Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Использование некрахмальных полисахаридов в комплексной терапии злокачественных новообразований (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

РЫБАЛКИНА ОЛЬГА ЮРЬЕВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НЕКРАХМАЛЬНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ В КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 / СЕВ 2314

Томск-2014

005545502

005545502

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Разина Татьяна Георгиевна доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

Толстикова Татьяна Генриховна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение Новосибирский институт органической химии имени H.H. Ворожцова Сибирского отделения Российской академии наук, лаборатория фармакологических исследований Отдела медицинской химии, заведующая лабораторией

Новожеева Татьяна Петровна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт психического здоровья» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория нейробиолопш, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт онкологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Защита состоится « (¿Ая/1Р 2014 года в часов на заседании

диссертационного совета Д (Ю 1.031.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3; \v\vw. pharmso.ni)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан « ¡Л» 2014 г.

Ученый секретарь .

диссертационного совета, -^ку/

доктор биологических наук <Т Амосова Евдокия Наумовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Одним из главных предметов внимания для здравоохранения развитых и развивающихся стран остается онкологическая заболеваемость [Гарин A.M., 2012]. В Российской Федерации в 2011 году выявлено 522 410 новых случаев злокачественных новообразований, из них 240 107 - у мужчин, 282 303 - у женщин. Прирост данного показателя по сравнению с 2010 годом составил 1,1 % [Чиссов В.И. и др., 2012].

Бурное развитие в конце XX века молекулярно-генетической онкологии кардинально изменило представления о процессах возникновения и развития новообразований различного генеза. Так, удалось расшифровать некоторые механизмы канцерогенеза и определить фенотипические признаки опухолевой клетки: независимость в отношении ростовых сигналов, нечувствительность к ингибиторным сигналам, уклонение от программированной клеточной смерти (апоптоза), неограниченность репликативного потенциала, ангиогенез, тканевая инвазия и метастазирование [Hanalian D. et al., 2000]. Появление этих данных явилось стимулом для поиска принципиально новых методов лечения, прицельным образом воздействующих на ключевые звенья патогенетической цени опухолевого процесса, получивших в связи с этим общее название «гаргетная терапия» [Чубенко В.А., 2010]. В настоящее время в клинике применяется 9 ингибиторов передачи сигналов в клетке (има-тиниб, сунитиниб, сорафениб, лапатиниб, гефитиниб, эрлотиниб, дазатиниб, нилотиниб, пазопаниб) и 5 моноклональных антител (трастузумаб, ритукси-маб, бевацизумаб, цетуксимаб, панитумумаб) [Harandi A. et al., 2009; Чубенко В.А., 2010]. Однако существует ряд причин, создающих проблему лечения онкологических больных этими средствами, главными из которых являются иммуногенность препаратов, гетерогенность опухолей, а также активация аутоиммунных реакций [Моисеенко В.М., 2002]. Кроме того, использование таргетных препаратов для лечения больных со злокачественными новообразованиями может привести к побочным эффектам со стороны сердечнососудистой, дыхательной, мочевыделительной систем, а также желудочно-кишечного тракта, костномозгового кроветворения [Chu D. et al., 2008; Chen H.X. et al., 2009; Harandi A. et al., 2009; Geiger S.L.V. et al., 2010; Hasinoff В., 2010; Toi J. et al., 2010]. Поэтому классическая химиотерапия еще длительное время будет оставаться основой медикаментозного лечения онкологических пациентов. Однако токсичность в отношении здоровых клеток организма и быстрое развитие химиорезистентности опухоли в процессе лечения лимитируют использование цитостатиков. Введение максимально переносимых доз антибластомных препаратов с целью наиболее полного подавления опухолевого роста приводит к развитию цитостатической болезни, повреждению быстро обновляющихся клеточных систем [Птушкин В.В., 2002; Iwamoto Т., 2013]. Одной из наиболее чувствительных к действию антибластомных препаратов систем организма является кроветворная в связи с высокой пролифе-ративной активностью составляющих ее элементов [Гольдберг Е.Д. и др., 1999; 2006; Дыгай A.M. и др., 2012]. Так, использование цитостатиков для лечения пациентов со злокачественными новообразованиями приводит к раз-

витию нейтропении, анемии, тромбоцитоиении, что сопровождается развитием инфекционных осложнений, геморрагического синдрома и ухудшением общего состояния больных [Удут Е.В. и др., 2007; Матяш М.Г., 2008; Дыгай A.M. и др., 2009; Abaid L.N. et al., 2013]. В связи с этим остается актуальной проблема повышения эффективности антибластомной терапии и уменьшения ее побочных проявлений, разработки патогенетически обоснованных методов коррекции нарушений гомеостаза, обусловленных развитием опухолевого процесса и/или проводимым цитостатическим лечением [Богуш Т.А. и др., 2000; Муфазалова Н.А., 2002; Зборовский А.Б. и др., 2003; Di Maio М. et al., 2005].

На современном фармацевтическом рынке существует ряд препаратов (нейпоген, граноцит, лейкомакс, эпрекс, рекормон и др.), способствующих проведению полноценных режимов лечения цитостатиками. Так, при их использовании для лечения онкологических больных наблюдается более короткий период нейтропении, менее выраженная тромбоцитопения, появляется возможность проведения интенсивной химиотерапии, поскольку уменьшается срок между курсами лечения [Переводчикова Н.И., 2005; Машковский М.Д., 2008]. Однако перечисленные средства также не лишены побочных эффектов. Кроме того, чрезвычайно высокая стоимость препаратов этой группы ограничивает их широкое применение.

Степень разработанности. Существуют экспериментальные данные о возможности использования в дополнительной терапии опухолей экстрактов из лекарственных растений (элеутерококка, шлемника байкальского, побегов и коры облепихи и др.), которые, повышая эффективность цитостатической терапии, с нижа гот её токсичность [Гольдберг Е.Д. и др., 2008; Зуева Е.П. и др., 2010]. Установлено, что в реализации эффектов комплексных препаратов растительного происхождения важная роль принадлежит флавоноидам, алкалоидам, гликозидам, витаминам, дубильным веществам и т.д. [Гольдберг Е.Д. и др., 2008]. Менее изученными в этом плане остаются полисахариды, в частности, некрахмальные. Между тем, они являются перспективными для создания на их основе корректоров химиотерапии злокачественных опухолей благодаря широкому спектру фармакологического действия [Silva Т.М.А. et al., 2005; Алексеева Т.В. и др., 2007; Cumashi A. et al., 2007; Sousa А.Р.А. et al., 2007; Вищук O.C. и др., 2009; Хотимченко М.Ю. и др., 2009; Хотимченко Ю.С. и др., 2010; Lee Y et al., 2012; Zhang Z. et al., 2013]. Эти вещества не токсичны для организма и обладают высокой биодоступностью, отличаются менее сложной технологией выделения и очистки от химически синтезированных. Богатая сырьевая база и низкая себестоимость производства делают эти вещества перспективными для создания на их основе новых, высокоэффективных препаратов. Однако в литературе практически не встречается сведений о возможности использования некрахмальных полисахаридов в схемах химиотерапии. Учитывая вышесказанное, актуальным является изучение некрахмальных полисахаридов в онкологическом эксперименте с целью создания на их основе препаратов, повышающих эффективность цито-статического лечения онкологических больных.

Цель исследования. Изучить влияние некрахмальных полисахаридов на развитие перевиваемых опухолей животных в условиях цитостатической терапии, оценить возможность снижения с их помощью токсичности цикло-фосфана на систему гемопоэза.

Задачи исследования:

1. Провести скрининговое исследование действия 10 образцов некрахмальных полисахаридов на развитие перевиваемых опухолей животных.

2. Изучить влияние некрахмальных полисахаридов на эффективность лечения циклофосфаном животных с перевиваемыми опухолями.

3. Изучить возможность коррекции токсического влияния циклофосфана на систему крови животных (периферическая кровь и костный мозг) с помощью некрахмальных полисахаридов.

Научная новизна. Впервые исследовано действие 10 образцов некрахмальных полисахаридов (пектин с молекулярной массой <10 Ша, 10-20 Ша, 40 Ша; хнтозан с молекулярной массой 50-190 Ша, 190-300 Ша; фу-коидан с молекулярной массой 75 Ша; алытшат натрия с молекулярной массой 1 Ша, 1-10 Ша, 20-30 Ша и 403 Ша) на развитие перевиваемых опухолей как при их изолированном использовании, так и на фоне введения циклофосфана. Впервые выявлено умеренное торможение роста первичной опухоли у мышей с карциномой легких Льюис при использовании пектина (М=40 Ша), альгината натрия (М=403 Ша) и фукоидана. Ингибирующее влияние на процесс метастазирования карциномы легких Льюис обнаружено при введении мышам фукоидана, а также низкомолекулярных полисахаридов - пектина (М<10 Ша и 10-20 Ша), альгината натрия (М=1 Ша, 1-10 Ша и 20-30 Ша). Впервые продемонстрирована возможность повышения противоопухолевого эффекта циклофосфана пектином (М=40 Ша), альгинатом натрия (М=20-30 Ша), хитозаном (М=50-190 Ша и 190-300 Ша) и противоме-тастатического действия - высокомолекулярным альгинатом натрия (М=403 Ша), альгинатом натрия (М=20-30 Ша), фукоиданом.

Создана новая биологическая модель умеренного торможения роста опухоли и метастазов карциномы легких Льюис с продолжительной лейкопенией у мышей в условиях 3-х кратного введения цитостатика.

Выявлена возможность коррекции циклофосфаниндуцированной гема-тотоксичности с помощью альгината натрия с молекулярной массой 1-10 Ша и 20-30 Ша путем стимуляции предшественников гранулоцитопоэза в костном мозге мышей с карциномой легких Льюис и здоровых животных.

Теоретическая и практическая значимость работы. На основании проведенных исследований выявлены некрахмальные полисахариды, обладающие способностью ингибироватъ рост перевиваемых опухолей и метастазов у животных. Определены некрахмальные полисахариды, повышающие эффективность лечения циклофосфаном. Показана принципиальная возможность снижения гематотоксичности циклофосфана с помощью альгината натрия с молекулярной массой 1-10 и 20-30 Ша.

Представленные данные могут быть использованы для разработки патогенетически обоснованных методов повышения эффективности химиоте-

parara опухолей и коррекции нарушений в системе крови онкологических больных, получающих цитостатическое лечение.

Разработана биологическая модель умеренного торможения роста первичного опухолевого узла и метастазов карциномы легких Льюис у мышей с сопутствующей продолжительной лейкопенией под влиянием Знатного введения циклофосфана. Предлагаемая модель может быть использована на этапе доклинического изучения веществ, повышающих эффективность химиотерапии и снижающих токсическое действие цитостатиков на клетки белой крови. По результатам диссертационного исследования оформлен патент (RU) на изобретение № 2488173 «Способ создания биологической модели умеренного торможения роста опухоли и метастазов карциномы легких Льюис с продолжительной пиктофссфашщдущфованнойлейкопенией у мышей».

Методология и методы исследования. Согласно поставленным задачам выбраны современные высокоинформативные методические подходы, имеющиеся в научно-исследовательских лабораториях ФГБУ «ПИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН. В качестве объекта исследования использовались аутбредные мыши СД 1 обоего пола с перевитой внутри-брюшинно аденокаршшомой Эрлиха и мыши линии C57BL/6 обоего пола с перевитой внутримышечно карциномой легких Льюис. Основные методы исследования: методы экспериментальной химиотерапии опухолей согласно методическому «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [Москва, 2005]; гематологические (подсчет мазков периферической крови и костного мозга мышей с опухолью); иммуноферментные (определение уровня концентрации Г-КСФ в сыворотке крови мышей с опухолью); культуральные (определение содержание КОЕ-Г в костном мозге мышей с опухолью).

Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень достоверности полученных результатов подтверждается достаточным объемом экспериментального материала с использованием современных методов и методических подходов, соответствующих поставленным задачам. Выводы, сформулированные в диссертации, подтверждены экспериментальным материалом, анализом литературы, точностью статистической обработки полученных результатов.

Основные положения диссертационной работы докладывались, обсуждались и представлялись на конференциях молодых ученых ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2011, 2012, 2013) и ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2012), на IX российско-немецкой научно-практической конференции форума им. Р. Коха и И.И. Мечникова «Новые горизонты: инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении» (Новосибирск, 2010), на первой Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века (Москва, 2012), на VII Международной (XVII Всероссийской) Пироговской научной конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2013), на первой Всероссий-

ской научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств» (Москва, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, из них 7 - в журналах, рекомендованных перечнем ВАК Минобрнауки РФ. Получен 1 патент (RU) на изобретение № 2488173.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 187 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, списка используемой литературы. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 33 таблицами. Библиографический указатель включает 338 источников, из них 116 отечественных, 222 иностранных.

Работа выполнена при поддержке гранта ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» в рамках Государственного контракта с Федеральным агентством по науке и инновациям Российской Федерации № 02.512.12.2043 «Разработка фармакологических средств на основе модифицированных некрахмальных полисахаридов для использования в терапии злокачественных новообразований» (2009-2012).

Автор приносит благодарность заведующему лабораторией фармакологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН, д.б.н., проф. Хотим-ченко Ю.С., заведующему лабораторией фармакологии и биоиспытаний школы Биомедицины Дальневосточного Федерального университета, д.м.н. Хотимченко М.Ю., а также заведующей отделом экспериментальных биологических моделей, д.б.н. Данилец М.Г., сотрудникам лаборатории патофизиологии и экспериментальной терапии, д.м.н., проф. Скурихину Е.Г. и к.м.н. Ермаковой H.H. (заведующий - д.м.н., проф. Жданов В.В.) ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН за консультативную помощь при выполнении работы и обсуждений ее результатов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цель и задачи исследования, научная новизна, теоретическое и практическое значение работы.

В первой главе проведен анализ отечественной и зарубежной научной литературы по теме исследования. В первом разделе представлены сведения о химиотерапии, как одном из основных методов лечения онкологических больных и описываются наиболее часто встречающиеся побочные эффекты ангабластомных препаратов. Далее с привлечением большого количества литературных источников представлены экспериментальные данные о структуре, физико-химических и фармакологических свойствах полисахаридов и их влиянии на развитие злокачественных новообразований.

Вторая глава диссертации посвящена описанию материалов и методов исследования. Эксперименты проведены на 562 аутбредных мышах СД 1 и 1033 мышах линии C57BL/6 обоего пола. Животные 1 категории (конвенциональные мыши) разводки ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольд-

берга» СО РАМН (сертификат качества № 188-05) содержались в соответствии с международным правилам, принятым Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей [European Convention, 1986]. Дизайн исследования одобрен Этическим комитетом ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д.Гольдберга» СО РАМН.

Трансплантацию аденокарциномы Эрлиха (АКЭ) аутбредным мышам СД 1 производили внутрибрюшинно по 7,5 х 10б клеток в 0,2 мл физиологического раствора. Карциному легких Льюис (3LL) мышам линии C57BL/6 перевивали гомогенатом опухолевой ткани внутримышечно по 5-6 х 10б опухолевых клеток в объеме 0,1 мл физиологического раствора [Софыша З.П. и др., 1980].

Циклофосфан (ОАО «Биохимик», г. Саранск) вводили мышам однократно внутримышечно (АКЭ) в дозе 150 мг/кг через 72 часа после перевивки опухоли либо внутрибрюшинно (3LL) в дозе 125 мг/кг (на 10 сут); в условиях курсового использования цитостатик животным с 3LL вводили в дозе 83,3 от/кг на 7, 14,21 сут после перевивки.

Образцы некрахмальных полисахаридов для экспериментального исследования (пектины с молекулярной массой <10 kDa, 10-20 kDa и 40 kDa, хигозаны с молекулярной массой 190-300 и 50-190 kDa, фукоидан (М=75 kDa), альгинаты натрия с молекулярной массой 1 kDa, 1-10 kDa, 20-30 kDa и 403 kDa), полученные по оригинальным технологиям, и сведения об их физико-химических свойствах были предоставлены лабораторией фармакологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН (г. Владивосток) (заведующий — д.б.н., проф. Ю.С. Хотимченко). Образцы пектинов были стандартизованы по молекулярной массе, вычисленной с помощью уравнения Мар-ка-Куна-Хауинка, содержанию натрия, уроновых кислот, золы; хитозанов -по молекулярной массе, содержанию 2-амино-2-дезокси-Д-глюкозы, золы, степени деацетилирования и вязкости 1%-ного раствора; фукоидана - по молекулярной массе, содержанию уроновых кислот, фукозы, сульфатов, белка; альгинатов натрия — по молекулярной массе, содержанию натрия, уроновых кислот, золы. Для проведения исследований некрахмальные полисахариды использовались в дозах 50 и 100 мг/кг. Полисахариды растворяли в дистиллированной воде и начинали вводить мышам внутрижелудочно через 24 часа после перевивки асцитной опухоли АКЭ и продолжали 7 сут. Животных с 3LL в условиях однократного введения циклофосфана начинали лечить полисахаридами через 7 сут после перевивки и продолжали в течение 11-13 сут. В условиях курсового введения цигостатика исследуемые вещества начинали вводить на 5 сут после трансплантации 3LL и продолжали в течение 22 сут.

Показатели периферической крови и костного мозга определяли стандартными гематологическими методами [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Уровень Г-КСФ в сыворотке крови измеряли иммуноферментным методом с использованием соответствующих тест-систем («R&D Systems», США) согласно прилагаемому протоколу. Содержание гранулоцитарных предшественни-

ков (КОЕ-Г) в костном мозге мышей с опухолью определяли методом клонирования in vitro в полувязкой культуральной среде [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. По окончании экспериментов животных умерщвляли, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», проводили вскрытие, ревизию внутренних органов, выделение опухоли и метастазов. При этом оценивали возможность торможения роста опухолей, ин-гибицию процесса метастазирования в условиях изолированного введения полисахаридов, а также повышения эффективности циклофосфана с помощью некрахмальных полисахаридов. Для этого вычисляли торможение роста опухоли - ТРО, частоту метастазирования 3LL вычисляли в процентах (по отношению числа мышей с метастазами к общему количеству мышей в группе). Подсчитывали среднее количество метастазов у одного животного в группе, определяли диаметр метастазов, вычисляли их среднюю площадь [Софыша З.П. и др., 1980]. Величину различия в метастазировании 3LL между контролем и опытом оценивали по индексу ингибировашш метастазирования [Архипов С.А. и др., 1984].

Для определения достоверности различий полученных данных в группах использовали непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Унтни. Достоверность различий между качественными признаками проверяли при помощи точного теста Фишера. Различия считали достоверными при Р<0,05 [Лакин Г.Ф., 1980].

Третья глава диссертации посвящена описанию результатов скринин-гового исследования влияния некрахмальных полисахаридов на развитие перевиваемых опухолей животных и эффективность лечения циклофосфаном. Изучена возможность снижения гематотоксичности циклофосфана с помощью низкомолекулярного альгината натрия. Полученные данные представлены в виде таблиц и рисунков.

Четвертая глава диссертационной работы посвящена обсуждению полученных результатов исследования с привлечением данных литературы.

Скрининговая оценка влияния некрахмальных полисахаридов на развитие перевиваемых опухолей и эффективность цитостатической терапии

На первом этапе скринингового исследования проводилось изучение влияния 10 образцов некрахмальных полисахаридов на развитие аденокарци-номы Эрлиха у мышей и эффективность терапии циклофосфаном.

Результаты исследования выявили, что применение пектина с различной молекулярной массой для лечения мышей оказало неоднозначное влияние на развитие АКЭ. Так, изолированное назначение пектина с молекулярной массой <10 и 40 kDa не влияло на рост опухоли у мышей, но при использовании с циклофосфаном повышало эффективность химиотерапии (ТРО=55 и 42% против 25% в ipynne животных, получавших цитостатик). В то же время, введение мышам пектина с молекулярной массой 10-20 kDa приводило к стимуляции роста АКЭ, а при совместном его назначении с циклофосфаном не меняло эффективность лечения.

Данные литературы также свидетельствуют о разнонаправленном действии пектинов с различной молекулярной массой на развитие опухолей [Piatt D. et al., 1992; Jackson C.L. et al., 2007; Гольдберг Е.Д. и др., 2008]. Вероятно, реакция опухолевых клеток на введение пектина зависит как от его типа, так и от различной чувствительности самих злокачественных клеток к этому веществу [Хотимченко Ю.С., 2010].

При изолированном назначении мышам хитозана с различной молекулярной массой (50-190 и 190-300 kDa) объем опухолевых клеток АКЭ не изменялся, однако при совместном использовании с циклофосфаном наблюдалось повышение иншбирующего действия на опухоль.

Maeda Y. et al. (2004) обнаружили, что использование хитозана с низкой молекулярной массой (21 kDa и 46 kDa) в дозе 100 мг/кг приводило к торможению роста саркомы 180. Полученные результаты авторы объясняют способностью низкомолекулярных хитозанов повышать функциональную активность натуральных киллерных клеток и макрофагов в результате повышения продукции ими различных цитокинов. В то же время, по данным Kimura Y. et al. (1999), применение хитозана с молекулярной массой 650 kDa в этой же дозе не влияло на развитие саркомы 180, однако при сочетанием использовании с 5-фторурацилом наблюдалось снижение иммуно-, гемато- и гаст-ротоксического эффектов цитостатика.

В эксперименте на мышах с АКЭ не обнаружено иншбирующего влияния фукоидана с молекулярной массой 75 kDa на развитие опухоли как при изолированном назначении, так и в сочетании с циклофосфаном.

Анализ литературных данных не позволяет сделать вывод об однонаправленном действии этой группы полисахаридов на развитие опухолей. Сообщается, что при использовании различных опухолевых штаммов наблюдается как иншбиция, так и стимуляция опухолевого роста [Yamamoto et al.,1984; Zhuang et al., 1995].

При изучении влияния альгинатов натрия с различной молекулярной массой на развитие АКЭ показано отсутствие связи между молекулярной массой и противоопухолевым эффектом. Так, при изолированном введении мышам как низкомолекулярных образцов полисахаридов: альгинат натрия (M=l kDa) в дозе 50 мг/кг, альгинат натрия (М<10 kDa) в обеих дозах, так и высокомолекулярного альгината натрия (М=403 kDa) в дозе 100 мг/кг, наблюдалось торможение роста опухоли (42%, 36%, 36% и 45% соответственно). При использовании альгината натрия с молекулярной массой 20-30 kDa (100 мг/кг) совместно с циклофосфаном отмечено повышение противоопухолевой активности последнего (ТРО=39% против 17% соответственно). В то же время, введение в схему химиотерапии альгината натрия с молекулярной массой 403 kDa (50 мг/кг) способствовало стимуляции роста АКЭ у мышей.

По-видимому, в фармакологических эффектах этих веществ имеет значение не только их молекулярная масса, но и химическая структура. В литературе имеются сведения о том, что противоопухолевая активность альгинатов зависит от соотношения маннуроновых и гулуроновых кислот. Так, аль-гинаты с большим содержанием p-D-маннуроновой кислоты обладают имму-

номодулирующим действием и более выраженным противоопухолевым эффектом, чем содержащие а-Ь-гулуроновую кислоту [ТчуШага М. й а1., 1993].

Способность к метастазированию опухоли - один из ключевых признаков ее злокачественности - является наиболее опасным проявлением опухолевой прогрессии, часто определяет судьбу больных и является причиной смерти. Именно раннее метастазирование лимитирует эффективность всех применяемых в онкологии методов терапии, поэтому так важна разработка новых способов фармакологического воздействия на механизмы диссемина-ции злокачественных новообразований.

Второй этап скришшгового исследования проведен на мышах с карциномой лёгких Льюис (31Х) для оценки влияния исследуемых соединений не только на рост первичной опухоли, но и метастазы. Считается, что карцинома легких Льюис по чувствительности к цитостатикам аналогична опухолям человека: адекватный экспериментальный поиск антимегастатических средств стал возможен лишь после введения в практику метастазирующего рака мышей Льюис [Не1кпапп К., 1984].

Анализ результатов экспериментов позволил разделить исследуемые некрахмальные полисахариды по характеру влияния на опухолевый процесс изолированно и в схеме химиотерапии на три группы: 1) умеренно ингиби-рующие развитие первичной опухоли; 2) оказывающие ингабирующее влияние на процесс метастазирования; 3) усиливающие антиметастатическое действие цитостатика.

В первую группу вошли: фукоидан (М=75 Ша), пектин (М=40 Ша) и альгинат натрия (М=403 Ша). Применение данных полисахаридов в изолированном режиме введения для лечения мышей с 31Х привело к статистически значимому торможению роста первичного опухолевого узла.

Во вторую группу вошли некрахмальные полисахариды, оказавшие ингабирующее влияние на процесс метастазирования карциномы лёгких Льюис при изолированном применении. Так, при лечении мышей пектином с молекулярной массой <10 Ша и 10-20 Ша в дозах 50 и 100 мг/кг снижалось количество гематогенных метастазов в легких в 1,4 и 1,3; 1,7 и 1,6 раза соответственно по сравнению с этим показателем у нелеченых животных. Аналогичные данные получены при использовании фукоидана (М=75 Ша), альпшата натрия с молекулярной массой 1 Ша, 1-10 Ша и 20-30 Ша. Кроме того, при использовании фукоидана и апьгината натрия (М=1 Ша) в дозе 100 мг/кг, альпшата натрия с молекулярной массой (М=1-10 Ша) в обеих дозах уменьшилось не только количество метастазов в легких, но и их площадь (Таблица 1).

В третью группу полисахаридов, повышающих противометастатиче-ский эффект циклофосфана, вошли вещества как с низкой, так и с высокой молекулярной массой: фукоидан (М=75 Ша), альгинаты натрия (М=403 Ша и 20-30 Ша). При использовании фукоидана в дозе 50 и 100 мпкг с циклофос-фаном для лечения мышей с ЗЬЬ уменьшилось как количество метастазов в легких, так и их площадь (в 2,0 и 1,7 раза; в 2,5 и 1,7 раза соответственно) по сравнению с этими показателями у получавших один цитостатик. Аналогичное действие на метастазы обнаружено при введении в схему химиотерапии

мышей с 3LL высокомолекулярного альгината натрия в дозе 50 мг/кг и альги-ната натрия смолекулярной массой 20-30 kDa в дозе 100 мг/кг (Таблица 2).

В механизме противоопухолевого действия изучаемых полисахаридов одним из ключевых звеньев может являться их способность оказывать влияние на апоптоз [Scott W. Lowe et al., 2000; Olano-Martin E. et al., 2003]. Данные литературы свидетельствуют о том, что полисахариды обладают способностью стимулировать процесс апоптоза, вызывая тем самым программируемую гибель опухолевых клеток [Avivi-Green С. et al., 2000; Jackson C.L., 2007; Yan J. et al., 2010; Cynthia A. et al., 2012; Xue M. et al., 2012; Boo H.J. et al., 2011, 2013; Park H.S. et al., 2011, 2013; Shi X. et al., 2013; Zhang Z. et al., 2013; Xue M.etal., 2013].

Таблица 1 - Влияние пектина (М<10, 10-20 Ша), фукоидана (М=75 Ша) и альгината натрия (М=1, 1-10 и 20-30 Ша) на развитие метастатического процесса у мышей-самок линии С 57В176 с каршшомой легких Льюис _

Группа наблюдения, доза препарата (количество животных) Частота метас-тази-рова-ния. % Количество метастазов на 1 мышь (Х±т) Площадь метастазов на 1 мышь (Х±га), мм2 НИМ, %

Пектин

1. Контроль (10) 100 50,20±2,06 97,91±20,32 -

2. Пектин (<10 kDa), 50 мг/кг (10) 100 35,00±3,67 1-2Р<0,01 128,98±27,68 30

3. Пектин (<10 kDa), 100 мг/кг (10) 100 38,70±3,88 1-ЗР<0,01 154,09±25,83 23

4. Пектин (10-20 kDa). 50 мг/кг (10) 100 29,60±2,63 1-4Р<0,05 126,43±30,58 41

5. Пектин (10-20 Ша), 100 мг/кг (10) 100 30,60±3,67 1-5Р<0,01 153,05±33,38 39

Фукоидан

1. Контроль (11) 100 30,09±2,49 30,61±7,00 -

2. Фукоидан, 50 от/кг (10) 100 21,10±1,91 1-2Р<0,05 21,58±5,04 30

3. Фукоидан, 100 от/кг (9) 100 20,00±2,52 1-ЗР<0,01 16,77±б,04 1-ЗР<0,01 34

Альпгаат натрия

1. Контроль, (10) 100 32,0±1,6 77,44±11,03 -

2. Альпгаат натрия (1 kDa), 100 мг/кг (10) 100 26,5±3,4 1-2Р<0,05 49.42±7,99 1-2Р<0,05 17

3. Альпгаат натрия (1-10 kDa), 50 мг/кг (9) 100 28,7±1,2 1-ЗР<0,05 30,05±3,92 1-ЗР<0,01 10

4. Альгинат натрия (1-10 kDa), 100 мг/кг (9) 100 24,б±2,1 1-4Р<0,01 37,07±7,39 1-4Р<0,01 23

5. Контроль (10) 100 27,80±2,01 60,84± 19,51 -

6. Альганат натрия (20-30 kDa), 100 мг/кг (10) 100 19,80±2,33 5-6Р<0,05 26,60±3,56 29

Таблица 2 - Влияние фукоидана (М=75 Ша) и альгината натрия (М= 20-30, 403 Ша) на эффективность противометастатического действия циюгофосфа-на у мышей-самок линии С57ВЬ/б с карциномой легких Льюис_|_

Группа наблюдения, лоза препарата (количество животных) Частота метас-тази-рова-ния, % Количество метастазов на 1 мышь (Х±т) Площадь метастазов на 1 мьппь (Х±т), мм2 НИМ, %

Фукоидан

1.ЦФ, 125 мг/кг (8) 100 10,88±1,13 3,11±0,42 64

2. ЦФ + фукоидан, 50 мг/кг (10) 100 5,56±0,50 1-2Р<0,01 1,22±0,37 1-2Р<0.01 82

3. ЦФ + фукоидан, 100 мг/кг (11) 100 6,36±0,61 1-ЗР<0,01 1,86±0,29 1-ЗР<0,05 79

Альгинат натрия

1. ЦФ, 125 мг/кг (10) 80 6,40±1,85 1,67±0,68 82

2. ЦФ + альгинат натрия (20-30 kDa), 50 мг/кг (10) 90 3,50±0,97 1,32±0,65 89

3. ЦФ + альгинат натрия (20-30 kDa), 100 мг/кг (10) 70 1,60±0,43 1-ЗР<0,05 0,11±0,03 1-ЗР<0.05 96

4. ЦФ + альгинат натрия (403 kDa), 50 мг/кг (10) 60 1,60±0,69 1-4Р<0,05 0,67±0,58 1-4Р<0,05 97

5. ЦФ + альгинат натрия (403 kDa), 100 мг/кг (10) 70 3,90*2,28 1,19±0,77 90

Другой механизм, приводящий к торможению роста опухоли, ингиби-ции процесса метастазирования и повышеш1ю эффективности химиотерапии под влиянием растительных полисахаридов, может быть опосредован активацией системы естественной резистентности, способствующей элиминации из организма трансформированных клеток. Развитие опухолевого процесса стимулирует Th2 тип иммунного ответа, полисахариды же способствуют «переключению» его на Thl, обеспечивая активацию антигенпрезентирую-щих механизмов, направленных на уничтожение опухолевых клеток [Iguchi C.et al., 2001; Shin J.Y. et al., 2002; Li B. et al., 2008; Лигачева A.A., 2010; Да-шшец М.Г., 2011; Jeong B.E. et al., 2012]. В литературе достаточно сведений об иммуномодулирующем действии пектинов, фукоиданов и альгинатов [Choi Е.М. et al., 2005; Inngjerdingen К.Т., 2005; Nergard C.S., 2005;Ye J. et al., 2005; Оводов Ю.С., 2009; Хотимченко Ю.С., 2010; Do H et al., 2010; Данилец М.Г.,2011].

Антиметастатическое действие полисахаридов, помимо активации иммунной системы организма, может быть связано с уменьшением процесса ан-гиогенеза в опухолевой ткани (неоангиогенеза), который способствует развитию метастазов на этапах инвазии и миграции опухолевых клеток. В литературе встречаются данные, свидетельствующие о способности полисахаридов подавлять проангиогенные факторы. К таковым относят: матричные метал-лопротеиназы, межклеточные регулируемые киназы, фосфоинозитид-3-

киназа, транскрипционный фактор NF-kp, фактор роста фибробластов и тромбоцитов, а также эндотелия сосудов [Mignatti P. et al., 1996; Nakahara Н. et al., 1997; Jain R. et al., 2001; Bhat-Nakshatri P. et al., 2002; Chambers A.F. et al., 2002; Smalley K.S.M., 2003; Suthiphongchai T. et al., 2003; Liao D. et al., 2006]. Предполагается, что одним из механизмов противометасгатического действия фукоидана является снижение активности ММР-2, которая через супрессию сигнальных путей PI3K-Akt-mTOR и NF-kB приводит к уменьшению синтеза опухолевыми клетками VEGF, а, следовательно, вызывает инги-бицию ангиогенеза и уменьшение интенсивности процесса метастазирования [Chetty С. et al., 2010; Lee Н. et al., 2012].

Противометастатическое действие полисахаридов может объясняться наличием у этих веществ антикоагулянтной активности [Кузнецова Т.А. и др., 2003; Лапикова Е.С. и др., 2012; Dore S.M. et al., 2013] и гиполипидеми-ческим действием [Knopp R.H. et al., 1999; Toeller М. et al., 1999; Кондратьева E.B., 2010; Кушнерова Т.В. и др., 2010; Brouns F. et al., 2012].

При развитии злокачественных новообразований увеличивается как концентрация катепсинов, так и их активность в различных тканях, свидетельствуя о неблагоприятном прогнозе заболевания [Hirai К. et al., 1999; Grubb А.О., 2000; Короленко Т.А. и др., 2004]. Помимо этого, цистеиновые катепсины участвуют в разрушении экстрацеллюлярного матрикса, что приводит к инвазивному росту опухолевых клеток [Koblinski J.E. et al., 2000; Flo-res-Resendiz D. et al., 2009].

Результаты экспериментов согласуются с данными о том, что фукоидан с молекулярной массой 40 kDa усиливает более чем в 2 раза антиметастатическую активность циклофосфана за счет влияния на активность катепсинов В, L и D [Жанаева С.Я. и др., 2009]. Не исключено, что повышение противо-метастатического действия химиотерапии некрахмальными полисахаридами может быть связано с угнетением неоангиогенеза за счет блокировки ими проангиогенных факторов [Smalley K.S.M., 2003; Suthiphongchai Т. et al., 2003; Ji N.F.et al., 2011; Zhang Z. et al., 2013].

В таблице 3 представлены обобщенные результаты скринингового исследования 10 образцов некрахмальных полисахаридов, проведенного в условиях изолированного введения и в комбинации с циклофосфаном на животных с перевиваемыми опухолями аденокарциномой Эрлиха и карциномой легких Льюис.

Следует констатировать тот факт, что некрахмальные полисахариды с различной молекулярной массой не оказывают однонаправленного действия на развитие опухолевого процесса.

Таким образом, анализ результатов исследования 10 образцов некрахмальных полисахаридов позволил определить наиболее перспективным для дальнейшего исследования альгинаты натрия с низкой молекулярной массой, которые тормозили рост АКЭ, а также повышали эффективность химиотерапии мышей с аденокарциномой Эрлиха и карциномой легких Льюис.

Таблица 3 - Влияние некрахмальных полисахаридов на развитие АКЭ, 3LL у мышей и эффективность лечения циклофосфаном_

АКЭ 3LL

Препарат, доза (мг/кг) ТРО Эффективность ТРО ТРМ Эффективность химиотерапии

химиотерапии Опухоль Метастазы

Пектин (М< 10 kDa) 50 100 ст - - + + - ст

Пектин (М= 10-20 kDa) 50 100 ст ст - - + + - ст

Пектин 50 (М=40 kDa) 100 - + + ; : -

Хитозан (М=50-190 kDa) 50 100 - + - - -

Хитозан (М=190-300 kDa) 50 100 - + + - - - -

Фукоидан (М=75 kDa) 50 100 - - + + + - + +

Альгинат 50 натрия (M=l kDa) 100 + - - + : -

Альгинат 50 натрия (М= 1 -10 kDa) 100 + + - - + + - -

Альгинат 50 натрия (М=20-30 kDa) 100 - + ; + - +

Альгинат натрия 50 (М=403 kDa) 100 + _ + - _ +

Примечание - «+» - наличие или «-» отсутствие эффекта; ст — стимуляция роста опухоли или метастазов.

Реакции системы крови у мышей при использовании альгипата натрия (М=1-10 и 20-30 kDa) в условиях цитостатичеекой терапии

Существующие в настоящее время цитостатические препараты не обладают избирательностью действия и оказывают выраженное токсическое влияние на нормальные интенсивно пролиферирующие ткани. Так, известно о гастроинтестинальной, иммуно-, оварио- и гепатотоксичности антибла-стомных препаратов [Ларионова В.Б. и др., 2004; Koster W. et al., 2004; Степанов Ю.М. и др., 2005; Боровская Т.Г. и др., 2007; Казюлин А.Н. и др., 2007; Скрипник И.Н. и др., 2007; Soares P.M. et al., 2008; Кудинова H.B., 2010]. Наиболее уязвимой является кроветворная ткань [Гольдберг Е.Д. и др., 2006; Дыгай A.M. и др., 2009, 2012; Федорова Е.П., 2011; Хмелевская Е.А., 2011]. В связи с этим в настоящее время при проведении цитостатичеекой терапии назначаются фармакологические препараты Г-КСФ (филграстим, ленограстим, пегфилграстим) и ГМ-КСФ (молграстим), восстанавливающие миелопоэз [Константинова М.М., 2002]. Однако они вызывают ряд побочных эффектов: кости о-мышечные боли, спленомегалию, аллергические реакции, тахикардию, падение артериального давления, отеки [Ruef С. et al., 1991; Vial Т. et al., 1995]. Кроме того, существуют литературные данные о том, что применение Г-КСФ может способствовать прогрессированию роста опухоли путем

стимуляции в ней ангиогенеза [Okazaki Т. et al., 2006]. В связи с вышеизложенным, остается актуальным поиск средств, снижающих токсичность цнто-статиков в отношении кроветворных клеток.

Для моделирования гемодепрессии бьш выбран циклофосфан, который наряду с высокой эффективностью обладает выраженной миелотоксично-стью [Удут Е.В. и др., 2007; Матяш М.Г., 2008, Дыгай A.M. и др., 2009; 2012]. Судя по результатам скринингового исследования, наиболее эффективно повышали противоопухолевое и антиметастатическое действие циклофосфана низкомолекулярные альгинаты натрия. Учитывая данные литературы о способности низкомолекулярных природных веществ активировать регенерацию гемопоэза [Chehg A. et al., 2008], проведено изучение влияния альгината натрия с молекулярной массой 1-10 kDa и 20-30 kDa на систему крови здоровых мышей и с опухолями на фоне химиотерапии.

Поскольку лимитирующим фактором применения цитостатиков чаще всего оказывается критическое состояние белого ростка кроветворения, на первом этапе исследования изучено влияние альгината натрия (М=1-Ю и 20-30 kDa) на миелоидный росток кроветворения в условиях однократного введения циклофосфана в дозе 125 мг/кг у здоровых животных и мышей с 3LL

В периферической крови мышей без опухоли, получавших изолированно альгинат натрия с молекулярной массой 1-10 kDa, развивался нейтро-филез и лимфоцитоз. Действие альгината натрия с молекулярной массой 20-30 kDa на показатели периферической крови здоровых мышей было незначительным и носило перераспределительный характер. На фоне развития глубокой гемодепрессии, вызванной однократным введением циклофосфана в дозе 125 мг/кг, использование альгината натрия с молекулярной массой 1-10 kDa приводило к отмене нейтропении на 1 сут после инъекции цитостатика.

В результате развития опухолевого процесса у мышей с карциномой легких Льюис в периферической крови регистрировался лейкоцитоз, преимущественно за счет сегментоядерных нейтрофилов. Полученные данные согласуются с литературными сведениями об увеличении общего количества лейкоцитов в периферической крови организма-опухоленосителя, главньм образом, за счет повышенного числа нейтрофилов [Антонеева НИ., 2007]. В костном мозге мышей с 3LL на протяжении всего эксперимента общее количество миелокариоцитов было ниже фонового значения, что свидетельствует об истощении костномозгового пула.

Под влиянием альгината натрия с молекулярной массой 1-10 и 20-30 kDa в периферической крови мышей с 3LL снижалась выраженность лейкоцитоза, возникающего в результате развития опухоли, при этом клеточность костного мозга у получавших альгинаты мышей не менялась, наблюдалось лишь перераспределение отдельных форм.

На 3 сут после однократной инъекции циклофосфана в дозе 125 мг/кг в периферической крови мышей с 3LL отмечалась выраженная лейкопения. Однако если в схеме химиотерапии использовался альгинат натрия с молекулярной массой 20-30 kDa, лейкопения на этот срок наблюдения не регистрировалась: выше оказалось как общее количество лейкоцитов, так и сегмен-

тоядерных нейтрофилов (в 2,6 и 3 раза). Аналогичные данные получены и на 7 сут после введения цитостатика: число клеток белой крови у мышей, получавших сочетанную терапию, превышало это значение у леченных одним ци-тостатиком. Следует отметить, что увеличение этого показателя было обусловлено повышенным содержанием сегментоядерных нейтрофилов. Картине периферической крови соответствовало состояние костномозгового кроветворения. Под влиянием альпшата натрия с молекулярной массой 1-10 kDa у мышей с 3LL выявлено повышение ОКК в костном мозге на 7 сут после инъекции цитостатика за счет незрелых и зрелых форм нейтрофильных грануло-цитов, что свидетельствует о стимулирующем действии полисахарида на клетки гранулошггарного ряда. В случае использования в схеме химиотерапии альпшата натрия с молекулярной массой 20-30 kDa отмечено также его защитное действие в отношении нейтрофильных гранулоцитов, о чем свидетельствовало повышенное число незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге мышей на 1 сут после введения циклофосфана.

Таким образом, следует констатировать, что назначение апьгинатов натрия с молекулярной массой 1-10 kDa и 20-30 kDa здоровым животным и с перевиваемой опухолью препятствует опустошению костного мозга и приводит к стимуляции процесса регенерации гранулоцитарного ростка кроветворения, поврежденного однократным введением цитостатика.

В литературе встречаются данные о способности нейтрофильных гранулоцитов фагоцитировать чужеродные антигены [Волкова М.А., 2001; Воробьев А.И., 2002]. Известно, что введение полисахаридов животным с опухолью приводит к активации антигенпрезентирующих клеток, которые являются ключевым звеном в каскаде иммунных реакций, направленных на уничтожение опухолевых клеток [Otterlei М et al., 1991; Fujihara М. et al., 1993; Данилец М.Г., 2011]. Возможно, увеличение числа сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови мышей с 3LL под влиянием альпшатов имеет значение в механизме повышения противоопухолевого действия цитостатика. Известно, что IL-1 индуцирует выработку колониестимулирующих факторов клеточными элементами гемопоэзиндуцирующего микроокружения (ГИМ), активирует пролиферацию стволовой кроветворной клетки, вследствие чего щггокин, вероятнее всего, играет ключевую роль в регенерации кроветворения при цитостатических гемодепрессиях. Кроме того, IL-1 стимулирует продукцию IL-6, обладающего свойством мульти-КСФ [Гольдберг Е.Д. и др., 2000]. Учитывая литературные данные о том, что в условиях in vitro использование полисахаридов с молекулярной массой 10 kDa приводит к активации макрофагов, повышая продукцию ряда цитокинов [Cheng A. et al., 2008], для дальнейшего изучения нами был выбран алъпшат натрия с молекулярной массой 1-10 kDa, под воздействием которого происходило ускорение восстановления основных показателей гемопоэза.

В клинической онкологии цитостатическое лечение больных со злокачественными новообразованиями, как правило, проводится курсами, а возникающая при этом длительная лейкопения является препятствием для проведения полноценной терапии. В связи с вышесказанным на следующем этапе

исследования представилось целесообразным изучить влияние альгината натрия на гемопоэз животных с опухолями на фоне длительной гемодепрессии, вызванной курсовым введением цитостатика. Ранее было показано, что введение циклофосфана в дозе 83,3 мг/кг (1/3 МПД) здоровым мышам приводило к угнетению костномозгового кроветворения [Хмелевская Е.С., 2011]. Наибольшей инпгоищш были подвержены клетки гранулоцитарного ростка кроветворения. Нами была создана новая биологическая модель умеренного торможения роста первичного опухолевого узла и метастазов у мышей с карциномой легких Льюис с сопутствующей продолжительной лейкопенией в периферической крови при 3-кратном введении циклофосфана в дозе 83,3 мг/кг. Так, в эксперименте обнаружено, что 3-кратное введите циклофосфана в дозе 83,3 мг/кг приводит к развитию длительной лейкопении, наиболее выраженной на 3 сут после каждой инъекции, за счет снижения количества лимфоцитов и сегментоядерных нейтрофилов.

При использовании в схеме химиотерапии альгината натрия гематологическая токсичность циклофосфана оказалась менее выраженной, о чем свидетельствовало достоверно большее ОКЛ и сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови мышей как на 5 сут после 1 инъекции цитостатика (в 2,0 и 3,2 раза соответственно), так и на 3 сут после 3 введения циклофосфана (в 1,6 и 1,9 раза соответственно). Анализ миелограмм животных с 3LL показал, что на фоне длительной депрессии костномозгового кроветворения, вызванной курсовым введением циклофосфана, использование альгината натрия привело к увеличению числа зрелых и незрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге мышей на 5 и 7 сут после 1 и 2 инъекции цитостатика, свидетельствуя о стимуляции гранулоцитарного ростка кроветворения. Кроме того, на 3 сут после 2, 3 введения цитостатика мышам с опухолью выявлено защитное действие этого образца полисахарида в отношении нейтрофильных гранулоцитов (Рисунок 1).

Изолированное введение животным с 3LL альгината натрия с молекулярной массой 1-10 kDa приводило к снижению лейкоцитоза, вызванного опухолевой прогрессией. Полученные результаты согласуются с литературными данными о том, что использование полисахаридов приводит к нормализации клеточного состава крови за счет активации провоспалительных механизмов [Сычев НА., 2008].

На миелограммах мышей с 3LL, получавших изолированно альгинат натрия, отмечалось увеличение количества гранулоцитарных нейтрофилов на 8, 10, 12, 22, 24 сутки и уменьшение числа лимфоцитов на 10, 12 и 24 сутки эксперимента относительно таковых у животных контроля.

70 60 50 и 40 2 30

о

20 )0

—о— Контроль —X— ЦФ+альгинат натрия

3 сутки 5 сутки 7 сутки 3 сутки 5 сутки

7 сутки 3 сутки 5 сутки 7 стуки

Рисунок 1 - Динамика содержания общего количества лейкоцитов (А) и сег-ментоядерных нейтрофилов (Б) в периферической крови мышей-самок линии С57В1/6 с карциномой легких Льюис под влиянием альгината натрия с молекулярной массой 1-10 Юа на фоне 3-кратного введения циклофосфана. Черным символом обозначена достоверность различия показателя по отношению к группе мышей, получавших один циклофосфан. Серым символом обозначена достоверность различия показателя по отношению к группе нелеченых животных.

Таким образом, назначение альгината натрия с молекулярной массой 110 Ша как здоровым животным, так и с ЗЫ, оказывает модулирующее действие на систему гемопоэза. При изолированном введении полисахарида животным с ЗЫ наблюдается снижение лейкоцитоза, вызванного развитием опухоли. В условиях курсового введения циклофосфана альгинат натрия препятствует угнетению костномозгового кроветворения, вызванного цито-статическим воздействием, а также способствует более быстрому восстановлению гранулоцитарного ростка кроветворения.

Важное место в механизме регуляции кроветворения занимает грану-лоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), действующий на про-

лиферацию и дифференцировку клеток-предшественников гранулоцитарного ростка кроветворения и стимулирующий продукцию зрелых нейтрофильных клеток [Волкова М.А., 2001; Gurion R. et al., 2011].

Принимая во внимание то, что наиболее значимое стимулирующее действие альгината натрия при изолированном использовании, а также в комбинации с циклофосфаном, было выявлено в отношении клеток гранулоцитарного ростка кроветворения, мы предположили, что этот эффект является результатом увеличения синтеза Г-КСФ клетками-продуцентами данного фактора у мышей с опухолью. Предложенная гипотеза была проверена в ходе следующего эксперимента, посвященного изучению влияния альгината натрия с молекулярной массой 1-10 kDa на уровень Г-КСФ в сыворотке крови мышей с 3LL в условиях 3-кратного введения циклофосфана в дозе 83,3 мг/кг. Так как результаты предыдущих исследований показали, что применение данного полисахарида на фоне 3-кратного введения циклофосфана приводит к стимуляции гранулоцитарного ростка кроветворения к 7 сут после инъекции цитостатика, нами были выбраны именно эти сутки наблюдения.

Иммуноферментный анализ определения концентрации Г-КСФ в сыворотке крови животных с 3LL показал, что на фоне развития опухоли использование альгината натрия как изолированно, так и в сочетании с циклофосфаном не приводило к изменению этого показателя.

Механизм регуляции гранулоцитарного ростка кроветворения заключается в непосредственном влиянии Г-КСФ на коммитарованные клетки-предшественники [Гольдберг Е.Д. и др., 1999; 2000]. Задачей следующего эксперимента было определить содержание гранулоцитарных предшественников (КОЕ-Г) у мышей с 3LL при введении циклофосфана.

При назначении альгината натрия животным с опухолью колониеобра-зующая активность предшественников гранулоцитопоэза не менялась. При совместном использовании альгината натрия с циклофосфаном наблюдалась стимуляция активности КОЕ-Г, подавленной антибластомным препаратом. Следовательно, один из возможных механизмов снижения гематотоксично-сти циклофосфана под влиянием альгината натрия может быть обусловлен его способностью стимулировать деление и созревание КОЕ-Г в костном мозге мышей с 3LL (Рисунок 2).

о 4,0 л ь

о>

§3,5-

+

2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 -

0,0

□ Исходный контроль (интакт) ■ Контроль (опухоль)

Ш ЦФ

И Альгинат натрия

□ ЦФ+альгннат натрия

Рисунок 2 - Влияние альгината натрия с молекулярной массой 1-10 kDa на содержание гранулоцитарных колониеобразующих единиц в культуре неад-гезирующих клеток костного мозга мышей с карциномой легких Льюис на 7 сут после однократного введения циклофосфана. По оси ординат - содержание КОЕ-Г в костном мозге (х 105 клеток).

+ Р<0,05 по сравнению с исходным контролем; * Р<0,05 по сравнению с контролем; ** Р<0,05 по сравнению с группой, получавшей цитостатик.

Имеются данные литературы о том, что природные полисахариды повышают функциональную активность клеток ГИМ через активацию макрофагов и синтез различных цитокинов, ответственных за пролиферацию и дифференцировку клеток-предшественников [Otterlei М. et al., 1991; Son E.H. et al., 2001; Yang D. et al, 2009; Liu P.J. et al., 2010].

Таким образом, при гемодепрессии, вызванной курсовым введением циклофосфана в дозе 83,3 мг/кг, использование альгината натрия с молекулярной массой 1-10 kDa приводит к стимуляции гранулоцитарного ростка кроветворения за счет активации клональной активности предшественников гранулоцитопоэза в костном мозге мышей с 3LL, в результате чего наблюдается увеличение количества нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге и периферической крови.

Проведенные эксперименты продемонстрировали, что альгинаты натрия с низкой молекулярной массой обладают защитными и гемостимули-рующими свойствами в отношении гранулоцитарного ростка кроветворения, подавленного циклофосфаном, и при этом не стимулируют развитие первичной опухоли и метастазов. Более того, при назначении мышам с перевивае-

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

мыми опухолями этих полисахаридов тормозится рост опухоли и ингибиру-ется процесс метастазирования.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод о том, что некрахмальные полисахариды, в частности, альгинаты натрия с молекулярной массой 1-10 и 20-30 Ша, являются перспективными для создания на их основе препаратов дополнительной терапии злокачественных новообразований, предназначенных для повышения эффективности химиотерапии, а также снижения гематотоксичности цигостатических препаратов.

ВЫВОДЫ

1. При скриниговом изучении влияния 10 образцов некрахмальных полисахаридов на развитие перевиваемых опухолей у мышей и эффективность лечения циклофосфаном выявлено, что наиболее перспективными с целью создания препаратов дополнительной терапии злокачественных новообразований являются фукоидан, высокомолекулярный и низкомолекулярный альгинат натрия (1-10 Ша и 20-30 Ша).

2 Назначение мышам альгината натрия с молекулярной массой 1, 1-10 и 403 Ша приводит к торможению роста аденокарциномы Эрлиха, использование пектина (40 Ша), фукоидана, альгината натрия (403 Ша) оказывает умеренное угнетающее влияние на рост первичного опухолевого узла карциномы легких Льюис.

3. Ингибирующее влияние на процесс метастазирования карциномы легких Льюис оказывает фукоидан, а также пектин (<10 и 10-20 Ша) и альгинат натрия (1, 1-10 и 20-30 Ша).

4. Повышают противоопухолевую активность циклофосфана пектин (40 Ша), альгинат натрия (20-30 Ша), хитозан (50-190 и 190-300 Ша). Усиливают противометастатическое действие циклофосфана фукоидан и альгинат натрия (20-30 и 403 Ша).

5. Стимулирует рост аденокарциномы Эрлиха пектин с молекулярной массой <10 и 10-20 Ша. Снижается эффективность лечения циклофосфаном мышей с аденокарциномой Эрлиха при использовании высокомолекулярного альгината натрия (403 Ша), уменьшается противоопухолевое и противометастатическое действие циклофосфана под влиянием пектина с молекулярной массой <10 и 10-20 Ша.

6. Альгинат натрия с молекулярной массой 1-10 Ша снижает токсическое влияние циклофосфана на систему крови здоровых мышей и с карциномой легких Льюис как при однократном, так и курсовом введении, препятствуя опустошению костного мозга и стимулируя восстановление гранулоцитарного ростка кроветворения.

7. На фоне гемодепрессии, вызванной курсовым введением циклофосфана, альгинат натрия с молекулярной массой 1-10 Ша стимулирует кло-нальную активность предшественников гранулощггопоэза (КОЕ-Г) в костном мозге мышей с карциномой легких Льюис.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зуева, Е.П. Разработка фармакологических средств на основе модифицированных некрахмальных полисахаридов для использования в терапии злокачественных новообразований / Е.П. Зуева, Т.Г. Разина, С.Г. Крылова, E.H. Амосова, К.А. Лопатина, Л.А. Ефимова, Е.А. Сафонова, О.Ю. Рыбалкина // Материалы итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». - М„ 2009. - С. 195-196.

2. Рыбалкина, О.Ю. Влияние фукоидана из морской бурой водоросли Laminaria japónica на развитие перепиваемых опухолей и эффективность цитостатической терапии / О.Ю. Рыбалкина, Т.Г. Разина, Е.П. Зуева, Ю.С. Хотимченко // Новые горизонты: инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении: Материалы IX российско-немецкой научно-практической конференции форума им. Р. Коха и ИИ Мечникова. — Новосибирск, 2010. - С. 192-194.

3. Дыгай, A.M. Система отбора природных соединений для использования в онкологической практике. Опыт работы Института фармакологии СО РАМН/А.М. Дыгай, Е.П. Зуева, Т.Г. Разина, E.H. Амосова, С.Г. Крылова, К.А. Лопатина, Л.А. Ефимова, Е.А. Сафонова, О.Ю. Рыбалкина // Тихоокеанский медицинский журнал. — 2010. — № 2. - С. 10-15.

4. Разина, Т.Г. Влияние пектинов с различной молекулярной массой на развитие аденокарциномы Эрлиха и карциномы легких Льюис и эффективность циклофосфана у мышей / Т.Г. Разина, Е.П. Зуева, E.H. Амосова, С.Г. Крылова, М.Ю. Хотимченко, К.А. Лопатина, Л.А. Ефимова, Е.А. Сафонова, О.Ю. Рыбалкина // Тихоокеанский медицинский журнал. -

2010.-№2.-С. 32-36.

5. Разина, Т.Г. Влияние фукоидана из морской бурой водоросли Laminaria japónica на развитие аденокарциномы Эрлиха и карциномы легких Льюис и эффективность циклофосфана у мышей / Т.Г. Разина, Е.П. Зуева, E.H. Амосова, С.Г. Крылова, М.Ю. Хотимченко, К.А. Лопатина, Л.А. Ефимова, Е.А. Сафонова, О.Ю. Рыбалкипа // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2010. - № 2. - С. 36-39.

6. Зуева, Е.П. Влияние хитозанов с различной молекулярной массой на развитие аденокарциномы Эрлиха и эффективность циклофосфана у мышей / Е.П. Зуева, Т.Г. Разина, E.H. Амосова, С.Г, Крылова, К.А. Лопатина, ЛА. Ефимова, Е.А. Сафонова, О.Ю. Рыбалкина // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2010. - № 2. - С. 82-84.

7. Рыбалкипа, О.Ю. Перспективы использования некрахмальных полисахаридов в комплексной терапии злокачественных опухолей / О.Ю. Рыбалкина, М.Ю. Хотимченко // Сибирский онкологический журнал. —

2011,-Прпл. 1.-С.100-101.

8. Разина, Т.Г. Сравнительная оценка эффективности различных форм аль-гинатов в условиях онкологического эксперимента / Т.Г. Разина, О.Ю. Рыбалкина, К.А. Лопатина, E.H. Амосова, Е.П. Зуева, М.Ю. Хотимченко, Ю.С. Хотимченко И Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2011. - Т. 152, № 8-С. 191-196.

9. Рыбалкина, О.Ю. Некрахмальные полисахариды как перспективные источники средств комплексной терашш опухолей / О.Ю. Рыбалкина, М.Ю. Хотимченко // Сибирский онкологический журнал. - 2012. -Прил. 1.-С. 133-134.

Ю.Рыбалкпна, О.Ю. Влияние некрахмальных полисахаридов с разной молекулярной массой на развитие карциномы легких Льюис у мышей и эффективность цитостатической терапии / О.Ю. Рыбалкина, Т.Г. Разина, К.А. Лопатина, E.H. Амосова, С.Г. Крылова, Л.А. Ефимова, Е.А. Сафонова, Е.П. Зуева, М.Ю. Хотимченко, Ю.С. Хотимченко // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2012. - Т. 154, № 10. - С. 488-494.

П.Сафонова, Е.А. Перспективы использования полисахаридов растений в комплексной терашш злокачественных новообразований / Е.А. Сафонова, Т.Г. Разина, Е.П. Зуева, К.А. Лопатина, Л.А. Ефимова, А.М. Гурьев, О.Ю. Рыбалкина, Ю.С. Хотимченко // Экспер. и клин. фарм. - 2012. - Т. 75, № 9. - С. 42-47.

12.Рыбалкина, О.Ю. Перспективы создание препаратов для дополнительной терапии опухолей на основе фукоидана из морской бурой водоросли Laminaria japónica (ARESCH) / О.Ю. Рыбалкина // Сибирский онкологический журнал. — 2013. — Прил. 1. — С. 78—79.

13. Рыбалкина, О.Ю. Сравнительная оценка эффективности альгинтатов с различной молекулярной массой в онкологическом эксперименте / О.Ю. Рыбалкина, М.Ю. Хотимченко II Вестник Российского государственного медицинского университета. — Спец. вып. 1.— 2013, — С. 152—153.

14. Рыбалкина, О.Ю. Поиск новых фармакологических средств на основе модифицированных некрахмальных полисахаридов для использования в комплексной терашш опухолей / О.Ю. Рыбалкина // Материалы первой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств». - М, 2013.—С. 104.

15. Рыбалкина, О.Ю. Разработка фармакологических средств на основе модифицированных некрахмальных полисахаридов для повышения эффективности химиотерапии опухолей / О.Ю. Рыбалкина // Материалы первой Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века». - М, 2013. -С. 310-311.

Патент на изобретение

Пат. 2488173 Российская Федерация. Способ создания биологической модели умеренного торможения роста опухоли и метастазов карциномы легких Льюис с продолжительной циклофосфаниндуцированной лейкопенией у мышей / О.Ю. Рыбалкина, H.H. Ермакова, Т.Г. Разина и др.; заявители и патентообладатели ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН. — Опубл. 20.07.2013, Бюл. № 20. - 7 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АКЭ - аденокаршшома Эрлиха

ГИМ — гемопоэзиндуцирующее микроокружение

Г-КСФ — гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

Ш-КСФ — гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирую-

щий фактор

ним — индекс ингибирования метастазирования

КОЕ-Г — гранулоцитарная колониеобразующая едшгаца

мпд — максимально переносимая доза

ОКК — общая клеточноеть костного мозга

ОКЛ — общее количество лейкоцитов

ТРО — торможение роста опухоли

ТРМ — торможение роста метастазов

ЦФ — циклофосфан

3LL — карцинома легких Льюис

Akt — киназа Akt

IL — interleukins, интерлейкин

ММР - матричная металлопротеиназа

mTOR — киназа mTOR

NF-kB — nuclear transcription factor kB, ядерный фактор

PI3K — phosphoínositol-3- kinasa, фосфоинозитид-3-киназа

VEGF — фактор роста эндотелия сосудов

Тираж 110 экз. Заказ 86. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники. 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40. Тел. (3822) 533018.