Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Полиморфизм генов и секреция in vitro про- и противовоспалительных цитокинов при туберкулезе легких

На правах рукописи

Никулина Евгения Леонидовна

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ И СЕКРЕЦИЯ IN VITRO ПРО- И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ ЛЕГКИХ

14.03.03 - патологическая физиология 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

9 ИЮН 2011

Томск-2011

4849203

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук

Уразова Ольга Ивановна Наследникова Ирина Олеговна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Федорова Татьяна Сергеевна Солонский Анатолий Владимирович

Ведущая организация:

ФГУ Новосибирский НИИ туберкулеза Минздравсоцразвития России, г. Новосибирск, ул. Охотская, 81а

Защита состоится: «¿р^» №2011 г. на заседании диссертационного совета Д 208.096.01 при Сибирском государственном медицинском университете (634050, г. Томск, Московский тракт, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета (г. Томск, проспект Ленина, 107)

Автореферат разослан «

Ученый секретарь диссертационного совета

2011г.

Петрова И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на существенные достижения отечественной и зарубежной медицины и фармакологии, туберкулез, ежегодно уносящий жизни около 2 млн. человек во всем мире, остается одной из ведущих проблем современной медико-биологической науки [Kumar V. et al., 2007; Шкарин A.B., 2008; Филиппова Т.П. и соавт., 2009]. В иммунопатогенезе туберкулеза принципиальны два основных фактора: генетическая организация инфицирующего штамма Mycobacterium tuberculosis и характер иммунного ответа макроорганизма [Непао M.I., 2006; Ates О., 2008].

Решающий момент специфического иммунного ответа при туберкулезной инфекции - ответ CD4+ ThO-клеток на распознавание антигена. На данном этапе определяется форма иммунного ответа: с преобладанием антител или клеточных реакций, что зависит от множества факторов: качества и дозы антигена, цитокинового фона микроокружения, наличия или отсутствия цитокинсвязывающих рецепторов и других мембранных молекул на иммунокомпетентных клетках. Показано, что Thl- и ТЬ2-лимфоциты отличаются не только фенотипически, но и по спектру продуцируемых ими цитокинов, однако общей чертой этих двух альтернативных субпопуляций является высокая чувствительность к стимулирующему пролиферацию действию интерлейкинов (IL)-2 и IL-4 [Фрейдлин И.С., 1998; Непао M.I., 2006; Шкарин A.B., 2008; Каралян М.А., 2010; Салина Т.Ю., Морозова Т.И., 2010; Сахно JI.B. и соавт., 2010].

IL-2 играет ключевую роль в иммунопатогенезе туберкулезной инфекции, что связано с его способностью оказывать аутокринное (на Thl) и паракринное (на Th2) воздействие, вызывать смещение баланса Thl/Th2 в направлении Т-клеточных реакций, регулировать рост и активность Т- и B-лимфоцитов, натуральных киллеров, моноцитов/макрофагов, определять интенсивность реакций гиперчувствительности замедленного типа [Хаитов P.M., 2006; Сахно JI.B. и соавт., 2010].

В структуре цитокинов, секретируемых регуляторными Т-клетками, IL-10 и трансформирующий фактор роста (TGF)-ß проявляют иммуносупрессорное действие [Непао M.I., 2006; Kumar V. et al., 2007; Корженевская K.B. и соавт., 2010]. Противовоспалительный IL-4, являясь продуктом CD4+ Т-лимфоцитов/хелперов с фенотипом Th2, выступает в качестве антагониста ТЫ-ассоциированных цитокинов, способствуя тем самым поляризации иммунного ответа в направлении гуморального типа реагирования [Хаитов P.M., 2001; Кучер А.Н. и соавт., 2009; Коненков В.И. и соавт., 2010]. Основная функция 1L-4 - контроль пролиферации, дифференцировки В-лимфоцитов в плазматические клетки и антителогенеза, в том числе за счет угнетения продукции провоспалительных цитокинов: IL-1, IL-6, IL-8, фактора некроза опухолей (TNF)-a [Фрейдлин И.С., 1998; Сахно JI.B. и соавт., 2010].

Характер течения воспалительного ответа, направленность противоинфекционного иммунитета при туберкулезной инфекции в значительной мере определяются особенностями межклеточной кооперации иммуноцитов, как модулируемыми в ответ

на воздействие M. tuberculosis, так и генетически детерминированными. Это влияние может быть опосредовано через изменение продукции и связывания иммунорегуляторных цитокинов иммунокомпетентными клетками [Сенников C.B. и соавт., 2002, 2005; Салина Т.Ю., Морозова Т.И., 2010]. В настоящее время высказывается предположение о связи генетически детерминированной гипер- или гипопродукции цитокинов с качеством иммунного ответа, ассоциативности аллельных вариантов генов цитокинов с тяжестью и продолжительностью инфекционных заболеваний [Рудко A.A., 2004; Коненков В.И. и соавт., 2009, 2010; Шевченко A.B. и соавт., 2010].

Структурные особенности белковых продуктов полиморфных генов цитокинов обуславливают дифференциацию иммунного ответа организма на бактериальную агрессию, определяющую течение и исход инфекционных заболеваний [Сенников C.B. и соавт., 2002; Гончарова И.А. и соавт., 2006]. Гены цитокинов имеют аллельные варианты, характеризующиеся большей или меньшей активностью белка либо различным уровнем его экспрессии. Показано, что полиморфные сайты T-330G гена IL2, С-590Г гена IL4, С-592А гена ILIO, G-308A гена TNFA, +874А/Т гена IFNG, С-509Т гена TGFB ассоциированы с уровнем продукции соответствующих цитокинов [Симбирцев A.C., 1998; Tso H.W. et al., 2005; Авдошина B.B. и соавт., 2006; Гончарова И.А. и соавт., 2006; Henao M.I., 2006; Ates О., 2008; Осташкин A.C. и соавт., 2008].

В свете вышеизложенного представляется весьма актуальным изучение секреции in vitro про- и противовоспалительных цитокинов в ассоциации с анализом полиморфизма их генов при туберкулезной инфекции, что в свою очередь может быть положено в основу разработки новых подходов к прогнозированию ее клинического течения, а также патогенетически оправданных способов профилактики и иммунокоррекции при данной патологии.

Цель исследования. Оценить модулирующее влияние аллельного полиморфизма иммунорегуляторных генов на секрецию про- и противовоспалительных цитокинов in vitro у больных туберкулезом легких.

Задачи исследования:

1. Изучить распространенность полиморфных сайтов T-330G гена IL2, С-590Т гена IL4, С-592А гена ILIO, G-308A гена TNFA, +874А/Т гена IFNG, С-509Ггена TGFB среди больных туберкулезом легких г. Томска и Томской области.

2. Оценить особенности CD-субпопуляционного состава лимфоцитов крови и секреции in vitro про- и противовоспалительных цитокинов в ассоциации с аллельным полиморфизмом иммунорегуляторных генов у больных туберкулезом легких г. Томска и Томской области.

3. Изучить связь аллельных вариантов T-330G гена IL2, С-590Т гена IL4, С-592А гена ILIO, G-308A гена TNFA, +874А/Т гена IFNG, С-509Т гена TGFB с клиническими формами (инфильтративная и диссеминированная) туберкулеза легких.

Научная новизна. С привлечением современных молекулярно-генетических и иммунологических методов исследования охарактериризована секреция in vitro про- и противовоспалительных цитокинов и оценена роль аллельного полиморфизма их генов (II. 2, TNFA, IFNG, IL4, ILIO, TGFB) при отдельных клинических формах туберкулезного процесса. Показано, что частота встречаемости аллеля G и генотипа GG (T-330G) гена 1L2, генотипа TT (С-590Т) гена 1L4 и генотипа АА (G-308A) гена TNFA значимо выше при диссеминированном, чем при инфильтративном туберкулезе легких. Риск развития туберкулеза легких ассоциирован с генотипами GG (T-330G) гена IL2; CT и TT (С-590Т) гена IL4, АА (С-592А) гена ILIO; GA и АА (G-308A) гена TNFA; TT (С-509Т) гена TGFB и АА (+874А/Т) гена IFNG.

Выделены ключевые генетические факторы, опосредующие изменения секреции основных цитокинов иммунного ответа на Mycobacterium tuberculosis и связанный с ними дисбаланс CD-субпопуляционного состава лимфоцитов крови при туберкулезе легких. Установлено, что Т-клеточный дефицит у больных туберкулезом легких сочетается с гипосекрецией IL-2 и увеличением продукции IL-10 in vitro, которые в свою очередь связаны с носительством аллеля G и генотипа GG (T-330G) гена IL2 и аллеля А и генотипа АА (С-592А) гена ILIO. При этом повышенное содержание CD20+ B-лимфоцитов в крови сопряжено с гиперсекрецией 1L-4 in vitro в связи с носительством «патологического» аллеля Т и генотипа CT (С-590Т) гена IL4.

Практическое и теоретическое значение работы. Полученные данные фундаментального характера раскрывают новые молекулярно-генетические аспекты развития туберкулеза легких. Результаты исследования CD-субпопуляционного состава лимфоцитов крови и секреции in vitro про- и противовоспалительных цитокинов в ассоциации с аллельным полиморфизмом иммунорегуляторных генов (IL2, IL4, ILIO, TNFA, IFNG и TGFB) представляются важными для формирования знаний о взаимосвязи особенностей генофондных параметров популяции с закономерностями развития туберкулезной инфекции, позволяют глубже проникнуть в молекулярные механизмы данной патологии. Положения исследования могут служить базисом не только для дальнейшего изучения патогенетических механизмов туберкулезного процесса, но и для разработки новых подходов к прогнозированию клинического течения и исхода туберкулеза легких.

Положения, выносимые на защиту: 1. Среди аллельных вариантов генов цитокинов у больных туберкулезом легких чаще, чем у здоровых доноров обнаруживаются аллель G и генотип GG (T-330G) гена IL2, аллель Т и генотип CT (С-590Т) гена IL4, аллель А и генотип АА (С-592А) гена ILIO, аллель А и генотипы GA и АА (G-308A) гена TNF А, аллель Т и генотип TT (C-S09T) гена TGFB и аллель А и генотип АА (+874А/Т) гена IFNG. У пациентов с инфильтративной формой туберкулеза легких также преобладают генотипы CT (С-590Т) гена IL4 и GA (G-308A) гена TNF А, а у больных диссеминированным туберкулезом легких - TT (С-590Т) гена IL4 и генотип АА (G-308A) гена TNF А.

2. Гипосекреция IL-2 и гиперсекреция IL-4, IL-10 in vitro и связанный с ними Т-клеточный дефицит у больных туберкулезом легких сопряжены с аллельным полиморфизмом генов 1L2 (T-330G), IL4 (С-590Т), III0 (С-592А).

3. Генотипы GG (T-330G) гена IL2, СТкТТ (С-590Т) гена IL4, АА (С-592А) гена IL10, GA и АА (G-308A) гена TNFA, ТТ (С-509Т) гена TGFB и АА (+874А/Т) гена IFNG ассоциированы с риском заболевания туберкулезом легких. К развитию диссеминированной формы туберкулеза легких предрасполагает носительство «патологических» генотипов GG (T-330G) гена IL2, ТТ (С-590Т) гена IL4 и АА (G-308А) гена TNFA.

Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии» (Томск, 2009), научной конференции с международным участием «Нейрогуморальные механизмы регуляции висцеральных органов и систем в норме и при патологии» (Томск, 2009), Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 2010), XV и XVI межгородских конференциях молодых учёных «Актуальные вопросы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2009, 2010), VIII Российско-германской научно-практической конференция «Инновации в медицине. Социально значимые инфекции» (Новосибирск, 2009), X и XI международных конгрессах молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2009, 2010), научных семинарах кафедры патофизиологии ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (Томск, 2008-2011).

Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по образованию РФ в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (государственный контракт П718 «Поиск факторов риска и прогнозирования течения и исходов социально значимых заболеваний на основе полиморфных ДНК-маркеров») и Министерства образования и науки РФ по ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (государственный контракт №16.512.11.2046 «Разработка комплекса молекулярно-генетических маркеров дизрегуляции иммунного ответа на Mycobacterium tuberculosis для оптимизации диагностики и коррекции вторичной иммунологической недостаточности при туберкулезе легких»).

Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре патофизиологии (разделы «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунитета», «Воспаление») ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России.

Публикации. По теме диссертации опубликована 21 работа, из них 10 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов, списка

литературы. Работа иллюстрирована 4 рисунками и 32 таблицами. Библиографический указатель включает 250 источников, из них 149 отечественных и 101 зарубежных авторов.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации.

Соискателем лично были выполнены анализ данных литературы по теме диссертации, планирование исследования, постановка цели и задач исследования, пробоподготовка, СО-типирование, иммуноферментный анализ, выделение ДНК, аллель-специфическая полимеразная цепная реакция, статистический анализ результатов, написание и оформление диссертации.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящей работе приведены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 160 больных (114 мужчин и 46 женщин) с впервые выявленным туберкулёзом лёгких (ТЛ) в возрасте от 18 до 55 лет (средний возраст 43,32±13,62 лет). Пациенты находились на стационарном лечении в Томской областной клинической туберкулёзной больнице (гл. врач - канд. мед. наук Г.В. Янова) во фтизиотерапевтических отделениях № 1 (зав. отд. - О.И. Новосельцева), № 2 (зав. отд. - Т.З. Малиновская).

Диагноз ТЛ устанавливался на основании клинической картины заболевания, рентгенологического исследования легких, данных микроскопического и бактериологического исследования мокроты. Клиническая форма заболевания определялась на основании данных рентгенологического исследования легких. У всех обследованных пациентов отмечался распространенный деструктивный характер поражения легочной ткани.

Инфильтративный туберкулез легких (ИТЛ) был диагностирован у 110 (68,75%) пациентов и характеризовался на рентгенограмме наличием одной или нескольких неоднородных теней туберкулезного инфильтрата диаметром от 5 до 7 см с очагами распада и обсеменения. Диссеминированный туберкулез легких (ДТЛ) был выявлен у 40 (25%) больных, его рентгенологическим признаком являлось наличие в одном или обоих легких мелких и среднеочаговых изменений неоднородной структуры за счет инфильтрации и распада. Диагноз фиброзно-кавернозного туберкулеза легких был выставлен 7 (4,375%) больным и характеризовался на рентгенограмме наличием нескольких кольцевидных теней более 2 см в диаметре, а также выраженным пневмофиброзом. Двум (1,25%) пациентам был поставлен диагноз туберкулемы и одному (0,625%) больному - казеозная пневмония.

В большинстве случаев просматривался сочетанный характер фаз специфического процесса. Бактериовыделение регистрировалось в 100% случаев болезни. Возбудитель туберкулеза выявляли методом прямой световой микроскопии мазка мокроты, окрашенного по Цилю-Нильсену, а также методом люминесцентной микроскопии с использованием флуорохрома (аурамина). Исследования проводились в

бактериологических лабораториях Томской областной туберкулезной клинической больницы (гл. врач - канд. мед. наук Г.В. Янова) и Томского областного противотуберкулезного диспансера (гл. врач - С.П. Мишустин). В исследование не включались пациенты моложе 18 и старше 55 лет, инфицированные вирусами иммунодефицита человека и гепатита В и С, страдающие аллергическими, иммунологическими и другими инфекционными заболеваниями в стадии обострения.

Группу сравнения составили 102 здоровых донора с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту, не имеющие в анамнезе хронических инфекционных заболеваний, аллергических реакций, заболеваемость острыми респираторными вирусными и бактериальными инфекциями которых составляла не чаще 3-4 раз в год.

Определение общего количества лейкоцитов в периферической крови проводили общепринятыми гематологическими методами.

Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови осуществляли с помощью моноклональных антител: к CD3 (общий маркер Т-лимфоцитов), CD4 (маркер Т-хелперов/индукторов и регуляторных Т-клеток), CD8 (маркер цитотоксических Т-лимфоцитов), CD16 (маркер натуральных киллеров), CD20 (маркер В-лимфоцитов).

Выделение мононуклеарных лейкоцитов из цельной крови выполняли на градиенте плотности фиколл-урографина (р=1077 кг/м3) («Медбиоспектр», Россия).

Определение содержания IL-2, IL-4, IL-10, TNF-a, IFN-y и TGF-ß в супернатантах купътуралъных суспензий проводили с помощью твердофазного иммуноферментного «сэндвичевого» метода. Процедуру анализа выполняли по инструкциям, предлагаемым производителями тест-систем («Протеиновый контур», Россия; «Biosource», США).

Выделение ДНК из периферической крови проводили сорбентным методом согласно инструкции, прилагаемой к набору «ДНК-сорб-В» («ИнтерЛабСервис», Россия).

Дня исследования полиморфных участков генов цитокинов использовали аллель-специфическую амплификацию специфических участков генома [Кофиади И.А., 2006]. Амплификацию осуществляли согласно инструкции, прилагаемой к набору «АмплиСенс-200-1» («ИнтерЛабСервис», Россия), в пробирках типа «Эппендорф» путём полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе, с применением амплификатора «Терцик МС2» («ДНК-технология», Россия). Было исследовано шесть полиморфных сайтов генов шести цитокинов: T-330G гена IL2 (rs2069762), С-590Т гена IL4 (rs2243250), С-592А гена ILIO (rsl 800872), G-308A гена TN FA (rsl800629), +874A/T гена IFNG (rs2340561), C-509Tгена TGFB (rsl 800469). В качестве маркера размера ДНК использовали плазмиду pUC19, расщепленную рестриктазой Mspl («Сибэнзим», Россия).

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием стандартного пакета программ SPSS v. 11.0. Для всех имеющихся выборок данных проверяли гипотезу нормальности распределения по критерию Колмогрова-Смирнова. Для каждой выборки вычисляли медиану, 25-й и 75-й пронентили. Для оценки достоверности различий выборок, не подчиняющихся нормальному распределению, использовали U-критерий Манна-Уитни (для независимых выборок) и критерий Вилкоксона (для зависимых выборок). Для исследования взаимосвязи признаков использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05. Распределение генотипов по исследуемым полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга с помощью точного теста Фишера. Для сравнения частот аллелей между различными группами использовали критерий у? Пирсона с поправкой Йетса. Обработка результатов генетических исследований .осуществлялась с использованием критерия отношения шансов OR с расчетом для него 95% доверительного интервала [ФлейсДж., 1989].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Одна из важных особенностей Т-лимфоцитов - способность синтезировать цитокины, которые осуществляют регуляцию иммунных процессов в организме [Фрейдлин И.С., 2001]. Макрофаги посредством секретируемых в ответ на микобактериальную инфекцию IL-1, IL-12, TNF-a способствуют дифференцировке и клональной экспансии Thl и, соответственно, формированию Thl-иммунного ответа. Thl-лимфоциты, продуцирующие IL-2 и IFN-y, выполняют основную защитную роль против Mycobacterium tuberculosis, тогда как производство Т112-ассоциированных цитокинов и медиаторов с иммуносупрессорной активностью (в частности IL-4, IL-10 и TGF-P), согласно парадигме Thl/Th2, способствует реализации иммунного ответа по гуморальному типу с одновременным подавлением Т-клеточных реакций, что приводит к клинической манифестации туберкулезной инфекции [Power С.А., 1998; Хаитов P.M. исоавт., 2011].

В настоящее время не вызывает сомнения то, что генетические факторы в значительной мере определяют восприимчивость организма к различным заболеваниям, в том числе и инфекционной природы. Так, у большинства людей, инфицированных М. tuberculosis, развивается протективный иммунитет, и лишь у 510% людей иммунный ответ оказывается неэффективным, в результате чего происходит реактивация латентно протекающей инфекции и развитие активных форм туберкулеза [Игмангулова М.М., 2005]. Это может быть обусловлено тем, что генетический контроль за функционированием иммунной системы вариабелен и может повышать риск заболевания TJI. В связи с тем, что экзонные последовательности генов цитокинов очень консервативны, а экспрессия соответствующего участка генома непосредственно контролируется его промотором, в настоящей работе был исследован

функциональный полиморфизм генов иммунорегуляторных цитокинов. В силу особенностей иммунопатогенеза TJI актуальным было изучение влияния алелльного полиморфизма генов IL2, IL4, ILIO, TNFA, IFNG, TGFB на уровень спонтанной и BCG-индуцированной продукции соответствующих цитокинов in vitro.

При сравнении частот аллелей и генотипов у больных ТЛ и здоровых доноров была установлена связь полиморфизма генов про- и противовоспалительных цитокинов с развитием TJI. Аллели 330G гена IL2, 308А гена TNF А, 874А гена IFNG, 590Т гена IL4, 592А TtazILlO, 509Т гена TGFB значимо чаще регистрировались в группе больных TJ1, чем в группе здоровх доноров (табл. 1).

Таблица 1

Распределение генотипов и аллелей полиморфизмов генов цитокинов (%, абс.) среди здоровых доноров и больных туберкулезом легких

Полиморфизм Генотипы и аллели Характеристика обследованных лиц х2 OR (95% CI)

Здоровые доноры Больные туберкулезом легких

1 2 3 4 5 6

T-330G гена IL2 TT 46,08 (47) 21,25 (34) 21,98 (Pi<0,05) 0,32(0,18-0,54)

TG 46,08 (47) 55,63 (89) 1,47 (0,89-2,42)

GG 7,84 (8) 23,12(37) 3,53 (1,57-7,95)

G 30,88 (63) 50,94(163) 19,62 (Pi<0,05) 2,32(1,61-3,36)

G-308A гена TNF А GG 50,00(51) 29,37 (47) 11,77 (р,<0,05) 0,42 (0,25-0,70)

GA 42,15 (43) 56,25 (90) 1,76(1,07-2,91)

AA 7,85 (8) 14,38 (23) 1,97(0,85-4,60)

А 29,04 (59) 42,52 (136) 9,83 (Pi<0,05) 1,82(1,25-2,64)

+874 А/Т гена IFNG AA 17,65 (18) 36,25 (58) 12,80 (pi<0,05) 2,64(1,45-4,85)

AT 53,92(55) 48,13 (77) 0,79 (0,48-1,30)

TT 28,43 (29) 15,62(25) 0,47 (0,25-0,85)

T 55,43 (ИЗ) 39,61 (127) 12,38 (Р.<0,05) 0,53 (0,37-0,76)

С-590Т гена 1L4 CC 69,61 (71) 48,75 (78) 9,39 (pi<0,05) 0,42 (0,25-0,70)

CT 26,47 (27) 45 (72) 2,33 (1,33-3,90)

TT 3,92 (4) 6,25 (10) 1,63 (0,50-5,35)

T 17,16(35) 28,75 (92) 9,12 (Pt<0,05) 1,95 (1,26-3,02)

С-592А гена ILIO CC 48,04 (49) 30,62 (49) 9,46 (Pi<0,05) 0,48 (0,29-0,80)

CA 44,12 (45) 53,13 (85) 1,44 (0,87-2,36)

AA 7,84 (8) 16,25 (26) 2,28 (1,01-5,26)

А 29,91 (61) 42,82(137) 8,83 (pi<0,05) 1,75 (1,21-2,55)

Окончание табл. 1

1 2 3 4 5 6

СС 43,14(44) 21,87 (35) 14,38 (pl <0,05) 0,37(0,21-0,63)

CT 42,16(43) 51,88 (83) 1,48(0,90-2,44)

С-509Т TT 14,70(15) 26,25 (42) 2,06(1,08-3,96)

гена TGFB т 35,81 (73) 52,22(167) 13,50 (Pi<0,05) 1,96(1,37-2,81)

Примечание. Здесь и в последующих таблицах 2 и 3: pi - уровень статистической значимости различий гто сравнению с соответствующими показателями у здоровых доноров; х2 -стандартный критерий Пирсона для сравнения частот генотипов и аллелей генов; OR -критерий отношения шансов, отражающий относительный риск развития заболевания при определенном генотипе по сравнению со здоровыми донорами с 95% доверительным интервалом.

Относительный риск для носителей генотипов GG (T-330G) гена IL2, GA (G-308A) гена TNF А, АА (+874А/Т) гена IFNG, CT (С-590Т) гена IIA, АА (С-592А) гена ILIO и TT (С-509Т) гена TGFB был достоверно выше единицы, что позволило сделать вывод о предрасполагающем к заболеванию эффекте этих генотипов. Кроме этого, выявлена протективная роль в отношении TJI генотипов TT (T-330G) гена IL2, GG (G-308A) гена TNF А, TT {+874А/Т) гена IFNG, СС (С-590Т) гена ¡14, СС (С-592А) гена ILIO и СС (С-509Т) гена TGFB (табл. 1).

У больных с инфильтративной и диссеминированной формами ТЛ распределение частот аллелей и генотипов исследуемых генов цитокинов было сходным. Однако в группе больных ДТЛ значимо чаще регистрировался аллель 330G гена IL2, нежели в группе больных ИТЛ. Ассоциацию с развитием ИТЛ проявляли генотипы GA (G-308A) гена TNFA и CT (С-590Т) гена IL4, а с развитием ДТЛ - генотипы АА (G-308A) гена TNFA и CT и TT (С-590Т) гена/« (табл. 2).

Исследования ассоциаций аллельных вариантов генов цитокинов с заболеваниями связаны с попытками установить иммуногенетические маркеры, предрасполгающие к их развитию. ТЛ относится к группе мультифакторных заболеваний, в основе которых лежит, наряду с действием болезнетворных факторов внешней среды, неблагоприятное сочетание аллельных вариантов генов, в частности генов иммунного контроля [Гончарова И.А. и соавт., 2006]. Это обусловлено полиморфностью системы цитокинов, их плейотропным действием, а также тем, что конечный эффект воздействия на клетку формируется комплексом медиаторов. В связи с этим приоритетным на сегодня является изучение взаимосвязи того или иного заболевания с целым рядом аллельных вариантов генов цитокинов [Сенников C.B., 2002].

В ходе проведенного исследования было показано, что наибольший риск развития ТЛ ассоциирован с одновременным носительством гомозиготных генотипов GG (Г-330G) гена IL2 и АА (+874А/Т) гена IFNG (OR=7,97). Протективный эффект в отношении ТЛ опосредован сочетанием генотипов TT (T-330G) гена IL2 и СС (С-592А) гена ILIO (OR=0,14).

Таблица 2

Распределение генотипов и аллелей полиморфизмов генов цитокинов (%, абс.) среди здоровых доноров и больных туберкулезом

легких в зависимости от клинической формы заболевания

Полиморфизм Генотипы и аллели Здоровые доноры Больные ИТЛ 1 Г (Ж (95% С1) Больные ДТЛ х2 (Ж (95% СГ)

т-ззов гена 1Ь2 ТТ 46,08 (47) 24,55 (27) 12,21 (Р1<0,05) 0,38(0,21-0,68) 12,5 (5) 19,62 (р,<0,05) 4,30 (р,<0,05) 0,17 (0,06-0,46)

те 46,08 (47) 58,18(64) 1,63 (0,95-2,80) 57,5 (23) 1,58(0,76-3,31)

вв 7,84(8) 17,27 (19) 2,36(1,01-6,32) 30,00(12) 5,04(1,87-13,54)

в 30,88 (63) 46,36 (102) 10,67 (р,<0,05) 1,93 (1,30-2,88) 58,75 (47) 18.81 (р,<0,05) 3,60 (р2<0,05) 3,19(1,87-5,44)

С-ЗОЯЛ гена ГМРА вв 50,00(51) 31,81 (35) 7,60 (р,<0,05) 0,47 (0,27-0,82) 25,00 (10) 10,02 (р,<0,05) 3,38 (р2<"0,05) 0,33 (0,15-0,75)

вА 42,15 (43) 60,00 (66) 2,06(1,19-3,56) 52,50(21) 1,52 (0,73-3,16)

АА 7,85 (8) 8,19 (9) 1,05 (0,39-2,83) 22,50 (9) 3,41 (1,21-9,61)

А 29,04(59) 38,24 (84) 4,06 (р|<0,05) 1,52(1,01-2,28) 48,67 (39) 10,00 (р,<0,05) 2,71 (Р2>0,05) 2,34(1,37-3,98)

+874 А/Т гена ¡РКС АА 17,65 (18) 34,55 (38) 10,62 (р,<0,05) 2,46 (1,29-4,69) 45(18) 11,54(р,<0,05) 0, 45 (р2>0,05) 3,82 (1,71-8,54)

АТ 53,92 (55) 50,91 (56) 0,89 (0,52-1,52) 40(16) 0,57 (0,27-1,20)

ТТ 28,43 (29) 14,54(16) 0,43 (0,22-0,85) 15(6) 0,44(0,17-1,17)

Т 55,43 (113) 40,00 (88) 10,06 (р]<0,05) 0,54 (0,36-0,79) 35,00 (28) 9,56 (р,<0,05) 0,62 (р,>0,05) 0,43 (0,25-0,74)

С-590Т гена 114 СС 69,61 (71) 51,82(57) 7,61 (Р1<0,05) 0,47 (0,27-0,83) 42,50(17) 9,89 (р,<0,05) 4,36 (р2<0,05) 0,32 (0,15-0,69)

СТ 26,47 (27) 44,55 (49) 2,23(1,25-3,89) 45,00(18) 2,27(1,06-4,87)

ТТ 3,92 (4) 3,63 (4) 0,92 (0,23-3,80) 12,50 (5) 3,50(1,01-13,78)

Т 17,16 (35) 25,91 (57) 4,77 (р,<0,05) 1,69(1,05-2,71) 35,00 (28) 10,67 (р,<0,05) 2,39 (р2>0,05) 2,60 (1,45-4,67)

С-592А гена 1Ы0 СС 48,04 (49) 29,09 (32) 9,65 (р(<0,05) 0,44 (0,25-0,78) 35 (14) 2,81 (р,>0,05) 0,50 (р2>0,05) 0,58 (0,27-1,24)

СА 44,12 (45) 53,64 (59) 1,47 (0,85-2,52) 50(20) 1,27(0,61-2,64)

АА 7,84(8) 17,27(19) 2,45 (1,02-5,88) 15(6) 2,07 (0,67-6,41)

А 29,91 (61) 44,12 (97) 9,12 (р,<0,05) 1,85 (1,24-2,76) 40,09 (32) 2,66 (р,>0,05) 0,40 (р2>0,05) 1,56(0,91-2,68)

С-509Т гена ТвУВ СС 43,14(44) 21,81 (24) 11,54 (р,<0,05) 0,37 (0,20-0,67) 25 (10) 6,07 (р,<0,05) 0,89 (р2>0,05) 0,44 (0,19-0,99)

СТ 42,16(43) 53,63 (59) 1,59(0,92-2,73) 45(18) 1,12(0,54-2,34)

ТТ 14,70(15) 24,56 (27) 1,89(1,94-3,80) 30(12) 2,49 (1,04-5,94)

т 35,81 (73) 51,41 (ИЗ) 10,43 (р,<0,05) 1,90(1,28-2,80) 52,51 (42) 6,66 (р,<0,05) 0,03 (р2>0,05) 1,98(1,17-3,35)

Примечание. Здесь и в таблице 3: р2 — уровень статистической значимости различий по сравнению с соответствующими показателями у больных ИТЛ

Известно, что перечисленные полиморфизмы генов IL2, TNFA, IL4, ILIO и TGFB расположены в области промотора, а полиморфизм гена IFNG находится в первом интроне, следовательно, замена одного нуклеотида на другой в полиморфном сайте может влиять на уровень экспрессии гена, а соответственно, и на уровень синтеза кодируемого им продукта [Симбирцев A.C., 1998; Кетлинский С.А., 2008].

Продукция провоспалительных цитокинов IL-2, TNF-a и IFN-y, обеспечивающих развитие протективного Thl-иммунного ответа на микобактериальную инфекцию зависит от количества клеток-продуцентов этих иммунорегуляторных молекул -моноцитов/макрофагов и Т-лимфоцитов, и кроме этого, оказывает модулирующее влияние на соотношение отдельных CD-субпопуляций Т-клеток (CD3+ общих, CD4* хелперов/индукторов и Т-регуляторных, CD8+ цитотоксических) и количество CD16+ NK в крови [Симбирцев A.C., 2004].

В ходе проведенных исследований было показано, что у больных TJI дефицит CD3+ и CD4+ Т-лимфоцитов в крови сопряжен со снижением продукции TNF-a (как спонтанной, так и BCG-индуцированной) и BCG-индуцированной секреции IL-2 in vitro.

Недостаточность продукции 1L-2 при TJ1 может быть как причиной, так и следствием дефицита Т-лимфоцитов или их анергии (что подтверждалось результатами корреляционного анализа в отношении CD3+ Т-клеток: г=0,436, р<0,05) [Салина Т.Ю., Морозова Т.И., 2004; Кноринг Б.Е., 2006]. В пользу последнего свидетельствует, в частности, незначительное повышение (относительно контрольных значений) секреции IL-2 in vitro при индукции клеток вакцинным штаммом BCG у больных ИТЛ и, напротив, ее уменьшение при ДТЛ (табл. 3).

Таблица 3

Содержание цитокинов в супернатантах культуральных суспензий (пг/мл) у здоровых доноров и больных туберкулезом легких в зависимости от клинической формы заболевания, Ме (СЬ5%:СЬ5%)

Секреция цитокина Группы обследованных лиц

Здоровые доноры Больные туберкулезом легких

Больные ИТЛ Больные ДТЛ

1 2 3 4

IL-2 Спонтанная 18,36 (14,26-31,65) 17,67 (10,81-28,03) Pi>0,05 21,75 (10,81-33,76) pi>0,05 Рз>0,05

При индукции BCG 115,20 (20,04-157,30) Рз<0,05 21,35 (13,19-32,80) pi<0,05 Рз>0,05 16,58 (11,41-26,78) pi<0,05 Р2>0,05 Рз>0,05

Окончание табл. 3

1 2 3 4

1L-4 Спонтанная 32,23 (21,14-45,04) 36,78 (21,40-51,50) Pi>0,05 54,79 (38,64-70,45) pi<0,05 P2<0,05

При индукции BCG 58,74 (32,18-62,12) Рз>0,05 36,36 (17,05-52,22) р, <0,05 рз>0,05 61,36 (43,18-75,00) pi>0,05 p2<0,05 Рз>0,05

IL-10 Спонтанная 16,24 (8,11-33,36) 38,12 (23,21-66,80) Pi<0,05 25,24 (17,80-52,14) Pi<0,05 P2>0,05

При индукции BCG 20,22 (20,22-35,11) рз>0,05 43,64 (25,79-92,13) Pi<0,05 рз>0,05 33,36 (22,21-81,19) pi<0,05 p2>0,05 рз>0,05

TNF-a Спонтанная 216,60 (186,50-329,50) 106,20 (73,01-119,57) Pi<0,05 91,09 (38,76-102,80) pi<0,05 P2>0,05

При индукции BCG 144,64 (119,60-246,10) рз>0,05 95,63 (71,71-119,55) pi<0,05 Рз>0,05 106,20 (71,71-140,50) pi>0,05 p2>0,05 Рз>0,05

IFN-y Спонтанная 31,91 (28,51-42,60) . 120,86 (73,07-154,30) Pi<0,05 154,90 (131,60-244,25) Pi<0,05 p2>0,05

При индукции BCG 58,90 (53,55-64,10) рз<0,05 185,60 (146,60-239,00) Pi<0,05 Рз>0,05 123,40 (73,41-154,90) pi<0,05 p2<0,05 Рз>0,05

TGF-ß Спонтанная 967,10 (913,23-1487,23) 989,12 (864,72-1250,23) Pi>0,05 928,95 (671,03-1959,13) pi>0,05 p2>0,05

При индукции BCG 1048,40 (764,14-1186,44) Рз>0,05 1250,40 (838,20-1483,00) Pi>0,05 PJ>0,05 770,73 (654,90-1105,30) pi>0,05 p2>0,05 p3>0,05

Примечание: рз - уровень статистической значимости различий ВСО-индуцированной и спонтанной продукции цитокина.

При изучении взаимосвязи между содержанием IL-2 в супернатантах культуральных суспензий с добавлением BCG и вариантом аллельного полиморфизма T-330G соответствующего гена было показано, что у больных TJ1 с генотипом GG уровень секреции IL-2 in vitro был ниже (7,86 (5,92-9,99) пг/мл), чем у пациентов с генотипами TG (25,59 (15,60-37,87) пг/мл) и TT (31,88 (21,75-53,82) пг/мл). Таким образом, показана ассоциация генотипа GG гена IL2 с низкой продукцией соответствующего цитокина при индукции антигеном (BCG).

Обнаруженный у обследованных больных TJI дефицит спонтанной и (при ИТЛ) BCG-индуцированной продукции TNF-a in vitro (табл. 3), с учетом данных литературы, может быть обусловлен нарушением секретирующей активности

моноцитов/макрофагов в результате токсического действия М. tuberculosis на процессы биосинтеза ДНК и белка или наличием антител к TNF-a [Наследникова И.О. и соавт., 2009]. Гипопродукция TNF-a при ТЛ ведет к глубокой дисрегуляции иммунного ответа, нарушению процесса гранулемообразования и неспособности контролировать рост М. tuberculosis, вследствие чего развиваются тяжелые, остропрогрессирующие формы туберкулеза легких.

В то же время установлено, что у больных TJI на фоне повышения (относительно соответствующих показателей в группе здоровых доноров) содержания NK-клегок и сопоставимого с контролем количества CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов в крови спонтанная и BCG-индуцированная продукция IFN-y была выше нормы (табл. 3).

Обнаруженное увеличение продукции IFN-y in vitro у больных TJI могло быть обусловлено несколькими причинами. Возрастание синтеза IFN-y можно рассматривать как универсальную реакцию иммунной системы в ответ на заражение М. tuberculosis. Роль IFN-y в иммунном ответе против М. tuberculosis обусловлена его активирующим влиянием на фагоцитарную активность макрофагов и прямую цитотоксичность Т-лимфоцитов и NK-клеток [Mitchell S.A., 2001]. Следует заметить, что высокая концентрация IFN-y, вероятнее всего, могла поддерживаться за счет секреторных способностей NK-клеток, количество которых в крови у больных TJI значимо повышалось. Действительно, в литературе описан один из механизмов компенсации, когда в условиях дефицита Т-лимфоцитов некоторые их функции, например, продукцию IFN-y, могут брать на себя NK-клетки, количество которых повышается, а активность возрастает в несколько десятков раз под влиянием IFN-a или IL-12 [Воронкова О.В., 2007]. С другой стороны, повышенный уровень образования IFN-y указывает на интерфероногенную активность самого возбудителя [Салина Т.Ю., Морозова Т.И., 2004]. На фоне высокого уровня спонтанной продукции IFN-y выявлялся также высокий BCG-индуцированный уровень образования цитокина, что может свидетельствовать о повышенной реактивности NK-клеток.

При изучении продукции TNF-a и IFN-y в зависимости от полиморфного варианта соответствующего гена было показано, что в группе больных TJI максимальный уровень продукции TNF-a in vitro обнаруживается у лиц с генотипом АА (G-308A)

(193,80 (187,8-197,7) пг/мл), а минимальный - у носителей генотипа GG (38,76(35,87-38,76)пг/мл) гена TNFA. Также в группе больных ТЛ у гомозигот TT (157,28 (147,30175,20) пг/мл) и гетерозигот AT (120,86 (105,55-154,30) пг/мл) по полиморфизму +874А/Т гена IFNG уровень продукции IFN-y in vitro был статистически значимо выше, чем у гомозигот АА (56,35 (39,28-79,84) пг/мл).

Поскольку носительство «низколродуцирующего» генотипа АА (+874А/Т) гена IFNG и «высокопродукцирующего» генотипа АА (G-308A) гена TNF А у больных ТЛ сочеталось с гиперпродукцей IFN-y и снижением секреции TNF-a in vitro можно полагать, что такого рода изменения цитокинопродукции не связаны с исследованными полиморфизмами генов цитокинов. По-видимому, они являются результатом действия М. tuberculosis на клетки-продуценты этих цитокинов. Как указывалось выше, повышение продукции IFN-y может расцениваться как механизм компенсации дефицита Т-лимфоцитов и их функциональной активности за счет активации NK-клеток, а гипосекреция TNF-a in vitro - как следствие супрессии цитокинсекреторной функции моноцитов/макрофагов [Воронкова О.В., 2007].

Следует заметить, что сам факт клинической манифестации ТЛ связывают с истощением клеточного звена иммунитета на фоне активации гуморального иммунного ответа [Симбирцев A.C., 1998,2004; Фрейдлин И.С., 2005].

IL-4 - ведущий цитокин с противовоспалительными свойствами, продуцируемый Th2-лимфоцитами и осуществляющий контроль пролиферации, дифференцировки и функциональной активности B-лимфоцитов, т.е. антительного иммунного ответа, неадекватного при внутриклеточном паразитировании микобактерий [Фрейдлин И.С., 1998; Черешнев В.А., 2001]. Наряду с IL-4 основными противовоспалительными цитокинами с иммуносупессорной активностью являются IL-10 и TGF-ß, секретируемые преимущественно регуляторными Т-клетками с фенотипом CD4+CD25+Foxp3+ (Treg). TGF-ß оказывает негативное регуляторное действие на функции иммунной системы, подавляет пролиферацию Т-лимфоцитов, цитотоксическую активность CD8+ Т-клеток, лимфокинактивированных киллеров, ингибирует секрецию иммуноглобулинов активированными B-лимфоцитами [Никитин H.A., 2009]. IL-10, являясь антагонистом IL-12 и обладая противововоспалительными и иммуносупрессорными свойствами, опосредует поляризацию иммунного ответа в направлении ТЪ2-пути и подавление антигенспецифического Т-клеточного иммунного ответа. Он тормозит пролиферативный ответ Т-клеток, антигенпрезентирующую и провоспалительную активность макрофагов, препятствует формированию гранулемы в очаге специфического воспаления и тем самым способствует диссеминации туберкулезной инфекций [Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., 2008].

В частности, было показано, что у больных ТЛ увеличение числа CD20+ В-лимфоцитов в крови сопряжено с повышением спонтанной и BCG-индуцированной продукции IL-10 in vitro (табл. 3). При этом у больных ИТЛ спонтанный уровень продукции IL-4 был близок к контрольным значениям, а BCG-индуцированный -

значимо ниже нормы. При диссеминированной форме TJ1 спонтанная продукция IL-4 ш vitro, напротив, была значимо выше, чем в группе здоровых доноров, однако при стимуляции клеток вакцинным штаммом BCG существенного прироста образования исследуемого цитокина выявлено не было (табл. 3).

Анализ ассоциации генотипов полиморфизмов С-590Тгена IL4 и С-592А гена ILIO с содержанием соответствующих цитокинов в супернатантах культуральных суспензий показал, что в группе больных TJI базапьная и BCG-индуцированная секреция IL-4 in vitro у пациентов с генотипом TT (70,45(62,12-109,4) пг/мл) была значимо выше, чем в случае носительства генотипов CT (38,64 (27,27-50,00) пг/мл) и СС (40,0(17,05-57,12) пг/мл) полиморфного сайта С-590Т гена IL4, а продукция IL-10 у больных с генотипом СС полиморфного сайта гена ILIO (19,27(16,40-23,37) пг/мл) ниже, чем у пациентов, имеющих генотипы CA (52,14(39,25-74,94) пг/мл) и АА (114,04(95,75-120,04) пг/мл).

Таким обазом, у больных TJI генотипы CT (для больных ИТЛ) и TT (для больных ДТЛ) гена IL4 и генотип АА (С-592А) гена ILIO ассоциированы с повышенной продукцией соответствующих интерлейкинов in vitro.

Помимо этого, в ходе проведенного исследования было выявлено, что на фоне снижения количества CD4+ Т-лимфоцитов в крови уровень спонтанной секреции TGF-ß у больных ТЛ был сопоставимым с соответствующими значениями в группе здоровых доноров (табл. 3).

Повышение уровня TGF-ß, как известно, выявляется преимущественно в период регрессии острофазных явлений и активации процессов репарации [Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., 2008]. Вероятно, факт обследования больных ТЛ в острый период заболевания мог обусловливать отсутствие изменений секреции цитокина. BCG-индуцированный уровень секреции TGF-ß in vitro также не претерпевал выраженных изменений. По-видимому, это-связано с тем, что регуляторные Т-клетки - основные продуценты данного цитокина, изначально являясь функционально энергичной популяцией Т-лимфоцитов, малочувствительны к действию BCG, что объясняет отсутствие ответной TGF-ß-секреторной реакции, индуцированной вакциной, как у здоровых доноров, так и у больных ТЛ (табл. 3).

Анализ продукции TGF-ß in vitro у больных ТЛ в зависимости от аллельного варианта полиморфизма С-509Т гена TGFB показал, что у гомозигот по аллелю Т она является максимальной ((4276,10(1913,1-2872,1) пг/мл), а у гомозигот по аллелю С -минимальной ((104,05(91,09-119,57) пг/мл).

Подытоживая полученные данные, следует отметить, что особенности патогенеза туберкулезной инфекции обусловлены, с одной стороны, сложным характером влияния М. tuberculosis на иммунокомпетентные клетки макроорганизма, а с другой стороны, -иммунологическими и молекулярно-генетическими особенностями формирования и течения патологического процесса у пациента. Так, показано, что дефицит CD3+ и CD4+ Т-лимфоцитов сочетается с дефицитом секреции IL-2 и увеличением продукции IL-10 in vitro, что обусловлено носительством аллеля G и генотипа GG (T-330G) гена IL2,

обеспечивающего низкую продукцию соответствующего цитокина, и аллеля А и генотипа АА (С-592А) гена IL10, ассоциированных с гиперпродукцией IL-10. Снижение секреции IL-2 и увеличение продукции IL-10 также могло быть обусловлено носительством «патологического» аллеля Т и генотипа СТ (С-590Т) гена IL4, ассоциированных с повышенной продукцией данного противовоспалительного цитокина. Повышение секреции IFN-y и снижение образования TNF-a in vitro у больных TJI не связано с носительством исследованных полиморфных сайтов генов, поскольку их ассоциации с частотой встречаемости «высокопродуцирующего» аллеля Та генотипа ТТ(+874А/Т) гена IFNG и «низкопродуцирующего» аллеля G и генотипа GG (G-308A) гена TNFA выявлено не было.

Полученные результаты обосновывают допущение о том, что структурная организация промоторной области гена влияет на продукцию кодируемого продукта, но не в полной мере определяет концентрацию синтезируемого белка. In vivo при контакте организма с чужеродным антигеном учитываются резервные возможности иммунной системы, заложенные в индивидуальном наборе генов, а также общее состояние системы противоинфекционной защиты на момент проникновения инфектогена [Gardy J.L.etal.,2011].

ВЫВОДЫ:

1. У больных туберкулезом легких аллель G и генотип GG (T-330G) гена IL2, аллель Т и генотип СТ (С-590Т) гена IL4, аллель А и генотип АА (С-592А) гена IL10, аллель А и генотипы GA и АА (G-308A) гена TNFA, аллель Г и генотип ТТ(С-509Т) гена TGFB и аллель А и генотип АЛ (+874А/Т) гена IFNG встречаются чаще, чем у здоровых доноров. У пациентов с инфильтративным туберкулезом легких значимо выше также частота встречаемости генотипов СТ (С-590Т) гена IL4 и GA (G-308A) гена TNFA, а у больных диссеминированным туберкулезом легких - генотипов ТТ (С-590Т) гена IL4 и АА (G-308A) гена TNFA.

2. Дефицит CD3+ и CD4+ Т-лимфоцитов в крови у больных туберкулезом легких сочетается с гипосекрецией IL-2 и увеличением продукции IL-10 in vitro в связи с носительством «патологического» аллеля G и генотипа GG (T-330G) гена IL2 (ассоциированных с низкой продукцией IL-2) и аллеля А и генотипа А А (С-592А) гена IL10 (ассоциированных с гиперпродукцией IL-10).

3. Повышенное содержание CD20+ В-лимфоцитов в крови у больных туберкулезом легких сопряжено с гиперсекрецией 1L-4 in vitro в связи с носительством «патологического» аллеля Т и генотипа СТ (С-590Т) гена IL4, ассоциированных с повышенной продукцией цитокина.

4. Гиперсекреция IFN-y и гипосекреция TNF-a in vitro, сочетающиеся с повышенным содержанием CD16+ клеток, нормальным числом CD8+ и дефицитом CD3+ и CD4+ Т-лимфоцитов в крови, не связаны с аллельным полиморфизмом генов IFNG и TNFA, о чем свидетельствует низкая частота встречаемости аллеля Т и генотипа ТТ (+874А/Т)

гена IFNG и, напротив, высокая частота обнаружения аллеля А и генотипа АА (G-308А) гена TNFA, ассоциированных с повышенной цитокинопродукцией.

5. Подверженность туберкулезной инфекции ассоциирована с генотипами GG (T-330G) гена IL2; CT и TT (С-590Т) гена 114, АА (С-592А) гена ILIO; GA и АА (G-308A) гена TNFA- TT(C-S09T) гена TGFB я АА (+874А/Т) гена IFNG.

6. При диссеминированном туберкулезе легких частота встречаемости аллеля G и генотипа GG (T-330G) гена IL2, генотипа TT (С-590Т) гена 1L4 и генотипа АА (G-308А) гена TNFA значимо выше, чем при инфильтративной форме туберкулеза легких.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Иммунопатогенез бактериальных и вирусных инфекций: роль полиморфизма генов цитокинов / И.О. Наследникова, О.И. Уразова, О.В. Воронкова, В.В. Новицкий, P.P. Хасанова, В.А. Серебрякова, Т.Е. Будкина, O.A. Васильева, Е.Л. Никулина и др. // Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9, № 3. - С. 294.

2. Сравнительная оценка показателей адаптивного иммунитета при лекарственно-чувствительном и лекарственно-устойчивом туберкулезе легких / О.В. Воронкова, О.И. Уразова, P.P. Хасанова, В.В. Новицкий, В.А. Серебрякова, О.И. Наследникова, А.Е. Колосова, Т.Е. Будкина, Е.Л. Никулина и др. // Аллергология и иммунология. - 2008. -Т. 9,№3.-С.288-289.

3. Генетическая гетерогенность возбудителей вирусного гепатита и туберкулеза легких на территории Томской области / О.В. Воронкова, И.О. Наследникова, О.И. Уразова, P.P. Хасанова, В.А. Серебрякова, Е.Л. Никулина и др. // Науки о человеке: Материалы XI конгресса молодых ученых и специалистов / под ред. Л.М. Огородовой, Л.В. Капилевича. - Томск: СибГМУ, 2010. - С. 56-57.

4. Полиморфизм генов IL2 и IL4 при инфильтративном туберкулезе легких / И.О. Наследникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, А.К. Стрелис, О.В. Воронкова, А.И. Рубанова, Ю.В. Стамбула, P.P. Хасанова, Т.Е. Будкина, О.В. Колоколова, В.А. Серебрякова, Е.Г. Чурина, Е.Л. Никулина и др. // Иммунология. - 2009. - Т. 30, № 2. -С. 88-92.

5. Молекулярно-генетические аспекты прогнозирования и иммунотерапии туберкулёзной инфекции / В.В. Новицкий, О.В. Воронкова, О.И. Уразова, И.О. Наследникова, А.К. Стрелис, P.P. Хасанова, В.А. Серебрякова, Е.Г. Чурина, О.В. Колоколова, Т.Е. Будкина, Н.П. Пирогова, Е.Л. Никулина и др. // Успехи физиологических наук. - 2009. - Т. 40, № 2. - С. 40-46.

6. Аллельный полиморфизм генов цитокинов при туберкулёзе лёгких / И.О. Наследникова, О.И. Уразова, О.В. Воронкова, А.К. Стрелис, В.В. Новицкий, Е.Л. Никулина и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - Т. 148, №8.-С. 137-139.

7. Молекулярно-генетические аспекты туберкулеза легких / Е.Л. Никулина, К.О. Михеева, H.A. Сухаленцева и др. // Материалы XV Межгородской конференции

молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», г. Санкт-Петербург, 22-23 апреля 2009 г. - СПб., 2009. - С. 85-86.

8. TGF-ß как фактор иммуносупрессии у туберкулинотрицательных пациентов с различными клиническими формами туберкулеза легких / А.Е. Колосова, Е.Г. Чурина, О.И. Уразова, Е.Л. Никулина и др. // Материалы VIII Российско-германской научно-практической конференции «Инновации в медицине. Социально значимые инфекции», г. Новосибирск, 13-14 ноября 2009 г. - Новосибирск, 2009. - С. 198-199.

9. Аллельный полиморфизм генов цитокинов при туберкулезе легких / Никулина Е.Л., Наследникова И.О., Уразова О.И. и др. // Материалы VIII Российско-германской научно-практической конференции «Инновации в медицине. Социально значимые инфекции», г. Новосибирск, 13-14 ноября 2009 г. - Новосибирск, 2009. - С. 214-215.

10. Препарат-индуцированный апоптоз лимфоцитов периферической крови у больных туберкулезом легких / В.А. Серебрякова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, Т.Е. Кононова, O.A. Васильева, О.В. Воронкова, И.О. Наследникова, А.Е. Колосова, Е.Л. Никулина // Материалы VIII Российско-германской научно-практической конференции «Инновации в медицине. Социально значимые инфекции», г. Новосибирск, 13-14 ноября 2009 г. - Новосибирск, 2009. - С. 218-219.

11. Эпидемиология и иммунопатогенез «BEIJINGw-туберкулеза в Томской области / О.И. Уразова, О.В. Воронкова, P.P. Хасанова, В.В. Новицкий, И.О. Наследникова, Е.Л. Никулина и др. // Материалы VIII Российско-германской научно-практической конференции «Инновации в медицине. Социально значимые инфекции», г. Новосибирск, 13-14 ноября 2009 г. - Новосибирск, 2009. - С. 221-222.

12. Аллельный полиморфизм генов цитокинов 1FNG и TGFB как фактор модуляции секреции цитокинов и подверженности туберкулезу легких / Е.Л. Никулина, И.О. Наследникова, О.И. Уразова и др. // Туберкулез и болезни легких. - 2010. - № 6. - С. 15-19.

13. Аллельный полиморфизм гена IFNG при туберкулезе легких У Никулина Е.Л., Наследникова И.О., Уразова О.И. и др. // Медицинская иммунология. - 2010. - Т. 12, № 3. - С. 259-264.

14. Особенности секреции про- и противовоспалительных цитокинов in vitro у туберкулинотрицательных пациентов с различными клиническими формами туберкулеза легких / Е.Г. Чурина, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, О.В. Воронкова, И.О. Наследникова, Е.Л. Никулина и др. // Пульмонология. - 2010. - № 6. - С. 46-50.

15. Аллельный полиморфизм генов цитокинов при социально значимых инфекционных заболеваниях / И.О. Наследникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, Е.Л. Никулина и др. // Вестник уральской медицинской академической науки. — 2010. — №4.-С. 259-264.

16. Реактивность иммунокомпетентных клеток при туберкулезе легких: молекулярно-генетическое исследование / О.И. Уразова, В.В. Новицкий, О.В. Воронкова, Р.Р Хасанова, И.О. Наследникова, Е.Л. Никулина и др. // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2010. - № 4. - С. 104-107.

17. Особенности иммунного дисбаланса при различных клинико-патогенетических вариантах остропрогрессирующего туберкулеза легких / О.В. Воронкова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, Е.Г. Чурина, P.P. Хасанова, И.О. Наследникова, О.В. Филинкж, В.А. Серебрякова, Ю.В. Колобовникова, Е.Л. Никулина и др.// Бюллетень сибирской медицины. - 2010. - Т. 9, № 3. - С. 42-50.

18. Особенности продукции провоспалительных цитокинов у больных инфильтративным и диссемшшрованным туберкулезом легких / Е.Г. Чурина, А.Е. Колосова, В.А. Серебрякова, Е.Л. Никулина и др. // Материалы XV Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», г. Санкт-Петербург, 21-22 апреля 2010 г. - СПб., 2010. - С. 184-185.

19. Влияние полиморфных вариантов генов IFN-G и TGF-B на восприимчивость к туберкулезной инфекции / Никулина Е.Л., Наследникова И.О., Уразова О.И. и др. // Науки о человеке: Материалы XI конгресса молодых ученых и специалистов / под ред. Л.М. Огородовой, JI.B. Капилевича. - Томск: СибГМУ, 2010. - С. 62-63.

20. Функциональный полиморфизм гена IL-2 при туберкулезе легких / И.О. Наследникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, Е.Л. Никулина и др. // Новые горизонты: инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении: Материалы IX российско-немецкой научно-практической конференции Форума им. Р. Коха и И.И. Мечникова / под общей ред. О.В. Кравченко (Россия), Г. Хана (Германия). - Новосибирск: Изд-во «Сибирский Центр Деловых Технологий», 2010. - С. 234-236.

21. Роль Т-лимфоцитов в патогенезе туберкулезной инфекции / Е.Г. Чурина, О.И. Уразова, О.В. Воронкова, В.В. Новицкий, И.О. Наследникова, А.Е. Колосова, Е.Л. Никулина и др. // Туберкулез и болезни легких. - 2011. - № 3. - С. 3-7.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДТЛ - диссеминированный туберкулез легких

ИТЛ - инфильтративный туберкулез легких

ОКЛ - общее количество лейкоцитов

ТЛ - туберкулез легких

ЦТЛ - цитотоксические лимфоциты

BCG - бацилла Кальметта-Герена

CD (cluster of differentiation) - дифференцировочные антигены IFN (interferon) - интерферон IL (interleukin) - интерлейкины NK (natural killers) - натуральные киллеры

TGF (transforming growth factor) - трансформирующий фактор роста TNF (tumor necrosis factor) - фактор некроза опухолей Thl - T-лимфоциты хелперы типа 1 Th2 - Т-лимфоциты хелперы типа 2

Тираж 120 экз. Заказ №131. Отпечатано на участке оперативной полиграфии ООО «Печатная мануфактура». 634055, г. Томск, а/я 3967. Тел./факс: (3822)493-119. Е-таН: pechat@tomsk.ru

Актуальность проблемы. Несмотря на существенные достижения отечественной и зарубежной медицины, туберкулез, ежегодно уносящий жизни около 2 млн. человек во всем мире, остается одной из ведущих проблем современной медико-биологической науки [Kumar V. et al., 2007; Шкарин A.B., 2008; Филиппова Т.П. и соавт., 2009]. В иммунопатогенезе туберкулеза принципиальны два основных фактора: генетическая организация инфицирующего штамма М. tuberculosis и характер иммунного ответа макроорганизма [Henao M.I., 2006; Ates О., 2008].

Решающий момент специфического иммунного ответа при туберкулезной инфекции - ответ CD4+ ThO-клеток на распознавание антигена. На данном этапе определяется форма иммунного ответа: с преобладанием антител или клеточных реакций, что зависит от множества факторов: качества и дозы антигена, цитокинового фона микроокружения, наличия или отсутствия цитокинсвязывающих рецепторов и других мембранных молекул на иммунокомпетентных клетках. Показано, что Thl- и ТЪ2-лимфоциты отличаются не только фенотипически, но и по спектру продуцируемых ими цитокинов, однако общей чертой этих двух альтернативных субпопуляций является высокая чувствительность к стимулирующему пролиферацию действию интерлейкинов (IL)-2 и IL-4 [Фрейдлин И.С., 1998; Henao M.I., 2006; Шкарин A.B., 2008; Каралян М.А., 2010; Салина Т.Ю., Морозова Т.Н., 2010; Сахно Л.В. и соавт., 2010].

IL-2 играет ключевую роль в иммунопатогенезе туберкулезной инфекции, что связано с его способностью оказывать аутокринное (на Thl) и паракринное (на Th2) воздействие, вызывать смещение баланса Thl/Th2 в направлении Т-клеточных реакций, регулировать рост и активность Т- и В-лимфоцитов, натуральных киллеров, моноцитов/макрофагов, определять интенсивность реакций гиперчувствительности замедленного типа [Хаитов P.M., 2006; Сахно Л.В. и соавт., 2010].

В структуре цитокинов, секретируемых регуляторными Т-клетками, IL

10 и трансформирующий фактор роста (TGF)-ß проявляют иммуносупрессорное действие [Henao M.I., 2006; Kumar V. et al., 2007; Корженевская K.B. и соавт., 2010]. Противовоспалительный IL-4, являясь продуктом CD4+ Т-лимфоцитов/хелперов с фенотипом Th2, выступает в качестве антагониста Thl-ассоциированных цитокинов, способствуя тем самым поляризации иммунного ответа в направлении гуморального- типа реагирования [Хаитов P.M., 2001; Кучер А.Н. и соавт., 2009; Коненков В.И. и соавт., 2010]. Основная функция IL-4 - контроль пролиферации, дифференцировки B-лимфоцитов в плазматические клетки и антителогенеза, в том числе за счет угнетения продукции провоспалительных цитокинов: IL-1, IL-6, IL-8, фактора некроза опухолей (TNF)-a [Фрейдлин И.С., 1998; Сахно Л.В. и соавт., 2010].

Характер течения воспалительного ответа, направленность противоинфекционного иммунитета при туберкулезной инфекции в значительной мере определяются особенностями межклеточной кооперации иммуноцитов, как модулируемыми в ответ на воздействие М. tuberculosis, так и генетически детерминированными. Это влияние может быть опосредовано через изменение продукции и связывание иммунорегуляторных цитокинов иммунокомпетентными клетками [Сенников C.B. и соавт., 2002, 2005; Салина Т.Ю, Морозова Т.И., 2010]. В настоящее время высказывается предположение о связи генетически детерминированной гипер- или гипопродукции цитокинов с качеством иммунного ответа, ассоциативности аллельных вариантов генов цитокинов с тяжестью и продолжительностью инфекционных заболеваний [Рудко A.A., 2004; Коненков В.И. и соавт., 2009, 2010; Шевченко A.B. и соавт., 2010].

Структурные особенности белковых продуктов полиморфных генов цитокинов обуславливают дифференциацию иммунного ответа организма на бактериальную агрессию, определяющую течение и исход инфекционных заболеваний [Сенников C.B. и соавт., 2002; Гончарова И.А. и соавт, 2006]. Гены цитокинов имеют аллельные варианты, характеризующиеся большей или меньшей активностью белка либо различным уровнем его экспрессии. Показано, что полиморфные сайты T-330G гена IL2, С-590Т гена IL4, С-592А гена ILIO, G-308A гена TNFA, +874А/Т гена IFNG, С-509Т гена TGFB ассоциированы1 с уровнем продукции соответствующих цитокинов [Симбирцев A.C., 1998; Tso H.W. et al., 2005; Авдошина B.B. и-соавт., 2006; Гончарова И.А. и соавт., 2006; Henao M.I., 2006; Ates О., 2008; Осташкин A.C. и соавт., 2008].

В свете вышеизложенного представляется весьма актуальным изучение секреции in vitro про- и противовоспалительных цитокинов в ассоциации с анализом полиморфизма их генов при туберкулезной инфекции, что в свою очередь может быть положено в основу разработки новых подходов к прогнозированию ее клинического течения, а также патогенетически^ оправданных способов профилактики и иммунокоррекции при данной патологии.

Цель исследования. Оценить модулирующее влияние аллельного полиморфизма иммунорегуляторных генов на секрецию про- и противовоспалительных цитокинов dn vitro у больных туберкулезом легких.

Задачи исследования:

1. Изучить распространенность полиморфных сайтов T-330G гена IL2, С-590Т гена IL4, С-592А гена ILIO, G-308A гена TNF А, +874А/Т гена IFNG, С-509Т гена TGFB среди больных туберкулезом легких г. Томска и Томской области.

2. Оценить особенности CD-субпопуляционного состава лимфоцитов крови и секреции in vitro про- и противовоспалительных цитокинов в ассоциации с аллельным полиморфизмом иммунорегуляторных генов у больных туберкулезом легких г. Томска и Томской области.

3. Изучить связь аллельных вариантов T-330G гена IL2, С-590Т гена IL4, С-592А гена ILIO, G-308A гена TNFA, +874А/Т гена IFNG, С-509Т гена TGFB с клиническими формами- (инфильтративная и диссеминированная) туберкулеза легких.

Научная новизна. С привлечением современных молекулярно-генетических и иммунологических методов исследования охарактериризована секреция in vitro про- и противовоспалительных цитокинов и оценена роль аллельного полиморфизма их генов (.IL2, TNFA, IFNG, IL4, ILIO, TGFB) при- отдельных клинических формах туберкулезного процесса. Показано, что частота встречаемости аллеля G и генотипа GG (Т-330G) гена IL2, генотипа TT (С-590Т) гена IL4 и генотипа АА (G-308A) гена TNF А значимо выше при диссеминированном, чем при инфильтративном туберкулезе легких. Риск развития туберкулеза легких ассоциирован с генотипами GG (T-330G) гена IL2; CT и TT (С-590Т) гена IL4, АА (C-S92A) гена ILIO; GA и АА (G-308A) гена TNF А; TT (С-509Т) гена TGFB и АА (+874А/Т) гена IFNG.

Выделены ключевые генетические факторы, опосредующие изменения секреции основных цитокинов иммунного ответа на М. tuberculosis и связанный с ними дисбаланс CD-субпопуляционного состава лимфоцитов крови при туберкулезе легких. Установлено, что Т-клеточный дефицит у больных туберкулезом легких сочетается с гипосекрецией IL-2 и увеличением продукции IL-10 in vitro, которые-в свою очередь связаны с носительством аллеля G и генотипа GG (T-330G) гена IL2 и аллеля А и генотипа^ (С-592А) гена/Z, 70. При этом повышенное содержание CD20+ В-лимфоцитов в крови сопряжено с гиперсекрецией IL-4 in vitro в связи с носительством «патологического» аллеля Т и генотипа CT (С-590Т) гена IL4.

Практическое и теоретическое значение работы. Полученные данные фундаментального характера раскрывают новые молекулярно-генетические особенности этиопатогенеза туберкулеза легких. Результаты исследования CD-субпопуляционного состава лимфоцитов крови и секреции in vitro про- и противовоспалительных цитокинов в ассоциации с аллельным полиморфизмом иммунорегуляторных генов (IL2, IL4, ILIO, TNFA, IFNG и TGFB) представляются важными для формирования знаний о взаимосвязи особенностей генофондных параметров популяции с закономерностями развития туберкулезной инфекции, позволяют глубже проникнуть, в молекулярные механизмы данной патологии. Положения исследования могут служить базисом не только для дальнейшего изучения иммунопатогенеза туберкулезного процесса, но и для разработки новых подходов- к прогнозированию клинического течения и исхода туберкулеза легких.

Положения, выносимые на защиту:

1. Среди аллельных вариантов генов цитокинов у больных туберкулезом легких чаще, чем у здоровых доноров обнаруживаются аллель G и генотип GG (T-330G) гена IL2, аллель Т и генотип СТ (С-590Т) гена IL4, аллель А и генотип АА (<С-592А) гена IL10, аллель А и генотипы GA и АА

G-308A) гена TNFA, аллель Т и генотип ТТ(С-509Т) гена TGFB и аллель А и генотип АА (+874А/Т) гена IFNG. У пациентов с инфильтративной формой туберкулеза легких, также преобладают генотипы СТ (С-590Т) гена IL4 и GA (G-308A) гена TNFA, а у больных диссеминированным туберкулезом легких - ТТ (С-59ОТ) гена 7L4 и генотип ^ (G-308A) гена TNFA.

2. Гипосекреция IL-2 и гиперсекреция IL-4, IL-10 in vitro и связанный с ними

Т-клеточный дефицит у больных туберкулезом легких сопряжены с аллельным полиморфизмом генов IL2 (T-330G), IL4 (С-590Т), IL10 (С-592А).

3. Генотипы GG (T-330G) гена/Z2, СГи ТТ (С-590Т) гена IL4, АА (С-592А) гена IL10, GA и ¿L4 (G-308A) гена 77VF4 ТТ (С-509Т) гена TGFB и АА (+874А/Т) гена /FM? ассоциированы с риском заболевания туберкулезом легких. К развитию диссеминированной формы туберкулеза легких предрасполагает носительство: «патологических» генотипов GG (T-330G) тта1Ь2, ТТ (С-590Т) гена IL4 и АА (G-308A) reua TNFA.

Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы; инфекционной; патологии» (Томск, 2009), научной конференции с международным участием

Нейрогуморальные механизмы регуляции висцеральных органов и систем в норме и при патологии» (Томск, 2009), Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 2010), XV и XVI межгородских конференциях молодых учёных «Актуальные вопросы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2009, 2010), VIII Российско-германской научно-практической конференция «Инновации в медицине. Социально значимые инфекции» (Новосибирск, 2009), X и XI международных конгрессах молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2009, 2010), научных семинарах кафедры патофизиологии ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (Томск, 2008-2011).

Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по образованию РФ в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (государственный контракт П718 «Поиск факторов риска и прогнозирования течения и исходов социально значимых заболеваний на основе полиморфных ДНК-маркеров») и Министерства образованиями науки РФ по ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (государственный контракт №16.512.11.2046 «Разработка комплекса молекулярно-генетических маркеров дизрегуляции иммунного ответа на М. tuberculosis для оптимизации диагностики и коррекции вторичной иммунологической недостаточности при туберкулезе легких»).

Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре патофизиологии (разделы «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунитета», «Воспаление») ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России.

Публикации. По теме диссертации опубликована 21 работа, из них 10 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 4 рисунками и 32 таблицами. Библиографический указатель включает 250 источников, из них 149 отечественных и 101 зарубежных авторов.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации. Соискателем лично были выполнены анализ данных литературы по теме диссертации, планирование исследования, постановка Цели и задач исследования, пробоподготовка, CD-типирование, иммуноферментный анализ, выделение ДНК, аллель-специфическая полимеразная цепная реакция, статистический анализ результатов, написание и оформление диссертации.

ВЫВОДЫ:

1.У больных туберкулезом легких аллель G и генотип GG (T-330G) гена IL2, аллель Т и генотип CT (С-590Т) гена4L4, аллель А и генотип АА (С-592А) гена ILIO, аллель А и генотипы GA и АА (G-308A) гена TNF А, аллель Т и генотип TT (С-509Т) гена TGFB и аллель А и генотип АА (+874А/Т) гена ZFM? встречаются чаще, чем у здоровых доноров. У пациентов с инфильтративным туберкулезом легких значимо выше также частота встречаемости генотипов CT {С-59 ОТ) гена IL4 и GA (G-308A) гена TNF А, а у больных диссеминированным туберкулезом легких - генотипов TT (С-590Т) гена IL4 и АА (G-308A) гена 7Ж4.

2. Дефицит CD3+ и CD4+ Т-лимфоцитов в крови у больных туберкулезом легких сочетается с гипосекрецией IL-2 и увеличением продукции IL-10 in vitro в связи с носительством «патологического» аллеля G и генотипа GG

T-330G) гена IL2 (ассоциированных с низкой продукцией IL-2) и аллеля А и генотипа АА (С-592А) гена/17Ö (ассоциированных с гиперпродукцией ILIO).

3. Повышенное содержание CD20+ B-лимфоцитов в крови у больных туберкулезом легких сопряжено с гиперсекрецией IL-4 in vitro в связи с носительством «патологического» аллеля Т и генотипа CT (С-590Т) гена IL4, ассоциированных с повышенной продукцией цитокина.

4. Гиперсекреция IFN-y и гипосекреция TNF-oc in vitro, сочетающиеся с повышенным содержанием CD16+ клеток, нормальным числом CD8+ и дефицитом CD3+ и CD4+ Т-лимфоцитов в крови, не связаны с аллельным полиморфизмом генов IFNG и TNF А, о чем свидетельствует низкая частота встречаемости аллеля Т и генотипа TT (+874А/Т) гена IFNG и, напротив, высокая частота обнаружения аллеля А и генотипа АА (G-308A)vetm TNF А, ассоциированных с повышенной цитокинопродукцией.

5. Подверженность туберкулезу легких ассоциирована с генотипами GG (Т-330G) гена IL2; CT и TT (С-590Т) гена IL4, АА (С-592А) гена ILIO; GA и АА (G-308A) гена TNF А; ТТ(С-509Т) гена TGFB и АА (+8 74А/Т) гена IFNG.

6. При диссеминированном туберкулезе легких частота встречаемости аллеля G и генотипа GG (T-330G) гена IL2, генотипа TT (С-590Т) гена IL4 и генотипа А А (G-308A) гена TNF А значимо выше, чем при инфильтративной форме туберкулеза легких.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, развитие туберкулеза является результатом сложного взаимодействия между организмом человека и МБТ в комплексе с факторами окружающей среды. Течение и исход туберкулезной инфекции во многом зависит от состояния иммунной системы. Ключевыми клетками иммунной системы, формирующими специфический иммунитет против туберкулезной инфекции, являются альвеолярные макрофаги и Т-лимфоциты, обладающие способностью синтезировать цитокины. Однако однозначная интрепретация роли про- и противовоспалительных цитокинов в реализации иммунного ответа при туберкулезе представляет трудности, что связано с многообразием проявлений туберкулезной инфекции [Каралян М.А., 2010].

Решающий успех в борьбе с туберкулезом немыслим без продолжения интенсивных исследований в области молекулярной генетики, иммунологии и вакцинации. С уверенностью можно сказать, что туберкулез, как МФЗ, развивается в результате действия множества генов, каждый из которых вносит небольшой вклад в развитие заболевания [Игманулова М.М., 2005]. Изучение полиморфных вариантов генов-кандидатов предрасположенности к туберкулезу является перспективным направлением современных научных исследований. Не исключено, что особенности в распределении частот аллелей и генотипов генов цитокинов лежат в основе разной подверженности представителей различных этнических групп к мультифакториальной патологии [Кучер А.Н. и соавт., 2009].

Безусловно, наличие SNP в генах регуляторных молекул воспаления свидетельствуют о предрасположенности к тому или иному заболеванию или изменению характера его протекания. Особенно это может быть значимо-при совместном носительстве сочетаний определненных SNP, существенно углубляющих нарушение реакций иммунитета [Симбирцев A.C., 2006].

Изучение секреции in vitro про- и противовоспалительных цитокинов в ассоциации с анализом полиморфизма их генов при туберкулезе легких представляется весьма актуальным, поскольку позволит уточнить молекулярные и генетические особенности иммунопатогенеза туберкулезной инфекции. Полученные данные могут быть положены в основу разработки новых подходов к прогнозированию клинического течения, патогенетически оправданных способов профилактики и комплексного (этиопатогенетического) лечения туберкулеза с обязательной коррекцией иммунного статуса пациента.

Глава 2. Характеристика клинического материала ш методы исследования

2.1. Характеристика больных туберкулезом, легких

Под наблюдением*находились 160 больных (114 мужчиши 46 -женщин) с впервые выявленным туберкулёзом лёгких (ТЛ) в возрасте от 18 до 55 лет (средний возраст 43,32±13,62 лет). Пациенты находились на стационарном* лечении в Томской областной клинической туберкулёзной больнице (гл. врач - канд. мед. наук Г.В. Янова) во фтизиотерапевтических отделениях № 1 (зав. отд. - О.И. Новосельцева), № 2 (зав. отд. - Т.З. Малиновская).

Диагноз ТЛ устанавливался на основании клинической картины заболевания, рентгенологического исследования легких, данных микроскопического и бактериологического исследования мокроты. Клиническая форма заболевания определялась на основании данных рентгенологического исследования легких. У всех обследованных пациентов отмечался распространенный (более 4 сегментов) деструктивный характера поражения легочной ткани с вовлечением в патологический процесс обоих легких.

Инфильтративный ТЛ (ИТЛ) был диагностирован у 110 (68,75%) пациентов и характеризовался на рентгенограмме" наличием, одной или нескольких неоднородных теней туберкулезного инфильтрата диаметром от 5 до 7 см с очагами распада и обсеменения.

Диссеминированный ТЛ (ДТЛ) был выявлен у 40 (25%) больных, рентгенологическим признаком которого являлось наличие в одном или обоих легких мелких и среднеочаговых изменений неоднородной структуры за счет инфильтрации и распада.

Диагноз фиброзно-кавернозного ТЛ был выставлен 7 (4,375%) больным и характеризовался на рентгенограмме наличием нескольких кольцевидных теней более- 2 см в диаметре чаще в субплевральных отделах, а также выраженным пневмофиброзом.

Двум пациентам был поставлен диагноз .туберкулемы (1,25%) и одному больному - казеозная пневмония (0,625%) (табл. 1).