Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Характеристика паттернов информативных лабораторных показателей развития системного воспалительно-инфекционного процесса у больных с тяжелыми термическими травмами

На правах рукописи

ФИЛИППОВА Юлия Юрьевна

ХАРАКТЕРИСТИКА ПАТТЕРНОВ ИНФОРМАТИВНЫХ ЛАБОРАТОРНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ РАЗВИТИЯ СИСТЕМНОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНО-ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА У БОЛЬНЫХ С ТЯЖЕЛЫМИ ТЕРМИЧЕСКИМИ ТРАВМАМИ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 о агр т

Челябинск-2013

005052074

Работа выполнена на кафедре микробиологии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинский государственный университет»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, Бурмистрова Александра Леонидовна

профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, доцент Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской Академии наук, заведующий

лабораторией иммунологии воспаления Гусев Евгений Юрьевич

доктор биологических наук, профессор ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения РФ, заведующий

кафедрой биологической химии Цейликман Вадим Эдуардович

Ведущая организация: Научно исследовательский институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской Академии наук, г. Пермь

Защита состоится «-/?» щу^С-Я^ 2013 года в _часов на заседании

диссертационного совета Д 208. 117. 03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Автореферат разослан «7^» ;//?£/->*/?, 2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Латюшина Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Ожоги - одна из самых распространенных и разрушительных форм травмы. По данным Всемирной организации здравоохранения термические поражения занимают 3 место среди прочих травм, в России на их долю приходится 10-11% случаев [Алексеев A.A., 2001; Тарасов А.Е., 2009]. 75% пациентов с тяжелыми ожогами (более 40% общей поверхности тела) умирают от сепсиса, вызванного инфекцией ожоговой раны и/или от развивающегося синдрома полиорганной недостаточности (ПОН) [Church D., 2006; Venet F., 2007; Dries D.J., 2009; Fu Y., 2012]. Как отмечает H.A. Гординская (2008): «практически каждого больного с обширными глубокими ожогами следует рассматривать как потенциально септического с первых суток после травмы». В настоящее время сепсис характеризуется как комплексный иммунный ответ, который варьирует во времени и демонстрирует поляризацию цитокиновой экспрессии:

1) в раннюю фазу - системный гипервоспалительный ответ на фоне потери компетенции основных эффекторов врожденного иммунного ответа -клеток миелоидно-фагоцитарной системы (МФС) (главным образом, способности к партнерству и кластрированию в создании очага локального воспаления) при тяжелых ожоговых травмах;

2) в позднюю фазу - гиперпродукцию противовоспалительных цитокинов в ассоциации с выраженным апоптозом клеток врожденного и адаптивного иммунных ответов [Гусев Е.Ю., 2009; Levy М.М., 2003; Greenhalgh D.G., 2007; Miller A.C., 2007].

Цитокины являются важными регуляторами иммунных процессов, и их продукция осуществляется клетками многих типов, прежде всего, моноцитами и нейтрофилами [Бурмистрова А.Л., 1997; Долгушин И.И., 2001; Cone J.B., 2001; Yeh F.L., 2002; Cassatella М.А, 2009; Zhang X., 2009; Silva M.T., 2010; Mantovani A., 2011]. Однако в условиях системного воспаления основную роль в создании системных цитокиновых полей различной поляризации и выраженности берут на себя клетки эндотелия [Cepinskas G., 2008; Hickey M.J., 2009], в то время как мононуклеары (МПК) и нейтрофилы (НПК) периферической крови выступают больше не в качестве организаторов локального очага классического воспаления, а в роли мишеней активных биологических молекул, включая цитокины сыворотки крови, молекулы микробных паттернов и т.д., то есть теряют свойства чрезвычайно значимые для защиты организма от инфекции [Hotchkiss R.S., 2003; Brown К.А., 2006].

Анализ литературы, посвященной вопросам дестабилизации цитокинового гомеостаза при ожоговой болезни, показал, что большинство исследований направлено на мониторирование уровней цитокинов в сыворотке крови на протяжении с 1-х по 28-е сутки после ожога, в зависимости от клинико-лабораторных параметров пациентов, в том числе: площади ожоговой поверхности, глубины поражения, вида колонизирующих и (или) инвазирующих ожоговую рану микроорганизмов и т.д., которые могли бы стать

основой построения прогностической кривой [Шлык И.В., 2009; Feezor R.J., 2003; Gauglitz G., 2008; Shefold J.C., 2009]. К сожалению, ожидания не принесли желаемых результатов.

Нами был выбран другой подход - комплексная оценка цитокиновой составляющей и растворимой формы триггерного рецептора, экспрессируемого на миелоидных клетках 1 типа (soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1 - sTREM-1), сыворотки крови и цитокинового ответа клеток МФС больных с тяжелой термической травмой в период после ожогового шока (3-6 сутки после травмы) и период септикотоксемии (10-17 сутки после ожога), с последующей интерпретацией полученных показателей в зависимости от данных ретроспективной оценки тяжести течения и исхода ожоговой болезни (25-40 сутки - дни наблюдения) [Филиппова Ю.Ю., 2011]. Выбор временных точек был основан на результатах исследований авторов [Алексеев A.A., 2001; Гординская H.A., 2008; Лыков A.B., 2009; Levy М.М., 2003] о наибольшем риске развития сепсиса у обожженных в период с 7 по 14 сутки после ожога (по типу септического шока), либо спустя месяц и более после поражения при длительном существовании инфицированных ожоговых ран.

К сожалению, несмотря на достигнутые успехи в области комбустиологии, многие вопросы, касающиеся патогенетических механизмов развития сепсиса при ожоговой болезни, изучены недостаточно, а результаты работ часто носят дискуссионный характер. Об этом свидетельствует рост частоты возникновения сепсиса, ежегодное увеличение количества летальных исходов у септических больных, недостаточная эффективность терапевтических мероприятий, что приводит к большим экономическим затратам и оставляет актуальными дальнейшее исследование комплексных механизмов, вовлеченных в развитие сепсиса при ожоговой болезни, поиск ранних предикторов развития сепсиса, его осложнений и исхода, и идентификацию новых терапевтических мишеней [Brun G.J., 2006; Church D„ 2006; Dejager L., 2011].

Цель исследования

Оценить комплекс иммунологических лабораторных показателей, характеризующих развитие системного воспалительно-инфекционного процесса у больных с тяжелой термической травмой в ранний период ожоговой болезни и соотнести полученные результаты с данными ретроспективного наблюдения - развитием сепсиса, тяжестью течения (сепсис/осложненный сепсис) и его исходом (выжил/не выжил).

Задачи исследования

1. Оценить концентрацию цитокинов (IL-6, IL-8, TNF-a, IFN-y, IL-lß, IL-lRa, IL-10, IL-18, IL-2, IL-4) и sTREM-1 в сыворотке крови больных на 3-6 (период после ожогового шока) и 10-17 (период септикотоксемии) сутки после тяжелой термической травмы и выявить возможную взаимосвязь между их уровнями и моно/смешанным инфицированием ожоговой раны.

2. Провести сравнительный анализ уровней цитокинов и sTREM-1 в сыворотке и супернатантах активированных и интактных мононуклеаров и

нейтрофилов периферической крови доноров и пациентов с тяжелыми ожогами на 3-6 и 10-17 сутки после травмы.

3. Определить уровень секреции цитокинов мононуклеарами и нейтрофилами периферической крови ожоговых больных на 3-6 и 10-17 сутки после травмы в зависимости от тяжести (сепсис/осложненный сепсис) и исхода (выжил/не выжил) ожоговой болезни, с помощью нелинейного анализа главных компонент по алгоритму САТРСА.

4. По результатам оценки содержания цитокинов и sTREM-1 в сыворотке крови ожоговых больных выделить прогностические лабораторные маркеры риска развития осложненного сепсиса и его исхода.

Научная новизна

Впервые показано, что в ранние сроки ожоговой болезни высокие уровни растворимой формы триггерного рецептора, экспрессированного на миелоидных клетках 1 типа (sTREM-1) в сыворотке крови пациентов с тяжелыми термическими поражениями ассоциируются со смешанным инфицированием ран, что может использоваться в предиктовой небактериологической лабораторной диагностике в качестве дополнительного критерия генерализации инфекционного процесса.

С помощью нелинейного анализа методом главных компонент нами впервые показано:

1. сетевое взаимодействие цитокинов, как базовая составляющая иммунобиологических процессов, может быть описано различными профилями, характерными для определенных состояний — цитокиновый гомеостаз/патобиологический процесс: в ранние сроки ожоговой болезни (после периода ожогового шока) — это комплексный гиперпродуктивный профиль системного цитокинового поля, важной составляющей которого является кластер провоспалительных цитокинов нейтрофилов периферической крови; в период септикотоксемии - функциональная обособленность цитокиновых партнеров врожденного иммунитета — мононуклеаров и нейтрофилов, друг от друга и от влияния на них системного цитокинового поля.

2. ранняя (до развития клинической картины сепсиса) поляризация секреции (высокая/низкая) некоторых цитокинов в условиях in vitro у двух важных эффекторов иммунного ответа - мононуклеаров и нейтрофилов периферической крови, по отношению друг к другу, ассоциирована с последующим развитием сепсиса и его исходом: у выживших - высокий уровень секреции мононуклеаров, низкий — нейтрофилов, у не выживших, в противовес, - высокий уровень секреции нейтрофилов и низкий -мононуклеаров.

Определено, что предиктовыми биомаркерами летального исхода сепсиса при ожоговой болезни могут являться высокие уровни цитокинов в сыворотке крови пострадавших: IL-10 на 3-6 сутки и IL-6 на 10-17 сутки после ожога.

Впервые, на основании комплексного анализа иммунологических параметров пациентов с тяжелыми ожогами, разработана модель, позволяющая

стратифицировать индивидуальный риск развития осложненного сепсиса на 1017 сутки после травмы, до появления клинических симптомов сепсиса.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные данные расширяют представление о пластичности функциональных свойств нейтрофилов и мононуклеаров периферической крови в условиях стресса. Показано, что уровень поляризации секреции основных цитокинов клетками больных с тяжелой термической травмой (оценка in vitro) на ранних стадиях ожоговой болезни ассоциирован с последующим развитием сепсиса (сепсис/осложненный сепсис) и его исходом (выжил/не выжил).

Определены лабораторные маркеры летального исхода ожоговой болезни на ранних сроках, до развития клинических признаков сепсиса - достоверно высокие уровни цитокинов в сыворотке крови: IL-10 на 3-6 сутки после травмы и IL-6 на 10-17 сутки после травмы.

Установлено, что на ранних сроках развития ожоговой болезни уровень sTREM-1 в сыворотке крови ожоговых больных, может служить небактериологическим маркером смешанного инфицирования ожоговой раны.

Предложена математическая модель, определяющая комплекс показателей: цитокинов — IL-6, IL-ip, IFN-y, и sTREM-1 сыворотки крови ожоговых больных, которые могут быть использованы для определения индивидуального риска развития септических осложнений на 10-17 сутки после травмы.

Положения, выносимые на защиту

1. Определен комплекс информативных иммунологических параметров, характеризующих развитие системного воспалительно-инфекционного процесса у больных с тяжелыми термическими травмами, и выделен ряд паттернов лабораторных показателей, которые могут использоваться на ранних сроках ожоговой болезни (до появления клинических симптомов сепсиса) в качестве маркеров прогноза течения (сепсис/осложненный сепсис) и исхода (выжил/не выжил).

2. Высокие уровни растворимой формы триггерного рецептора, экспрессированного на миелоидных клетках 1 типа (sTREM-1) в сыворотке крови пострадавших в ранний период ожоговой болезни ассоциированы со смешанным инфицированием ожоговых ран и могут применяться в качестве дополнительных предиктовых небактериологических показателей генерализации инфекционного процесса.

Внедрение результатов исследования

Результаты работы используются в учебном процессе: при преподавании курса «Иммунный гомеостаз в норме и при патологии» в магистерской программе «Медико-биологические науки» на кафедре микробиологии биологического факультета ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет».

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены на XIII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика

В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009 г.); Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология -практическому здравоохранению» (Москва, 2010 г.); Областной научно-практической конференции «Инфекции кровяного русла» (Челябинск, 2010 г.); VIII конференция иммунологов Урала (Сыктывкар, 2010 г.); Межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии — междисциплинарные проблемы» (Санкт-Петербург, 2010 г.); XV Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2010 г.); IX конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2011 г.); II Международной научно-практической конференции «Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологий» (Екатеринбург, 2011 г.); Национальной конференции «Клиническая иммунология и аллергология — практическому здравоохранению» (Москва, 2012 г.).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, включает семь рисунков, девять таблиц. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глав материалы и методы исследования, и результаты собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка литературы, включающего работы 45 отечественных и 97 иностранных авторов, и приложения, включающего 10 таблиц.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 22 печатные работы из них 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Контрольная группа была сформирована случайным образом среди практически здоровых доноров крови ОГУП «Челябинская областная станция переливания крови», состояла из 11 женщин и 19 мужчин в возрасте от 20 до 48 лет (средний возраст 32,3 ± 3,4 года).

Группа больных была сформирована за период с 2007г. по 2010г. совместно с заведующим отделением анестезиологии и реаниматологии для ожоговых больных МБУЗ ГКБ №6 Угнивенко М.И. и состояла из 63 больных. Среди обследованных было 46 мужчин и 17 женщин в возрасте от 15 до 61 года (средний возраст 37,2 ± 1,8 года). Все обследованные имели глубокие комбинированные ожоги II-IIIA, Б, IV степени тяжести с площадью поражения от 12 до 50% общей поверхности тела. Повреждающим фактором являлось пламя. Для интегральной оценки тяжести травмы использовали Индекс тяжести поражения [Парамонов Б.А., 2000]. В исследование были включены больные с Индексом тяжести поражения от 30 до 110 условных единиц.

Всем пациентам проводилось комплексное клинико-лабораторное обследование, в ходе которого оценивалось общее состояние больных, течение

раневого процесса, характер температурной кривой, данные клинических, биохимических анализов крови, мочи и бактериологических исследований. Мониторинг микробиологического состояния крови, раневого отделяемого и биоптатов ожоговых ран пациентов с тяжелыми термическими травмами, проводился на протяжении всего периода нахождения больного в стационаре, в бактериологической лаборатории МБУЗ ГКБ № 6 (заведующая - к.м.н. Бахарева Л.И.) в соответствии с Приказом № 535 от 22.04.1985г. МЗ СССР «Об унификации микробиологических/бактериологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях ЛПУ». В соответствии с положениями согласительной конференции Американской ожоговой ассоциации [ОгеепЬа^Ь О.в., 2007] микробиологический диагноз «колонизация ожоговой раны» ставился при количестве микроорганизмов в ране < 105 Колониеобразующих единиц (КОЕ)/грамм ткани, при количестве бактерий КОЕ > 105 на грамм ткани был поставлен диагноз «инфекция ожоговой раны». Концентрация микроорганизмов в ране в количестве < 103 КОЕ/грамм ткани не учитывалась и оценивалась как транзиторная микрофлора.

На основании комплексного клинико-лабораторного обследования 54 пациентам на 20-30 сутки после ожога был поставлен диагноз «сепсис» на фоне длительно существующих инфицированных ожоговых ран. У 6 больных развился только синдром системного воспалительного ответа (ССВО). 6 ожоговых больных (10%) умерли на 25-40 сутки после травмы. У 3 пострадавших на 8-10 сутки после ожога был диагностирован септический шок с летальным исходом, поэтому показатели, полученные при иммунологическом обследовании данных больных, не вошли в нашу работу. Диагноз «ССВО», «сепсис», «септический шок» ставился на основании положений Чикагской согласительной конференции (1992) и согласительной конференции Американской ожоговой ассоциации (2007).

В соответствии с поставленными задачами - выявление ранних маркеров прогноза течения ожоговой болезни (сепсис/осложненный сепсис) и ее исхода (выжил/не выжил) у больных были определены иммунологические показатели на 3-6 сутки после ожога (период после ожогового шока) и на 10-17 сутки после травмы (период септикотоксемии), до появления клинических симптомов сепсиса. По данным ретроспективной оценки тяжести течения и исхода ожоговой болезни мы распределили всех больных на 7 групп (диагноз был поставлен на 20-30 сутки, дни наблюдения - с 1 по 40 сутки нахождения больного в стационаре): 3-6 день: группа 1 - «ССВО - выжили», группа 2 -«сепсис - выжили», группа 3 - «сепсис с ПОН - выжили», группа 4 - «сепсис с ПОН - умерли»; 10-17 день: группа 5 - «сепсис - выжили», группа 6 - «сепсис с ПОН - выжили», группа 7 - «сепсис с ПОН - умерли». У 22 больных изучаемые показатели были определены в динамике на 3-6 и 10-17 дни после травмы. С помощью методов математического моделирования был проведен поиск закономерностей между установленными иммунологическими параметрами и течением и исходом ожоговой болезни. Во всех исследуемых группах были определены - общее количество лейкоцитов, показатели лейкоцитарной формулы, содержание цитокинов: 1Ь-6, ТОТ-а, 1Ь-8, 1Ь-1(3,

IL-lRa, IFN-y, IL-2, IL-4 и IL-18 («Вектор Бест», Новосибирск), IL-10 («Biosourse», USA), и растворимой формы TREM-1 («R&D Systems», USA) в сыворотке крови и в супернатантах интактных (и) и активированных (а) живыми бактериями Escherichia coli (Е. coli) МПК и НПК. Время инкубации составляло 2 часа (НПК) и 24 часа (НПК и МПК) [Dowsett S.A., 1997; Tateda К., 2003; Bergman М., 2004]. Окончательный выбор времени культивирования был определен на основании предварительных данных: при 24-часовой инкубации у доноров и, в еще большей степени, у больных отмечались большие межиндивидуальные разбросы значений показателей, что приводило к нивелированию различий. Поэтому, в работе мы использовали данные об уровне цитокинов в супернатантах НПК через 2 часа культивирования.

Выделение МПК и НПК проводили на двойном градиенте плотности фиколла («Pharmacia», Sweeden) и урографина («Schering», Germany) (р=1,077-1,078 г/см3:1,093-1,095 г/см3). Для активации клеток использовали Е. coli АТСС® штамм 25922 (получен из ГИСК им. JI.A. Тарасевича), однодневную культуру, в соотношении бактерии: лейкоциты - 10:1.

Уровни всех исследуемых цитокинов и sTREM-1 определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа согласно инструкции производителей. Результаты считывали на планшетном анализаторе «MultiscanEX» («Labsystems», Финляндия).

Уровни цитокинов: IL-4 и IL-2 в сыворотке крови больных имели значения ниже чувствительности тест-систем и были исключены из исследования. Концентрация цитокина IL-18 была определена в сыворотке крови и супернатантах клеток только у 33 пострадавших с тяжелой термической травмой и 9 доноров, поэтому, полученные данные не были включены в основную математическую модель.

При оценке функциональной активности НПК мы определяли не только уровни цитокинов в супернатантах культивированных клеток, но и их бактерицидную активность (киллинг живых Е. coli при 2-часовом взаимодействии in vitro). Оценка бактерицидной активности нейтрофилов проводилась по методу С.Д. Дугласа, П.Г. Куи (1983), путем подсчета колоний Е. coli, выросших на среде Эндо после двухчасового взаимодействия с НПК в среде Хенкса in vitro. Несмотря на полученные данные о том, что на 10-17 сутки после травмы умершие больные имели достоверно низкую бактерицидную активность НПК (высокую выживаемость E.coli) по сравнению с остальными группами больных, особенности используемых статистических методов не позволили нам включить эти данные в общую математическую модель.

Методы статистической обработки данных. В ходе статистической обработки данных использовали порядковые статистики и критерии: для оценки центральной тенденции - расчет медиан и 25-75 квартилей, для оценки значимости межгрупповых различий - критерий Краскела - Уоллиса с апостериорными парными сравнениями по Коноверу - Инману.

В связи со сложностью механизмов, лежащих в основе развития септических состояний у тяжелых ожоговых больных, нами был применен математический подход с использованием многомерных методов статистического анализа. В качестве разведывательной техники был применен многомерный эксплораторный анализ методом нелинейных главных компонент по алгоритму САТРСА [Van der Kooij, Meulman, 1999]. При этом данные обрабатывались как количественные показатели с последующим ранжированием; для принятия решения о числе необходимых и достаточных компонент руководствовались критериями Кэттелла, Кайзера и «сломанного стержня» («broken stick»). Для упрощения решения использовалось вращение «варимакс» (недокументированные возможности пакета SPSS) [Факторный... анализ, 1989]. Использование этого метода позволяет произвести редукцию множественных данных с обобщением, нивелируя межиндивидуальные различия, а также определить неявные, но объективно существующие закономерности и тенденции развития изучаемых процессов, когда наблюдаемые объекты обладают большим разнообразием разнонаправленных и скрытых взаимосвязей между их признаками [Konig R., 2002; Gorban А., 2007; Manisera М., 2010].

Для прогнозирования риска развития осложнений болезни использовали аппарат множественной логистической регрессии. Для определения конкретного значения показателя, который позволяет разделить больных на пациентов с моно- и смешанной инфекцией ожоговой раны использовали ROC-анализ (Receiver Operating Characteristic Analysis) с вычислением площади под ROC-кривой и «точки отсечения» (cut off value) - значение показателя, которое делит исследуемых больных на искомые группы. Все расчеты и графические построения выполнены в пакетах SPSS for Windows (v. 15.0., SPSS Inc.), MedCalc (v. 10.2.0) и KyPlot (v. 2.0 beta 15; Yochioka, 2002). Во всех случаях различия и зависимости считали статистически значимыми при Р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Особенности формирования системного воспалительно-инфекционного ответа у больных с тяжелыми травмами в ранние сроки развития ожоговой болезни и поиск ранних маркеров смешанного микробного инфицирования ожоговых ран

Для решения первой задачи мы провели сравнительный анализ показателей лейкоцитарной формулы и уровней некоторых цитокинов (IL-6, TNF-a, IL-8, IL-lß, IL-lRa, IFN-y, IL-18 и IL-10) и sTREM-1 в сыворотке крови доноров и пациентов с тяжелой термической травмой на 3-6 и 10-17 сутки после ожога (Табл. 1). У пациентов на 3-6 сутки после травмы были выражены 3-4 клинических и лабораторных признака ССВО, включая лейкоцитоз и, дополнительно — достоверно высокие уровни цитокинов IL-6, TNF-a, IL-8, IL-18, IL-lß, IL-lRa и sTREM-1 в сыворотке крови по сравнению с группой доноров. К 10-17 суткам картина практически не изменялась, что соответствует данным других авторов [Greenhalgh D.G., 2007; Pileri, 2008] (табл. 1).

Известно, что проявления и выраженность ССВО при ожоговой травме во многом определяется характером раны: площадью поражения, глубиной поражения, и ее инфицированием [Church, 2006]. Поэтому мы проанализировали результаты бактериологических исследований: выраженность инфицирования и видовое разнообразие этиологически значимых микроорганизмов в ожоговых ранах пациентов с тяжелыми термическими поражениями на 3-6 и 10-17 сутки после травмы. Было показано, что колонизация поверхности ран развивается уже с 1-2 суток после травмы. К 6 суткам диагноз «инфекция ожоговой раны» был поставлен 69% обследованных (25 человек из 36). Одновременное развитие в ране нескольких видов возбудителей было определено у 25% пациентов (9 человек из 36). На 1017 сутки после травмы количество больных с инфицированием ожоговой раны не изменялось. Количество пациентов со смешанным инфицированием ожоговых ран увеличивалось до 43%. Основными возбудителями раневой инфекции являлись: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp. Ha 10-17 сутки после травмы происходило расширение ассортимента микроорганизмов в ожоговой ране, за счет: Klebsiella pneumoniae и Enterococcus faecium. Смешанная инфекция была представлена, в основном, ассоциацией S. aureus и P. aeruginosa или S. aureus совместно с Acinetobacter spp., что согласуется с данными ряда авторов: Меньшиков Д.Д., 2009; Шлык И.В., 2009; Wysocki А.В., 2002; Boekema В.К., 2012; Fu Y., 2012.

Мы обратили внимание, что к 10-17 суткам после травмы почти в половине случаев (43%), микробный пейзаж ожоговых ран представлен в виде ассоциантов. По данным авторов: Вельского 1999, Clark N.M., 2003, Weber J., 2004, одновременное развитие в ране нескольких возбудителей приводит к суммированию их болезнетворных возможностей и вызывает взаимное усиление вирулентности ассоциантов. В настоящее время в ряде работ показано, что высокие уровни sTREM-1 в сыворотке крови связаны с наличием инфекционного процесса [Gibot, 2004; Ford, 2009], однако, данные о том, является ли sTREM-1 показателем тяжести инфекционного процесса (микст инфекция) носят дискуссионный характер. Поэтому, мы оценили изменение уровней цитокинов и sTREM-1 в сыворотке крови пациентов с тяжелой термической травмой в зависимости от моно- и смешанной инфекции ожоговой раны с целью выявления ранних небактериологических маркеров смешанного микробного инфицирования. Результаты исследований показали, что в сыворотке крови у больных со смешанным инфицированием ожоговой раны был достоверно повышен уровень sTREM-1 по сравнению с пациентами с моноинфекцией, не зависимо от дня исследования. С помощью ROC-анализа мы оценили диагностическую значимость уровней sTREM-1 в сыворотке крови и определили конкретные значения этого показателя, которые могут быть использованы в качестве маркеров небактериологической диагностики смешанного микробного инфицирования. Результаты исследования показали, что уровень sTREM-1 в сыворотке крови: выше 298,8 пг/мл (на 3-6 сутки после травмы) и выше 294,2 пг/мл (на 10-17 сутки после ожога) может являться

Таблица 1

Уровень 1Ь-6, "ШР-а, 1Ь-8,1Ь-1р, 1Ь-111а, 1Ь-18,1Ь-10 и бТЯЕМ-! в сыворотке крови доноров и ожоговых больных

на 3-6 и 10-17 сутки после травмы

название 1Ь-6 ЮТ-а 1Ь-8 1Ь-10 1Ь-та 1Ы8 1Ы0 нТКПМ-!

группы

Доноры (п=17) 2,76 1,63 186,80 0,10 305,70 203,60 0,01 121,20

(0,97-7,22) (0,01-13,21) (38,86-412,50) (0,01-0,58) (120,90-437,40) (175,60-304,00) (0,01-0,03) (92,23-164,50)

и 3-6 день 132,40* 46,47* 433,24* 4,51* 1502,20* 311,50 0,01 248,55*

я (п=36) (67,97-205,40) (10,91-131,50) (237,88-955,13) (1,02-6,94) (1153,00-3878,80) (206,20-359,80) (0,01-2,16) (181,35-309,20)

с; 10-17 день 95,90* 13,80*/** 375,65* 2,66* 1666,50* 513,90*/** 0,01 254,80*

ю (п=46) (48,25-218,40) (1,95-69,61) (179,74-1078,10) (0,67-7,36) (1166,20-3568,80) (388,40-616,20) (0,01-2,93) (183,70-332,60)

Примечание: данные представлены в виде медианы (25-75 квартилей); * - различия между донорами и больными (р<0,05),** - различия между ожоговыми больными на 3-6 и 10-17 сутки после травмы (р<0,05).

Таблица 2

Уровень 1Ь-6,1Ь-1р, ТОТ-а и 1Ь-10 в супернатантах нейтрофилов и мононуклеаров периферической крови ожоговых _больных на 10-17 сутки после ожога, в зависимости от тяжести и исхода болезни_

Груп Клинический П.-6 1ЫР ЮТ-а 1Ь-6 1Ь-10

пы диагноз/исход аНПК аНПК аНПК иМПК аМПК иМПК аМПК

боль

ных

5 сепсис - выжили 750,50 258,95 828,60 23660,00 21940,00 47,26 37,19

(п=28) (261,15-1530,60) (104,10-467,60) (492,80-1511,00) (15776,00-55400,00) (11080,00-49000,00) (22,09-200,20) (4,86-107,50)

6 сепсис, 105,20* 101,00* 324,60* 31012,00 30944,00 18,13 97,46

осложненный ПОН - выжили (п=8) (58,36-221,10) (22,90-147,50) (148,60-469,20) (15070,00-38120,00) (19348,00-38348,00) (13,45-37,41) (64,59-116,90)

7 сепсис, 492,80** 417,20** 949,20** 4368,00Л 2736,00л/** 1,02л 0,01л/**

осложненный ПОН -умерли (п=5) (476,90-943,80) (163,68-940,00) (610,40-1212,00) (355,70-19686,00) (1534,00-9758,00) (0,21-6,68) (0,01-0,65)

Цитокины НПК МПК

Примечание: представлены только цитокины, по которым наблюдаются достоверные различия. Данные представлены в виде медианы (25-75 квартилей); Группы, 10-17 сутки: 5 - сепсис - выжили, 6 - сепсис с ПОН - выжили, 7 - сепсис с ПОН - умерли. МПК - мононуклеары периферической крови; НПК - нейтрофилы периферической крови; и - интактные клетки, а - активированные клетки * - достоверные различия между группами 5 и 6 (р<0,05), ** - различия между группами 6 и 7 (р<0,05). л - различия между группами 5 и 7 (р<0,05).

предиктовым маркером небактериологической диагностики смешанного инфицирования ожоговых ран. В 2007г. Gibot S. было продемонстрировано, что высокие уровни TREM-1 зарегистрированы у мышей с летальным исходом при полимикробном сепсисе.

Комплексный анализ цптокиновой составляющей сыворотки крови и цитокинового потенциала лейкоцитов периферической крови в группах доноров и ожоговых больных в зависимости от развития и исхода системного воспалительно-инфекционного процесса

Для решения второй и третьей задачи мы провели оценку паттерна цитокиновых показателей при тяжелых термических травмах. Для комплексного анализа использовали эксплораторный анализ данных методом нелинейных главных компонент по алгоритму САТРСА, что позволило произвести редукцию множественных данных с обобщением, нивелируя межиндивидуальные различия, и определить неявные закономерности и тенденции развития изучаемых процессов [Konig R., 2002; Gorban А., 2007; Manisera М., 2010]. Достоверность различий между показателями была подтверждена с использованием теста Краскела-Уоллиса.

Этап 1. Поиск взаимозависимых влияний показателей цитокинов сыворотки и клеток (МПК и НПК) друг на друга в условиях физиологического гомеостаза (доноры) и при патобиологическом процессе — тяжелая термическая травма (больные на 3-6 и 10-17 сутки после ожога) (Для наглядности результаты представлены в виде рисунков - рис. 1).

В результате анализа и в группе доноров, и в группе больных выделено 3 паттерна взаимосвязанных показателей цитокинов (Главные компоненты: ГК1, ГК2, ГКЗ). Каждый паттерн представлен комбинацией цитокинов из 2-3 источников: цитокины сыворотки, цитокины, секретируемые МПК или НПК, с доминированием показателей цитокинов из одного источника (показатели образуют корреляционные связи высокой силы), который дает название паттерну «МПК», «НПК» и «сыворотка» (рис. 1). Рассматривая биологический смысл описанных данных, можно сказать, что цитокины, выделяемые в среду культивирования МПК и НПК, отражают характер локальных цитокиновых полей, а цитокины сыворотки крови - системного цитокинового поля. Таким образом, используя метод нелинейных главных компонент, мы рассматриваем партнерство клеток МФС и сыворотки в создании цитокиновых сетей, как основы работы врожденного и адаптивного иммунных ответов в условиях физиологического гомеостаза и патобиологических состояний.

1.1. состояние физиологического гомеостаза — доноры:

1) Первый («МПК») и второй («НПК») паттерны демонстрируют, с большей или меньшей степенью выраженности, состояние партнерства МПК и НПК в создании локального цитокинового поля (в состав паттерна «МПК» входят 6 показателей цитокинов НПК (IL-6, TNF-a, IL-8, IFN-y, IL-IRa), в состав паттерна «НПК» — 2 показателя цитокинов МПК (IL-10, IFN-y), при незначительном участии цитокинов сыворотки (рис. 1).

2) Третий паттерн «сыворотка» состоит из 5 изученных показателей цитокинов сыворотки, и практически не включает показатели цитокинов МПК и НПК, т.е. несет отпечаток автономности (рис.1).__

«МПК» (ГК1) «НПК» (ГК2) «Сыворотка» (ГКЗ)

Доноры /л-4 \ /\ / П.-Я \ / \ 1 1лт" ЛтЛ 1 П.-1К» 1Н11К\ \ тч-т / \\1 «НИК \(Ы1о|И11ш ШШ/ N. У \ГЫВ01МТ*Я /СивопоткиЧ X о.-<. \ /\ 11-8 Д . 1 ТМ7-! I \ ¡7 /V 1Ы1<а пик / мттк

Модули цитокиновой активности на 3-6 сутки после травмы

Ожоговые больные [, ) мпк и 11ПК',/ 'у у' \гы»вряти (, ) НПК ( х) /М 'ыво|ЮТКа\ / \ 1Ы. /\ Щ ^ { \ 1/ / юр \\1 V / П_-|Ка V/ /V /\ НПК/ N. ТЛГМЛ/ \>шк

Модули цитокиновой активности на 10-17 сутки после травмы

/(Ц _1ШК/ N. У ^«..оро™ ( НПК Г] У 1 ивярчтч. / Сыворотка \ / П.-6 /\ 1 П'"! \ 1 1 \ у \ п""'(1 У» N. У У>птк_

Рис. 1 Структура взаимосвязей показателей цитокинов сыворотки и цитокиновой активности МПК и НПК доноров и ожоговых больных на разные сутки после травмы, полученная в результате анализа нелинейных главных компонент

Примечание: МПК - мононуклеары периферической крови (оранжевый цвет); НПК -нейтрофилы периферической крови (голубой цвет); сыворотка (желтый цвет); а - клетки, активированные живой Е. соН.

1.2. патобиологическое состояние - тяжелая термическая травма:

1) Первый паттерн - «МПК». Начиная с 3 суток и включая 17 сутки от травмы (дни оценки иммунологических показателей) выраженно снижаются партнерские связи между показателями цитокинов МПК и НПК, за счет уменьшения количества показателей цитокинов НПК, включенных в паттерн (с шести показателей до одного). Возможно, это является отражением деструкции локального цитокинового поля МПК (рис.1).

2) Развитие патобиологического процесса - ожоговая болезнь, не нашло отражения на 3-6 сутки в характере второго паттерна («НПК»), который, по сути, не отличается от аналогичного паттерна доноров. Однако на 10-17 сутки (период септикотоксемии) для паттерна характерна автономность показателей цитокинов НПК, не имеющего никаких связей с показателями цитокинов МПК, т.е. наблюдается расщепление партнерства (рис. 1).

3) Третий паттерн - «сыворотка» - демонстрирует наиболее значимые изменения в ходе патобиологического процесса. Во-первых, паттерн на 3-6

сутки от травмы начинает включать показатели всех изученных цитокинов и sTREM-1 сыворотки крови (с высокой силой связи); во-вторых, несет выраженный комплексный характер, демонстрируя корреляционные связи между показателями цитокинов из трех источников, в большей степени между НПК (IL-8, IFN-y, IL-lRa) и сывороткой, что, возможно, отражает состояние -«цитокиновый шторм» (рис. 1), основанием для такого предположения служат высокие уровни цитокинов и sTREM-1 в сыворотке крови (табл. 1).

Более того, результаты работ ряда исследователей [Casatella М.А., 1999; Nathan С., 2006; Mantovani А., 2011], свидетельствуют, что цитокины IL-8, IL-lRa и IFN-y (именно показатели этих цитокинов участвуют в кооперации двух кластеров: НПК и сыворотка - рисунок 1) запасаются в везикулах нейтрофилов и выделяются практически немедленно при действии различных агентов, однако эти события, как считают авторы [Brown К.А., 2006; Hickey M.J., 2009], не происходят (или происходят в минимальной степени) в циркуляции при физиологических и, вероятно, при патобиологических условиях, но хорошо выражены при классическом воспалении. Возможно при ожогах, в условиях выраженного ССВО, нейтрофилы попадают под события «цитокинового шторма» и дают выброс цитокинов. К 10-17 суткам - характер паттерна «сыворотка» кардинально меняется: снижается количество показателей цитокинов сыворотки, имеющих связи высокой силы, а сами показатели принадлежат только провоспалительным цитокинам, и полностью исчезают показатели цитокинов НПК, т.е. из комплексного он переходит в состояние автономности, что является, как можно предположить, «образом пограничного состояния».

Таким образом, нелинейный анализ главных компонент позволяет, с определенной мерой условности, охарактеризовать состояния: физиологический цитокиновый гомеостаз/патобиологический цитокиновый профиль:

1. Физиологический цитокиновый гомеостаз - это активный процесс, для которого характерны партнерские отношения между МПК и НПК при незначительном участии в них цитокинов сыворотки крови.

2. В ранний период ожоговой болезни (3-6 сутки, период после ожогового шока) гиперпродуктивный тип системного цитокинового поля поддерживается локальным цитокиновым полем НПК (IFN-y, IL-8, IL-lRa) и в меньшей степени — МПК (два показателя TNF-a).

3. Для периода септикотоксемии (10-17 сутки после ожога) характерен процесс обособления локальных цитокиновых полей МПК и НПК друг от друга и от системного цитокинового поля сыворотки крови. Возможно, это является отражением «пограничного состояния», во многом определяющего дальнейшее течение ожоговой болезни (развитие сепсиса/сепсиса с синдромом ПОН), а также исход (выжили/не выжили).

Этап 2. Выявление профилей цитокиновой активности НПК и МПК на 3-6 и 10-17 сутки ожоговой болезни в зависимости от тяжести и исхода сепсиса у ожоговых больных.

В результате анализа главных компонент выделено 2 профиля цитокиновой активности клеток (два паттерна показателей — ГК1 и ГК2): мононуклеарный и нейтрофильный. Распределение групп пациентов с разной тяжестью течения и исходом сепсиса в пространстве главных компонент позволило выявить следующие особенности (рис. 2):

1) На 3-6 сутки после ожога больные с неосложненным и осложненным ПОН течением сепсиса имели четкие различия по профилю цитокиновой активности лейкоцитов периферической крови (рис. 2).

В "

а

~ 0.-1

НПТПМ1НЫ

мононуклсаров

Шттгря штжпновоЛ яктвногт моко|пк1п)р«в (ГК1)

ТЬттгрн 1 (ГК1)

Рис. 2 Ординационная диаграмма Рис. 3. Ординационная диаграмма показателей цитокиновой активности показателей цитокинов сыворотки лейкоцитов периферической крови крови ожоговых больных с разной ожоговых больных в зависимости от тяжестью течения и исходом тяжести течения и исхода болезни болезни

Примечание: графическое изображение результатов нелинейного анализа главных компонент; аНПК - нейтрофилы периферической крови, активированные Е.соН. Группы ожоговых больных: 3-6 сутки: 1 - ССВО - выжили, 2 -сепсис - выжили, 3 - сепсис с ПОН - выжили, 4 - сепсис с ПОН - умерли; 10-17 сутки: 5 - сепсис - выжили, 6 - сепсис с ПОН - выжили, 7 - сепсис с ПОН - умерли. Цифрами показано распределение групп пациентов с разной тяжестью течения и исходом сепсиса в пространстве главных компонент. На рис. 2 полученные паттерны делят рисунок на 4 сектора, в каждом из которых преобладает свой вид цитокиновой активности: верхний левый сектор - нейтрофильный; нижний правый сектор - мононуклеарный; верхний правый сектор - и нейтрофильный и мононуклеарный, нижний левый сектор - отсутствие цитокиновой активности клеток. На рис. 3 «О» по оси X делит группы ожоговых больных по наличию/отсутствию у них показателей, вошедших в паттерн 1 (ГК1): группы, расположенные в положительной части оси имеют наиболее высокие уровни показателей цитокинов, вошедших в паттерн 1, в отрицательной части оси - наиболее низкие уровни показателей. «О» по оси У делит группы ожоговых больных по наличию/отсутствию в них показателей, вошедших в паттерны 2 и 3 (ГК2 и ГКЗ): группы, расположенные в положительной части оси имеют наиболее высокие уровни показателей цитокинов, вошедших в паттерны 2 и 3, в отрицательной части оси -наиболее низкие значения показателей.

Пациенты, у которых течение ожоговой болезни на 20-30 сутки после травмы было осложнено сепсисом с синдромом ПОН - группы 3 и 4 (вне зависимости от исхода болезни), имели более низкие уровни нейтрофильной и

мононуклеарной цитокиновой активности (достоверные различия - только по уровню IL-1|3 аНПК, данные не показаны) по сравнению с больными без осложнений (группы 1 и 2) (рис. 2).

2) На 10-17 сутки после ожога группы пациентов с разной тяжестью течения (наличие/отсутствие осложнений) и исходом сепсиса (выжили/умерли) имели уникальные прописи профилей цитокиновой активности лейкоцитов периферической крови (рис. 2, табл. 2). Ожоговые больные, у которых на 20-30 сутки после травмы развился сепсис без осложнений (группа 5), имели высокие уровни мононуклеарной и нейтрофильной цитокиновой активности (Рис. 2). Цитокиновый профиль умерших пациентов (группа 7), имел полярный характер по отношению к показателям цитокинов МПК и НПК группы 6 (сепсис, осложненный ПОН - выжили), и характеризовался самой низкой цитокиновой активностью МПК (достоверно снижены уровни цитокинов: IL-6 и IL-10, в супернатантах аМПК) и высокой цитокиновой активностью НПК (значимо высокие уровни цитокинов: IL-6, TNF-a, IL-ip, выделяемые в среду культивирования аНПК) (рис. 2, табл. 2).

Таким образом, с помощью нелинейного анализа главных компонент показано наличие зависимости между тяжестью и исходом системного воспалительно-инфекционного процесса и степенью цитокиновой активности клеток МПК и НПК в условиях in vitro, у пострадавших с тяжелой термической травмой до развития полной клинической картины сепсиса: на 10-17 сутки после ожога у не выживших (смерть на 25-40 сутки) резко снижена цитокиновая активность аМПК и повышена - аНПК, по сравнению с цитокиновой активностью аналогичных клеток выживших больных. Как отмечает Brown К.А. (2006), снижение функциональной активности (прежде всего, цитокиновой) мононуклеаров на фоне чрезмерной активации нейтрофилов может привести к развитию септических осложнений и летальному исходу, в том числе и у ожоговых больных.

Цитокины сыворотки и sTREM-1 в качестве ранних прогностических лабораторных маркеров тяжести и исхода сепсиса у ожоговых больных

Для решения четвертой задачи и на основании результатов, полученных при выполнении второй и третьей задач исследования, мы предприняли попытку выделить прогностические лабораторные маркеры риска развития осложненного сепсиса и его исхода при ожоговой болезни.

Применение метода главных компонент и теста Краскела-Уоллиса позволило выделить паттерны информативных показателей цитокинов в сыворотке крови, которые могут использоваться в качестве предиктовых лабораторных маркеров прогноза течения ожоговой болезни - развитие сепсиса, осложненного ПОН, и ее летального исхода в ранние сроки после травмы (3-17 сутки) (рис. 3). Как видно из ординационной диаграммы (рис. 3), исследуемые показатели распределились по 3 паттернам: первый паттерн -очерчивает комплекс показателей цитокинов сыворотки крови — IL-8, TNF-a, IL-ip, IL-10, высокие уровни которых (достоверно - уровень цитокина IL-10 -3,67 : 0,01 пг/мл) характерны для группы 4, т.е. на 3-6 сутки после травмы они

могут являться лабораторными маркерами летального исхода ожоговой болезни после развившегося сепсиса с синдромом ПОН (25-40 дни после ожога).

Второй и третий паттерны включали показатели цитокинов сыворотки крови: IL-IRa, IL-6, IFN-y, и sTREM-l(pHc. 3), высокие концентрации которых (достоверные различия по уровню цитокина IL-6 - 175,7 и 196,2 : 81,6 пг/мл) характерны для групп 6 и 7, т.е. для раннего периода ожоговой болезни (10-17 сутки от травмы), осложненной развитием сепсиса с синдромом ПОН, не зависимо от исхода патологического процесса (сравнение показателей групп 6, 7 с группой 5).

Таким образом, высокие уровни цитокинов - IL-10 на 3-6 сутки и IL-6 на 10-17 сутки, у больных с тяжелой ожоговой травмой (Р<0,05 по сравнению с группой выживших) могут являться причинными агентами и лабораторными биомаркерами плохого прогноза — развитие тяжелого, осложненного ПОН, сепсиса и летального исхода.

В свете этого, с помощью ROC—анализа мы попытались определить конкретные значения концентрации IL-10 и IL-6 в сыворотке крови ожоговых больных, которые могли бы служить маркерами летального исхода. К сожалению, малые выборки в группах умерших, не позволили нам выявить данные показатели.

Тогда мы оценили риск развития септических осложнений (развитие синдрома ПОН) у больных на 10-17 сутки после ожога по уровню IL-6, по которому наблюдались статистически значимые различия. ROC-анализ показал, что уровень IL-6 >184,6 пг/мл как диагностический маркер осложнений имеет низкую чувствительность и специфичность (60% и 77%). Поэтому мы решили построить математическую модель прогноза риска развития септических осложнений, в основу которой были взяты показатели, полученные в результате анализа главных компонент (а именно показатели, вошедшие в паттерны 2 и 3 и IL-1(3 из первого паттерна) с помощью метода бинарной логистической регрессии. Путем логистического регрессионного анализа рассчитано, что комплекс, включающий четыре информативных показателя: уровни sTREM-1 и цитокинов: IL-6, IL-ip, IFN-y, в сыворотке крови, позволяет стратифицировать индивидуальный риск развития сепсиса, осложненного ПОН, при ожоговой болезни на 10-17 сутки после тяжелой термической травмы. Вероятность развития осложненного сепсиса в ранние сроки ожоговой болезни определяется по формуле:

Логит{ Р)= -2,5915 +0,009Х, +0,078Х2 -0,321Х3 +0,004X4

где X], Х2, Х3, X), - концентрация IL-6, IFN-y, IL-1(3 и sTREM-1 в сыворотке крови конкретного больного.

Получив значение Логит(Р), можно вычислить значение вероятности отнесения больного к группе риска развития осложнений (Р) по формуле:

Р =

где е - математическая константа = 2,718281828

Если Р<0,5 пациента следует причислить к группе 0 (отсутствие риска развития осложнений), если Р>0,5 - к группе 1 (наличие риска развития ПОН при сепсисе у ожоговых больных). Полученная модель риска развития осложнений при ожоговой болезни высоко статистически значима (р=0,0012),обладает высокой диагностической эффективностью (86,96%).

Таким образом, на основе математической модели множественной логистической регрессии, включающей комплекс трех показателей цитокинов -IL-6, IL-ip, IFN-y, и sTREM-1 сыворотки крови, можно уже на 10-17 сутки после ожога дать персонифицированный прогноз риска развития септических осложнений у больных с тяжелой термической травмой.

Полученные нами результаты свидетельствуют о перспективности проведения дальнейших исследований в данном направлении, а расширение спектра лабораторных маркеров позволит улучшить предиктовую диагностику сепсиса у ожоговых больных.

ВЫВОДЫ

1. Предиктовым методом небактериологической диагностики смешанного инфицирования ожоговых ран на ранних сроках ожоговой болезни, до развития клинической картины сепсиса, является оценка уровня sTREM-1 в сыворотке крови: на 3-6 сутки после травмы - выше 298,8 пг/мл, на 10-17 сутки после ожога - выше 294,2 пг/мл.

2. Использование эксплораторного анализа данных методом нелинейных главных компонент позволило показать:

2.1. В ранний период ожоговой болезни (период после ожогового шока) гиперпродуктивный тип системного воспалительного поля может быть охарактеризован как «цитокиновый шторм» и поддерживается локальным цитокиновым полем нейтрофилов периферической крови (IFN-y, IL-8, IL-IRa). В период септикотоксемии инициируется процесс обособления локальных цитокиновых полей мононуклеаров и нейтрофилов друг от друга и от системного цитокинового поля сыворотки, что, возможно, определяет в дальнейшем тяжесть ожоговой болезни (сепсис/осложненный сепсис) и ее исход (выжил/не выжил).

2.2. Отмечен полярный характер секреции цитокинов (высокий/низкий) между мононуклеарами и нейтрофилами периферической крови пострадавших в условиях in vitro в зависимости от исхода ожоговой болезни: на 10-17 сутки после травмы у не выживших наблюдался достоверно высокий уровень секреции цитокинов активированными нейтрофилами (IL-6, IL-ip, TNF-a) и низкий - активированными мононуклеарами (IL-6, IL-10), в противовес - у выживших - секреция цитокинов низкая у активированных нейтрофилов (IL-6, IL-ip, TNF-a) и высокая у активированных мононуклеаров (IL-6, IL-10), при сравнении друг с другом.

3. Биомаркерами плохого прогноза ожоговой болезни - сепсис с синдромом полиорганной недостаточности, летальный исход, могут являться достоверно высокие уровни цитокинов в сыворотке крови: IL- 10 на 3-6 сутки и IL-6 на 10-17 сутки от термической травмы.

4. С помощью логистического регрессионного анализа разработана математическая модель, позволяющая на 10-17 сутки после травмы, до появления клинических симптомов сепсиса, на основе показателей уровней цитокинов: IL-6, IL-lß, IFN-y, и sTREM-1 в сыворотке крови ожоговых больных оценить индивидуальный риск развития септических осложнений.

Практические рекомендации

В качестве дополнительного лабораторного маркера смешанного инфицирования ожоговых ран может быть предложен уровень sTREM-1 в сыворотке крови: на 3-6 сутки после травмы - выше 298,8 пг/мл, на 10-17 сутки после ожога - выше 294,2 пг/мл.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бурмистрова, A.JI. Общая и внутриклеточная выживаемость живых E.coli при взаимодействии с нейтрофилами ожоговых больных и продукция цитокинов в среде культивирования / A.JI. Бурмистрова, Ю.Ю. Филиппова, М.И. Угнивенко, С.С. Шестопалов //Аллергология и иммунология. - 2008. -Т.9, № 3. - С. 320.

2. Филиппова, Ю.Ю. Ассоциация синдрома системной воспалительной реакции (SIRS) с полиморфизмами гена HLA-DRB-1 / Ю.Ю. Филиппова, Е.И. Лупарь, Е.П. Конева, М.И. Угнивенко, O.A. Струнина, С.С. Шестопалов, A.JI. Бурмистрова // Вестн. Челябинского гос. ун-та. - 2008. - № 4 (105). - С. 27-28.

3. Филиппова, Ю.Ю. Бактерицидная активность нейтрофилов при «SIRS-I», «SIRS-III» и сепсисе у ожоговых больных / Ю.Ю. Филиппова, М.И. Угнивенко, С.С. Шестопалов, A.JI. Бурмистрова, Т.Г. Бондаренко // Вестн. Челябинского гос. ун-та. - 2008. - № 4(105). - С. 23-27.

4. Бурмистрова, A.JI. Распределение аллелей и генотипов гена IL-IRa у ожоговых больных с синдромом системного воспалительного ответа / A.JI. Бурмистрова, Е.П. Конева, Ю.Ю. Филиппова, Т.А. Суслова, Д.С. Сташкевич // Медицинская иммунология. - 2009. — Т.11, № 4-5. - С. 456.

5. Бурмистрова, A.JI. Уровень экспрессии генов HLA-DRA,-DMA,CIITA у ожоговых больных с синдромом системного воспалительного ответа (SIRS) / A.JI. Бурмистрова, Е.П. Конева, Ю.Ю. Филиппова, М.И. Угнивенко, Т.А. Суслова //Аллергология и иммунология. - 2009. - Т. 10, № 2. - С. 231.

6. Конева, Е.П. Оценка уровня экспрессии генов HLA-DRA,-DMA и СИТА у ожоговых больных с септическими состояниями / Е.П. Конева, Т.А. Суслова, Ю.Ю. Филиппова, М.И. Угнивенко, A.JI. Бурмистрова // Вестн. гематологии. - 2009. - Т.5, № 4. - С. 34-35.

7. Угнивенко, М.И. Уровни цитокинов в среде культивирования нейтрофилов ожоговых больных в зависимости от стадии развития сепсиса / М.И. Угнивенко, Ю.Ю. Филиппова, Е.П. Конева, Н.Е. Самышкина, Т.А. Суслова, С.С. Шестопалов, A.JI. Бурмистрова // Мед. иммунология. - 2009. -Т.11,№4-5.-С. 463.

8. Филиппова, Ю.Ю. Провоспалительные/протвовоспалительные цитокины в сыворотке крови ожоговых больных в различные стадии развития сепсиса / Ю.Ю. Филиппова, А.Л. Бурмистрова, М.И. Угнивенко, Е.П. Конева,

Н.Е. Самышкина, Т.А. Суслова, С.С. Шестопалов // Мед. иммунология. - 2009. -Т.11,№4-5.-С. 464.

9. Бурмистрова, A.JI. Диагностическая значимость определения растворимого триггерного рецептора, экспрессируемого на миелоидных клетках — 1, как маркера сепсиса у ожоговых больных / А.Л. Бурмистрова, Ю.Ю. Филиппова, М.И. Угнивенко, Е.П. Конева, Н.Е. Самышкина, И.А. Кочергина, И.А. Скорик // Рос. аллергологический журн. - 2010. - Вып.1, №5. -С. 59-60.

10. Бурмистрова, А.Л. Оценка бактерицидной активности и секреции цитокинов лейкоцитами периферической крови на ранней стадии развития ожоговой болезни / А.Л. Бурмистрова, Ю.Ю. Филиппова, М.И. Угнивенко, Н.Е. Самышкина, И.А. Кочергина, И.А. Скорик // Известия Самарского науч. центра Рос. акад. наук. - 2010. - Т. 12 (33), №1 (7). - С. 1722-1725.

11. Бурмистрова, А.Л. Оценка цитокинового профиля ожоговых больных при синдроме системного воспалительного ответа в зависимости от тяжести и исхода болезни. / А.Л. Бурмистрова, Ю.Ю. Филиппова, М.И. Угнивенко, Е.П. Конева, Н.Е. Самышкина, Т.А. Суслова, Д.Ю. Нохрин, И.А. Скорик // Рос. аллергологический журн. —2010. —Вып.1, № 1. —С. 34-35.

12. Бурмистрова, А.Л. Содержание некоторых цитокинов в сыворотке крови ожоговых больных с сепсисом, вызванным грам-позитивной и грам-негативной флорой / А.Л. Бурмистрова, Ю.Ю. Филиппова, М.И. Угнивенко, Е.П. Конева, Н.Е. Самышкина, И.А. Кочергина, Л.И. Бахарева, C.B. Андреева, И.А. Скорик // Вестн. Уральской мед. академической науки. - 2010. - № 2/1 (29). - С. 103-104.

13. Конева, Е.П. Распределение полиморфизмов генов ИЛ-ip и ИЛ-1Ра среди ожоговых больных с сепсисом / Е.П. Конева, Ю.Ю. Филиппова, М.И. Угнивенко, Д.С. Сташкевич // Вестн. Уральской мед. академической науки. - 2010. - № 2/1 (29). - С. 151-152.

14. Конева, Е.П. Экспрессия генов HLA в норме и патологии / Е.П. Конева, А.Л. Бурмистрова, Т.А. Суслова, М.И. Угнивенко, Ю.Ю. Филиппова, И.В. Шмунк // Материалы межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 75-летию службы крови Челябинской области. Актуальные вопросы клинической и производственной трансфузиологии. — Челябинск, 2010.-С. 127-128.

15. Бурмистрова, А.Л. Уровни циркулирующих цитокинов у ожоговых больных с септическим шоком до и после продолжительной веновенозной гемофильтрации / А.Л. Бурмистрова, И.А Кочергина, Ю.Ю. Филиппова, И.А. Худяков, Н.Е. Самышкина, И.А.Скорик // Вестн. Уральской мед. академической науки. - 2011. - № 2/2 (35). - С. 12-13.

16. Филиппова, Ю.Ю. Лабораторные маркеры в качестве предикторов различных фаз развития и исхода сепсиса у ожоговых больных / Ю.Ю. Филиппова, А.Л. Бурмистрова, М.И. Угнивенко, Е.П. Конева, Е.В. Семенов, Л.И. Бахарева, П.С. Садовников // Достижения, инновационные направления,

перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологий: материалы II Международной науч.-практ. конф. 15 декабря 2011 г. -Москва, 2011. -С. 227-229.

17. Филиппова, Ю.Ю. Цнтокнны как предиктовые маркеры летального исхода у ожоговых больных на стадии сепсиса / Ю.Ю. Филиппова, М.И. Угнивенко, Е.П. Конева, Н.Е. Самышкина, И.А Кочергина, И.А. Скорик // Вестн. Уральской мед. академической науки. —

2011.-№2/1 (35).-С. 211-212.

18. Бурмистрова, АЛ. Дестабилизация гомеостаза организма ожоговых больных как маркер развития сепсиса, его осложнений и исхода / A.JI. Бурмистрова, Ю.Ю. Филиппова, М.И. Угнивенко, Д.Ю. Нохрин, Е.П. Конева, Л.И. Бахарева // Журн. микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. - 2012. - №4. - С. 109-113.

19. Бурмистрова, A.JI. Нелинейный анализ главных компонент в оценке вклада цитокиновой активности лейкоцитов периферической крови в развитие сепсиса у ожоговых больных / A.JI. Бурмистрова, Ю.Ю. Филиппова, М.И. Угнивенко, Е.П. Конева, И.А. Кочергина // Рос. аллергологический журн. -

2012. -Вып.1, №1. - С. 68-69.

20. Конева, Е.П. Гетерозиготность гена ИЛ-10 как предиктовый маркер осложненного сепсиса у ожоговых больных / Е.П. Конева, A.JI. Бурмистрова, Ю.Ю. Филиппова, Т.А. Суслова // Вестн. Уральской мед. академической науки. -2012.-№4(41).-С. 123-124.

21. Burmistrova, A.L. Expression of HLA-DRA,-DMA and CIITA genes in burn injury patient with systemic inflammation response syndrome / A.L. Burmistrova, E.P. Koneva, T.A. Suslova, I.V. Shmunk, J.J. Philippova // European journal of natural history. - 2008. - № 3. - P. 52-53.

22. Koneva, E.P. HLA class messenger RNA expression depending TNF-a promoter polymorphism / E.P. Koneva, T.A. Suslova, A.L. Burmistrova, J.Y. Philippova // International Conference 6-th East-West Immunogenetics Conference. - Olomouc, Czech Rep., 2012. - P. 39.

Список используемых сокращений

a — активированные клетки

и — интактные клетки

КОЕ - колониеобразующая единица

МПК - мононуклеары периферической крови

МФС — миелоидно-фагоцитарная система

НПК — нейтрофилы периферической крови

ПОН - полиорганная недостаточность

ССВО - синдром системного воспалительного ответа

sTREM-1 (soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1) -

растворимая форма триггерного рецептора, экспрессируемого на

миелоидных клетках 1 типа

ФИЛИППОВА Юлия Юрьевна

ХАРАКТЕРИСТИКА ПАТТЕРНОВ ИНФОРМАТИВНЫХ ЛАБОРАТОНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ РАЗВИТИЯ СИСТЕМНОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНО-ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА У БОЛЬНЫХ С ТЯЖЕЛЫМИ ТЕРМИЧЕСКИМИ ТРАВМАМИ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Челябинск - 2013

Заказ № 892 Подготовлено к печати и отпечатано в студии дизайна и типографии TETA 454048, г. Челябинск, ул. Яблочкина, 23 (351)225-09-18 http://www.tetadesign.ru e-mail: teta-art@mail.ru