Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Некоторые генетические и иммунологические механизмы развития гемокоагуляционных осложнений у пациентов с политравмой

На правах рукописи

Доржеев Владимир Владимирович

НЕКОТОРЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ ГЕМОКОАГУЛЯЦИОННЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ У ПАЦИЕНТОВ С ПОЛИТРАВМОЙ

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

005560515

1 1 ПАР 2015

Чита-2015

005560515

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Читинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Заслуженный работник высшей школы РФ, доктор медицинских наук, профессор Витковский Юрий Антонович Научный консультант:

доктор медицинских наук, доцент Мироманов Александр Мих:айлович

Официальные оппоненты:

Шилов Сергей Николаевич, доктор медицинских наук. Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Новосибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации, доцент кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии Гергесова Екатерина Евгеньевна, кандидат медицинских наук. Государственное учреждение здравоохранения "Краевой детский консультативно-диагностический центр" Министерства здравоохранения Забайкальского края, врач клинической лабораторной диагностики клинико-диагностической лаборатории

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Иркутский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Иркутск

Защита состоится "__"____2015 года в___на заседании

диссертационного совета Д 208.118.01 при ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" Минздрава РФ (адрес: 672090, г. Чита, ул. Горького 39а)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" Минздрава России, 672090, г.Чита, ул. Горького 39а, и на http://chitgma.ru/nauka/zashchita-сП55ег1а15у?1а8к=кет.У1е\у&1'<1=21

Автореферат разослан " С^О^ШЛ^ 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Д 208.118.01 д.м.н., профессор б^й^-^^ И.Н. Гаймоленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В последние годы отмечается рост травматизма. Так, в течение 2013 года лечебно-профилактическими учреждениями Минздрава зарегистрировано 13,07 млн. травм, отравлений и других последствий внешних факторов (Миронов С.П., 2010). В группе мужчин 20-24 лет несчастные случаи являются причиной смерти в более чем 80% (Соколов В.А., 2006). Политравма отличается особой тяжестью клинических проявлений, сопровождается значительным нарушением жизненно важных функций организма, трудностью диагностики и лечения, частым развитием осложнений, длительным периодом пребывания в стационаре, высокой инвалидизацией (Агаджанян A.A., 2008). Тромбоэмболи-ческие осложнения при политравме встречаются в 40-77% случаев, и характеризуются скрытым клиническим течением, трудностью лечения и высокой летальностью (Бялик Е.И., 2012, Копенкин С.С., 2012).

Степень разработанности темы.

Травма является пусковым моментом для возникновения ферментного каскада системы гемостаза, и при этом у пациентов, страдающих тромбофилией, происходит срыв резервных возможностей организма, что неизбежно приводит к грубым патофизиологическим сдвигам (Кузник Б.И., 2010). На сегодняшний день установлено несколько генетических дефектов, имеющих прямое или опосредованное отношение к нарушениям гемостаза, утяжеляющие течение основного заболевания (Bertina R.M., 1997; Dahlback В., 2003).

В Забайкалье под руководством Ю.А. Витковского выполнены по-пуляционные исследования частоты протромботических мутаций FV (Leiden), мутация в гене протромбина (G20210A), в гене MTHFR (С677Т) среди здоровых и больных сосудистыми заболеваниями головного мозга, инфекционными заболеваниями у детей, опухолях легких в этническом и возрастном аспектах (Богданов И.Г, 2006; Богданова A.C., 2006; Мироманова H.A., 2006; Страмбовская H.H., 2006). Известно, что между системами иммунитета и гемостаза существует тесная взаимосвязь, поэтому сдвиги в одной из них могут усугублять изменения в другой и, следовательно, усиливать патогенетические механизмы проявления заболеваний (Витковский Ю.А., 1997-2014; Кузник Б.И. и соавт., 1981-2014). В связи с вышеизложенным, возможно, что генетические аномалии системы гемостаза могут отражаться на тяжести течения травмы.

Таким образом, поиск генетических маркеров, определяющих особенности индивидуального реагирования защитных систем,- вовлеченных в патогенез осложнений, является актуальной задачей для прогнозирования течения, профилактики гемокоагуляционных нарушений и исхода травмы.

Цель исследования: изучить роль точечных полиморфизмов некоторых протромботических генсв и генов цитокинов в патогенезе тромбоэмболии при политравме у резидентов Забайкальского края.

Задачи исследования:

1. Изучить распространенность SNP генов фактора V (Leiden) (G1691A), протромбина (G20210A), метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) (С677Т), IL-2 (T330G), IL-10 (G1082A), IL-10 (С819Т) у пациентов с политравмой и оценить риск развития тромбоэмболи-ческих осложнений у носителей различных аллельных вариантов указанных полиморфизмов.

2. Изучить концентрацию провоспалительных цитокинов TNFa, IL-lß, IL-8, TGFß, а также коагулологические показатели у пациентов с политравмой. Оценить особенности содержания IL-2 и IL-10 в зависимости от генотипов SNP генов IL-2 (T330G), IL-10 (G1032A), IL-10 (С819Т) и наличия тромбоэмболии у пациентов с политравмой.

3. Исследовать лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию у больных с политравмой в зависимости от генотипов SNP гена IL-2 (T330G), SNP гена IL-10 (G1082A) при развитии тромбоэмболических осложнений.

4. Провести многофакторный регрессионный анализ и оценить значение изучаемых полиморфизмов, концентрации цитокинов, JITA, ко-агулологических показателей для прогнозирования развития тромбоэмболических осложнений политравмы.

Научная новизна исследования. Впервые установлено, что но-сительство аллели G SNP гена IL-2 (T330G), аллели A SNP гена IL-10 (G1082A) и аллели Т SNP гена IL-10 (С819Т) снижает риск развития тромбоэмболических осложнений при политравме.

Впервые обнаружено, что значения концентраций IL-2 и IL-10 зависят от полиморфизмов их генов. Наиболее значимым для повышения концентрации IL-2 является генотип Т/Т SNP гена IL-2 (T330G) при наличии осложнений, а для повышения уровня IL-10 - генотип А/ A SNP гена IL-10 (G 1082А), генотип Т/Т SNP гена IL-10 (С819Т) у пациентов с неосложненным течением политравмы. При политравме повышается продукция провоспалительных цитокинов TNFa, IL-lß, IL-8, а также TGFß.

Выявлено, что у пациентов с политравмой на 3-й день повышается лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия. Наибольшая способность лимфоцитов вступать в контакт с тромбоцитами отмечена у носителей генотипов Т/Т SNP гена IL-2 (T330G), G/G SNP (G1082A) при развитии тромбоэмболических осложнений политравмы.

Теоретическая и практическая значимость работы. В результате исследования установлены новые данные о распространенности

различных аллельных вариантов SNP генов фактора V (Leiden) (G1691A), протромбина (G20210A), MTHFR (С677Т), 1L-2 (T330G), IL-10 (G1082A), IL-10 (С819Т) у пациентов с политравмой и раскрыта их роль в патогенезе развития тромбоэмболических осложнений. Но-сительство аллели G SNP гена IL-2 (T330G). аллели A SNP гена IL-10 (G1082A) и аллели Т SNP гена IL-10 (С819Т) снижает риск развития тромбоэмболических осложнений политравмы.

Полученные результаты могут послужить основой для разработки новых подходов к оценке риска, профилактике, прогнозированию развития тромбоэмболических осложнений политравмы. Выявленные сведения о наличии полиморфизмов SNP генов фактора V (Leiden) (G1691A), протромбина (G20210A), MTHFR (С677Т), IL-2 (T330G), IL-10 (G1082A), IL-10 (С819Т) могут быть включены в генетический паспорт индивидуумов, и совместно с другими полиморфизмами и исследованием JITA, D-димеров и АЧТВ использоваться для оценки риска развития тромбоэмболических осложнений при политравме.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Аллельные варианты SNP протромботических генов FV (Leiden) (G1691A), FII (G20210A), MTHFR (С677Т) повышают, а аллель G SNP гена IL-2 (T330G), аллель A SNP гена IL-10 (G1082A) и аллель Т SNP гена IL-10 (С819Т) снижают риск развития тромбоэмболических осложнений политравмы.

2. При политравме значения концентрации IL-2 и IL-10 зависят от генотипа SNP гена IL-2 (T330G), SNP гена IL-10 (G1082A), SNP гена IL-10 (С819Т) и наличия тромбоэмболии. Наиболее значимым для повышения концентрации IL-2 является генотип Т/Т полиморфизма гена IL-2 и наличие тромбоэмболических осложнений, а для повышения уровня 1L-10 - генотнп А/А полиморфизма гена IL-10 (G1082A) и генотип Т/Т гена IL-10 (С819Т) при неосложненном течении политравмы. При политравме на 3-й день повышается лим-фоцитарно-тромбоцитарная адгезия. Наибольшая способность лимфоцитов вступать в контакт с тромбоцитами проявляется у носителей генотипов Т/Т SNP гена IL-2 (T330G), G/G SNP (G1082A) при развитии тромбоэмболических осложнений.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты диссертационной работы внедрены в работу травматологического отделения ГУЗ "Городская клиническая больница №1" г. Чита. Материалы диссертационного исследования используются в учебном процессе кафедр патологической физиологии, тразматологии и ортопедии ГБОУ ВПО Читинской государственной медицинской академии.

Апробация работы. Материалы исследований доложены на I (учредительном) съезде травматологов-ортопедов Дальневосточного федераль-

ного округа "Травматология и ортопедия на Дальнем Востоке: достижения, проблемы, перспективы" (г. Хабаровск, 2009), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, с элементами научной школы для молодежи, посвященной 90-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР, профессора Я.Л. Цивьяна - "Инновационные аспекты научно-исследовательских разработок в области вер-тебрологии, травматологии и ортопедии, нейрохирургии, нейроонколо-гии" (Цивьяновские чтения) (Новосибирск, 2010), II Китайско-Российском конгрессе "Травматология, ортопедия и восстановительная медицина третьего тысячелетия" (КНР, Маньчжурия, 2011), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, с элементами научной школы для молодежи "Хирургические технологии лечения патологии позвоночника и суставов" посвященная 65-летию Новосибирского НИИТО (Цивьяновские чтения, Новосибирск, 2011), XVI Всероссийской научно-практической конференции "Многопрофильная больница: проблемы и решения", (Ленинск-Кузнецкий, 2012), заседании научно-практического общества травматологов-ортопедов Забайкалья (Чита, 2013, 2014).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 3 статьи в ведущих рецензируемых журналах, определённых ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация содержит 123 страницы машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и списка использованной литературы (166 отечественных и 88 зарубежных источников). Работа иллюстрирована 25 таблицами и 7 рисунками.

Диссертационная работа выполнена по плану НИР ГБОУ ВПО "ЧГМА" Минздрава России (номер государственной регистрации 01200703646).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Médical Association Déclaration of Helsinki 1964, 2011 - поправки) и "Правилами клинической практики в Российской Федерации", утверждёнными Приказом № 266 Минздрава РФ от 19.06.2003 г. Данное диссертационное исследование одобрено локальным этическим комитетом ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия", протокол № 2 от 06.11.2009г.

Для решения поставленных задач нами проведено комплексное обследование 114 пациентов в возрасте от 20 до 40 лет с политравмой, лечившихся в ГУЗ "Городская клиническая больница №1" г. Читы. Из них мужчины составили 71,9% (82 человека), женщины - 28,1% (32 пациента).

По механизму травмы распределение было следующим: основную часть составили пострадавшие в дорожно-транспортных происшествиях - 70 человек (61,5%), травмы связанные с падением с высоты - 23 человека (20,2%), повреждения нанесенные другими лицами - 12 человек (10,5%), травмы в результате контакта с различными механизмами и устройствами - 6 человек (5,2%), прочие виды травм - 3 человека (2.6%).

Диагноз устанавливался на основании клинического осмотра, данных рентгенограмм, компьютерной томографии, УЗИ (ультразвуковое исследование), лабораторных исследований. Оценка тяжести повреждений осуществлялась по шкале Abbreviated Injury Scale (AIS) и Injury Severity Score (ISS) (Котельников Г.П., 2011). Тромбоэмболические осложнения подтверждались клиническими, инструментальными (электрокардиография, обзорная рентгенография органов грудной клетки, компьютерная томография, ультразвуковая доплерография сосудов) и лабораторными (количественное определение D-димера, АЧТВ, MHO, РФМК) данными.

Пациенты распределены на следующие группы: I группа представлена 73 больными с неосложнённым течением политравмы. II группа -41 пациент с венозными тромбоэмболическими осложнениями политравмы (тромбоз сосудов нижних конечностей, тромбоэмболия легочной артерии, в т.ч. мелких ветвей). Контрольную группу составили 100 практически здоровых мужчин и женщин в возрасте от 20 до 40 лет.

Критерием включения в исследование была политравма с индексом ISS > 9. Исключали из исследования пациентов со злокачественными образованиями, острыми воспалительными заболеваниями и хроническими в стадии обострения, женщин в период менструации и беременности, а также людей получавших антикоагулянтную терапию в анамнезе.

Лабораторные методы исследования.

Определение концентрации цитокинов. При определении концентрации цитокинов в сыворотке крови (IL-1, IL-2, IL-8, IL-10, TNFa и TGFP) использовались наборы реагентов ЗАО "Вектор-Бест" (г. Новосибирск). Измерение уровня цитокинов проводили "сэндвич"-вари-антом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).

Исследование системы гемостаза. Стабилизированную венозную кровь исследуемых центрифугировали 15 минут при 3000 об./ мин. Полученную после центрифугированную плазму исследовали ко-агулологическим методом на фибринтаймере "Behring-fibrintimer" (Австрия) с использованием наборов реактивов фирмы "Технология-Стандарт" (Барнаул). Коагуляционный гемостаз оценивали по следующим тестам: протромбиновое время, MHO, АЧТВ, концентрация фибриногена, резистентность Va фактора к АРС коагулометрическими методами, концентрацию D-димера - турбидиметрическим методом.

Определение показателя лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии. Исследование показателя J1TA проводили по методу Ю.А. Вит-ковского с соавт. (1999).

Полимеразная цепная реакция. Определение SNP генов - IL-2 (T330G), 1L-10 (G1082A, C8I9T), FV (Leiden - G169IA), FII (протромбин G20210A), MTHFR (С677Т) - осуществлялось методом ПЦР с использованием праймеров ООО "Литех" (г. Москва). Анализу подвергалась геномная ДНК, выделенная из лейкоцитов цельной крови с помощью реагента "ДНК-экспресс-кровь", затем проводилась реакция амплификации с двумя парами аллель-специфичных праймеров.

Способы статистической обработки полученных результатов. Полученные данные обработаны с помощью пакета электронных программ "Microsoft Office 2003 for Windows XP Professional" и "STATISTICA 6.0" (Stat Soft, USA). При сравнении изучаемых клинических и лабораторных показателей использовались непараметрические методы. Данные представлены в виде медианы (Me) и интерквартального (25-й и 75-й перцен-тили) интервала. Статистически значимые различия между группами по количественным признакам оценивались при помощи критерия Манна -Уитни (U-тест). Для сравнения групп по качественному бинарному признаку применялся критерий у} (точный критерий Фишера). Для определения частот аллельных вариантов генов использовался закон Харди-Вайн-берга. Вычислялась относительная вероятность события (ОР) и отношения шансов (ОШ). Предсказания значений ряда зависимых переменных по известным значениям других переменных осуществлялись с помощью множественного регрессионного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Распространенность SNP гена IL-2 (T330G), гена IL-10 (С819Т, G1082A)

Выявлено, что встречаемость аллели Т SNP гена (T330G) в группе пациентов с осложненной политравмой выше, чем в группе лиц с неосложненным течением и составляет 0,93 и 0,82, соответственно (^=4,79, р=0,028). При наличии осложнений среди пациентов, гомозигота Т/Т встречается чаще, а при неосложненной - реже (0,88 и 0,66, соответственно), (х:=7,47, р=0,0063), (табл. 1).

Установлено, что политравма сопровождается повышением уровня IL-2 не зависимо от генотипа и наличия осложнений по сравнению с контролем (р<0,001). Наибольшая концентрация IL-2 выявлялась у носителей гомозиготного варианта Т/Т, при неосложненном течении политравмы уровень IL-2 составлял 9,5 (7,3; 10,9) пкг/мл, тогда как у гомозигот G/G он находился на значении 6,3 (4,2; 7,0) пкг/мл (р<0,001) (рис. 1).

Таблица 1

Частота полиморфизма гена 1Ь-2 (ТЗЗ(Ю) у пациентов с неосложненным течением политравмы и развитием тромбоэмболических осложнений

Показатель Неосложненное течение (п=73) Осложненное течение (п=41) X3

Генотип

тлг 48 (0,66) 36 (0,88) Т/Т к T/G 7,47 (р=0,0063)

T/G 24 (0,32) 4 (0,10) Т/G к GIG 1,71 (р=0,19)

G/G 1 (0,014) 1 (0,02) Т/Т к GIG 0,04 (р=0,84)

Аллель

Т 120 (0,82) 76 (0,93) 4,79 (р=0,028)

G 26 (0,18) 6 (0,07)

Примечание: р - статистическая значимость различий при р<0.05.

16 14

2 пкг/мл

10 8 6 4

2 0,2 0,2 0,2 Контроль

ч" Т/Т

Рисунок ]. Содержание IL- 2 в зависимости от полиморфизма гена 1L-2 (T330G). Примечание: * - статистическая значимость различий с контролем: ** - статистическая значимость различий между клиническими группами: # - статистическая значимость различий с генотипом Т/Т (достоверно при р<0.05).

Гомозиготный вариант носительства SNP IL-10 (G1082A) G/G чаще наблюдали в группе тромбоэмболических осложнений (0,71 ), тогда как в группе с неосложненным течением - 0,45, (х2 =4,44, р=0,035). Го-

V"

Неосложненное течение Осложненное течение X т/G * G/G

мозиготная мутация А/А выявлена у восьми пациентов из неосложнен-ной группы (0,11) и у одного пациента с осложнением (0,02) (х: =4,10, р=0,043). Аллель С чаще регистрировали у пациентов с осложнениями - 0,84, тогда как аллель А чаще выявляли среди лиц с неосложнен-ным течением политравмы - 0,33 (х2 =7,76, р=0,0053) (табл. 2).

Таблица 2

Частота полиморфизма гена 1Ь-10 (С1082А) у пациентов с неосложненным течением политравмы и развитием тромбоэмболических осложнений

Показатель Не осложненное течение Осложненное течение Хг

Генотип

G/G 33 (0,45) 29 (0,71) С/С к СП 4,44 (р =0,035)

С/А 32 (0,44) И (0,27) СГГкТЛГ 0,14 (р=0,71)

А/А 8 (0,11) 1 (0,02) С/С к Т/Г 4,10 (р =0,043)

Всего 73 41

Аллели

G 98 (0,67) 69 (0,84) 7,76 (р=0,0053)

А 48 (0,33) 13 (0,16)

Всего 146 82

Примечание: р - статистическая значимость различий при р<0,05.

Изучая концентрацию 1L-10 у пациентов с политравмой в зависимости от генотипа SNP гена IL-10 (G1082A) и наличия тромбоэмболических осложнений, зафиксировано, что политравма сопровождается повышением уровня IL-10 не зависимо от генотипа и наличия осложнений по сравнению с контролем (р<0,001), (рис. 2).

Наибольшая концентрация 1L-10 выявлялась у носителей гомозиготного варианта А/А. Так, при неосложненном течении у носителей этого генотипа при политравме уровень 1L-10 составлял 12,2 (6,3; 13,0) пкг/мл. тогда как у гомозигот G/G он находился на значении - 5,6 (3,8; 6,1) пкг/мл (р<0,001).

Выявлено, что нормальные гомозиготы (С/С) полиморфизма гена IL-10 (С819Т) чаще регистрировались в группе пациентов имевших тромбоэмболические осложнения (0,76), (Х"=3,85, р=0,049). Статистической значимости различий встречаемости гетерозигот С/Т, гомозигот Т/Т, а также аллелей С и Т между группами не выявлено (табл. 3).

14

12 пкг/wui

10

8 6 4

2 03 0,4 0,4

g Л\\\ 'Щ1Ч

Контроль

С* G/G

Рисунок 2. Содержание IL-10 в зависимости от полиморфизма гена IL-10 (G1082А) у пациентов с политравмой

Примечание: * - статистическая значимость различий с контролем; * * - статистическая значимость различий между клиническими группами; # - статистическая значимость различий с генотипом G/G (достоверно при р<0,05).

Таблица 3

Частота полиморфизма гена 1Ь-10 (С819Т) у пациентов с иеосложненным течением политравмы и развитием тромбоэмболических осложнений

Показатель Неосложненное течение Осложненное течение X2

Генотип

С/С 34 (0,47) 26 (0,76) С/С к ОТ 3,85 (р=0,049)

С/Г 38 (0,52) 13 (0,19) С/Г к Т/г 2,39 (Р=0,12)

Т/Г 1 (0,01) 2 (0,05) С/СкТЛГ0,63 (р=0,43)

Всего 73 41

Аллели

С 106 (0,73) 65 (0,793) 1,24 (р=0,26)

Т 40 (0,27) 17 (0,207)

Всего 146 82

Примечание: □ - статистическая значимость различий при р<0,05.

Неосложненное течение Осложненное течение X G/A 3 А/А

Установлено, что политравма сопровождается повышением уровня 1Ь-10, не зависимо от генотипа БОТ гена 1Ь-10 (С819Т) и наличия осложнений по сравнению с контролем (р<0,001), (рис. 3).

Наибольшая концентрация 1Ь-10 выявлялась у носителей гомозиготного варианта Т/Т. Так, при неосложненном течении политравмы уровень 1Ь-10 составлял 11,2 (8,8; 12,6) пкг/мл, тогда как у гомозигот С/С он находился на значении 4,9 (3,6; 5,7) пкг/мл (р<0,001).

Таким образом, присутствие аллельных вариантов генов 1Ь-2 (-33(Ю), гена 1Ь-!0 (-819Т, -1082А) существенно снижают риск развития тромботических осложнений у больных с политравмой. У обладателей указанных аллелей показатели отношения шансов и относительного риска оказались ниже 1,0.

12

Контроль Неосложкенное течение Осложненное течение

* с/с с/т а т/т

Рисунок 3. Содержание ГЬ-10 в зависимости от полиморфизма гена 1Ь-10 С819Т у здоровых и пациентов с политравмой.

Примечание: * - статистическая значимость различий с контролем; ** - статистическая значимость различий между клиническими группами; # - статистическая значимость различий с генотипом С/С (достоверно при р<0,05).

Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия у пациентов с политравмой

При изучении функции ЛТА у пациентов с политравмой в зависимости от наличия гемокоагуляционных осложнений, а также от генотипов изучаемых полиморфизмов генов 1Ь-2 и 1Ь-10 на 3-й день травмы, выявлено, что в обеих клинических группах относительно здоровых лиц повышаются как относительные, так и абсолютные показатели ее функции. Максимальные значения отмечены у пациентов с гемокоагуляционными нарушениями, у которых абсолютный показатель ЛТА зозрастал в 2,8

раз по сравнению с группой контроля (р<0,001) (рис. 4).

Установлено, что наибольшая активность лимфоцитарио-тромбоци-тарного взаимодействия рег истрируется среди носителей генотипа Т/Т (рис. 5). Абсолютный показатель ЛТА в неосложненной группе регистрировался на уровне 0,56 (0,43;0,6l) х 109/л, а в осложненной - 0,75 (0,64;0,86) х Ю'/л, тогда как у здоровых лиц этого генотипа данный показатель составил 0,26 (0,23; 0,35) х 109/л (р<0,001). У пациентов с гетеро-зигоным вариантом T/G полиморфизма гена 1L-2 (T330G) абсолютный показатель ЛТА оказался ниже, чем у гомозиготных носигетелй G/G, как в неосложненной - 0,43 (0,38; 0,56), так и в осложненной - 0,58 (0,42; 0,76) группах (р<0,05). Степень ЛТА и содержание лимфоцитов при этом генотипе не отличалась по своему значению от таковых у гомозигот Т/Т.

Наименьшие показатели ЛТА выявили среди носителей G/G полиморфизма гена IL-2 (T330G). В неосложненной группе абсолютный показатель достигал - 0,34 х 109/л, в осложненной - 0,44 х 109/л, и отличался от контрольных значений и гомозиготного варианта Т/Т изучаемого полиморфизма.

ЛТА, абс.

1

0,5

0

Контроль

К Генотип Т/Т S Генотип T/G * Генотип G/G

Рисунок 4. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия у пациентов с политравмой, в зависимости от генотипа полиморфизма гена IL-2 (T330G).

Примечание: * - статистическая значимость различий с контролем: ** - статистическая значимость различий между клиническими группами; # - статистическая значимость различий с генотипом Т/Т (достоверно при р<0.05).

При анализе активности ЛТА у пациентов с политравмой в зависимости от полиморфизма гена IL-10 (G 1082А), отмечено, что высокие показатели ЛТА зарегистрированы у носителей генотипа G/G (рис. 5). Количество коагрегатов среди неосложненной группы составило -0,51 х 109/л, среди осложненной - 0,65 х 109/л, и отличалось от значений контроля - 0,25 х 109/л, (р<0,001).

Неосложне иное течение

Осложненное течение

У носителей генотипа G/A полиморфизма гена JL-10 (G1082A) показатели JITA отличались от таковых значений контроля и представителей генотипа G/G. В неосложненной группе абсолютный показатель составил - 0,38 (0,26; 052), а в осложненной группе - 0,53 (0,36; 0,64), соответственно (рис. 5).

ЛТА, абс.

0,8

0,6

Ц и®

Контроль

X Генотип G/G Генотип G/A £ Генотип А/А

Рисунок 5. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия у пациентов с политравмой, в зависимости от гснотипанолиморфизма remIL-10 (G1082A).

Примечание: * - статистическая значимость различий с контролем; ** - статистическая значимость различий между клиническими группами; # - статистическая значимость различий с генотипом G/G (достоверно при р<0,05).

Распространенность протромботических мутаций: V фактора Leiden 1691 А, протромбина G20210A, MTHFR С677Т

Среди пациентов с неосложненным течением гомозиготное носи-тельство G/G SNP гена фактора V Leiden (G1691A) составило 96%, в контрольной группе - 99%. Генотип G/A встречался с частотой 0,04, и не отличался от такового среди здоровых лиц (0,01) (х*1,81, р=0,1789). Гомозиготных носителей А/А среди обеих групп не наблюдали. У пациентов с тромбоэмболическими осложнениями генотип G/ А встречался с частотой 0,18 ( 2=14,44, р<0,001), аллель А - 0,10 (Х2=18,66, р<0,001), что достоверно выше, чем в контрольной группе.

Выявлено, что у больных с неосложненным течением политравмы по сравнению с осложненным, чаще выявляется гомозигота G/G (0,964 и 0,80, соответственно). Встречаемость генотипов G/A, А/А оказалась выше у пациентов при наличии гемокоагуляционных осложнений (0,036% и 0,2 соответственно), (х2 =5,74, р=0,0166). Аллель А при осложненной форме политравмы наблюдали у 10% пациентов, тогда как при неосложненной - только в 2% (х2 =8,38, р=0,0038), (табл. 4), (Доржеев В.В., Витковский Ю.А., 2014).

*

*

Нео ело жне иное течение

Осложненное течение

Встречаемость генотипов SNP гена протромбина (G20210A) среди здоровых лиц и пациентов с неосложненной формой политравмы оказалась одинаковой. Так, генотип G/G выявлялся с частотой 0,98 в группы контроля и 0,99 - в неосложненной, гетерозиготный генотип G/A - 0,02 и 0,01, соответственно (х:=0,1, р=0,7538). Среди всех исследуемых мы не выявили ни одного носителя гомозиготного варианта А/А (табл. 5).

Таблица 4

Частота полиморфизма гена фактора V (Leiden) (G1691A) у пациентов с неосложненным течением политравмы и развитием тромбоэмболических осложнений

Показатель Контроль (п=100) Неосложненное течение (п=73) Осложненное течение (т=41)

Генотип

G/G 99 (0,99) 70 (0,96) 33 (0,80) */**

G/A 1 (0,01) 3 (0,04) 1 (0,18)

А/А - - 1 (0,02)

Аллель

G 199 (0,995) 143 (0,979) 73 (0,90) */**

А 1 (0,005) 3 (0,021) 9 (0,10) */**

Примечание: * - статистическая значимость различий с контролем: ** - статистическая значимость различий между клиническими группами (достоверно при р<0.05).

Установлено, что при отсутствии осложнений гомозиготные носители G/G встречаются с частотой 0,99, тогда как при наличии осложнений реже - с частотой 0,85 (табл. 6). Частота аллели А указанного полиморфизма при осложнениях политравмы составила 0,07, тогда как без таковых - 0,01 (х: =6,00, р=0,014), (Доржеев В.В., Витковский Ю.А., 2014).

Частота SNP гена MTHFR (С677Т) у пациентов с осложненным течением травмы существенно отличается от неосложненного (табл. 6). Так аллель Т среди пациентов с наличием тромбоэмболических осложнений встречается в 3 раза чаще, чем в группе без осложнений (Х:=37,2, р<0,001). В группе лиц с осложнениями политравмы уменьшается доля носителей гомозиготного варианта С/С до 0,56 против 0,71 в группе неосложненного течения (х2=5,24, р=0,0209) и увеличивается доля гомозигот Т/Т до 0,15 против 0,06 (х:=27,22, (р<0,001).

Установлено, что одновременное присутствие аллели G полиморфизма гена FII (G20210A) и аллели Т полиморфизма гена MTHFR (С677Т) встречалось у трех пациентов с политравмой, течение которой сопровож-

далось тромботическими осложнениями (ТЭЛА), тогда как в группе с неосложненным течением политравмы таких сочетаний не выявлено.

Таблица 5

Частота полиморфизма гена фактора II (протромбина С20210А) у пациентов с неосложненным течением политравмы и развитием тромбоэмболических осложнений

Показатель Контроль (п=100) Неосложненное течение (п=^73) Осложненное течение (т=41)

Генопшп

СЮ 98 (0,98) 72 (0,99) 36 (0,85) */**

СМ 2 (0,02) 1 (0,01) 5 (0,15) */**

А/А - - -

Аллель

С 198 (0,99) 145 (0,99) 77 (0,93) */**

А 2 (0,01) 1 (0,01) 5 (0,07) */**

Примечание: * - статистическая значимость различий с контролем: ** - статистическая значимость различий между клиническими группами (достоверно при р<0.05).

Таблица 6

Частота полиморфизма гена МТНРИ. (С677Т) у пациентов с неосложненным течением политравмы и развитием тромбоэмболических осложнений

Показатель Контроль (п=100) Неосложненное течение (п=73) Осложненное течение (т=41)

Генопшп

С/С 44 (0,44) 52 (0,71)* 12(0,29) **

СЛ" 45 (0,45) 17 (0,23) 12 (0,29) */**

Т/Т 11 (0,11) 4 (0,06) * 17 (0,42) */**

Аллель

С 133 (0,67) 121 (0,83) * 36 (0,44) */**

Т 67 (0,33) 25 (0,17) * 46 (0,56) */**

Примечание: * - статистическая значимость различий с контролем: ** - статистическая значимость различий между клиническими группами (достоверно при р<0.05).

Сочетание полиморфизмов гена V фактора Leiden 1691А и гена MTHFR С677Т в группе осложнений наблюдали в двух случаях, а в группе с неосложненным течением - в одном (х:=5,54, р=0,018), (Дор-жеев В.В., Витковский Ю.А., 2014).

Показатели коагуляционного гемостаза у больных с политравмой Параметры коагуляционного гемостаза у больных с политравмой представлены на рисунке 6.

1 0.910.8«

мни

И

■ ■III

l>|HIHv'ft-H Г Л l-'-QlliVir'I'M. iVif 1

2Х > =

I!

|i "НТ]>"П|-.

" П.-ЧМ'-НЦ. T-;lh

Рисунок 6. Показатели коагуляционного гемостаза у больных с политравмой. Примечание: * - статистическая значимость различий с контролем: ** - статистическая значимость различий между клиническими группами (достоверно при р<0.05).

Зафиксировано, что на третий день после получения травмы у пациентов значимо уменьшается уровень MHO и повышается содержание АЧТВ, Фибриногена, D-димеров и РФМК по сравнению с контролем (р<0,01). Снижение MHO говорит о состоянии гиперкоагуляции и расценивается как риск тромбообразования, а содержание АЧТВ, фибриногена, D-димеров и РФМК значительно возрастает при всех ситуациях, связанных с увеличением образования фибрина в кровотоке и развитием тромбоэмболических осложнений (Мироманов A.M., 2013).

Регрессионная многофакторная модель развития тромбоэмболических осложнений при политравме

Лабораторная составляющая в регрессионной модели включала: - некоторые параметры иммунной системы - цитокины TNFa, IL-lß, IL-2, IL-4, IL-8, IL-10, TGF-ßj, ЛТА; - показатели гмостаза. Кроме того, регрессионная модель охватывала данные о распределении генотипов полиморфных маркеров генов IL-2 (-303G), IL-10 (-1082А), FV (Leiden) (-1691А). F-II (-2021 OA) и MTHFR (-677Т).

Наиболее близко связанным с тромбоэмболическими осложнени-

ями при политравме у пациентов оказалось выявление ЛТА (%) (шаг 1). Точность предсказания увеличивалась при добавлении данных о концентрации 11.-2 (шаг 2), содержании Э-димера (шаг 3), полиморфизма гена МТНРЯ (-677Т) (шаг 4), полиморфизма гена 1Ь-10 (-10820 (шаг 5), АЧТВ (шаг 6), полиморфизма гена 1Ь-2 (-3ЗОй) (шаг 7) и полиморфизм гена РУ(Ье1с1еп) (-1691А) (шаг 8). При добавлении других показателей в дополнение к уже отобранным, нарастания значимой прогностической мощности не отмечалось (табл. 8).

Таблица 8

Прогностическое значение показателей в многофакторной модели развития тромбоэмболических осложнений при политравме

N=114 *БЕТА Ст. Ош. БЕТА В Ст. Ош. В **р-уров.

ЛТА, % 0,34 0,06 0,03 0,01 0,0001

IL-2 0,26 0,07 0,04 0,01 0,0004

D-димер 0,17 0,06 1,05 0,39 0,009

MTHFR-677T 0,37 0,08 0,23 0,05 0,0001

ILI0-I082A -0,22 0,05 -0,16 0,04 0,0001

АЧТВ -0,17 0,05 -0,04 0,01 0,0008

IL2-330G -0,28 0,1 -0,24 0,08 0,004

FV(Leiden)-1691А 0,18 0,06 0,25 0,09 0,007

Примечание: beta - регрессионный коэффициент: **р - уровень статистической значимости (достоверен при р<0.05).

Значение множественного коэффициента корреляции составило 0,885, коэффициент детерминации (R-квадрат) - 0,78, а уровень значимости регрессионной модели составил меньше 0,0001.

Таким образом, высокую прогностическую ценность имеет определение ЛТА, концентрации IL-2, D-димера, полиморфизма гена MTHFR (С677Т), полиморфизма гена ILIO (G1082A), АЧТВ, полиморфизма гена IL-2 (T303G) и полиморфизма гена РУ(Лейден) (G1691 А), что может использоваться в диагностическом процессе с целью предсказания развития гемокоагуляционных нарушений и позволит провести профилактику развития тромбоэмболических осложнений.

Учитывая полученные результаты в процессе наших исследований, мы предлагаем схему патогенеза гемокоагуляционных осложнений у больных с политравмой (рис. 7).

- ».ткан

__травма

MTHfR (CS77T) гомоцистеин

^ W I

: / \

репарация

Миграция Лимфоцитов

i V\

фиэринолиз

тромб

.эмболия

Рисунок 7. Схема патогенеза гемокоагуляционпых осложнений у пациентов с политравмой.

Полученные сведения указывают на повышенный первичный риск тромбоза у пациентов, несущих отдельные аллельные варианты протромботи-ческих генов и модулирующее влияние на тромбогенез транслируемых 1Ь-2 и 11,-10, концентрации которых зависят от 5МР соответствующих генов.

Мы считаем, что изученные полиморфизмы генов и транслируемые ими белки (факторы свертывания, цитокины, фермент) прямо или косвенно вовлекаются в патогенез тромбообразования и тромбоэмболии, часто осложняющие политравму.

Таким образом, изучение полиморфизмов генов цитокинов, протром-ботических генов, лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии является ярким примером тесной взаимосвязи иммунитета и гемостаза, являющихся составными частями единой интегральной клеточно-гуморальной системы защиты организма, в которых цитокины выполняют роль связующего звена.

1. Частоты аллели А SNP гена фактора V (Leiden) (G1691A), аллели А гена протромбина (G20210A), аллели Т SNP гена MTHFR (С677Т) у пациентов при осложненной тромбоэмболией политравме выше, чем при неосложненной. Относительный риск развития тромбоэмболичес-ких осложнений при политравме у носителей аллели А SNP гена фактора V (Leiden) (Gl691 А) составляет 2,64, аллели А гена протромбина (G20210A) - 3,91, аллели Т SNP гена MTHFR (С677Т) - 2,18.

ВЫВОДЫ

2. Аллельный полиморфизм генов IL-2 и IL-10 снижает риск развития тромбоэмболических осложнений при политравме. Показатель относительного риска тромбоэмболии у носителей аллели G SNP гена IL-2 (T330G) составляет 0,952, аллели A SNP гена IL-10 (G1082A) - 0,746, аллели Т SNP гена IL-10 (С819Т) - 0,690. Гомозиготный и гетерозиготный варианты носительства указанных аллелей чаще наблюдаются в группе пациентов с политравмон без гемокоагуляци-онных осложнений.

3. При политравме повышается продукция провоспалительных цитоки-нов TNF а, IL-lß, IL-8, a также TGFß. Политравма сопровождается увеличением содержания IL-2 и IL-10 независимо от генотипа и наличия осложнений. Значения концентрации IL-2 и IL-10 при политравме зависят от генотипа SNP гена IL-2 (T330G), SNP гена IL-10 (G1082A) и наличия тромбоэмболии. Наиболее значимым для повышения концентрации IL-2 является генотип Т/Т полиморфизма гена IL-2 при наличии тромбоэмболических осложнений, а уровня IL-10 генотип А/А полиморфизма гена IL-10 (G1082A), генотип Т/Т полиморфизма IL-10 (С819Т) у пациентов с неосложненным течением политравмы.

4. При политравме на 3-й день повышается лимфоцитарно-тромбоци-тарная адгезия. Наибольшая способность лимфоцитов вступать в контакт с тромбоцитами отмечена у носителей генотипов Т/Т SNP гена IL-2 (T330G), G/G SNP (G1082A) при развитии тромбоэмболических осложнений политравмы.

5. В регрессионной модели развития тромбоэмболических осложнений политравмы наибольшей значимостью обладает определение ЛТА, IL-2, D-димера, полиморфизма гена MTHFR (С677Т), полиморфизма гена ILIO (G1082A), АЧТВ, полиморфизма гена IL2 (T330G) и полиморфизма гена FV(Leiden) (G1691A).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России

1. Содержание в крови TGFa и TGFßl у больных с механической и термической травмой / К.Г. Шаповалов, В.В. Доржеев и [др.] // Вестник травматологии и ортопедии имени H.H. Приорова. - 2008. - № 4. - С. 71-73.

2. Доржеев, В.В. Полиморфизм генов фактора V Лейден (G1691A), протромбина (G20210A) и метилентетрагидрофолатредуктазы (С677Т) у больных с тромбоэмболическими осложнениями при политравме в Забайкальском крае [Электронный ресурс] / В.В. Доржеев, Ю.А. Витковский // Забайкальский медицинский вестник, 2014. - № 2. - С. 60-63. - Режим доступа: http://cliitgma.ru/zmv2.

3. Доржеев, B.B. Содержание IL-1B, IL-2, IL-8, IL-10 и TNFA у пациентов с политравмой [Электронный ресурс] / В.В. Доржеев // Забайкальский медицинский вестник. - 2014. - № 4. - С. 132-135. -Режим доступа: http://chitgma.ru/zmv2.

Прочие:

4. Профилактика и лечение тромбоэмболических осложнений у больных с политравмой / М.В. Бубенко, В.В. Доржеев [и др.] // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения РАМН. - 2008. - № 3. - Иркутск, 2008. - С. 59-60.

5. Актуальность лечения больных с сочетанной травмой таза / М.В. Бубенко, В.В. Доржеев [и др.] // Травматология и ортопедия третьего тысячелетия : тез. междунар. конф. - Чита-Маньчжурия, 2008. - С. 32-33.

6. Профилактика и лечение осложнений у больных с тяжелой политравмой / М.В. Бубенко, В.В. Доржеев [и др.] // Забайкальский мед. вестник. 2008. - Спец. вып. - Чита, 2008. - С. 32-33.

7. Мироманов, A.M. Состояние некоторых показателей цитокинов у больных с открытыми переломами длинных костей конечностей и их диагностическая значимость / A.M. Мироманов, A.B. Бусоедов, В.В. Доржеев // Забайкальский мед. вестник, 2008. - Спец. вып. -Чита, 2008. - С. 64-65.

8. Мироманов, A.M. Показатели TGFa, TGFßl у больных с сочетанной травмой и открытыми переломами / A.M. Мироманов, A.B. Бусоедов, В.В. Доржеев // Лечение сочетанных травм н повреждений конечностей : Всерос. юбилейная науч.-практ. конф. - М., 2008. - С. 59.

9. Доржеев, В.В. Прогнозирование и лечение тромбоэмболических осложнений у больных с политравмой / В.В. Доржеев, A.M. Мироманов, Ю.А. Витковский // Травматология и ортопедия на Дальнем Востоке : достижения, проблемы, перспективы : материалы I (учредительного) съезда травматологов-ортопедов Дальневосточного федерального округа. - Хабаровск, 2009. - С. 78-79.

10. Доржеев, В.В. Прогнозирование тромбоэмболических осложнений у больных с политравмой / В.В. Доржеев // Инновационные аспекты научно-исследовательских разработок в области вертеб-рологии, травматологии и ортопедии, нейрохирургии, нейроонко-логии : материалы Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием с элементами научной школы для молодежи (Цивьяновские чтения). - Новосибирск, 2010. - С. 124-125.

11. Сизоненко, В.А. Биорегулирующая терапия у больных с сочетанной политравмой / В.А.Сизоненко, В.В. Доржеев, A.M. Мироманов // Повреждения при дорожно-транспортных происшествиях и их последствия : нерешенные вопросы, ошибки и осложнения :

сборник тез. докл. II Московского междунар. конгр. травматологов и ортопедов (Москва, 24-25 марта, 2011). - М. : ГЭОТАР-Ме-диа, 2011. - С. 98.

12. Доржеев, В.В. Наследственные тромбофилии у больных с политравмой / В.В. Доржеев, Ю.А. Витковский // Хирургические технологии лечения патологии позвоночника и суставов : материалы Все-рос. науч.-практ. конф. с междунар. участием с элементами научной школы для молодежи, посвящ. 65-летию Новосибирского НИ-ИТО (Цивьяновские чтения) [Электронный ресурс]. - Новосибирск, 2011. - 1 электрон, опт. диск. - С. 130-131.

13. Мироманов, A.M. Профилактика венозных тромбоэмболических осложнений при повреждениях и заболеваниях опорно-двигательного аппарата / A.M. Мироманов, В.В. Доржеев // Многопрофильная больница : проблемы и решения : маг. XVI Всерос. науч.-практ. конф. ( Ленинск-Кузнецкий, 6-7 сент. 2012 г.). - Кемерово : Примула, 2012. - С. 87.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AT - антитела

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время

ИФА - иммуноферментный анализ

Л ТА - лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия

МНО - международное нормализованное отношение

MTHFR - метилентетрагидрофолатредуктаза

ПЦР - полимеразная цепная реакция

АРС - активированный протеин С

CD - кластер дифферениировкн

FVL - фактор V Leiden

F - фактор

IL - интерлейкин

OR - относительный риск

Me - медиана

TGFß - трансформирующий фактор роста бета

TNF - фактор некроза опухолей

TF - тканевой фактор

Лицензия ИД№03077 от23.10.00. Подписано в печать 20.02.2015. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman Формат 60 х 84 V|6. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100. Заказ № 29/2015.

Отпечатано в редакционно-издательском центре ЧГМА 672090, Чита, ул. Горького, 39-а.