Послодсяательностью аминокислот KSIHIGPGR0FYA у иэолятов ВИЧ-1, распространенных а Еаропа и CSÜA. Титры нейтрализующих антител в СЫЗОРОТках вольных равны примерно 100. Синтетический пептид B№uarw»a»j»:»MMoro ссстаэа з» концентрации 3 / 10<-Ь) И эффективно CCPCW»y»T гдавктмчгски всю нейтрализующую активность сывороток от вэльвмиства паииямтоа. Dcudsmit J. et al. С19903, однако, выявили ооног Пвцмегнт* tus 13-ти у»ссяяяочанных, у которого i молись нойтрзпиэукиие витйтвпа, которыэ и» Реагировали с данным синтетическим пептидом. Следсзатальна, яиао PN0 - не единственный эпитоп нейтрализации, л.к- ■ Данной пептид ив имитирует индивидуальную для данного пациента

и »го вируса конФормацию веркушки УЗ-петли.

Минимальный пептид, имитирующий впитоп нейтрализации из PND изолята ВИЧ-1 IIIB имеет состав ICRSРОЯДР, иаолята RF - ITKGPBRVI. При перекрестной реиммунизации животных (шимпанзе, кроликов) • один из ©тин пептидов вызывает возрастании титра антител, связывающиеся с другим пептидом, и наоборот, котя перекрестной биологической активности (вирус-нейтрализуищей) нееду антителами анти-IIIB и анти-RF практически нет»

Fung M.S.С. et al. С19903 получили два анти-идиотипических моноклональных антитела мышей против моноклонального антитела ВАТ 123, специфичного к PND V3. По предварительным данным автороо анти-идиотипи"еские антитела достоверно имитируют собой пш»атсп из др120, то есть VS-пстлю.

Но О. D. et al. С19883 описали в tip уснайтгчтизукцт активность антисывороток кроликов, иммунизированным синтетическими петидвми из второго консервативного домена молекулы др120 с номерами аминокислот 254—2741 СТНЗIRPWST.GLLLMGSLAE. Пептид получил название "21Е". Эти амтисыворотки »««cktmshd нейтраливуют ШЧ-1 иаолятоо II IB, RF, fiRV-2. Механизм нейтрализации не сегш&н с блокировкой вееимасвязи gpi20 с СБ4. Антитела к пептиду "2IE" опосредуют АЗКЦТ протиз Т-лимфоцитов, инфицированных ВИЧ-1.

Chanh Т.С. et al. С1986D получили йнтисызоротки кроликов против двух синтетических пептидов - одного и® С-конца gpl20 (NN 503-532) и dtopoго иэ gp41 <NN 73S-752), и назвали оти антисыорротки нейтрализующими, хотя оценивали их биологическую активность только о тесте на синцитиообразование« обе антисызсротки р&сатали в разведении И32.

Опыт показал, что нейтрализовать имФокционнэсть вируса могут антитела, направленные не только к самым поосзрхмостнин авлкам оболочки ВИЧ, но такхе и антитела к иатриксному протеину р17 CPapeitiero L.D. et.al., 198?]. С помощью гексапсптидсп, синтозироаамных в твердоФавнои кембриджской система, картировали две сгвлтопа дли втих нейтралиауюи^т антител. Эпитопы перекрываются и расположены в N-конце молекулы р17. Первый - N 12-19 (Slu-Leu-Aep-Arg-Trp-Olu-Lye-Ile), второй - ЫИ 17-22 (QIu-Lym-Ile-Arg-Leu-Arg). Молекулярные мэханивмы нейтрализации на понятны.

Naylor Р.Н. et al. С19В7] описали нейтрализующую ВИЧ активность

онтисывсроток кроликов, полученных против альФа-тимозина и перекрестно-реагирующих с вирусным р17. Известно, что между альфа-тимоаином и С-оЗластыо р17 (NN 86-113) существует 50У. гомологии а составе аминокислот.

Kennedy-Stoskop-f В. and Nera/an О. С19В63 чтобы понять, почему все-таки при лентивирусных инфекциях нейтрализухнцив антитела нвпротективнм даже когда они есть, оценили кинетику взаимодействия ■гируса меди-висна овец с их клетками-мишенями (макрофагами) по сравнению с противовирусными антителами, известными как нейтрализующие а культуре In vitro. Эксперимент показал, что процесс связывания вируса с антителами много медленнее* чем процесс связывания вируса с клеткой-мишенью. В результате антитела в прямом смысле не успевают пяраиаативать вирионоз при ми распространении от клетки к клетке. Таким образом, быстрота вирусной атаки на клетку - вто еще одна причина неэффективности гуморального анти-ВИЧ иммунитета.

Подводя итоги, перечислим все известные причины ускользания ВИЧ от иммунологического контроля!

1) быстрая интеграция генома вируса в геном клетки

сргвнмэмз-хоаяина, гдо вирус как сущность недоступен ни распознаиани-о, ми элиминации обычными естественными механизмами иммунитета»

2) "сахарный панцирь" на поверхности свободных вирионов, маскирующий основную массу антигенных опитопоэ вирусных белков?

3) быстродействие связывания вириона с клеткой, опережающее связывание с тем же вириомом антител.

■1) высокая генетическая изменчивость ВИЧ.

Суммарные титры анти-ВИЧ антител в сыворотках инфицированных людей 9 клинически бессимптомном периоде заболевания могут составлять от 100 до 3000 (в тестах ИФА и иммуноФлюоресценции). У больных продвинутым СПИД титры падают до S - Ю0.

Итак, опыт покапывает, что в начальные периоды инфекционного процесса организм человека отвечает достаточно сильными иммунологическими реакциями как гуморальными, так и клеточными. Однако вто ив останавливает прогрессии» общего патологического процесса. БИЧ отлично приспособлен к самозащите от иммунной системы. Более того, »тот вирус "выбрал" иммунную систему экологической нишей для себя. Стимуляция иммунной системы естественными для нее раздражителями -антигенами и митогенами - является сильным активатором для ВИЧ! при этом обостряется латентная инфекция в уже инфицированных клетках и интенсифицируется распространение инфекции на новые клетки. Суммируем имеющиеся данные о патогенных последствиях для организма

естественного гуморального иммунного ответа на ВИЧ « Антитела'

1) нейтрализующие - Фактор селекции устойчивых к нейтраливации и более вирулентных квази-вияов ВИЧ)

2) опосредующие АЗКЦТ - разрушают неинФицированные клетки, на которых сорбированы вирусные белки) облегчают высвобождение зрелых вигионов из клеток типа макрофагов и др.I

3) направленные к др120 и способные его агрегировать -агрегированный др120 оказывает усиленное токсическое действие на неинФицированные Т4-лимФоциты, нейроны и другие клетки)

4) усиливающие вирусную инфекцию - Феномен ADEJ

3) противовирусные, но перекрестно-реагирующие с собственными ¿елками организма (антигенами ГКГС 2-го класса и другими) - аутоиммунная симптоматика (нарушение нормальных взаимодействий клеток в коае иммунного отввта, повышение концентрации в крови и тканях иммунных комплексов, и т.д.).

Кроме того, по неизвестным причинам комплемент человека не способен инактивировать вирус в комплекса "антиген-антитело", и на способен лиэиро»ать клетки, несущие на поверхности вирусные антигены и покрытые антителами. Липфокины!

1) Фактор некроза опухолей - TNF-alpha - активирует транскрипцию с I ЛЬ ВИЧ)

2) GM-CSF, O-CSF, Ik-6 - стимулируют вкспрессию ВИЧ8

3) IL-1, IL-2, JL-3, 1L-4, гамма-мнтероарон, ©актор роста и» тимоцити» - не усиливают однозначно вкспрессию ВИЧ, но и не компенсируют де»иииг иммунологической дееспособности лимфоцитов и моноцитов, выделенных в культуру от инфицированных пациентов.

Из лимфокинов наиболее выраженный эффокт стимуляции.вкспрессии ВИЧ пгояыпяат TNF-alpha. Этот лимФокин является продуктом моноцитов/макрофагов. Он действует как аутокринннй и паракринный актийатор о отношении самих моноцитов/макрофагов (вовлекает в ответ новые моноциты, усиливает их цитотоксичность, усиливает ПРолиФирацию Т-клыток на антигенные и митпг-енные стимулы, проходящие через моноциты). Кроме того, TNF обладает ангиогенной активностью. У nsin-iHTüB, ин8мцированных ВИЧ, достоверно растет концентрация TNF в крори. В 4-й стадии СПИД она может превышать 10 пг/мл. Макрофаги, в»г.(?лечн»<е в культуру in vitro от инфицированных пациентов,

ьсстовсрно больше TNF, чем макрофаги от здоровых людей

tKueenberg Z.F., Fauci fl.8., 19903. Связывание ВИЧ с рецептором CD4 на моноците является сигналом для продукции клеткой TNF-alpha. Оорболмисистат-ацетат стимулирует продукцию и.самого TNF и клеточного рецептора для TNF.

Механизм действия TNF опосредован череа NF-kB. Антитела к TNF оказываю-1 ингиьир>н>щве действиэ как на конститутивную, так и на индуцированную Фогболмиристат-ацетатсм экспрессию ВИЧ.

Заключить раодел о гуморальном иммунитете при СПИД мы иптяли йы немногими рабочими ориентирами для исследователей! что делать, где искать? Если нв защищает естественный иммунный ответ, значит надо пытаться вызвать искусственный иммунный ответ на отдельные детерминанты, с использованием эффективных адъювантов и эффективных схем иммунизации. Особое внимание следует оаратить на специфический местный иммунитет на слизистых (IgA), поскольку именно заражение со сли»истым в настоящее время является главным путем трансмиссии впидомии.

ВАКЦИНЫ ПРОТИВ СПИД.

После анализа естественных взаимоотношениях ВИЧ и иммунной системы уместно рассмотреть искусственную иммунизацию, целенаправленную против ПИЧ, то есть по определению вакцинацию. 0 данном контексте мы будем понимать вакцины а классическом смысле этого термина (без расширения до иных анти-ВИЧ во»действий, типа генетических вмешательств) как некие именно иммунотропныа субстанции, предназначенные для введения е организ в цвляи блокировки развития патологического инфекционного процесса. Идеи на вакцинам против СПИД можно классифицировать по крайней мере по 4-м рааличным принципам«

I. iirir'iHaii цель вакцинации!

1) Эффективный протективный иммунитет.

2) Полная иммунологическая толерантность к БИЧ (идея автора данное работы)I

II. Состав вакцинных препаратов (инактиеированный природный ВИЧ, равличные рекомвинантные вирусы, отдельные белки вируса, синтитические пептиды, равличное иммуноадьювантное укомплектование вакцинных препаратов и т.д.).

III. Параметр иремвни, то есть "до" (профилактика заражения) или "после" (лечение) Факта реального инфицирования организма человека.

IV. По достигаемым результатам!

1) вакцины, способные предотвратить инфекции организма!

2) вакцины, противодействующие болезни, но неспособные полностью блокировать инфекциюI

3) вакцины, способные блокировать трансмиссию вируса от человека

к человеку (напримвр, обеспечивающие эффективный местный иммунитет на слизистых)!

4) вакцины, оказывающие терапевтическое (лечебное) воздействие

на организм СПункт "IV" цитирован по Bolagnest D.P., 1992J пункты I—III сформулированы автором].

Т-система иммунитета при СПИД и широкий круг различных проявлений иммунопатогенева при СПИД подробно описаны в главе S монографии "СПИД", стр. 154-166. Принципиальные выводы об отсутствии протекти-зного ответа действительны и для 7-подсистемы иммунитета при длиной вирусной инфвкции.

Литературные ссылки, приведеннные в автореферате, также даны в монографии, представляамой siitopom к защите на соискание стсг.с!-!и доктора медицинских наук.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ РАБОТЫ.

ПОЛУЧЕНИЕ ГИБРМХЮМНЫХ МОНОКЛИНАЛЬНЫХ АНТИ-ВИЧ-1. АНТИТЕЛ.

в 1905-вагг. автором лично получено 13 клонированных устойчивых линий мышиных гибридом, продуцирующих моноклональныо антитела, реагирующие с антигенами вируса ВИЧ-1. В качестве антигенов при иммунизации мышей дли получения гибридом использованы либо лизат цельного натианого вируса, либо антитела 0КТ4А (Ortho Diagnostics Inc.) - с целью получения анти-идиотипических моноклональных антител со специфичностью анти-анти-С04 и, следовательно, с возможной перекрестной реактивностью с акцепторной детврминантой вирусного белка др120 (реагирующего по природе с тем же участком клеточного рецептор« CD4, что и ентитепз 0КТ4А- Лизат цельного натианого вируса использовали в растворимой »езрме и в «орме сорбированного на полисти^оловык гранула» иль1 внут>ч!ин»й поверхности полистиролосых культуральных Флаконов материал,., лизатс. Пас лаяний вариант испот»зооали для повторной иммунизации ,i.'.rit:'iiiiTnp net-en гиьридиэациеи в культуре клеток селезенки в смеси с <;-.-'!> .4 1 пгрщй«са(1ьноро экссудата in vitro.

Нлыты с реиммунизацивй лимфоцитов в культуре in vitro показали, что на '.-3-е сутки титры антител а супернатанте в 3-iO раз превосходят титры мтитол в сыворотках мышей, реиммунизированным in vivo. При иммунизации in vitro лифоциты врали в гибридизацию на 3 сутки. В опытах с вирусным

,,иэатом получено 7 штаммов гмйридом« IV-2 <IgGl>, IV-3 (IgG2a), IV-4

S«Q1>, IV-10 (IgG2a>, 13.13.1 (IgM>, 6.lOgl (IgtD, PS-Z (IgBl>. _ опытах п анти-идиотипичвскими анти-анти-С04 антителами получено 8 гтанмов гибридом» альоа-Т4-1 (IgM), альФа-Т4-2 < IgM), алЬФа-Т4-3 (IgM), ППК-7 (Igtt), АО KS <ХдЮ, А4А-1,- А4А-3, А4А-4.

гхтитела первично от'ЙИРали по специфичности связывания в твердофазном ;1ммумоФ»риментном аналиоо на плэйтах на коммерческих Л1.латных «ист-системаи Vironoätlca/Drganon и Ortho Diagnostica, ."мти-млиотиличвскиэ антитола тестировали так«а методом проточной •кюсрной цитофлюоромэтрии на связывание с антигенным антителом 0КТ4А с •¡унифицированными миг усам клетками Н9 (о контроле - с антителом ОКТЗ) и "отвм иссладоаали Функциональное влияние анти-идиотипических антител на "ачаниэ реальной инфекции а культура клеток Н9, инфицированных HIV-1 3113 (о спэцеоксв лаборатории гсрпэсвирусныи инФекций института смрусолагии им. Д.И.Ивановского). Разультаты этих опытов будут приведены нияв о отдельной руврикв.

.4P ома i ига оценивали геактианость монаклональных антител с разделенными Г.гнатурироаанными ¡зирусными вилками в иммунойпотв. Полосы связывания с Япнатурироианными отдольными колками ВИЧ-1 показали только 2 ионокломальнык антитела» P3-Z - с полосой др120 (лучше с PllO), 13.18.1 - с полосой Для 12 антитип был выполнен анализ

реактивности методом иммуноФлноресцентной микроскопии с клетками Н9, инФицирояанными хиаым вирусом HIV-1 HIB (опыты с активной инфекцией такзе выполнены в спэцлаворатории герпесвирусных инФекций Института вирусологии им. Л.И.Ивановского). Пологительнов связывание с мнфицисп»»иными клетками покаоапнЗ антитела - 13.18.1, IV-4 и альФа-Т4-1, еще 4 антитела - PB-Z, IV-2, IV-S, IV-10 - показали реакцию на +/-, остальные — отрицательны. С нвинфицировинными клетками Н9 но связывалось ни одно ив исследованных антител.

Исследовали реактивность моноклональных антител в т/о И (РА с доступными на период равоты синтетическими пептидами из белков gpl20, др41, gag вируса ВИЧ-1, синтезированными в Институте иммунологии. Результаты показали специфичное связывание для двух пар "антитело-пептид"' антитело IV-10 реагирует с 19-членным пептидом из последовательности Ср41 (иммунодоминантный эпитоп NM 506-604 - RILAVERYLKDQQLLGIWG)I антитела PS-2 реагирует с 10-чяенным пептидом AZ-31 из gpl20 <fJM

301-310 Nie—BVAPTKAKR). В последнем случае антитело PB-Z давало возможность оценить в ИФА иммунологическую сохранность и количество пептидного впитопа AZ-31 в составе конъмгатоп с различными макромолекулпрными носителями - желатином, БСА, пальмитоилом. То есть, BTD моноклональнов антитело является специфичным чистым реагентом на определенный синтетический пептидный антигенный впитоп. Количаственнап оценка впитопной плотности пептида в конъюгатам возможна ,во-пороых, по цифрам оптической плотности поглощения цветного продукте ИФЙ и, во-вторых, по количеству видимых невооруженным глазом центров кристаллизации на дне лунок планшета ИФА при услояии, что в итога реакции в лунки не добавляется серная кислота и лунки высыхают не воздухе.

ЭФФЕКТ УСИЛЕНИЯ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ВИЧ-1 МаНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИ-ИДИОТИПИЧЕСКИМИ АНТИ-АНТИ-С04 АНТИТЕЛАМИ.

Автором получено 8 анти-анти-С1Э4 моноклональных антител. Для »того мышей иммунизировали моноклональными антителами Ortho Diagnostics Inc. 0КТ4А. в из В клонированных массовых культур соответствующих гибридом получены в асцитной форм«* альФа-Т4-1, альФа-Т4-2, аль»а-Т4-3, АОК-7, АОК-Э. Асцитнаи Форма дала возможность исследовать биологические свойства этих антител двумя методами!1> на взаимодействие с иммуногеном (антителами 0KT4A) в проточной лазерной цитоФлюоромвтрии на клегках линии Н9, экспрвссирующих рецептор CD4I 2) на вааимодайствие с живым ВИЧ-1 в культур» тех же клеток H?.

8се полученные анти-идиотипические антитела принадлежали к классу IgM. Опыты по проточной цитоФлкорометрии ставили на приборе Epics С по следующей схеме. Объем провы для анализа 200 мкл. Конечная концентрации кпеток Н9 в прове 5хЮ(5)/мл. Антитела 0КТ4А (коммерческий препарат Ortho Diac|. Inc.) добавляли согласно инструкции 20 мкл на 200 мкл. Испытуемые моноклональные асциты титровали от Н2до 1Н00. Моноклинальные антитела смешивали с тест-антителами ОКТ либо ex témpora ливо аа 4-12 часов до опыта. Как оказалось, реаультат не зависит от времени преинкувации. Препарат антител добавляли к клеткам, держали на ль о у до измерения Флюоресценции (в пределах 30-35 мин.) В качестве

о i - < ,к-и.1х протиаоклегочных антител испольвовали анти-пан-T антитела VKiy iii-tho Olagn. Inc.), в качестве контрольных моноклональных ¡-;in.'t-i?i'.ian мганти-ияиотипические анти-ВИЧ антитела (например, PS-Z) и актн.ел гаго же классе lgli,. но посторонней специфичности (против

чумного антигена F1, против матриксного белка.вируса гриппа Ml, против колерного внтвротоксина и др.). Результаты экспериментов представляют

Таблица 1.

Элияныв моноклональных антител на 0KT4ft- и ОКТЗ-Флюоресценцик> мзинФициРованныи ВИЧ клеток Н9 (протонный Флюоримвтр EPICS С).

1 234367 В 9 10 11 12

".H7+GKT4A Xf 98 03 ВЗ 79 79 ВЗ 79 - - 37 37 S3

!«1дл 63 63 62 36 39 63 37 - - 34 34 47

3.1* Z* 100 92 93 91 93 94 93 98 98 58 69 79

апьвл-Т4-1 -fo-fK 2 9 10 12 14 11 14 О О 21 32 24

klgJ 03 70 07 91 92 93 94 89 92 40 43 62

IgJo-lgJK 20 IS 25 35 33 32 37 20 21 6 10 IS

JOAJK 2 1,3 2 2,3 2,32,3 3 2 2 1 1 1,5

3. l+AOK-0 %i - ______-•- - - 92

fO-fK - - -- -- -- - - -37

klgJ - - - - -07

Igje-IgjK - - -- -- -- - - -40

JO/JK - - - - 3

4.1+ Y. f 98 - - -- -- -- -

альва-Т4-2 fo-fK О - --------

klgJ 63 - --------

lgjo-lgj« О - - -- -- -- -

JO/JK ,1 - - -- -- -- -

3. 1+PS-Z Xf - - -- -- -- - - - ьо

fo-fK - - -- -- -- - - - 5

klgJ - - -- -- -- - - -47

lgj0-lgjK - ________ - - о

JO/JK - - -- -- -- - ~ - t

Продоляение таблицы Ni

6.1+М64

7.1+К2/д7

Xf fo-fK

kl g J lgJo-lgjK Jo/Jk

97 1 63 0 1

7,i 98 38 34 43

fo-fK - - - - - - - - -1 -3 -12

klgj - 67 67 33 32 41

lgJo-lgJK - - - - - - -2 -4 0 0 -6

Jo/Jk 1 1 1 1

8-l+H2/f7

y.f

fo-fK

klgj 1 gJo-1 çJk Jo/JK

9B 98

69 71

9.1+КЛВТКИ Xf

ГИбРИДО- fO-ÍK мы альва- klgj

Т4-1 1gJo-1gj* Jo/Jk

71 62 90

-12 -21 10

41 41 00

-22 -21 25

2 2 2

B9 -

а -

73 -*7 -

1,5-

10.9t Xi

альФа-Т4-1 fo-fK klQJ lgJo-lgJx JO/Jk

BB 09 93 96 -5 6 14 16 -

62 79 91 103 -

0 17 35 46 -

1 1,5 2,5 4 - -

11.контроль

H9*CKT3+ H2/Í7

Xi fo-fK

klgj IÇJo-IQJK JO/OK

81 82 - -

42 44

Продолжвнив таблицы N 1

2. контроль 7.f - _ _ -----76 89 8

Н9+0КТЗ+ fo-fK - - - ------ - - -

K2/Q7 klgj - - - ---- 43 50 - - 43

lgJo-lgJK - ______ ____

JO/JK - ______ ____

3. контроль xi - ______ ____ 9

H9+0KT3 fo-fK - - ------_ ___ 48

IclgJ - -------____

lgJo-lgJK - - _- -- - - - - -

Jo/Jk - ______ ____

14.13+ y.f - - ----76 08 - - 21

алы»а-Т4-1 fo-fK - - ------0 0-- 13

klgj - ___----43 S' - 53

lgJo-lgJK - - ------oo- - 8

JO/Jk - - ------11-- 0,3

13.13+P3-Z y.f - - - ------ -_ - 12

fo-fK - - ----- ____ 4

klgj - - - ------ -__ 44

lgJo-lgJK - ______ ____ —4

JO/JK - - -_----____ j

16.13+A0K-8 Xf - - ------____ за

fo-fK - - ------____ 30

Klgj - - - ------ -- _ 46

1 gJo-1 gJK - ______ ____ -2

Jo/JK - -------____ 1

Пояснения к таблице 1I

1) Все самодельные испытуемые моноклональные антитела в этих опытам использовались в виде асцитных жидкостей е конечном разведении И 21

2) X* - процент Флюоресцирующих клеток в суспензии!

3) J - параметр, пропорциональный средней удельной Флюоресценции клетки!

4) fa-fк - разность процентов Флюоресцирующих клеток в опытной и соответствующей контрольной группа«

<Jq-Jk>+1 3«----------

5) Jo/Jk» 10 236 ■ i где Jo - параметр удельной Фглаорзсцанш-п в опытной группе, Jk - параметр удельной Флюоресценции ■ соответствующей контрольной группе сравнении.

6) В вкспариментах испытаны следующие самодельные гибР1л«сн^;иэ моноклональные антитела! анти-анти-СС4 класса IgM — альСа-Т4-1, альФа-Т4-2, A0X-8I класса IgM, но посторонней антигенной специфична п - Me—4 -против матриксного белка вирусе гриппа, К2/д7 - против Fl-антигена чумного микроба! класса IgBl - H2/f7 - протиэ коленного токсина» анти-ВИЧ, но не анти-анти-СВ4 - P8-Z класса IgBl.

Данные втих 12-ти опытов показывают следующее! 1) ни одно из 3 испытанных анти-идиотипичвеких анти-анти-С04 моноклинальных антител не блокировало связывание антю-С04 антитела 0КТ4А с рецепторам GD4 клетках Н9| 2) против ожидания 2 ив втих антител - альФа-Т4-1 и АОК Е) усиливали СЖТ4А-Флюоресценц|/ш> клеток Н9 в 2-4 рава «группы N 2 и 3) Hi сравнению с 0КТ4А—Флюоресценцией в отсутствии енти-анти-С04 антител. Оба усиливающих антитела класса IgMI 3) другие моноклональные снтитеи того же класса IgM, но посторонней антигенной специфичности (против матриксного белка вируса гриппа, против Fl-антигена чумного мимроба) или другого класса (IgBl - против холерного токсина), а текке другие антитела против, озолоченного белка ЕИЧ-1 gpl20 (PS-Z, IgGl) ни оказывали никакого влияния на 0КТ4А-Флюоресцените'клеток kv (группы f: 6, 7, 8, 3)| 4) ни одно из испытанных моноклональных «нтитол никак ни влияло на ОКТЗ-Флюоресиенцим клеток Н9 (группы NN 11-16).

□дно иэ "усиливающих Флюоресценцию" енти-анти-С04 антител <аг.ьФа-Т4-1 было исследовано (с соответствующими контроловл) на культуре тек ас-клеток Н9 с текущей вирусной инфекцией HIV-I 1IID и с подсосом неварахенных клеток. Опыты с инфицированными клзтками сыполнплись ма ease лаборатории герпесоирусных инфекций Института вирусологии им. Д.И.Ивановского (аавеажщий профессор И.Ф.БаРинский). В втих вкспвримеитах был зарегистрирован вФФект усиления вирусной продукции.

• 2-3 рана и быстрая гибель инфицированных культур в присутсви»; лмти-анти-СС4 маноклональных антител, причем именно тох ко, котс?ыл ■силиватл 0КТ4А-Фшгс»есцемцик>. Данные опытоз приводим о тайлицо N Е

• гюаробно единая раг.ота предстголона о статье в ДАН СССР, 1S09, 30а, 5, г. 1277-1Г>75> .

Тавлица 2. 3«««кт воздействия монокланальных анти-анти-С04 антител альФа-Т4-1, а также сыворотки ВИЧ-1 инфицированного вольного на продукцию вируса а культуре клеток Н9.

Испитуаммв антитела

Контрольная культура Сев антител

7. ВИЧ-1 инфицированных клеток & культуре на 3-7 сутки 12 сутки

21,0+3,0

20,3+3,6

'«упзрнатент

¡•МИРИДОМЫ

«ль>Фа-Т4~1

38,0+3,3

Асцит

альоа-

T4-I

И20 И40 it 100

61,3+3,9 34,3+6,7 31,2+3,9

гибель культуры

30,4+3,1

36,2+3,0

Сгзсротка ИЗО

ЗДОРС.Я-7ГО 1ПОО донор ы И 300

32,1+2,6 26,3+2,7 27,0+2,3

Cubwqiiu 1150 йольиаго 1!100 СПИД 1«200

2,3+1,1 6,4+1,6 4,0+1,2

Пригшчания к тазлице 2« в опыты врали культуру инфицированных ВИЧ-1 111» книги« Н9, к которым в момент "О" подсевали в соотношении 111 чистые (ивимФицироаамные) клетки одноименной линии; Факт инфицированное™ клеток регистрировали по вкспрессии вирусных антигенов катодом непрямой иммунофлюорвеценции| в каждой опытной группе подсчитывали 300-500 клеток! средние аначения вычисляли по данным 3-4 опытов! моноклональные антитела иной специфичности испытывали <те же, ч о » таалицв 1) и в данной системе! они нв оказывали никакого влияния на течение инфекции ВИЧ-1 а культуре (данные не приведены).

Выводы из втих результатов следующие. Ингибирующее влияние сыворотки вольного СПИД на течение ВИЧ-1 в культуре клеток In vitro является ожидаемым результатом, совпадающим с литературными данными. Два анти-анти-СВ4 моноклональных антитела из 5 испытанных показали парадоксальный (относительно ожидаемого) результат! они не тушили, а усиливали в 2-4 раза 0КТ4А-иммуноФлкюресценцих> клеток Н9. □ ба усиливак>щих антитела относятся к классу IgM. Именно вти 2 антитела при добавлении в культуру клеток Н9, инфицированных ВИЧ, усиливали инфекцию. В присутствии таких антител хронически текущая инфекция превращалась в острую летальную (вФФект дозово-зависим). На неинФицированные клетки Н9 вти моноклональные антитела кс оказывали никакого влияния.На клетках Н9, с которыми проведены эти вксперименты, Fc-роцептор не обнаружен. Следовательно, в данном случае Феномен усиления инфекции ВИЧ антителами не связан с использованием дополнительного канала инфицирования через связывание с Кс-рецептором комплекса вируса с антителом и интернализации его. Вероятно, и рецептор для комплемента в этом случае не-задействован, поскольку, по крайней мере, усиление Флюоресценции проходит в средь, не содержащей комплемент. Корреляция между усилением 0КТ4А-Флкюресценции и усилением инфекции ВИЧ одними и теми же антителами позволила автору представить себе механизм усиления таким образом. Моноклинальное антитело анти-анти-С04 класса IgM связывает от 2-х до 4-х молекул 0КТ4А или по перекрестно-реагирующей детерминанте (именно на вто вели отбор гибридомных антител) от 2-х до 4-х bhphohoi ВИЧ. Природным свойством втих антител оказалось то, что их связывание с антителами 0КТ4А и также с ВИЧ не препятствует ни 0КТ4А, ни ВИЧ взаимодействовать с рецептором CD4 на клетках. Таким овраоом, моноклональное условно говоря анти-идиотипическое антитело связывает в "пучки" от 2 до 4 молекул 0КТ4А или также 2-4 вириона ВИЧ. Такие "пучки" вместо единичным лигандов связываются с рецепторо! CD4. Происходит мультипликация либо дозы 0КТ4А на один рецептор CD4, либо дозы ВИЧ. В результате - усиление либо 0КТ4-Флюоресценцип, либо ВИЧ-инФекции. Феномен ADE (Antibody-dependent enchancement) описан в литературе в отношении нескольких вирусных инфекций. Он не слишком распространен, но все же был известен иммунологам, вирусологам и инфекционистам на примерах вируса лихорадки Денге CHotta Н. et al., вируса бешенства CKing A.A. et al., 19843, вируса желтой лихорадки tPrandriss M.W. et al19В4 3, риновирусов CMurphy B.R. et al., 19B£> вируса инфекционного перитонита кошек - FIPV tWeiss R.O. et al.,. 19B В отношении ВИЧ мы наблюдали Феномен усиления инфекции антителам!" вп

-39» мире. Позже шведские исследователи под руководством H.Wlgzell выделил усиливающие ВИЧ-инФекцию антитела из крови инфицированного человека. Эффвкт усиления вирусной инфекции антителами на уровне организма может проявляться с весьма серьезными последствиями. Опыт показывает, что предварительная вакцинация, например, риновирусной вакциной, а также профилактическое введение уже готовых антисывороток, за которым следует реальное заражение инфекционным вирусам, могут вызвать ускоренное и более тяжелое по клинике течение инфекционного заболевания (вплоть до летального исхода) по сравнению с контрольными группами людей или животных, в организме которым на момент веражения не было предварительно выработанных или пассивно приобретенных специфических противовирусных антител.

РЕЗУЛЬТАТЫ ОПЫТОВ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЯ) СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИ-ВИЧ АНТИТЕЛ В ИОЧЕ ЧЕЛОВЕКА.

Немодная идея работы заключалась в разработке методики неинвазивной диагностики специфических антител в моче человека с целью избежания проникновения медицинским инструментом во внутреннюю среду организма и э перспективе с целью возможной адаптации тест-системы для домашней предварительной самодиагностики брачных пар.

Работа ориентирована на пептидный синтетический иммуноФерментный диагностикум "Пвптоскрин-2", разравотанный в Институте иммунологии МЭ РФ. "Пептоскрин-2" (версия 1991/92гг.) сам по себе не дифференцирует саезевзятую мочу ВИЧ-инФицированных пациентов и здоровых людей! и тот и другой еиоматериал показывает довольно выраженную цветную реакцию (0D420 0,2-0,6). Описанный в литературе путь концентрации мочи ультрафильтрацией на мембранах Minicon BIS или аналогичных мы не пытались адаптировать к имеющеейся тест-системе. Подбор условий однако пакааал, что есть вариант простой предобработки биоматериала, а именно, криопреципитация, которая позволяет в растворенном преципитате достоверно обнаружить специфические анти-ВИЧ антитела. Подробно мзтодика и результаты апробации на больных описаны в нашей статье (Имнунология, 1993г., N 1, стр.14-1В). Мочу обычно не используют как б-.оиатериал для поисков каких-либо специфических антител. В немногочисленных старых работах, однако, описано обнаружение в моче антител к таким инфекционным микроорганизмам как холерный вибрион, тифозная палочка, лептоспиры, сальмонеллы, пневмококки, дифтерийный твкссиц СDurrows W., Havens 1. ff J.Infect.Di»., 1948, v.(32, 2 SI-2423.

В 19Э9-90гг. Cao Y. с соавторами опубликовали 3 работы С J. AIDS, 1990, v.3, 193-1991 Lancet, 198S, v.1, S31-B32I AIDS Ree.Human Retrov., 1989, v.5, N3, 311-3193, в которых покапали, что в моче инфицированных ВИЧ людей имеются анти-ВИЧ антитела, причем у ряда пациентов преимущественно вирус-нейтрализуквдие. Авторы использовали коммерчески' диагностические ИФА ^ест-систвмы фирм "Abbott Laboratories" и "Du Рпп» (инмуноб/ют), предназначенные для работы с сывороткой крови. Чвткие дифференцированные результаты удавалось получить, если мочу перед анализом концентрировали в 200 раз ультраФильтрацией на мембране Mlnicon BIS. Таким образом антитела выявили у 93 инфицированных пациентов из 100.

Целям нашей работы не соответствовали средства концентрации мочи ультрафильтрацией. Мы испытывали новые подходы, но описанные в литературе. Антитела определяли твердофазным ИФА на стандартных 96-луночных полистироловых планшетах. В качестве антигенов на твердую фазу сорбировали либо коммерческую композицию синтетических пептидов "Пептоскрин-2", либо отдельные пептиды, синтезированные в Институте иммунологии" СП-13 (из др41> и СП-22 (из др120> (оба из состава "Пептоскр.лна-2"), а также дополнительные пептиды Н4-191 (из др41) и МС-4В& (из др120 изолята Bru). В качестве отрицательного контрольного антигена использовали синтетический пептид N 508 из последовательное m белка холерного внтеротоксина. Сразу скажем, что ложно положительны:! реакций с данным пептидом не наблюдали. В рлботе использовали пробы мочи от 11 серопозитивыных ВИЧ-инФицированных пациентов Института иммунологии МЗ РФ, и 34 про»ь мочи и сывороток крови от неинФицированных ВИЧ пациентов отделений бронхиальной астмы, поллиноэов, врожденных иммунодоФицитов, а так«« сотрудников лаборатории беа Формальных диагнозов. Мы испытали следующие варианты предобработки мочи перед ИФА! 1> цельная интактнап ceeieiitiw* моча без венкой предобработки! 2) доведение кислого pH свежей мочи до нейтрального карбонат-бикарбонатнын буфером или гидроокисью натрип| 3) охлаждение цельной мочи при •♦■4 (о)С, при котором происходит выпадение осадка солзй и других малорастзоримык компонентов, центрифугирование, освобождение от осадка и использование супернатанта в ИФА| 4> »амор«жи«*ние-оттаи»»ние, центрифугирование при 3000 об/мин в течение 13 мин., удаление супяернатанта (в отличие от предыдущего пункта», растворение осадка ■ минимальном достаточном объеме Фосевтно-солевого «v-ФвРа и исследование »того раствора в ИФА на содержание антитиел. т^пцкп последний вариант предобработки мочи позволил отработать условия 1;-г «пьвгиого вифференцирования мочи ВИЧ-им»ициРованмых и

немнФициРованных людей. Мы назвали »тот методический прием криопрвцмпитацией [антителЗ. Название условно. Вероятно, при втой процедуре происходит процесс высаливания иммуноглобулинов собственными солями мочи, вффвктивность которого выше в условиях

ваморахиванип-оттаиванил образцов, чем только охлахдения при +4<о) С, а также освобождение от каких-то компонентов мочи обеспечивающим систематическое лохно положительное связывание с твердой Фазой. ИФА на "Пептоскрине-2", а такяе на отдельном пептиде Н4-191 при использовании растворенного криопреципитата с достоверностью 0,99 дифференцировало мочу от ВИЧ-имФицированных и неинФицированных людей. Цельную мочу наших пациентов, а также криопреципитат исследовали ь иммуноблоте <Du Pont HIV-1 Western blot kit). Результаты показали, что а цельной свеженjnron моче можно вынапгь антитела к др160, др120, р<Ь6, др41, р24. При исследовании в иммуноьлоте растворов криопееципитачов из тех so проб мочи у пациентов дополнительно могут проявиться полосы р55, р31, Р17.

Таким образом, мы предлагаем начальную разработку неинаазивного метода обследования на мнфицированность ВИЧ, доступного по материальным возможностям рядовой клинической отечественной лаборатории. По нашим представлениям этот подход ориентирован на обследования детских коллективов, беременных, или других групп населения, для которых взятие крови на анализ лимитируется этическими, гуманными, медицинскими, организационными или экономическими причинами. Задачами дальнейшего усовершенствования метода, доработки или прераеотки тест-системы с нашей точки зрения являются! 1) исследование Физико-химических и/или биохимических механизмов концентрации антител или приобретения ими свойсв доступности для анализа в криопреципитате; 2) подбор синтетических пептидов, более специфичных для противовирусных антител, вкскретируемых с мочой, и таким образом исследование возможного неравновесного распределения противовирусных антител в крови и в моче» 3) испытание методики на большем числе пациентов! 4) адаптация метода, возможно и принципиально новые решения, для применимости анализа мочи для домашнего самотестирования сексуальных пар (цель - противодействие распространению эпидемии по двум самым существенным путям трансмиссии инфекции на сегодня - сексуальным контактам и медицинским инвазиям).

-42-ЭАКЛЮНЕНИЕ.

Таким обравом, главное собственное »включение автор* по итогам теоретического анализа механизмов иммунопатогенеза при СПИД состоит ив двух гипотез. Первая гипотеза предполагает лечебную и/или профилактической роль специфической иммунологической толерантности к ВИЧ1 возможно, что в условиях специфической толерантности в организме человека ВИЧ не способен эффективно прижиться и/или инфекция не прогрессирует, оставаясь • латентной Форме в немногий первично-инФицированнык клетках (может быть именно вто имеет место в организме эмбрионов и новорожденных детей

от ВИЧ-инФицированных женщин, но не имеющих постнатальныи лабораторный и клинических признаков наличия дееспособного вируса в организма (ребенка)). Вторая гипотеза состоит в предположении о том, что более вероятно, что защищающие вакцины против СПИД не будут представлять из себя просто вФФективные иммуногенные (в классическом представлении о гуморальном и клеточном иммунном ответе на вирусные антигены) препараты. Следует быть готовым к нетривиальным решениям анти-ВИЧ вакцинации, к целенаправленной индукции искусственного иммунного ответа, сильно отличающегося от естественного иммунного ответа на вирус, который весьма силен в ходе естественного развития рвтровируснс? инфекции, но в принципе не защищает от прогрессий инфекционного процесса в целом.

Результаты собственных экспериментов позволяют заключить следующее»

1) Автором впервые в- мировой научной практике был экспериментально показан Феномен усиления течения инФекции ВИЧ в культуре клеток in vitro в присутствии определенных анти-анти-СВ4 антител, первктестно-реагирушцих с антигенами лизата природного вируса

ВИЧ-1/II1В. Усиливающим инФвкци» вФФектом обладали полученные автором моноклональные анти-идиотигмческие «нти-анти-С04 мышиные антитела.

2) Для конкретной экспериментальной модели »нти-иаиотипических антител «втором разработана методика предварительной оценки усиливающих свойств антител (или отсутствия такового) • «в»инфекционной тест-системе проточной лазерной микроцитоФляоеометрии, что позволяет существенно сократить объем работ с инфицированными клетками и снмвить профессиональный риск заражения персонала вир усом ВИЧ и контаминацию присоров, оборудования и окружающей среды.

Л Предложен* простая методика неинвазивной диагностики ВИЧ-ин*екции по „iTP^ -fvmw со»ци»ических антител • криопреципитате мочи человека • г -, > uft.ii упнумоФерментным анализом.

¿ыводы»

1. Автором выполнен теоретический анализ иммунопатогенв'за нового инфекционного заболевания человека - синдрома'приобретенного иммунодефицита. Работа имеет характер цельной, логически завершенной •-истомы знаний о пирусгз-возяудитеяо и вызываемом им заболевании -¡тгрпой в истории истиной пандемии. Исследование оформлено в виде монографии ("СПИД", Москва, 1992г., в соавторства с академиком

Р.М.Хвитоиым) объемом 22 печатных листа, содержащей 10 глав, гайота может служить учебным и справочным руководством для врачей и студентов, а также в каждом разделе содержит теоретические обобщения м ориентиры на порспгктивныо исследования для научных г ааотников. НинограФия палпзтсп первой в России по данной проблеме.

2. автором предложена гипотеза относительно механизмов иммунопатогенвза w^uimx патологических процессов при СПИД. Суть ее о предположении о Еюамояном терапевтическом ввфектв специфической иммунологической толерантности к антигенам БИЧ.

3. Стояап гипотеза азгбра, логически связанная с предыдущей, заключается о предположении о том, что для инфекции ВИЧ протектипныим могут оказаться нетрадиционные вакцины, которые будут, например, гндуцпрсзать о организма состояние специфической иммунологической толерантности, а ив продуктивный d обычном смысле иммунный отпет на diipychuo антигены. Азтор подчеркивает, что новизне инфекции более адекватными ногут оказаться принципиально новые неклассические подходы при разработка вакцин.

4. И результате собственных экспериментальных исследований автором получена панель из 13 гибридом мыши, продуцирующих моноклональныв антитела к антигенам ВИЧ. Гиеридомы депонированы в официальных коллекциях клеточных культур.

5. Автором апврвыо в мировой научной практике был экспериментально показан Феномен усиления течения инфекции ВИЧ в культуре клоток in vitro о присутствии определенных анти-анти-С04 антител, пероктестно-рвагируищих с антигенами лизата природного вируса DÍ14-1/II1B. Усиливающим инфекцию эФФектом обладали полученный автором моноклональныв «нти-идмотипическив анти-анти-с04 мышиные антитела.

6. Все предлагаемые вакцинные препараты необходимо тщательно проверит! на отсутствие быстронаступающих или отдаленных эффектов усиления инфекции ВИЧ In vitro и in vivo.

-447. Для конкретной вкспериментальной модели анти-идиотмпическик ентитеп автором разработана методика предварительной оценки усиливающим свойств антител (или отсутствия такового) в безинФвкционной тест-система проточной лазерной микроцитоФлюорометрии, что позволяет существенно сократить обьем работ с инфицированными клетками и снизить профессиональный риск заражения персонала вирусом ВИЧ и контаминациз прийороо, оборудования и окружающей среды.

В. Предложена простая методика неинвазизной диагностики ВИЧ-инФекци.и по определению специфических антител в криопреципитате мочи человеке, твердофазным иммуноФерментным анализом.

Па материалам диссертации опубликовано 25 работ, из них S монографии. Основное содержание отражают следующие публикации!

1. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А. СПИД (учебник/монограФия), 1992г., Москва, Народная академия культуры и общечеловеческих ценностей.

2. Игнатьева Г.А., Фукс Б.Б., Сидорович И.Г. Анти-идиотипические моноклональные антитела в изучении механизмов инфекции HIV в культуре

«увствительных клеток. Журнал ВХО им. Д.И. Менделеева, 1988, 5, С. 367-370.

3. Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г., Нгстерчук С.Л., Ьаринский И.0. Усиление инфекции вирусом иммунодефицита человека моноклональными антителами. ДАН СССР, 1989, 306, 5, с. 1272-127S.

4. Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г., Щербакова Т.И., Николаева И.А., ВаФина М.Г., Сидорова М.В., Макарова С.А. Диагностика инфекции вирусом иммунодефицита человека по анализу мочи! иммуноФвРментный анализ в тест-системе "Пептоскрин-2". Иммунология, 1993, N1, стр. 14-18.

3. Khaitov R.M., Sidorovitch I.G., Ignatleva G.A., Prokopenfeo V.D. Possible dangerous effect of some anti-idiotypic antibodies! excoplо of monoclonal antl-anti-CD4 antibodies. Int. Syepoeium "New generation оf monoclonal antibodies in diagnosis and therapy", Benoa, Italy, april 12-15, 1992, p.48.

6. Ignatieva В., Sidorovitch I. Antibody dependent enhancement of HIV-1

infeetlon in T-cells by anti-anti-CD4 antibodies is FcR- and CSR-independent. VIII Int. Ccnf. AIDS, Amsterdam, 19-24 July 1992, PoA Я472, p. A31. .

7. Sldorovltch I., Ignatieva Q., Tcherbacova T. Detection of anti-HIV antibodies by peptide ELISA in cryoprecipitate from human urine. VIII Int. Conf. AIDS, Amsterdam, 19-24 July 1992, PoC 4764, p. C370.

П. Irjnatieva 0.A. , Sldoros/itch I.B. Anti-idiotypic anti-anti-CD4 monoclonal antibodies induce enhancement of HIV-1 infection in T-cella. Jntnrn. Conference on AIDS, cancer, and human retroviruses, 5fc.-Poterburg, 13-22 November 1992, 29.

T, Ignatieva G.rt., 31doravltch I.В., Tcherbacova T.I. stection of »-.ntl-HIV antibodies in human urine by peptide ELISA. Intern. Conference on AIDS, cancer, and human retroviruses, ol.-Petcrburg, 10-22 November 1992, 43. iO. IrjnatiGva G.A., 3idorovitch I., Negai 0. "Immunopathogencais of HlV-lnfecticne immunological tolerance delay progression?" IXth Tntrrmtienal canferonca on AID3/ IVth STD World Congress, Berlin, Juiifj >11, 1993, P0-R19-0370, v. 1, p. 196.

it. ®У1<с З.Б., Смдоропич И.Р., Игнатьева Г.А. Гивридомы и ¡тзнвкяоиальниэ антитела. Журнал 3X0 им. Я.И. Менделеева, 19В2, XXVII, 4, 407-4S6.

!2. Оукс 5.3., Смясрович И.Г., Игнатьева Г.А., Юрин В./1. ГибРидоми и канскломэльныэ антитола. ВИНИТИ, Итоги науки и техники, 1983, т. 11, 103-124.

13. Лгтг>03 Р.В.Г Сидорович И.Г., Игнатьева Г.А., Фукс Б.Б. ТхВ гксрмянио клены, спосоеныа тормозить развитие лейкоза in vivo. яан СССР, 1703, т. 269, 26 S04-S0B.

Игнатьева Р.Л., Петров Р.В., Сидорович И.Г., Фукс Б.Б. Выведение мутантныя лю-влй клеток для использования в гийридомной ЕкзгеянолйГИИ« В ей. трупов 2-ого Всесоюзного совещания по генетике ссмзттсяемя клеток гэ культуре. Звенигород, 1В-21 декабря 19ВЗ, с. 19.

13. Спдсроаич И.Р., Игнатьева Г.А., Николаева И.А., Хаитов P.M. Влияние «еатнзноаровьи лммФоцитов-супрессоров на пролиферацию гибридомных !?Я9ТО!{. Иммунология, 1934, 3, с. 35-37.

1Л.Сиао5»спич И.Г., Игнатьева Г.А., Николаева И.А. Моноклональные антитела к полисному токсину. В се. "Моноклональные антитела в нгхзоапологии и вирусологии", Москва, 1985, с. В8-96.

17. Ignatjava О.А., Sidorovitch I.G. Suprossion of hybridoma cell proliferation by B-suppreasors from the bone marrow of normal mice. In

"Immunobiologics and their application, april 21-27, 1983", Eudapas:, Hungary, p. 102. IB. Сидорович И.Г., Игнатьева Г.А., Ляхов В.В., Новиков В.И. Исследование Функциональной активности костномозговых супрассоров. Г ей. трудов Всес. симпозиума "Клеточные основы противоопухолевого иммунитета. Гибридомы", Москва, 4-5 декабря 1983, с. S3.

19. Сидорович И.Г., Игнатьева Г.А., Лиознер А.Л., Иоацвнко Синтетические антигены в биотехнологии! получение гибридомных антител' против М1-белка вируса гриппа. Иммунология, 1986, 1, с. 31-5J

20. Игнатьева Г.А. Моноклинальные антитела» возможности и перспективы. (Обзор). Патологическая оизиол. и вкспер. терапия, 19G6, 4, С. ¿1-66.

21. Хаитов P.M., Сидорович И.Г., Игнатьева Г.А. Современные аспвкти гивридомной биотехнологии. (Монография), Москва, 19В7, 70 стн.

22. Костина Г.И., Сидорова М.В., Алексеева H.W., Андреев С.М., Фснина Л.А., Николаева И.А., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунологические свойства гекса- и декапептидо» бэта-СУбъодинпцы внтвротоксиное. Иммунология, 1980, М 1, с. 49-55.

23.Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г., Болтооская М.Н. Гибридомы и моноклональные антитела в биотехнологии и медицине (монография/. ВИНИТИ, Москва, 19В9, 132 стр.

2А. Рыеальский Н.Г., Серова И.А., Игнатьева Г.А., Старчеус А.П. Моноклональные антитела и гибридомы (патентная ващита). Москва, 19BV,

343 стр.

23. Зайденов В.А., Ямщикова О.А., Игнатьева Г.А. Эпитопный анализ» антигена F1 чумного микроба с помощью панели моноклональных антител. С сь. "1 Всесоюзного иммунологического cvoofla. том 1( Сочи 15-17 ноября 19Н9", Москва, 19В9, с. 153.

Г.й. Игнатьева имеет следуищие авторские свидетельства на штаммы гибридомным культивируемых клеток»

АС N 15773371 АС N 13773541 АС N 1577359» АС N 157735В» АС N 15773561 АС N 152447В.

Креме того, следующие линии гибридом, полученные автором, депонирован).! в официальной Специализированной коллекции перевиваемых соматическим клпток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур при Институте цитологии Академии наук СС.-Петербург)I

лт»та-Т4-1 под N ВСКК(П) 419 Д. | Р8-г под N ВСКК (П) 416 Д. | 1У-10 поя N Г :К(П) 414 Д! АПК—8 под N ВСКК(П) 417 Д| А0К-7 под N ВСКК(П) -418 Д|

6.10.0.1 под N BCKKtm 413 Д| Ма-4 под N БСКК<П> 11В Д» M2/glt под N ВС1СК<П) 141 Д| МТ-4 ПОЯ N ВСКК(П) 120 Д| А1/С11 под N ВСКК(П) 467 Д» НТ-2 под N ВСККСП) 469 Д| Н4/Ч»12 под N ОСКК(П) 140 Д| НТ-1 под N 2СКк(П) 119 Д| F3N3 под N ВСКК<П> 412 Д| K6/h9 под М ВСКК<П> 466 Д| К2/д7 под N ВСКГСШ) 130 Д! K6/d3 под N 0СКК<П) 139 Д| К6/Ы1 под N ВСКК(П) 137 Д.

Следующие линии гибридом, получанныв еотором и имеющие отношения к данной работе, депонированы в кяиобанке Института иммунологии МЗ РФ« IV-2 под N И-6-Я1 IV-3 поя N и-7-Д1 альФа-Т4-2 под N и-2-Д1 аск-7 пол n И-4-Д.

В тексте научного доклада «етор испольвоввла общепринятые аббревиатуры!

АЗКЦ - антитело-ввписимая клеточная цитотоксичностьI

БСА - бычий сывороточный альбумин)

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека!

ПСГС - валки главного комплекса гиетосозмастимости!

ИФА - иммунофврмвнтный анализ}

СПИД - синдром приояретенного иммунояаФицита!

1ЯР - цвпная полиморавнья реакция!

ЦТЛ - цитотоксичвскио Т-лимвоциты!

ADE - antibody-dependant enchancement!

Gfl-CSF - granulocyte-monocyte colonystimulatlng factor!

It- - lnterleufclnsl

OIV - Blmlan Immunodeficiency virueaai

GCID-hu-мыши - модальные мыши с тяжелым комбинированным иммунным дефицитом, которым инокулировдли каки-ливо клетки человека(лим»оидныв, кроветворные, опухолевые и т.п.}) TNF - tumor necrosis factor.