Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Состояние иммунной системы и полиморфизм генов цитокинов при диализных перитонитах

005009995

КАБУРНЕЕВА Ольга Геннадьевна

СОСТОЯНИЕ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ И ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ ПРИ ДИАЛИЗНЫХ ПЕРИТОНИТАХ

14.03.10 - Клиническая лабораторная диагностика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

і о о:з ш

Санкт-Петербург

2012

005009995

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель -доктор медицинских наук Гумилевский Борис Юриевич.

Официальные оппоненты;

доктор медицинских наук профессор Эмануэль Владимир Леонидович,

доктор медицинских наук профессор Жирков Анатолий Михайлович.

Ведущая организация - ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита состоится 28 февраля 2012 года в 14 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.08 при ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д.6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ.

Автореферат разослан 20 января 2021 года.

Ученый секретарь совета

доктор медицинских наук профессор

Митин Юрий Алексеевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Рост сердечно-сосудистой патологии, сахарного диабета, аутоиммунных заболеваний приводит к значительному увеличению числа пациентов с терминальной хронической почечной недостаточностью (Тареева НЕ., 2000; Arikan Н. et al., 2005; Collins A. J. et al., 2009). К методам лечения тХПН относятся программный гемодиализ, перитонеальный диализ, трансплантация почки. По данным различных авторов, количество пациентов, нуждающихся в заместительной почечной терапии, ежегодно увеличивается на 7-8% (Lysaght M.J., 2002; Бикбов Б.Т. и др., 2009). В настоящее время развитие и усовершенствование методов заместительной почечной терапии стоит в ряду актуальных проблем.

Перитонеальный диализ, позволяя дольше сохранять остаточную функцию почек и давая возможность пациенту самостоятельно проводить лечение, становится первоочередным и наиболее частым методом заместительной почечной терапии (Lameire N. et al., 2010). Однако, продолжительность его использования, в большинстве случаев, ограничена 5-6 годами (Андрусев А.М., 2005). Одной из причин, в результате, которой возникает необходимость в прекращении лечения перитонеальным диализом, является диализный перитоиит (Mactier R., 2009; Davenport А., 2009; Li Р.К.. et al., 2010). Около 20-40 % инфекционных диализных перитонитов протекает в тяжелой форме, рефрактерной к антибиотикотерапии (Kavanagh D. Et al., 2004; Бикбов Б.Т. и др., 2009). Причины и механизмы, с помощью которых можно было бы предугадать риск возникновения и тяжесть течения диализного перитонита, до конца не ясны. В настоящее время ведется активное исследование факторов, участвующих в иммунопатогенезе перитонита и влияющих на его исход.

Для пациентов с тХПН, вне зависимости от исходного заболевания почек, характерен схожий симптомокомплекс, в частности иммунопатологические нарушения, связанные со значительным снижением массы действующих нефронов (до 60-70%) и накоплением уремических токсинов (Vanholder R. et al., 2008). Нарушения в системе иммунитета, связанные с уремией, с одной стороны проявляются в виде его активации (гиперцитокинемия, остро-фазные реакции), а с другой стороны иммуносупрессией, проявляющейся в непротективной иммунной реакции в ответ на стимуляцию инфекционными агентами.

Факторы, связанные с процедурой перитонеального диализа способствуют снижению активности иммунного ответа в перитонеальной полости. Бионесовместимые диализирующие растворы оказывают повреждающее действие на структуру и функции иммунокомпетентных клеток перитонеума и стимулируют выработку воспалительных медиаторов (Pecoits-Filho R. et al., 2003). Таким образом, хронический воспалительный процесс, обусловленный воздействием бионесовместимых растворов и уремический

иммунодефицит, связанный с тХПН, приводят к различным нарушениям гомеостаза пациентов на перитонеальном диализе.

В связи с развитием технологий генотипирования и возможностью идентифицировать генетические мутации, накоплены данные о влиянии полиморфизмов генов цитокинов на состояние иммунной системы. В ряде исследований предполагается роль отдельных полиморфизмов генов цитокинов в развитии и характере течения воспалительного процесса (Sutherland A.M. et al., 2005; Yende S. et al., 2009). Другие работы подтверждают, что генетический полиморфизм цитокинов, наряду с патогенностью микроорганизма и состоянием иммунной системы, влияет на баланс в развитии про- и противовоспалительной реакций. (Останин А.А. и др., 2002; Holmes C.L. et al., 2003). Например было показано, что при определенном наборе SNP полиморфизмов промоторной области провоспалительных цитокинов пациентов на перитонеальном диализе их выживаемость снижается (Gillerot G. et al., 2005; Uchiyama К. et al., 2005).

Таким образом, риск возникновения и развитие диализного перитонита у каждого пациента, находящегося на ПАПД индивидуален и может быть связан с нормальными вариациями генома — SNP полиморфизмом генов, отвечающих за иммунорегуляцию. Однако, вопрос о влиянии генетических факторов, в частности полиморфизма генов цитокинов, на частоту возникновения и тяжесть течения диализных перитонитов, а так же их связь с состоянием иммунной' системы пациентов на ПАПД остается открытым. Это определяет актуальность научного исследования, посвященного изучению клинико-иммунологических особенностей больных, получающих лечение постоянным амбулаторным перитонеальным диализом и поиску критериев для индивидуализации терапии на основе оценки риска развития перитонитов.

Цель исследования: ' •

Целью настоящей работы является разработка лабораторных критериев прогноза риска развития и тяжести течения диализных перитонитов на основе характеристики индивидуальных особенностей иммунной системы пациентов, находящихся на лечении постоянным амбулаторным перитонеальным

диализом.

Задачи исследования:

1. Оценить состояние клеточного, гуморального и фагоцитарного

звеньев иммунитета пациентов с тХПН, находящихся на постоянном

амбулаторном перитонеальном диализе.

2. Изучить видовой спектр микрофлоры, вызывающей диализные перитониты у пациентов с тХПН, находящихся на постоянном амбулаторном перитонеальном диализе.

3. Исследовать роль SNP мутаций промоторных участков генов

ключевых цитокинов (IL-4, IL-10, IL-17a, TNF-a) в развитии диализных перитонитов.

4. Выявить прогностически значимые лабораторные маркеры, связанные с течением и исходом диализных перитонитов и на основе полученных результатов разработать алгоритм лабораторного обследования.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное исследование механизмов адаптивного и врожденного иммунитета, а также спектра микрофлоры, вызывающей диализные перитониты, у пациентов с терминальной хронической почечной недостаточностью, находящихся на постоянном амбулаторном перитонеальном диализе в зависимости от наличия и характера осложнений лечения.

Выявлено нарушение Т-клеточного звена иммунитета у всех пациентов с тХПН, получающих ПАПД. Показано, что сочетание дефицита Т-клеточного звена иммунитета и снижения фагоцитарной активности нейтрофилов на фоне цитокиновой диерегуляции является основой для развития диализных перитонитов.

Установлено, что этиологическим фактором диализных перитонитов является условно-патогенная микрофлора и тяжесть клинического течения диализных перитонитов не зависит от вида микроорганизма, а сопряжена со степенью иммуносупрессии.

Впервые определены характеристики генотипов ключевых цитокинов у пациентов с риском развития диализных перитонитов. Показано, что характер клинического течения диализных перитонитов связан с иммуногенетическим профилем. Выдвинуто предположение об иммуногенетической детерминированности развития осложнений перитонеального диализа.

Практическая значимость работы

Проведена оценка биохимических, иммунологических,

микробиологических и генетических факторов, способствующих развитию диализных перитонитов у больных терминальной хронической почечной недостаточностью, вошедших в программу лечения постоянным амбулаторным перитонеальным диализом. Это позволило определить критерии риска развития инфекционных осложнений перитонеального диализа.

Получены данные о том, что риск возникновения и тяжесть клинического течения диализных перитонитов зависит от состояния иммунной системы и может быть генетически предопределены.

Выявлено, что спектр возбудителей диализного перитонита представлен условно-патогенной микрофлорой.

Полученные результаты работы могут быть использованы в практической работе врачей клинической лабораторной диагностики, нефрологов, иммунологов и терапевтов при выборе метода лечения больных терминальной хронической почечной недостаточностью, а также при профилактике и лечении диализных перитонитов.

Положения, выносимые на защиту:

1. У больных тХПН через месяц после начала проведения ПАПД отмечаются признаки иммунодепрессии врожденного и адаптивного иммунитета. Наличие вторичного иммунодефицита при проведении ПАПД у больных тХПН является основой для персистирования условно-патогенной

микрофлоры в брюшной полости и развития осложнений заместительной почечной терапии.

2. Глубина подавления механизмов врожденного и адаптивного иммунитета у больных тХПН детерминируется иммуногенетическими особенностями, выражающимися в индивидуальном наборе аллельных вариантов генов 1И0 и 1И7а.

3. Изменения параметров иммунного статуса и особенности полиморфных вариантов БЫР мутаций интерлейкинов 10 и 17а позволяют осуществить оценку риска развития диализных перитонитов и тяжести их течения. ,

Реализация результатов работы ‘

Разработанный алгоритм прогноза риска осложнений постоянного амбулаторного перитонеального диализа используется при лечении больных в ГУЗ «Волгоградский областной уронефрологический центр». Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс на кафедре клинической лабораторной диагностики Волгоградского государственного медицинского университета. На основе полученных данных разрабатывается дискриминационная база данных для выявления и оценки других иммуногенетических факторов риска осложнений при проведении заместительной почечной терапии. По результатам исследования оформляется заявка на изобретение «Способ прогноза развития диализного перитонита у пациентов на постоянном амбулаторном перитонеальном диализе» (2011) в Федеральный Институт промышленной собственности Российского агентства по патентам и товарным знакам. Выпущены методические рекомендации для практических врачей «Лабораторный мониторинг пациентов с тХПН на ПАПД».

Апробация работы

Результаты работы были представлены на IV Конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Москва, 2006г.; V Конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Москва, 2010г.; научно-практической конференции «Инновационные технологии в лабораторной диагностике», Волгоград, 2009г.; городской конференции «Актуальные проблемы современной лабораторной диагностики», Волгоград, 2009г.; семинаре кафедры иммунологии и аллергологии ВолГМУ «Роль исследования 8ЫР мутаций в оценке иммунного статуса организма», Волгоград, 2010г.; научно-практической конференции «Актуальные проблемы лабораторной диагностики инфекций», Волгоград, 2010г.

Публикации по теме диссертации: Опубликовано 7 печатных работ, из них 2 в журналах, рекомендованных ВАК и 1 методические рекомендации.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, иллюстрирована 8 рисунками и 27 таблицами. Список

источников цитируемой литературы включает 154 работ, из которых 31 отечественных и 123 зарубежных публикаций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сбор и анализ клинических данных, а также проведение лабораторных, иммунологических и молекулярно-генетических исследований осуществляли в ГУЗ Волгоградский областной уронефрологический центр за период с 2005 по 2011 г.

Сбор биологического материала (кровь, диализат) проводили у пациентов с тХПН на второй месяц после установки перитонеального катетера при неосложненном течении лечения ПАПД и отсутствии в анамнезе других видов заместительной почечной терапии. Всем обследуемым проводили общий анализ крови и биохимический анализ крови (креатинин, мочевина). Для оценки эффективности диализа пациентам с тХПН, получающим постоянный амбулаторный перитонеальный диализ (ПАПД) определяли концентрацию креатинина и мочевины в моче и диализате. Во время диализного перитонита проводили бактериологическое исследование диализата. Состояние иммунного статуса оценивали, определяя субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови (С02+, СЦЗ+, СЭ4+, С08+, С019+, СЭ25+), уровни поликлональных иммуноглобулинов (^А, ^М, 1§С), фагоцитарную активность нейтрофилов (неспецифическое звено иммунитета) и цитокиновый статус (1Ь-4, 1Ь-10). Для выявления генетических особенностей определяли полиморфизм промоторной области генов цитокинов (1Ь-4, [НО, ТЫР-а, 1Ь-17а).

Критерием включения в исследование служили: наличие тХПН без ЗПГ не более года перед началом лечения ПАПД, критериями исключения из исследования служили: длительное проведение гемодиализа перед переходом на ПАПД, СПИД, сахарный диабет, СКВ. У всех включенных в исследование собирали анамнез жизни и заболевания (больные тХПН). Осмотр и физикальное обследование пациентов с тХПН осуществляли в динамике с момента имплантации перитонеального катетера.

Сбор венозной крови проводили утром натощак, до приема медикаментов, физиопроцедур и рентгенологического обследования. Суточную мочу и диализат собирали через 1 месяц после начала ПАПД. В первый день начала диализного перитонита для бактериологического исследования собирали диализат.

Клиническая характеристика обследованных пациентов

В соответствии с поставленными задачами и на основании разработанных критериев включения были обследованы 84 пациента (38 женщин и 46 мужчин) с тХПН в возрасте от 21 до 60 лет (средний возраст - 44,9±2,33 года), вошедших в программу лечения ПАПД. Причиной развития тХПН в 71,4% случаев был хронический гломерулонефрит, в 11,9% случаев - поликистоз почек, в 10,7% случаев - хронический пиелонефрит и в 6,0% случаев другие заболевания почек. Контрольную группу составили 30 условно здоровых лиц (18 женщин и 12 мужчин) без клинических и лабораторных признаков поражения почек, в возрасте от 27 до 56 лет (средний возраст - 39,4±1,72 года).

Все обследуемые являлись жителями Волгоградской области. Всем больным был имплантирован постоянный прямой двухманжеточный катетер Тэнкхоффа лапароскопическим методом. Лечение ПАПД осуществлялось с помощью системы «Stay Safe» фирмы «Fresenius» (Германия), с использованием лактатного буфера в качестве диализирующего раствора. Выбор оптимального варианта ПАПД (частота обменов, концентрация диализирующего раствора) зависел от перитонеального транспорта метаболитов (креатинин, мочевина) и массы тела больного.

Все обследуемые выполняли четыре обменных процедуры в сутки, применяя диализирующий раствор с содержанием глюкозы 1,5% (61,9% больных), 2,3% (33,3% больных) и 4,25% (4,8% больных). Объем заливаемого раствора при каждом обмене составлял 2 литра.

После клинического и лабораторного мониторинга лечения, пациенты с тХПН, находящиеся на ПАПД были разделены на две группы в зависимости от наличия или отсутствия осложнений в виде диализных перитонитов. Анализируя частоту и клиническое течение диализных перитонитов, пациенты, в анамнезе которых были отмечены эпизоды перитонита, были разделены на группу с легким течением и группу с тяжелым течением диализных перитонитов.

Первую группу составил 31 пациент с тХЛН (14 женщин и 17 мужчин), получающих ПАПД. Весь период наблюдения, лечение постоянным амбулаторным перитонеальным диализом больных данной группы проходило без осложнений диализными перитонитами. Средний возраст пациентов составлял 45,7±2,1 лет. Средняя продолжительность нахождения на ПАПД -52±4 месяца. Содержание глюкозы в диализирующих растворах у 64,5% пациентов составляло 1,5%, у 32,3% пациентов - 2,3% и у 3,2% пациентов -4,25%. '

Во вторую группу вошло 26 пациентов с тХПН (10 женщин и 16 мужчин), получающих ПАПД, в анамнезе которых отмечались диализные перитониты с легким характером течения. Средний возраст пациентов составлял 45,2±2,1 лет. Продолжительность нахождения на ПАПД в среднем была 40±4 месяца. Во время лечения перитонеальным диализом, пациенты данной группы использовали диализирующие растворы с содержанием глюкозы 1,5% (65,4% пациентов), 2,3% (30,8% пациентов) и 4,25% (3,8% пациентов). За период наблюдения во второй группе средняя частота диализных перитонитов составила 2,8 эпизода на одного больного за весь период наблюдения. Клиническая картина зарегистрированных диализных перитонитов (ДП) характеризовалась легким характером течения. Типичными клиническими симптомами ДП с легким характером течения являлись абдоминальные боли, болезненность при пальпации живота и помутнение диализата. Диагностика перитонитов основывалась на присутствии двух из трех следующих признаков:

1. Симптомы воспаления брюшины

2. Мутная перитонеальная жидкость с увеличенным числом лейкоцитов (более 100 в мкл) с преимущественным (более 50%) содержанием полиморфноядерных нейтрофилов

3. Обнаружение бактерий в перитонеальной жидкости при микроскопическом или бактериальном исследовании (Ермоленко В.М. и др., 2001; Казимиров В.Г. и др., 2005; МкШйои О., 2011).

В первый день клинических проявлений диализного перитонита была собрана перитонеальная жидкость для общеклинического и бактериологического исследования.

Схема лечения пациентов с диализными перитонитами, протекающими в легкой клинической форме, включала следующие мероприятия:

1. Перитонеальный лаваж (три быстрых обмена) проводился для снятия боли и удаления продуктов воспаления;

2. Гепаринотерапия (1000 ЕД/л диализного раствора) проводилась с целью предотвращения фибриновых сгустков в перитонеальной жидкости

3. Начальная эмпирическая антибактериальная терапия, которая заключалась в интраперитонеальном введении антибактериальных препаратов (цефалоспорины I поколения и аминогликозиды) в виду быстрого достижения высокой локальной концентрации препарата (Гуревич К.Я. и др., 2003; Рцато

В.е1 а!., 2005).

Длительность лечения диализных перитонитов с легким характером течения составляла 2 недели.

Диализный перитонит с легкой формой клинического течения, характеризовался быстрым снижением выраженности симптомов после начала терапии с их полным исчезновением в течение 2-3 дней.

Третья группа состояла из 27 пациентов с тХПН (14 женщин и 13 мужчин), находящихся на лечении ПАПД, лечение которых сопровождалось развитием тяжелых диализных перитонитов. Средний возраст пациентов данной группы был 42,9±2,0 лет. Среднее время нахождения на ПАПД составило 29±6 месяцев. Содержание глюкозы в диапизирующих растворах у 59,3% пациентов составляло 1,5%, у 33,3% пациентов - 2,5% и у 7,4% пациентов - 4,25%. За период наблюдения средняя частота диализных перитонитов у пациентов третьей группы составила 2,3 эпизода на одного больного. К основным клиническим симптомам диализных перитонитов (помутнение диализата, абдоминальные боли) присоединялись симптомы раздражения брюшины (положительный симптом Щеткина-Блюмберга), повышение температуры тела, тошнота и рвота, гипергидратация. Диагностика перитонитов основывалась на клинических и лабораторных (цитоз в диализате более 100 лейкоцитов в мкл) данных. Лечение диализных перитонитов с тяжелым клиническим течением проводилось согласно рекомендациям Международного общества перитонеального диализа (Рцато В. е1 а!., 2005). С целью своевременного начала лечения перитонитов применялась эмпирическая антибактериальная терапия с интраперитонеальным введением препарата. Дальнейший выбор антибактериальной терапии зависел от этиологии диализного перитонита (особенности клинических проявлений, бактериоскопическое и бактериологическое исследование) и чувствительности выделенного микроорганизма к антибиотикам. Наряду с этиотропным лечением проводилась симптоматическая терапия (дезинтоксикация, перитонеальный

лаваж, фибринолитическая терапия). В данной группе больных, 75 % случаев диализных перитонитов характеризовались рефрактерностью к антибактериальной терапии, и их лечение заканчивалось удалением перитонеального катетера. В 17 % случаев лечение тяжелой формы диализного перитонита имело положителную динамику с отчетливым клиническим улучшением. В 8 % случаев диализные перитониты с тяжелым клиническим течением закончились смертью больных.

Иммунофенотипирование циркулирующих в периферической крови лимфоцитов являлось необходимым исследованием в оценке иммунного статуса пациента, что позволило прогнозировать возможность развития осложнений. Был произведен подсчет субпопуляций лимфоцитов с поверхностными антигенами CD2+, CD3+, CD4+, CD8+, CD19+ и CD25+ на проточном цитофлуориметре Facscantoo II (Becton Dickinson, США) с использованием моноклональных антител к поверхностным антигенам лимфоцитов, меченные флуоресцеина изотиоцианатом FITC и фикоэритрином РЕ (Caltag laboratories, Канада).

Оценку фагоцитарной активности нейтрофилов проводили методом инкубации смеси исследуемой крови с взвесью пекарских дрожжей в течение необходимого времени и дальнейшим подсчетом процента фагоцитирующих нейтрофилов и среднего числа поглощенных клеток дрожжей одним фагоцитом. Относительное и абсолютное количество нейтрофилов периферической крови определяли на автоматическом гематологическом анализаторе Sysmex KX-N21 (Rosh, Германия).

Определение концентрации иммуноглобулинов основных классов (IgA, IgM, IgG) проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) наборами реагентов фирмы «Хема» (Россия).

Определение концентрации IL-4 и IL-10 в сыворотке крови проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа набором реактивов «ИФА-1Ь-4» (ООО «Цитокин», Россия).

Генотипирование промоторных участков цитокинов проводили на основании данных о нуклеотидной последовательности исследуемых генов из базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/) с использованием регистрационных номеров IL-4 С-589Т (rs2243250), IL-10 G-1082A (rsl800896), IL-10 С-592А (rs 1800872), IL-10 C-819T (rsl800871), TNFa G-308A (rsl800629), IL-17a (rs2275913). Определение полиморфизмов промоторных участков генов IL-4 (С-589Т), IL-10 (G-1082A), IL-10 (C-592A), IL-10 (C-819T), TNFa (G-308A), IL-17a (G-197A) осуществляли методом ПЦР с аплель-специфичными праймерами, синтезированными в НПФ «Литех». Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов цельной крови с помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь» («Литех», Россия).

Оценка адекватности перитонеального диализа проводилась по индексу К^Унедельный. Для этого все обследуемые пациенты в течение суток собирали мочу и диализат с измерением объема. Далее определяли концентрацию мочевины в пробах суточного диализата и суточной мочи ферментативным кинетическим методом стандартными наборами согласно

рекомендациям фирмы-производителя (Human, Германия) на биохимическом анализаторе «Humalyzer 2000». Фактический недельный Kt/V рассчитывался по формуле:

Kt/VHefl=t(Url)xU24+UrdxD24)x7]/[UrsxWxK], где Uru - мочевина мочи (ммоль/л), U21 - суточный диурез (л), Urd - мочевина диализата (моль/л), D24 -суточный объем диализата (л), Urs - мочевина сыворотки (моль/л), W - вес тела пациента (кг), К - коэффициент, равный 0,6 для мужчин и 0,55 для женщин. Для расчета Kt/V использовалась программа Patient Online 4.2.0.1. Минимальными уровнями адекватной дозы перитонеального диализа являются Kt/VHefl=2,0-2,2

Статистическая обработка данных проведена с использованием пакета прикладных программ «STATISTICA for Windows 6.0» и «SPSS Base 14.0». Данные анализировали с помощью расчета описательных статистик, использовали непараметрические критерии и корреляционный анализ. Для сравнения частот признаков в анализируемых группах использовали двусторонний точный критерий Фишера, для сравнения средних уровней количественных показателей - тест Крускаля-Уоллиса, в том числе его специальная модификация для парных сравнений. Для оценки различия средних величин в попарно несвязанных выборках использовали U-критерий Манна-Уитни. Данные представлены в виде М±т, где М - среднее арифметическое, m - ошибка среднего. Статистически значимыми различиями считали таковые при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Постоянный амбулаторный перитонеальный диализ является одним из основных методов заместительной почечной терапии пациентов с тХПН. Уже при тХПН, вследствие накопления продуктов метаболизма и их токсического воздействия, происходят изменения в системе иммунитета. С началом ПАПД дисфункции в иммунной системе частично корректируются за счет снижения уровня уремических токсинов. В то же время сам процесс перитонеального диализа способствует нарушениям в системе местного иммунитета (перитонеальная полость) и открывает дополнительный доступ к

проникновению инфекционных агентов в организм с возможным развитием диализных перитонитов. Следует полагать, что выраженность этих нарушений индивидуальна и зависит от многих фаеторов, включая генетические

особенности. В связи с этим исследование общеклинического,

иммунологического и генетического статуса к началу проведения ПАПД представляется необходимым и может оказать существенную помощь в

прогнозировании осложнений в виде диализных перитонитов и индивидуализации их лечения.

В настоящей работе были проанализированы данные анамнеза, общеклинические, биохимические, иммунологические и молекулярногенетические параметры 84 пациентов с тХПН, получающих ПАПД. Данные анамнеза о наличии, частоте и характере диализных перитонитов, развившихся

за время наблюдения, позволили разделить обследуемых больных на три группы (I - без ДП, 2 - с легкими ДП, 3 - с тяжелыми ДП). В обследуемых группах к началу лечения ПАПД находилось схожее количество больных с тяжелым и среднетяжелым состоянием.

В результате проведенного бактериологического исследования диализатов, собранных в первый день начала диализных перитонитов было выявлено, что частота видов высеянных микроорганизмов не различается между группами пациентов с легкой и тяжелой формой ДП (табл.1). И в большинстве случаев диализные перитониты индуцированы аутофлорой, что соответствует данным литературы (Ермоленко В.И. и др., 2000; УаБ З.й а1., 2001; Чернышева Н.Н.и др., 2005). Таким образом, можно предположить, что развитие диализных перитонитов обусловлено состоянием общего и местного иммунитета пациентов.

Таблица 1.

Частота выявления разных видов микроорганизмов при диализных

перитонитах с разным характером течения

Микроорганизм Частота выявления

При легком ДП (%) При тяжелом ДП (%)

St. Epidermidis 23,1 25,9

Enteroccocus 19,2 22,2

St. Aureus 11,5 18,5

Enterobacter 7,7 1М

E. coli 7,7 11,1

Pseudomonas 7,7 7,4

St. Saprophyticus 3,9 3,8

He выявлено 19,2 0

Исследование общего и местного иммунитета у пациентов с тХПН, получающих перитонеальный диализ, позволило выявить ряд выраженных изменений иммунной системы. Так у всех пациентов с тХПН вне зависимости от наличия и характера течения диализного перитонита было значимо снижено относительное и абсолютное количество всех исследованных субпопуляций Ти В-лимфоцитов при выраженном лейкоцитозе за счет нейтрофильных

гранулоцитов. Видимо, с началом заместительной почечной терапии происходит активация иммунной системы факторами, связанными с процессом перитонеального диализа (Ра1ор Ь., 1997; Андрусев А.М., 2005).

Обсуждая состояние клеточного звена иммунитета пациентов с тХПН следует сказать, что в группе с предрасположенностью к тяжелому течению ДП, снижение общего количества лимфоцитов было более выражено по сравнению с количеством лимфоцитов у пациентов, лечение которых проходило без осложнений. При этом лимфопения пациентов с тяжелыми ДП сопровождалась более низким уровнем С02+, СОЗ+ и СЭ4+ лимфоцитов по сравнению с уровнем этих субпопуляций у пациентов без перитонитов и пациентов с легким течением перитонитов. Это свидетельствует о более глубоких нарушениях в системе клеточного иммунитета и, как следствие, недостаточной иммунной реакцией в ответ на внедрение инфекционного агента, вызывающего в конечном счете перитонит (рис. I).

Рис. 1 Содержание в периферической крови субпопуляций лимфоцитов у пациентов с тХПН на ПАПД (% от контрольной группы).

* - значимые отличия от контрольной группы (р<0,01)

# - значимые отличия от пациентов без ДГ1 (р<0,01)

§ - значимые отличия от пациентов с легкими ДП (р<0,05)

Функциональное состояние Т- и В-клеточного звена иммунитета, а также готовность иммунокомпетентных клеток к пролиферации и дифференцировке в ответ на бактериальную стимуляцию во многом определяется действием цитокинов. Известно, что одним из главных биологических свойств 1Ь-4 является его способность стимулировать пролиферацию и функциональную активность В-лимфоцитов (Ройт А., 2006; Кетлинский С.А. и др., 2008). Исследование уровня 1Ь-4 позволило выяснить, что его концентрация в периферической крови больных тХПН на перитонеальном диализе значительно

ниже, чем у здоровых обследуемых. В то же время межгрупповых различий в содержании 1Ь-4 обнаружить не удалось. Можно заключить, что одинаково низкое количество В-лимфоцитов во всех трех обследуемых группах коррелирует с низкой концентрацией 1Ь-4 в этих группах.

Эффективность противоинфекционного иммунитета находится в прямой зависимости от баланса между уровнем продукции про- и противовоспалительных цитокинов. Исследования цитокинового статуса пациентов с тХПН на перитонеальном диализе свидетельствуют о гиперактивации провоспалительных механизмов ^ет/тке! Р. & а1., 2005; Гумилевский Б.Ю. и др., 2009). У пациентов с неосложненным течением лечения ПАПД уровень IЬ-10, как и у пациентов, лечение которых в дальнейшем сопровождалось развитием легких перитонитов, достоверно не отличалось от уровня 1Ь-10 контрольной группы (рис.2). У пациентов предрасположенных к тяжелому течению ДП наблюдается значительное снижение концентрации 1Ь-10, что вместе с низким уровнем 1Ь-4 по-видимому приводит к выраженной дисрегуляции иммунного ответа.

Рис. 2 Содержание в периферической крови пациентов с тХПН на ПАПД цитокинов 1Ь-4 и 1Ь-10 (% от контрольной группы).

%

120 100 80 60 40 20 0

* - значимые отличия от контрольной группы (р<0,01)

# - значимые отличия от пациентов без ДГ1 (р<0,01)

Активность В-лимфоцитов оценивали по концентрации сывороточных |£А, ^М и (рис.З). Несмотря на сниженное количество В-лимфоцитов состояние гуморального иммунитета пациентов, получающих перитонеальный диализ, характеризовалось повышением содержания иммуноглобулинов класса

С. Высокий сывороточный уровень может расцениваться как показатель хронического системного воспаления, характерного для пациентов с уремией.

6 без ДП

11.-4 11-10

Выявленный, при сравнении с пациентами без ДП и с легкими ДП, достоверно низкий уровень у пациентов с тяжелыми ДП может быть следствием ослабления хелперных функций Т-лимфоцитов по отношению к 13-лимфоцитам.

Рис. 3 Уровни иммуноглобулинов в сыворотке крови пациентов с тХПН на ПАГ1Д (% от контрольной группы).

%

200

1ёА ІдЄ

* - значимые отличия от контрольной группы (р<0,01)

# - значимые отличия от пациентов без ДП (р<0,01)

§ - значимые отличия от пациентов с легким ДП (р<0,01)

& - значимые отличия от пациентов с легким ДП (р<0,05)

В то же время состояние местного гуморального иммунитета в сравниваемых группах пациентов, находящихся на ПАПД, характеризовалось схожими концентрациями ^А и [§С в диализате и увеличенным содержанием у пациентов склонных к легким ДП. (рис.4).

Состояние фагоцитарного звена иммунной системы во многом определяет характер антибактериальной защитной реакции. Поэтому, для оценки работы врожденного иммунитета у пациентов с тХПН на ПАПД, было определено относительное и абсолютное количество нейтрофилов периферической крови и их способность к фагоцитозу. Оказалось, что изначально у всех пациентов на перитонеальном диализе, вне зависимости от предрасположенности к перитониту, было снижено процентное содержание нейтрофилов способных к фагоцитозу (ФП) на фоне повышенного относительного и абсолютного количества нейтрофилов.

Рис. 4 Уровни иммуноглобулинов в диализной жидкости пациентов с тХПН, получающих ПАПД (в % от группы без ДП)

%

300 &

в без ДП □ с легким ДП м с тяжелым ДП

1ёа 1§м де

& - значимые отличия от группы без ДП (р<0,05)

При этом абсолютное количество фагоцитирующих нейтрофилов было снижено только у пациентов, лечение которых в дальнейшем осложнялось тяжелыми диализными перитонитами. Исходное абсолютное количество фагоцитирующих нейтрофилов у пациентов без ДП и пациентов предрасположенных к легким ДП было компенсировано повышенным относительным и абсолютным содержанием нейтрофилов. Также следует отметить снижение поглотительной способности нейтрофилов (ФЧ и фагоцитарная емкость крови) пациентов с тХПН на ПАПД. Обращает на себя внимание, что фагоцитарное число и фагоцитарная емкость крови пациентов предрасположенных к тяжелым ДП ниже, чем пациентов, дальнейшее лечение которых проходило без ДП или с легкими ДП (рис.5). Таким образом, полученные результаты подтверждают факт негативного влияния уремических токсинов, накапливающихся при тХПН, на способность нейтрофилов к фагоцитозу.

Обнаруженные в исследовании межгрупповые отличия в состоянии клеточного, фагоцитарного и гуморального звена иммунитета пациентов с тХПН, находящихся на перитонеальном диализе, можно объяснить индивидуальными особенностями организма. Для выяснения возможного влияния генетически обусловленных свойств иммунной системы на антибактериальную реактивность организма пациентов с тХПН на ПАПД было исследовано распределение аллельных вариантов генов ключевых иммуномедиаторов (1Ь-4, 1Ь-10, 1Ь-17а и ТОРа), определяющих активацию и ингибицию иммунного ответа.

Рис. 5 Показатели фагоцитарного звена иммунитета у пациентов с тХПН на ПАПД (% от контрольной группы).

Нейтрофилы ФП Фагоцит ФЧ ФЕК

Нейтрофилы

* - значимые отличия от контрольной группы (р<0,01)

# - значимые отличия от контрольной группы (р<0,05)

§ - значимые отличия от пациентов без ДП (р<0,01)

& - значимые отличия от пациентов с легкими ДП (р<0,01)

Образцы ДНК пациентов с тХПН были подвергнуты генотипированию с определением аллельных вариантов промоторных областей генов: (Ь-4 С-589Т («2243250), 1Ь-10 С-1082А (гэ 1800896), 1Ь-10 С-592А (^1800872), 1Ы0 С-819Т (ге 1800871), Т1М Иа С-308 А (ге 1800629), 1Ь-17а в-197А (ге2275913).

Выяснилось, что у пациентов с тХПН на ПАПД в анамнезе которых не было отмечено диализных перитонитов нет значимых отличий распределения изученных аллельных вариантов от здоровых. В то время как, у пациентов с риском развития легких ДП полиморфизм 1Ь-10 С-592А показал достоверную ассоциацию с развитием диализного перитонита. Аллель 1Ь-10-592А (38,5% против 23,8%; х2=3,89; р<0,05) достоверно чаще встречался у больных с осложнениями терапии. Согласно результатам расчетов, носительство редкого аллеля 11_,-10-592А для пациентов получающих ПАПД является риском развития легких перитонитов (011=2,0; 95%С1=1,0-4,02).

Генотипирование ДНК пациентов с тХПН, находящихся на ПАПД показало, что у пациентов с тяжелым характером течения диализных перитонитов в анамнезе достоверно чаще встречаются аллель 1Ь-10 -1082А (68,5% против 35,2%; х2=16,71; р<0,0001) и генотип 1Ы0 -1082А/А (55,5% против 16,4%; х2=14,61; р<0,0007) по сравнению с контрольной группой. Исходя из расчета показателя «отношения шансов» носительство аллеля 11.-10-1082А и генотипа 1Ь-10-1082АА ассоциировано с увеличенным риском развития тяжелой формы диализного перитонита по сравнению с аллелем

IL-10-1082G и генотипом IL-10-1082GG (C>RA=4,0; 95% CI=2,02-7,92 и OR аа=6,38; 95% С1=2,3-17,64 соответственно).

При исследовании lL-17a G-197A полиморфизма выявлено, что у пациентов с риском развития тяжелых ДП чаще встречался генотип IL-I7a -197GA (63,0% против 29,5%; ^2=8,89; р<0,01). Гетерозиготное носительство А-аллеля, а также комбинация генотипов GA+AA IL-17a в позиции - 197 ассоциировалось с риском развития тяжелой формы диализного перитонита (ORoa-4,06; 1,56-10,56 и OR ga+aa=3,37; 1,24-9,13 соответственно).

Таким образом, развитие диализных перитонитов может быть связано с особенностями строения регуляторных областей (промотор) генов цитокинов ILIO А-1028А, IL-IO С-592А и IL-17а G-I97A, определяющих характер секреции противовоспалительных цитокинов.

ВЫВОДЫ:

1. У больных тХПН через месяц после начала проведения ПАПД наблюдается выраженный иммунодефицит, связанный с уменьшением уровня циркулирующего пула субпопуляций Т- и В- лимфоцитов и снижением фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов на фоне цитокиновой дисрегуляции.

2. Выраженность иммунодепрессии и глубина цитокиновой дисрегуляции через месяц после начала проведения ПАПД у больных тХПН является определяющим фактором в развитии диализных перитонитов.

3. Тяжесть диализных перитонитов не связана с особенностями бактериальной флоры диализатов, поскольку частота обнаруженных видов микроорганизмов при диализных перитонитах с разной степенью тяжести значимо не различается и спектр возбудителей представлен условнопатогенной микрофлорой.

4. Особенности цитокиновой регуляции, связаны с индивидуальным набором SNP полиморфизмов интерлейкинов 10 и 17а и определяют степень уремической иммунодепрессии у больных тХПН.

5. Риск развития диализных перитонитов и тяжесть их течения можно прогнозировать на основе комплексной оценки параметров иммунного статуса и аллельных вариантов SNP мутаций интерлейкина 10 и 17а.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для прогноза риска развития диализного перитонита у пациентов с тХПН, через месяц после установки перитонеального катетера Тэнкхоффа рекомендуется определить показатели клеточного, гуморального и фагоцитарного звеньев иммунитета:

- для оценки Т-клеточного звена иммунитета рекомендуется определить содержание в периферической крови Т-лимфоцитов с поверхностным маркером

для оценки гуморального звена иммунитета рекомендуется определить концентрацию сывороточного (г/л).

- для оценки фагоцитарного звена иммунитета рекомендуется определить уровень общего количества нейтрофилов и нейтрофилов способных к фагоцитозу, фагоцитарного числа (ед) и фагоцитарной емкости крови (ед).

- для оценки генетической предрасположенности к развитию диализного перитонита рекомендуется определить генотип промоторной области гена интерлейкина 10 в позиции -1082 и в позиции -592, интерлейкина ] 7а в позиции -197.

Анализ полученных данных рекомендуется проводить по нижеприведенной схеме 1.

Схема 1. Алгоритм интерпретации результатов обследования для прогноза развития диализного перитонита

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Особенности клеточного иммунитета у пациентов перитонеального диализа при перитоните // В соавт. с Б.Ю. Гумилевским, О.П. Гумилевской,

B.Н. Цыганом, В.А. Кормаковым / Вестник ВМедА. - 2009. - №1 (25). - С. 484.

2. Роль противовоспалительных цитокинов IL-J0 и IL-4 в развитии диализных перитонитов // В соавт. с Б.Ю. Гумилевским, О.П. Гумилевской / 57ая Региональная конференция ВолГМУ - 2010. - С.45-50.

3. Эффективность вакцинации против гепатита В при хронической почечной недостаточности и гемодиализе // В соавт. с Б.Ю. Гумилевским, О.П. Гумилевской / Рос. иммунологический журнал. - 2008 - Т2(1П - №2-3 -

C.336. ' '

4. Сравнение иммуносупрессивного влияния циклоспорина и такролимуса при трансплантации почки // В соавт. с Б.Ю. Гумилевским, О.Г1. Гумилевской / Современные представления об иммунокоррекции: Сборник материалов науч.-практ.конф. - Пенза. - 2008. - С.26-27.

5. Полиморфизм промоторной области ИЛ-10 у пациентов с диализным перитонитом // В соавт. с Б.Ю. Гумилевским, О.П. Гумилевской / Российский аллергологический журнал. - 2010. - №5. вып. 1. - С.81 -82

6. Роль иммунологических факторов в особенностях развития и фармакотерапии диализного перитонита // В соавт. с Б.Ю. Гумилевским, О.П. Гумилевской / Вестник ВолгГМУ приложение (Материалы III Всероссийского научно-практического семинара «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» - 2011. - С.99-101.

7. Особенности иммунологических нарушений у пациентов

перитонеального диализа с разной степенью риска к развитию перитонита // В соавт. с Б.Ю. Гумилевским, О.П. Гумилевской / Вестник ВолгГМУ - 2011 -№3. - С.88-92. '

8. Лабораторный мониторинг пациентов с тХПН на ПАПД: Метод, рекомендации для практических врачей. - Волгоград, 2011. - 22с. (Соавт. Б.Ю. Гумилевский, О.П. Гумилевская)

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДГ1 - диализный перитонит

тХПН-терминальная хроническая почечная недостаточность

ПАГТД - постоянный амбулаторный перитонеальный диализ

СКВ - системная красная волчанка

ФЕК - фагоцитарная емкость крови

ФП - фагоцитарный показатель

ФЧ — фагоцитарное число

ТЫР - фактор некроза опухоли

1Ь - интерлейкин

- единичный нуклеотидный полиморфизм СО - мембранная форма кластера дифференцировки ^ - иммуноглобулин

КЛ/У - индекс адекватности перитонеального диализа

Подписано в печать 20.01.12 . Формат 60x84/16

Обьем 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 20

Типография ВМА,

194044, СПб., ул. Академика Лебедева, б.