Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль эозинофильной реакции крови в иммунопатогенезе туберкулеза легких

005532944

На правах рукописи

Колобовникова Юлия Владимировиа

РОЛЬ ЭОЗИНОФИЛЬНОЙ РЕАКЦИИ КРОВИ В ИММУНОПАТОГЕНЕЗЕ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ

14.03.03 - патологическая физиология 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени - доктора медицинских наук

12 СЕН 2013

Томск-2013

005532944

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, Заслуженный деятель науки РФ

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, директор Научного центра клинической и экспериментальной медицины СО РАМН

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, руководитель лаборатории радионуклидных методов исследования ФГБУ «НИИ кардиологии» СО РАМН доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории патофизиологии и экспериментальной терапии ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН

Новицкий

Вячеслав Викторович

Уразова Ольга Ивановна

Шкурупий

Вячеслав Алексеевич

Лишманов Юрий Борисович

Агафонов

Владимир Иванович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза» Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Новосибирск).

Защита состоится: уАУ'-л ССНТф<;!}.(2013 г. в 9 часов на заседании диссертационного совета Д 208.096.01 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 634050, г. Томск, Московский тракт, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России (г. Томск, проспект Ленина, 107).

Автореферат разослан «¿13» СьЬ'ЩбИЬСс^ 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета

И.В. Петрова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эозинофилия крови при туберкулезе легких (ТЛ) в большинстве случаев возникает на фоне проводимой противотуберкулезной терапии [Мишин В.Ю. и соавт., 2004; Михеева О.М. и соавт., 2010; Мордык А.В., 2010]. Лекарственная непереносимость по аллергическому типу является на сегодняшний день основанием (Приказ МЗ РФ от 21.03.2003 №109, Приложение №6 Инструкция по химиотерапии больных туберкулезом) для внесения корректив в стандартные схемы лечения пациентов с TJI, что неблагоприятно сказывается на течении заболевания в связи с высокой степенью изменчивости генома Mycobacterium tuberculosis [Сафаряп М.Д., 2008; Зиновьев И.П. и соавт., 2009; Филинюк О.В., 2011]. Вместе с тем, врачи-фтизиатры констатируют случаи возникновения эозинофилыюй реакции крови у впервые выявленных больных TJ1 до начала лечения противотуберкулезными препаратами [Филинюк О.В., 2001; Земляная Н.А. и соавт. 2007; Воронкова О.В. и соавт., 2007; Legrand F. et al., 2009; Kirman J. et al., 2009; Driss V. et al., 2012].

В 90 % случаев формирование эозинофилии крови при патологии связывают с гиперпродукцией ключевых эозинофил-активируюших медиаторов -интерлейкина (1L) 5 и эотаксинов, регулирующих гомеостаз клеток посредством связывания их со специфическими рецепторами (1L-5R и CCR3) [Wise E.L. et al., 2010; Endo Y. et al., 2011; Fukushima Y. et al., 2012; Zafra M.P. et al., 2012].

Одним из главных факторов, определяющих функциональную активность цитокинов и их рецепторов у отдельного индивидуума, является аллельный полиморфизм генов [Rowe S.M., 2005; Кононенков В.И. и соавт., 2006; Кофиади И.А., 2006; Pullat et al., 2007; Абрамов Д.Д. и соавт., 2011]. Установлено наличие ассоциаций аллельных вариантов генов цитокинов и их рецепторов с характером экспрессии соответствующих белковых продуктов и предрасположенностью к определенным заболеваниям [Онищенко Г.Г. и соавт., 2008; Attab К.А., 2008; Ризванова Ф.Ф. и соавт., 2010; Шевченко А. В. и соавт., 2010; Wise Е. L. et al., 2010; Zhu W. et al., 2010; Цыган B.H. и соавт., 2011]. Так, полиморфизм С-703Т гена IL5, G-80A гена IL51U, A-384G гена CCL11 и T-5IC гена CCR3 ассоциирован с уровнем секреции соответствующих цитокинов, экспрессией на клетках комплементарных им рецепторов и количеством эозинофилов в периферической крови [Карпова А.В., 2009; Al-Abdulhadi S.A. et al., 2010; Wang T.-N. et al., 2010; Innoue N. et al., 2011].

В настоящее время эозинофилы рассматривают в качестве полифункциональных лейкоцитов, обладающих цитотоксической и фагоцитарной активностью, а также проявляющих функции антигенраспознающих и антигенпрезентирующих клеток, способных секретировать широкий спектр

иммунорегуляторных молекул [Blanchard С., Rothenberg М.Е., 2009; Park Y.M., Bochner B.S., 2010; Farahi N. et al., 2012; Yousefî S. et al., 2012; Feng Y.H., Mao H., 2012; Fulkerson P.C., Rothenberg M.E., 2013; AI-Muhsen S. et al., 2013; Esnault S. et al., 2013]. Установлено, что эозинофильные гранулоциты презентируют на своей поверхности toll-подобные рецепторы (TLR), у5Т-клеточный рецептор (ySTCR), молекулы главного комплекса гистосовмеетимости типа II, рецепторы к цитокинам и хемокинам, молекулы адгезии и др.; секретируют свыше 35 цитокинов [Hogan S.P. et al., 2008; Speirs R.S. et al., 2009; Park Y.M., Bochner B.S., 2010; Xue F.M. et al., 2012; Xue F.M. et al., 2012; Reece P. et al., 2013].

При ТЛ количество эозинофильных гранулоцитов может увеличиваться не только в крови, но и в области грацулематозного воспаления [Kirman J. et al., 2009; Linch N.S. et al., 2009; Hattori Y. et al., 2011; Driss V. et al., 2012]. Показана способность эозинофилов взаимодействовать с микобактериями различных видов {М. tuberculosis, M. bovis, M. avium, M. smegmatis), в результате чего происходит дегрануляция клеток, высвобождение активных форм кислорода, цитотоксических протеинов и цитокинов [Lasco Т.М. et al., 2004; Legrand F. et al., 2009; Linch N.S. et al., 2009].

Известно, что длительное присутствие эозинофильных гранулоцитов в крови и тканях может сопровождаться развитием серьезных осложнений. Весьма часто у пациентов с эозинофильной реакцией крови обнаруживаются признаки васкулита и эндомиокардиалыюй болезни, десквамация и деструкция бронхо-альвеолярного эпителия, повреждение и фиброзирование эпителия желудочно-кишечного тракта, замедление репаративных явлений в органах и др. [Белобородова Э.И., Колосовская Т.Л., 1986; Озерецковская H.H., 2000; Черногорюк Г.Э., 2002; Park Y.M., Bochner B.S., 2010; Baandrup U., 2012; Farahi N. et al., 2012; Fulkerson P.C., Rothenberg M.E., 2013].

В связи с вышеизложенным, представляется актуальным изучение механизмов формирования эозинофильной реакции крови при TJI, а также оценка ключевых функций эозинофильных гранулоцитов с определением их возможного участия в реализации повреждающих и защитно-приспособительных реакций макроорганизма Изучение влияния гемической эозинофилии на течение и исход туберкулезной инфекции позволит обосновать необходимость контроля данной гематологической реакции при ТЛ.

Цель исследования: охарактеризовать молекулярно-генетические механизмы формирования эозинофильной реакции крови и ее роль в патогенезе иммунного дисбаланса при туберкулезе легких.

Задачи исследования: 1. Оценить экспрессию рецепторов IL-5RA, CCR3 на эозинофилах и содержание

комплементарных им ключевых эозинофил-активирующих цитокинов IL-5 (в крови и культуре эозинофилов in vitro) и CCLI 1/эотаксина (в крови) у больных инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулезом легких с эозинофилией и без нее.

2. Проанализировать ассоциацию аллельных вариантов промоторных регионов С,-НОЛ гена 1L5RA, Т-51С гена CCR3, С-703Т гена IL5 и A-384G гена CCL11 с экспрессией на эозинофилах соответствующих рецепторов, концентрацией цитокинов и содержанием эозинофильных гранулоцитов в крови у больных туберкулезом легких.

3. Оценить адгезивные свойства, цитотоксическую, фагоцитарную и цитокинсекреторную активность эозинофильных гранулоцитов крови у больных туберкулезом легких с эозинофилией и без нее.

4. Исследовать показатели клеточного (содержание CD3+ Т-лимфоцитов, 1L-2 и IFNy) и гуморального (содержание CD20+ В-лимфоцитов, IL-5 и IL-4) иммунитета, а также факторы иммуносупрессии (содержание регуляторных Т-клеток, IL-10 и TGFP) при туберкулезе легких в зависимости от наличия эозинофильной реакции крови.

5. Оценить роль эозинофилии крови в формировании иммунопатологических и клииико-рентгенологических проявлений туберкулеза легких с учетом формы заболевания и чувствительности возбудителя к противотуберкулезным препаратам.

Научная новизна. Впервые у больных туберкулезом легких исследованы молекулярно-генетические механизмы эозинофильной реакции крови, формирующейся до лечения противотуберкулезными препаратами. Показано, что гемическая эозинофилия при туберкулезе легких обусловлена повышением концентрации IL-5 и CCLI 1 в крови, секреции IL-5 in vitro и гиперэкспрессией IL-5RA эозинофильными лейкоцитами. Установлена ассоциация эозинофильной реакции крови при туберкулезе легких с носительством генотипов СС полиморфизма С-703Т гена IL5, GG полиморфного участка A-384G гена CCL11, а также генотипа СС (Т-51С) гена CCR3. Идентифицированы «высокопродуцирующие генотипы» СС (С-703Т) гена IL5 и GG (A-384G) гена CCL11, обусловливающие избыточные концентрации IL-5 и CCL11/эотаксина в крови у больных туберкулезом легких. Выявлено, что повышение количества IL-5RA+ эозинофилов в крови при туберкулезе легких с эозинофилией не связано с полиморфным сайтом G-80A гена 1L5RA.

При изучении особенностей функциональной активности эозинофильных гранулоцитов крови показано, что у больных туберкулезом легких с эозинофилией выявляется увеличение числа эозинофилов, экспрессирующих 1L-5RA, CD18 (при

нормальном количестве CD9+ клеток) и CCR3 (при индукции клеток рекомбинантным IL-5). При этом активация фагоцитарной функции эозинофильных гранулоцитов крови сопряжена со снижением активности эозинофилыюй пероксидазы, а увеличение IL-5- и TNFa-секреторной реактивности клеток - с разнонаправленными изменениями базалыгой секреции IL-2 эозинофилами in vitro (снижение при инфильтративном и увеличение при диссеминированном туберкулезе легких).

В результате анализа показателей иммунного ответа при различных клинических формах лекарственно-чувствительного и лекарственно-устойчивого туберкулеза легких в зависимости от наличия эозинофильной реакции крови впервые установлено, что при туберкулезе легких, сопровождающемся эозинофилией крови, независимо от формы заболевания и чувствительности возбудителя к противотуберкулезным препаратам, дефицит IFNy сочетается с повышением содержания IL-5 в крови, а также увеличением продукции мононуклеарными лейкоцитами in vitro IL-4 и цитокинов с супрессорной активностью - IL-10 (при индукции BCG у больных инфильтративным и диссеминированным туберкулезом легких) и TGF(5 (базальной и BCG-индуцированной). Обосновано также, что изменения цитокиновой секреции у больных с эозинофильной реакцией сопряжены с повышением содержания в крови количества CD20+ В-лимфоцитов и иммуносупрессорных CD4+CD25+Foxp3+ Treg-лимфоцитов. Выявлено, что количество CD4+CD25+Foxp3+ Treg-лимфоцитов в крови при диссеминированном туберкулезе легких коррелирует с гиперпродукцией IL-2 эозинофилами и дефицитом его секреции (базальной и при индукции BCG) мононуклеарными лейкоцитами in vitro, что подтверждает участие эозинофильных гранулоцитов в реализации механизмов ТЫ-супрессии, характерной для туберкулезной инфекции.

При исследовании клинических и рентгенологических проявлений патологического процесса в легких установлена ассоциация эозинофилыюй реакции крови с деструктивными изменениями и замедлением темпов рассасывания инфильтратов в легочной ткани при инфильтративном и диссеминированном туберкулезе легких. Показана достоверная взаимосвязь между формированием очагов деструкции в легких у больных туберкулезом легких и базальной секрецией TNFa эозинофильными гранулоцитами in vitro.

Практическое и теоретическое значение работы. Полученные данные фундаментального характера существенно расширяют представления о роли эозинофилыюй реакции крови в иммунопатогенезе туберкулеза легких, механизмах формирования данной гематологической реакции и участии эозинофильных гранулоцитов в реализации повреждающих и защитно-

приспособительных реакций макроорганизма Результаты молекулярно-генетических исследований, подтверждающих ассоциацию аллельного полиморфизма генов IL5 и CCLI1 с содержанием соответствующих цитокинов в крови, представляются значимыми с позиции новых знаний о генетически детерминированном характере эозинофилыюй реакции крови при туберкулезе легких. Результаты оценки цитокинсекреторной и цитотоксической активности эозинофильных гранулоцитов дополняют представления об участии данных клеток в реализации механизмов иммуносупрессии и деструкции легочной ткани при туберкулезе легких. Полученные новые данные о негативной роли эозинофилыюй реакции крови в иммунопатогенезе туберкулеза легких, проявляющейся дисбалансом иммунного ответа по пути доминирования Th2-реакций в условиях иммуносупрессии факторов ТЫ-ответа, а также отрицательной динамикой рентгенологических и клинических признаков повреждения легочной ткани, обосновывают необходимость контроля и коррекции данной гематологической реакции у больных туберкулезом легких.

Положения, выносимые иа защиту:

1. Развитие эозинофилии крови при инфильтративном и диссеминированном лекарственно-чувствительном и лекарственно-устойчивом туберкулезе легких до лечения ассоциировано с повышением секреции эозинофилами IL-5 и его содержания в крови, гиперэкспрессией на эозинофилах IL-5RA, а также носительством аллеля С и генотипа СС (С-703Т) гена IL5, аллеля G и генотипа GG (A-384G) гена CCI Ai и аллеля С и генотипа СС (Т-51С') гена CCR3. При этом повышенное содержание IL-5 и CCL11/эотаксина в крови сопряжено с генотипами СС (С-703Т) гена IL5 и GG (A-384G) гена ССШ; увеличение числа IL-5RA+ эозинофилов крови не связано с полиморфным вариантом G-80A гена IL5RA.

2. Эозинофильные гранулоциты крови у больных туберкулезом легких с эозинофилией характеризуются повышенной реактивностью, о чем свидетельствует увеличение числа клеток, экспрессирующих CD18 и (при действии рекомбинантного IL-5) рецепторы 1L-5RA и CCR3, базальная и BCG-индуцированная гиперсекреция IL-5, IL-2 (при диссеминированпом туберкулезе легких) и TNFa in vitro, активация фагоцитоза в ассоциации с менее выраженным понижением активности эозинофильной пероксидазы.

3. При туберкулезе легких с эозинофилией крови иммунный дисбаланс в направлении ТЬ2-зависимых реакций с признаками иммуносупрессии проявляется дефицитом в крови IFNy при повышении содержания IL-5, CD20+ В-лимфоцитов и CD4+CD25+Foxp3+ Treg-клеток в сочетании с гиперсекрецией мононуклеарными лейкоцитами in vitro IL-4 и цитокинов с Thl-супрессорной активностью - IL-10 и TGFp.

4. Ассоциация эозинофильной реакции крови при туберкулезе легких (инфильтративном и диссеминированном) с деструктивными изменениями и замедлением темпов рассасывания инфильтратов в легочной ткани в сочетании с признаками Тгс^-опосрсдованной иммуносупрессии и ТЫАП12-дисбаланса обосновывает негативную роль гемической эозинофилии в патогенезе туберкулеза легких.

Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на IX Российско-германской научно-практической конференции им. Р. Коха и И.И. Мечникова «Новые горизонты: инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении» (Новосибирск, 2010); Всероссийской научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии - 2011» (Санкт-Петербург, 2011); XVII Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии - 2011» (Санкт-Петербург, 2011); IX Съезде фтизиатров России (Москва, 2011); XI и XII Российском конгрессе молодых ученых с международным участием «Науки о человеке» (Томск, 2010, 2011); Международной интернет-конференции: «Медицина в XXI веке: традиции и перспективы» (Казань, 2012); на научно-образовательных семинарах «Патофизиология системы крови и иммунитета» при Центре компетенции по проблеме инфекционных болезней им. И.И. Мечникова и Р. Коха ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России (Томск, 2010 - 2013), на научных семинарах кафедр патофизиологии и фтизиатрии и пульмонологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России (Томск, 2010 - 2013).

Исследования проведены при финансовой поддержке РФФИ (Соглашение № 13-04-01417/13 «Феномен гемической эозинофилии в патогенезе инфекционного процесса», руководитель - Ю.В. Колобовникова); Совета по грантам Президента Российской Федерации для поддержки молодых российских ученых - кандидатов медицинских наук (Договор № 14.124.13.3383-МК «Роль эозинофильной реакции крови в патогенезе инфекционного процесса», руководитель - Ю.В. Колобовникова) и Совета по грантам Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ (НШ-614.2012.7 «Идентификация молекулярных мишеней регуляции апоптоза, пролиферации и дифференцировки клеток крови при патологии инфекционного и неинфекционного генеза», руководитель - академик РАМН В.В. Новицкий).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 299 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 8 рисунками и 58 таблицами.

пульмонологии (в тематических разделах «Иммунитет и аллергия при туберкулезе», «Патофизиология туберкулезного воспаления»).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 25 работ, из них 15 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации. Соискатель принимал непосредственное участие в разработке научной концепции, дизайна и планировании исследования, постановке его цели и задач. Автором лично выполнены все клинико-лабораторные методы исследования; получены, проанализированы и интерпретированы эмпирические данные исследования; подготовлены к публикации статьи и тезисы по теме диссертации.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Общая характеристика клинического материала

В основу настоящей работы положены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 217 пациентов (149 мужчин и 68 женщин) европеоидного происхождения в возрасте от 18 до 55 лет (средний возраст 41,94±10,63 лет) с впервые выявленным туберкулезом легких (ТЛ), проживающих на территории г. Томска и Томской области. Пациенты находились на стационарном лечении в Томской областной туберкулезной клинической больнице (гл. врач - врач высшей категории, канд. мед. наук Г.В. Янова) во фтизиотерапевтическом отделении №1 (зав. отд. - О.И. Новосельцева).

Диагноз ТЛ устанавливался на основании клинической картины заболевания, рентгенологического исследования органов грудной клетки, результатов микроскопического и бактериологического исследования мокроты. Инфильтративный ТЛ (ИТЛ) был диагностирован у 132 (60,8 %) пациентов, диссеминированный ТЛ (ДТЛ) - у 85 (39,2 %) (табл. 1).

Возбудитель туберкулеза выявлялся методом прямой световой микроскопии мазка мокроты, окрашенного по Цилю-Нильсену, а также методом люминесцентной микроскопии с использованием флуорохромов (аурамина). Бактериовыделение регистрировалось в 100 % случаев заболевания. Для видовой идентификации микобактерий туберкулеза (МБТ) и определения их чувствительности к противотуберкулезным препаратам (методом абсолютных концентраций) производился посев мокроты на плотные питательные среды Левенштейна-Иенсена и Финн-2. Исследования выполнялись в бактериологических лабораториях Томской областной туберкулезной клинической больницы (гл. врач - врач высшей категории, канд. мед. наук Г.В. Янова) и Томского областного противотуберкулезного диспансера (гл. врач - главный фтизиатр Томской области, врач высшей категории С.П. Мишустин).

концентраций) производился посев мокроты на плотные питательные среды Левенштейна-Иенсена и Финн-2. Исследования выполнялись в бактериологических лабораториях Томской областной туберкулезной клинической больницы (гл. врач — врач высшей категории, канд. мед. наук Г.В. Янова) и Томского областного противотуберкулезного диспансера (гл. врач - главный фтизиатр Томской области, врач высшей категории С.П. Мишустин).

Таблица 1

Распределение больных туберкулезом легких по группам исследования

Принципы распределения больных туберкулезом легких на группы исследования С эозинофилией Без эозинофилии Всего

Всего пациентов 102 115 217

По клинической форме заболевания Инфильтративный 62 70 132

Диссеминиро ванный 40 45 85

По чувствительности возбудителя к основным ПТП Лекарственно-чувствительный 43 56 99

Лекарственно-устойчивый 35 23 58

Примечание: ПТП - противотуберкулезные препараты.

У 157 обследованных больных ТЛ (94 больных ИТЛ и 63 больных ДТЛ) была определена лекарственная чувствительность возбудителя к основным противотуберкулезным препаратам (ПТП). По данному критерию было выявлено 99 пациентов, выделяющих МБТ, чувствительные к основным ПТП, и 58 пациентов, выделяющих МБТ, устойчивые к препаратам основного ряда (изониазиду, рифампицину и стрептомицину).

Контрольную группу составили 120 здоровых доноров (91 мужчина и 29 женщин), сопоставимых по возрасту, не имеющих в анамнезе соматических заболеваний и аллергических реакций, заболеваемость которых острыми респираторными инфекциями составляла не чаще 2-3 раз в год.

Все пациенты с ТЛ были обследованы при поступлении на стационарное лечение до назначения терапии.

Критерием включения в исследование было наличие у впервые выявленных больных инфильтративного и диссеминированного ТЛ.

Учитывая то, что эозинофильная реакция крови сопровождает аллергические заболевания и паразитарные инвазии, в исследование не включались больные, имеющие в анамнезе аллергические заболевания, отягощенную наследственность, лекарственную и пищевую аллергию. Всем обследованным лицам проводился

иммуноферментный анализ (ИФА) с целью выявления диагностически значимых титров антител к антигенам гельминтов, в отдельных случаях отсутствие паразитоза подтверждалось копроовоскопически.

В связи с запланированным дизайном исследования оценка ассоциаций носительства аллелыюго полиморфизма генов с изменением цитокинопродукции и экспрессии рецепторов на мембране клеток in vitro проводилась на примере двух общих групп больных ТЛ с эозинофилией (102 человека) и без эозинофилии (115 человек).

Исследование функциональной активности эозинофильных гранулоцитов и роли гемической эозинофилии в патогенезе туберкулезной инфекции у больных ТЛ проводилось с учетом эозинофилии крови, формы заболевания и чувствительности возбудителя к ПТП: среди больных ТЛ с эозинофилией (62 пациента с ИТЛ и 40 - с ДТЛ), среди больных ТЛ без эозинофилии (70 пациентов с ИТЛ и 45 - с ДТЛ); по лекарственной чувствительности возбудителя к основным ПТП (среди больных ТЛ с эозинофилией (43 пациента, выделяющих МБТ, чувствительные к основным ПТП, и 35 пациентов, выделяющих МБТ, устойчивые к препаратам основного ряда), среди больных ТЛ без эозинофилии (56 пациентов, выделяющих МБТ, чувствительные к основным ПТП, и 23 пациента, выделяющих МБТ, устойчивые к препаратам основного ряда) (табл. 1).

Материал исследования

Материалом исследования являлась венозная кровь, взятая у здоровых доноров и у больных ТЛ до назначения специфической химиотерапии, а также супернатанты культуральных суспензий эозинофильных гранулоцитов и мононуклеарных лейкоцитов крови. Кровь забирали утром натощак из локтевой вены в количестве 20 мл. Исследования проводились в Центральной научно-исследовательской лаборатории (зав. - д-р мед. наук, профессор А.Н. Банков) и в лаборатории клинической и экспериментальной патофизиологии кафедры патофизиологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России.

Методы исследования

• Выделение эозинофильных гранулоцитов из цельной крови по методу I. Gartner [1980].

• Выделение мононуклеарных лейкоцитов из цельной крови по методу А. Boyum [1968].

• Определение концентрации IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFNy, TNFa, TGFß и CCL11 в супернатантах культуральных суспензий эозинофильных гранулоцитов и мононуклеарных лейкоцитов методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), согласно инструкциям, предлагаемым производителями тест-систем

(ЗАО «Вектор-Бест», Россия, ООО «Протеиновый контур», Россия, «Biosource», США, «Bender Medsystems» США, «ВСМ Diagnostics», США).

• Определение поверхностных рецепторов к IL-5 (IL-5RA) и эотаксину (CCR3), молекул адгезии (CD9 и CD18) на эозинофильных гранулоцитах методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител (МКАТ), меченных флуоресцентными метками, согласно протоколам фирм-производителей («R&D Systems» и «Caltag Laboratories», США).

• Выделение ДНК из периферической крови сорбентным методом, согласно инструкции, прилагаемой к набору «ДНК-сорб-В» («ИнтерЛабСервис», Россия).

• Исследование полиморфных участков генов цитокинов и их рецепторов с использованием рестрикционного анализа продуктов амплификации специфических участков генома (ПДРФ-анализ) [Fukunaga К., 2001; Фрейдин М.Б., 2002; Tsunemi Y., 2002].

• Определение фагоцитарной активности эозинофильных гранулоцитов, согласно инструкции, прилагаемой производителем тест-системы PHAGOTEST («Glycotope Biotechnology GmbH», Германия).

• Определение активности эозинофильной пероксидазы по методу Е. Sato в модификации D. Quaglino [1967].

• Определение белка микробиуретовым методом.

• Определение поверхностных молекул CD3 и CD20 на лимфоцитах периферической крови методом иммунофлуоресцентного анализа с использованием МКАТ (ООО «Сорбент», Россия).

• Определение поверхностных молекул CD4, CD25 и внутриклеточного маркера иммуносупрессорной активности Foxp3 в лимфоцитах периферической крови методом проточной цитометрии с использованием МКАТ, меченных флуоресцентными метками («Becton Dickinson (BD)», США).

• Определение в крови концентрации суммарных антител к антигенам Mycobacterium tuberculosis методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), согласно инструкции, предлагаемой производителем тест-системы (ЗАО «Вектор-Бест», Россия).

• Статистический анализ результатов исследования.

Анализ первичных данных проводили с применением методов статистического описания и проверки статистических гипотез. Все количественные показатели проверяли на нормальность распределения с использованием критерия Шапиро-Уилка. Для нормально распределенных выборок вычисляли средневыборочные характеристики: среднее арифметическое (X), среднее квадратичное отклонение (а), ошибку среднего (т). Для выборок, распределение которых отличалось от нормального, рассчитывали медиану (М),

первый и третий квартили (Q,, Q3). Для показателей, характеризующих качественные признаки, вычисляли W - выборочные доли и Sw-среднюю ошибку выборки для доли (%). Проверку гипотезы о равенстве долей в двух исследуемых выборках проводили методом угловой трансформации, основанной на <р-преобразовании Фишера. При соответствии количественного признака в исследуемых выборках нормальному закону распределения проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием t-критерия Стыодента, не подчиняющихся нормальному распределению - с применением U-критерия Манна-Уитни (для независимых групп). Различие двух сравниваемых величин считали достоверным при уровне значимости р<0,05 [Лакин Г.Ф., 1980].

С целью выявления функциональных взаимосвязей между параметрами применяли корреляционный анализ путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена (г). Для анализа связи между качественными признаками использовался бисериальный коэффициент корреляции и коэффициент ассоциации (га). При значениях коэффициента корреляции (коэффициента ассоциации) меньше 0,5 связь считалась сомнительной, от 0,5 до 0,75 -достаточной, более 0,75 - высокой [Боровиков П.П., 2003].

Распределение генотипов по исследуемым полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга с помощью точного теста Фишера Для сравнения частот аллелей между различными группами использовали критерий х2 Пирсона с поправкой Йетса. Обработка результатов генетических исследований осуществлялась с использованием критерия отношения шансов OR с расчетом для него 95 % доверительного интервала [Флейс Дж., 1989].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОЬСУЖДЕНИЕ

Молекулярно-генетическиП механизм формирования эозинофнлии крови при туберкулезе легких

Эозинофилию крови при туберкулезе легких в большинстве случаев расценивают как побочный эффект проводимой противотуберкулезной терапии [Мишин В.Ю. и соавт., 2004; Мордык A.B., 2010]. Согласно данным анализа медицинских карт пациентов, находящихся на стационарном лечении в Томской областной туберкулезной клинической больнице (гл. врач - врач высшей категории, канд. мед. наук Г.В. Янова) во фтизиотерапевтическом отделении №1 (зав. отд. - О.И. Новосельцева) в период с 2009 по 2012 гг., эозинофильная реакция крови регистрировалась у 30 % пациентов с ТЛ на фоне приема ПТП основного (первого) ряда (изониазид, рифампицин, стрептомицин, пиразинамид и этамбутол).

Наряду с лекарственной эозинофилией нередки случаи повышенного содержания эозинофилов в периферической крови у больных TJ1 до проведения специфической химиотерапии [Филинюк О.В., 2001; Земляная H.A. и соавт. 2007; Воронкова О.В. и соавт., 2007; Legrand F. et al., 2009; Kirman J. et al., 2009]. По результатам настоящего исследования, умеренная эозинофилия крови (абсолютное содержание эозинофилов (0,966±0,110)х109/л) была зарегистрирована у 18 % больных с впервые выявленным ТЛ до назначения ПТП (по результатам анализа медицинских карт пациентов физиотерапевтического отделения №1 Томской областной туберкулезной клинической больницы (2009-2012 гг.)). Максимальное увеличение абсолютного числа эозинофилов (до 1,140х|0''/л) было зарегистрировано у больных с диссеминированной формой ТЛ.

Изучение молекулярных механизмов формирования гемической эозинофилии при патологии, в том числе при ТЛ, предполагает оценку ключевых цитокинов, модулирующих основные функции эозинофильпых гранулоцитов: IL-5 и эотаксинов. Эти медиаторы регулируют процессы пролиферации и дифференцировки эозинофилов, ингибируют апоптоз данных клеток, опосредуют реализацию ими эффекгорных и иммунорегуляторных свойств [Rothenberg М.Е. et al., 2007; Paplinska М. et al., 2007; Manqieri D. et al., 2012; Morshed M. et al., 2012].

При анализе содержания IL-5 (ключевого эозинофилопоэтина) в крови его увеличение было установлено только у пациентов с инфильтративным ТЛ (ИТЛ) и диссеминированным ТЛ (ДТЛ) в сочетании с эозинофилией, тогда как уровень IL-5 в крови у пациентов с ТЛ без эозинофилии не отличался от контрольных значений (табл. 2).

Среди больных ДТЛ, ассоциированным с эозинофилией, максимальное значение содержания IL-5 в крови отмечалось при лекарственно-устойчивом (ЛУ) варианте инфекции (71,52 (56,73-77,32) пг/мл, р4<0,05).

Определяющая роль IL-5 в механизмах формирования эозинофилии крови у больных ТЛ подтверждалась наличием положительной корреляции между концентрацией IL-5 и абсолютным количеством эозинофильных гранулоцитов в крови при ДТЛ (г=0,81, р<0,05).

Для уточнения вклада эозинофилов в механизм формирования эозинофилии крови при ТЛ в ходе исследования оценивалась способность этих клеток секретировать IL-5. Как показали результаты исследований, содержание IL-5 в интактной культуре эозинофильных гранулоцитов оказалось повышенным лишь у больных ТЛ, ассоциированным с эозинофилией крови. Это подтверждает способность эозинофилов к аутокринной стимуляции эозинофилами собственной активности, эозинофилопоэза и пролонгированного пребывания в кровотоке.

Таблица 2

Содержание 1Ь-5 и ССЫ 1/эотаксина в крови (пг/мл) у больных туберкулезом легких (Ме (ОгСЬ))

Группы обследованных лиц 1Ь-5 СОЛ1

Здоровые доноры 8,99 (7,56-19,44) 25,19 (18,27-34,31)

Больные туберкулезом легких с эозинофилией Инфильтративный 52,96 (35,65-69,81) Р1<0,05 42,52 (26,09-51,38) Р1<0,05

Диссеминиро ванный 64,02 (38,09-75,18) ' р,<0,05 р3<0,05 51,08 (41,78-56,49) Р1<0,05

Больные туберкулезом легких без эозинофилии Инфильтративный 10,80 (8,64-13,73). р2<0,05 28,21 (25,37-37,96) Р2<0,05

Диссеминиро ванный 8,22 (7,31-10,81) р2<0,05 31,56 (29,45-43,51) Рг<0,05

Примечание: р\ - уровень статистической значимости различий по сравнению с аналогичными параметрами у здоровых доноров; р2 - у больных туберкулезом легких с эозинофилией; рз-у больных инфилыпративным туберкулезом легких.

Реактивный характер эозинофилии крови при ТЛ подтверждается также результатами количественной оценки другого эозинофил-активирующего медиатора - СС1Л1 (белок подсемейства эотаксинов). В ходе настоящего исследования было зарегистрировано достоверное повышение содержания ССЫ 1/эотаксина в крови только у больных ТЛ с эозинофилией (табл. 2). Обращал на себя внимание высокий уровень ССЫ 1/эотаксина в крови у больных ТЛ в сочетании с эозинофилией, выделяющих лекарственно-резистентные штаммы МБТ (54,32 (44,92-67,32) пг/мл при ЛУ ИТЛ с эозинофилией (р<<0,05) и 58,09 (44,12-62,40) пг/мл при ЛУ ДТЛ с эозинофилией (р4<0,05)). Одним из возможных механизмов избыточного содержания ССЬ11/эотаксина в крови у больных ТЛ, на наш взгляд, может быть опосредованное влияние ТЬ2-цитокинов (в избытке секретируемых при ЛУ ТЛ), которые стимулируют экспрессию мРНК эотаксинов в эндотелиальных и эпителиальных клетках, а также в фибробласгах. Кроме этого, при ТЛ с эозинофилией высокий уровень ССЫ 1/эотаксина в крови мог быть результатом выраженной секреторной активности самих эозинофильных гранулоцитов.

Известно, что цитокины реализуют свои эффекты при взаимодействии со специфическими рецепторами на поверхности клеток-мишеней. При исследовании механизмов формирования гемической эозинофилии несомненный интерес представляет оценка экспрессии рецепторов для эозинофил-специфичных

цитокинов (IL-5 и CCLU/эотаксина), нарушения которой могут являться еще одним механизмом увеличения количества эозинофилов в периферической крови при ТЛ.

С использованием метода проточной цитометрии в условиях in vitro нами была проведена оценка экспрессии на эозинофилах, выделенных из крови больных ТЛ с эозинофилией и без таковой, а-субъединицы мембраносвязанной формы рецептора к IL-5 (IL-5RA/CD125) и рецептора к эотаксину (CCR3). В результате было показано достоверное повышение количества эозинофилов, несущих IL-5RA, в интактной культуре клеток у больных с эозинофилией (ИТЛ - 20,86 (16,20-23,35) % и ДТЛ - 24,61 (9,89-29,32)) %), что может быть опосредовано, на наш взгляд, влиянием одноименного медиатора, избыточные концентрации которого идентифицированы в крови у пациентов данных групп наблюдения. Обращал на себя внимание также установленный нами факт положительной корреляции между содержанием IL-5 и IL-SRA-позитивных клеток в крови у пациентов с ДТЛ, сопровождающимся эозинофилией (г=0,73, р<0,05).

При добавлении в культуру меток рекомбинантного IL-5 (rIL-5) повышение содержания IL-5RA+ эозинофилов относительно контрольных значений устанавливалось у больных ТЛ с эозинофилией. При определении соотношения числа клеток, несущих IL-5RA, в базальной и rIL-5-индуцированной культурах эозинофилов было показано увеличение индекса стимуляции рецепторной экспрессии у больных ИТЛ с эозинофилией и без нее. Данное обстоятельство позволяет думать о том, что гиперэкспрессия эозинофилами IL-5RA может быть как следствием повышения концентрации IL-5 в крови, так и одной из причин повышенной чувствительности клеток к IL-5 при туберкулезной инфекции.

При оценке содержания CCR3+ клеток в интактной культуре эозинофильных лейкоцитов in vitro было зарегистрировано увеличение их количества только у больных ИТЛ (36,63 (23,36-47,28) %) и ДТЛ (45,99 (35,31-72,42) %) без эозинофилии. Гиперэкспрессия эозинофилами CCR3 в сочетании с нормальным уровнем CCL11 /эотаксина в крови у больных ТЛ без эозинофилии указывает на ключевую роль комплекса «эотаксин-ССЯЗ» в механизмах рекрутирования эозинофилов в зону гранулематозного воспаления. В свою очередь, нормальный уровень клеток, несущих CCR3, в культуре эозинофилов in vitro на фоне высокого содержания CCLU/эотаксина в крови при ТЛ, сопровождающимся эозинофилией, вероятно, в большей степени отражает предрасположенность к длительному пребыванию клеток в кровотоке, опосредованному гиперсекрецией IL-5 -ключевого эозинофил-активирующего фактора. В то же время, при анализе результатов оценки содержания клеток в культуре эозинофильных гранулоцитов in vitro, инкубированных с rIL-5, было установлено достоверное повышение

количества ССЯЗ-позитивных эозипофилов относительно их числа в интакгной культуре. Это подтверждает способность IL-5 увеличивать пул клеток, несущих CCR3 и праймировать эозинофилы в отношении этого лиганда [Zimmermann N. et al., 2003]. Полученные результаты свидетельствуют о сохранении резерва рецептор-экспрессирующей способности эозинофильных гранулоцитов у больных ТЛ.

Проведенный анализ позволяет заключить, что повышенное содержание CCLll/эотаксина, IL-5 и 1Ь-511Л-->кспрсссирующих эозинофилов в периферической крови является ключевым фактором гемической эозинофилии при ТЛ. Основной хематтрактант эозинофильных гранулоцитов CCLll/эотаксин в сочетании с профицитом IL-5 выступает в роли фактора активации клеток, обусловливая избыток эозинофильных лейкоцитов в периферической крови при туберкулезной инфекции.

Анализируя возможные причины повышения концентрации IL-5 и CCLll/эотаксина в крови и содержания IL-5RA+ и CCR3+эозинофилов при ТЛ, необходимо учитывать генетически детерминированный характер секреции медиаторов клетками и экспрессии ими рецепторных структур. В литературе представлены данные о наличии взаимосвязей аллелыюго полиморфизма генов цитокинов и их рецепторов с характером экспрессии кодируемых ими белковых продуктов и вероятностью развития определенных болезней [Sehmi R., 1997; Фрейдин М.Б. и соавт., 2004; Lee J.-H. et al., 2007; Namkung J.H. et al., 2007].

В результате настоящего исследования было установлено, что у больных ТЛ с эозинофилией распределение аллелей и генотипов полиморфных сайтов генов исследуемых цитокинов и их рецепторов значимо отличалось от такового у здоровых доноров и у больных ТЛ без эозинофилии (табл. 3).

Так, в промоторной области гена IL5 идентифицирован полиморфный участок в положении -703, замена цитозина на тимин (С-703Т) в котором оказывает влияние на уровень секреции белкового продукта. В ходе настоящего исследования у больных ТЛ было установлено изменение распределения аллельных вариантов полиморфизма С-703Т гена 1L5, что выражалось в преобладании гомозиготного генотипа СС над гетерозиготным CT и гомозиготным TT генотипами. При статистическом анализе были получены значимые различия в распределении генотипов (С-703Т) гена IL5 между здоровыми донорами и больными ТЛ с эозинофилией и без нее (табл. 3).

Исследование распределения аллелей и генотипов полиморфизма С-703Т гена IL5 позволило установить при ТЛ положительную ассоциацию гомозиготного генотипа СС, а также аллеля С с эозинофилией крови и,

Таблица 3

Распределение генотипов и аллелей полиморфизма генов цитокинов и их рецепторов (% (абс.)) у больных туберкулезом легких

Полиморфизм Генотипь и аллели Здоровые доноры, п=120 Больные туберкулезом легких с эозинофилией, п=102 х2 I Больные . I туберкулезом легких без эозинофилии, п=115 х2

С-703Т гена IL5 СС 49,2% (59) 67,6% (69) 50,4% (58) 3,31

СТ 44,2% (53) 23,5% (24) 10,37 36,5% (42) pi>0,05 6,61 Р2<0,05

тт 6,7% (8) 8,8% (9) pi <0,05 13,0% (15)

с 71,3% 79,4% 68,7% 0,36 pi>0,05 6,41 р2<0,05

Г 28,8% 20,6% Pi=0,05 31,3%

G-80A гена IL5RA GG 52,5% (63) 54,9% (56) 4,38 Pi >0,05 57,4% (66) 0,91 pi>0,05 2,21 р2>0,05

GA 42,5% (51) 33,3% (34) 36,5% (42)

АА 5,0% (6) 11,8% (12) 6,1% (7)

G 73,75% 71,6% 0,26 pi >0,05 75,7% 0,22 Pi >0,05 0,93 Р2>0,05

А 26,25% 28,4% 24,3%

A-384G гена CCL11 АА 58,3% (70) 44,1% (45) 10,18 Pi<0,01 51,3% (59) 2,12 Pi >0,05 3,33 Рг>0,05

AG 32,5% (39) 31,4% (32) 33,9% (39)

GG 9,2% (11) 24,5% (25) 14,8% (17)

А 74,6% 59,8% 11 m 68,3% 2,30 Pi>0,05 3,37 Р2>0,05

G 25,4% 40,2% Pi<0,00l 31,7%

ТТ 51,7% (62) 42,2% (43) 56,5% (65) 0,94 Pi >0,05 10,85 Р2<0,01

ТС 34,2% (41) 30,4% (31) 6,10 Pi =0,05 33,1% (38)

T-5IC гена CCR3 СС 14,2% (17) 27,5% (28) 10,4% (12)

Т 68,8% 57,4% 73,0% 6 1(? 1 I,05 Pi >0,05 II,81 Рг <0,001

С 31,2% 42,6% P1=0,01 27,0%

Примечание: Р1 - уровень статистической значимости различий по сравнению с аналогичными параметрами у здоровых доноров: Рг - У больных туберкулезом легких с эозинофгшией.

соответственно, протективный в отношении эозинофилии эффект генотипов СТ и 7Т, а также аллеля Г (рис. 1).

сс

ст

тт

О 0,5 1 1,3 2 2,5

Рис. 1. Показатели относительного риска развития эозинофилии при туберкулезе легких в зависимости от генотипа полиморфного сайта С-703Т гена IL5. Слева - генотипы полиморфного сайта С-703Т, справа - значения критерия отношения шансов (OR)

Анализ зависимости концентрации IL-5 в крови от варианта полиморфного сайта С-703Т гена IL5 показал, что у индивидуумов с генотипом СС (С-703Т) гена IL5 содержание IL-5 в крови значимо превышало таковое у пациентов с генотипами СТ и ТТ. Таким образом, идентифицирован «высокородуцирующий» генотип СС полиморфного сайта С-703Т гена IL5, ассоциированный с высоким содержанием IL-5 в крови у больных ТЛ.

Как упоминалось ранее, действие IL-5 реализуется посредством связывания со специфическим рецептором IL-5RA. При исследовании полиморфизма G-80A гена IL5RA не было выявлено существенных различий в распределении аллелей и генотипов у больных ТЛ с эозинофилией и без таковой относительно аналогичных параметров у здоровых доноров, а также при сравнении групп больных ТЛ в зависимости от числа эозинофильных гранулоцитов в крови (табл. 3). Анализ зависимости содержания IL-5RA+ эозинофилов от варианта полиморфного сайта G-80A соответствующего гена также не выявил каких-либо достоверных различий у больных ТЛ - носителей разных генотипов. Но всей видимости, увеличение числа эозинофилов, несущих на своей поверхности IL-5RA, у больных ТЛ с эозинофилией не зависит от полиморфизма G-80A гена IL5RA, а является результатом активирующего влияния одноименного цитокина, присутствующего в крови у пациентов в избыточных концентрациях.

Другим фактором, обусловливающим развитие эозинофилии крови, является CCL11/эотаксин. Замена аденина на гуанин в положении -384 промотора гена CCL1I ассоциирована с высокой концентрацией кодируемого хемокина при бронхиальной астме [Wang T.-N. et al., 2007; 2010]. В ходе проведенного нами иммуногенетического исследования полиморфизма A-384G гена CCL11 было установлено, что среди пациентов с ТЛ, сопровождающимся эозинофилией крови,

г—"""......................... ; „.„. -2.05

|

-"..Л "'Т''1.^ 0.65 1

достоверно чаще встречались носители гомозиготного генотипа АА, реже -носители гомозиготного генотипа ОС (табл. 3). Выявлены статистически значимые различия в распределении аллелей и генотипов (А-384С) гена ССШ у больных ТЛ с эозинофилией и у здоровых доноров. Обнаружена положительная ассоциация аллеля О и генотипа СС (А-3840) гена ССШ с ТЛ, сопровождающимся эозинофилией, что свидетельствует о предрасполагающем влиянии данного полиморфизма к формированию эозинофилии крови при туберкулезной инфекции (рис. 2).

ГТТЛ 0.54 ! 1

! 1 | :

____ : 3,53

о 0,5 ] 1,5 2 2,5 3 3.5 4 Рис. 2. Показатели относительного риска развития эозинофилии при туберкулезе легких в зависимости от генотипа локуса А-384 О гена ССШ. Слева - генотипы полиморфного сайта А-384 С, справа - критерий отношения шансов (ОЯ)

При анализе содержания ССЫ 1/эотаксина в крови в зависимости от аллельных вариантов полиморфизма А-3840 гена ССШ у больных ТЛ с эозинофилией было показано, что у гомозигот по аллелю б отмечался максимальный, а у гомозигот по аллелю А и гетерозигот АО - минимальный уровень секреции эотаксина-1 (табл. 3). Следовательно, наличие у больного ТЛ генотипа ОС исследуемого полиморфного сайта А-3840 гена ССШ в ассоциации с высокой концентрацией ССЫ 1/эотаксина в крови может лежать в основе развития эозинофилии крови при туберкулезной инфекции.

Биологическая роль ССЫ 1/эотаксина осуществляется при взаимодействии со специфическим рецептором ССЯЗ, экспресснрованным на эозинофильных гранулоцитах. При статистическом анализе установлены значимые различия в распределении аллелей и генотипов полиморфного сайта Т-51С гена ССЯЗ у больных ТЛ, сопровождающимся эозинофилией, и без таковой (табл. 3).

Выявлена ассоциация аллеля С и генотипа СС (ОЯ=3,25) полиморфизма Т-51С гена ССКЗ с развитием эозинофилыюй реакции крови при ТЛ и, соответственно, протективный эффект генотипов ТС (011=0,88), ТТ (ОК=0,56) и аллеля Т полиморфизма 7-5/С гена ССКЗ.

При исследовании зависимости содержания ССЯЗ-позитивных клеток в культуре эозинофилов крови от варианта полиморфного сайта Т-51С соответствующего гена не было выявлено каких-либо достоверных различий у

больных TJl - носителей разных генотипов. Следовательно, аллельный полиморфизм Т-51С гена CCR3 не оказывает существенного влияния на уровень экспрессии рецептора к эотаксинам.

Резюмируя вышеизложенное, следует заключить, что генетически детерминированная гиперсекреция ключевых факторов, активирующих эозинофильные гранулоциты - IL-5 и CCL11/эотаксина, обусловливает формирование эозинофилыюй реакции крови у пациентов с ТЛ. Риск развития эозинофилии повышается при сочетании в геноме больного ТЛ нескольких «высокопродуцирующих» генотипов полиморфизмов С-703Т гена IL5 и A-384G гена CCL11.

Особенности функциональной активности эозинофильных граиулоцитов крови при туберкулезе легких

При ТЛ эозинофильные гранулоциты могут циркулировать (в избытке) не только в периферической крови, но и участвовать (наряду с макрофагами и лимфоцитами) в формировании туберкулезной гранулемы. На моделях лабораторных животных продемонстрировано привлечение эозинофилов в очаг гранулематозного воспаления, вызванного М. tuberculosis, M. bovis, M. avium, M. smegmatis [Lasco T.M. et al., 2004; Kirman J. et al., 2009; Linch N.S. et al., 2009; Hattori Y. et al., 2011]. Тем не менее, до настоящего времени остается актуальным вопрос, способствуют эозинофильные гранулоциты иммунной защите макроорганизма от МБТ или, напротив, служат дополнительным резервуаром персистенции инфекта и участником деструктивных изменений в ткани легких?

Эозинофилы - агрессивные эффекторные клетки воспаления, реализующие свои функции, главным образом, в очаге воспаления, куда они мигрируют при участии хемокинов и молекул адгезии. Посредством адгезивных молекул (селектиновых рецепторов) происходит начальное прикрепление к эндотелию и «роллинг» эозинофилов in vivo [Wardlaw Л.J., 1999]. Прочная адгезия и миграция эозинофилов через стенку сосуда обеспечиваются кооперацией молекул адгезии семейства ргшггегринов (CDlla/CD18 (Мас-1) и CDllb/CD18 (LFA-1)), ß,-интегрипов (VLA-4) и семейства тетраспанинов (CD9), экспрессируемых на мембране эозинофилов, и молекул VCAM-1, MAdCAM-1 и ICAM-1, 2, 3, представленных на эндотелиальных клетках [Kunkel E.J., Butcher Е.С., 2002; Hogan S.P. et al., 2004; Curran C.S., Bertics P.J., 2012].

Проведенное нами in vitro исследование уровня экспрессии адгезивных молекул CD9 (обеспечивают адгезию эозинофилов к фибронектину) и CD 18 (общая субъсдиница Мас-1, LFA-1 и CR4) на эозинофилах, выделенных из крови больных ТЛ, позволило констатировать достоверное увеличение содержания

CD18 -позитивных клеток у больных TJT с эозинофилией и без нее; количество CD9+ эозинофилов во всех группах пациентов соответствовало контрольным значениям. При ТЛ с эозинофилией количество С018-презентирующих эозинофилов увеличивалось (до 21,54 (19,49-24,36) % при ИТЛ и 20,40 (18,5027,31) % при ДТЛ) по сравнению с аналогичными параметрами у больных ТЛ без эозинофилии (рис. 3).

%

30 20 10 о

Прочная адгезия и миграция эозинофилов через эндотелий

Здоровые Болыше с Больные без доноры зшшюфиией эозннофишщ

Рис. 3. Содержание CD18 клеток в культуре эозинофилов in vitro у больных туберкулезом

Это может быть связано со способностью IL-5 усиливать экспрессию на мембране эозинофилов молекул адгезии Мас-1 и LFA-1, имеющих общую субъединицу CD 18. Существование взаимосвязи изученных показателей подтверждалось наличием положительной корреляционной зависимости между уровнем базальной продукции эозинофильными гранулоцитами IL-5 и количеством CD 18+ клеток у больных ДТЛ с эозинофилией (i=0,79, р<0,05).

Дальнейшее привлечение эозинофилов в очаг воспаления осуществляется при участии хемокинов и экспрессии соответствующих рецепторов. Как упоминалось ранее, специфическими хематрактантами эозинофилов принято считать эотаксины INagase H. et al., 2000; Oliveira S.H. et al., 2002]; выраженной хемогаксической активностью обладает также IL-5 [Wise E.L. et al., 2010; Kusano S. et al., 2012].

Активирующее влияние IL-5 в отношении экспрессии рецепторов хемотаксиса эозинофильных гранулоцитов было продемонстрировано в ходе настоящего исследования. При ТЛ с эозинофилией было установлено достоверное повышение содержания ССКЗ-позитивных клеток в культуре эозинофилов при добавлении рекомбинантного IL-5 (относительно их количества в интактной культуре) при одновременном увеличении пула эозинофильных клеток, несущих IL-5RA. Выявленные изменения в сочетании с высоким содержанием IL-5 и CCL11/эотаксина в крови указывают на то, что эозинофилы при ТЛ, сопровождающемся эозинофилией, находятся в состоянии активации. Нормальный уровень экспрессии CCR3 клетками в интактной культуре

эозинофильных гранулоцитов у больных ТЛ с эозинофилией не исключает возможность хемотаксиса клеток в очаг воспаления за счет функционирования других хемокиновых рецепторов. Эозинофильные лейкоциты несут на своей мембране рецепторы для MCP и RANTES, опосредующие хемотаксис; рецепторы для PAF, при участии которого повышается экспрессия молекул CD9, играющих важную роль в агрегации и адгезии эозинофилов [Hosoki К. et al., 2012].

Экспрессия рецепторпых структур, обеспечивающих процессы активации, адгезии и хемотаксиса эозинофильных клеток, обусловливает их дальнейшую аккумуляцию в очаге воспаления, вызванного M tuberculosis, с последующей реализацией своего агрессивного цитотоксического потенциала, действие которого может быть направлено как в отношении бактерий, так и ткани легкого.

Цитотоксическая функция эозинофилов осуществляется за счет катионных протеинов гранул, а также метаболитов кислорода и азота, выделяемых при дегрануляции клеток [Rothenberg М.Е., Hogan S.P., 2006; Hogan S.P. et al., 2008; Ярилин A.A, 2010].

Ключевую роль в реализации антибактериальных свойств эозинофилов играет эозинофильная пероксидаза (ЕРО), которая при участии перекиси водорода, галогенидов (бромид, хлорид или иодид) и псевдогалогенидов (тиоционат) опосредует образование высокореактивных продуктов, взаимодействующих с тиоловыми группами клеточной стенки бактерий, что приводит к усилению ее проницаемости [Воробьев А.И., 2003; Wang J., Slungaard А., 2006; Hogan S.P. et al., 2008]. В эксперименте F. Legrand et al. [2009] продемонстрировано, что при взаимодействии эозинофильных гранулоцитов с М. tuberculosis, клетки выделяют а-дефензины и ЕРО, опосредующие лизис бактерий. В состав первичных гранул эозинофилов входит миелопероксидаза - фермент, катализирующий образование хлорноватистой кислоты и других агентов, угнетающих жизнедеятельность многих бактерий [Boreiii V. et al., 1999, 2003].

В настоящем исследовании мы оценивали активность пероксидазы (ЕРО и миелопероксидазы) в лизате эозинофильных гранулоцитов, выделенных из крови больных ТЛ. У всех пациентов независимо от наличия эозинофилии крови регистрировалось снижение пероксидазной активности эозинофилов по сравнению с нормой (рис. 4).

Данные изменения, на наш взгляд, Moiyr являться следствием усиления дегрануляционной активности клеток, обладающих повышенной чувствительностью ко многим сигналам, либо результатом ускоренной мобилизации эозинофильных гранулоцитов из костного мозга с преобладанием в крови пула молодых форм клеток, характеризующихся энзиматической незрелостью. Вместе с тем, снижение активности пероксидазы в эозинофильных

гранулоцитах может быть отражением угнетения их цитотоксической функции, реализуемой в отношении М. tuberculosis.

мккат/г 250 200 f 150 -

■

100 -50 т

Здоровые Больные с Больные без доноры эозинофилией зозннофилии

%

30

20 -

10 - Ü-

о •> Здоровые доноры

Больные с Больные без эозинофилией зозинофнлии

Рис. 4. Активность пероксидазы (А) и фагоцитарная активность (Б) зозинофшьных гранулоцитое при туберкулезе легких

Следует отметить, что при ТЛ, сопровождающимся эозинофилией, снижение активности пероксидазы в эозинофилах носило менее выраженный характер по сравнению с таковым у больных ТЛ без эозинофилии (рис. 4). По-видимому, в условиях длительного активирующего влияния 1L-5, концентрация которого была повышенной в крови и супернатантах культурштьных суспензий клеток у пациентов данной группы, в эозинофильньгх гранулоцитах может происходить наработка пероксидазы de novo.

Наряду с выделением пероксидазы и токсических метаболитов кислорода в межклеточное пространство эозинофилы способны уничтожать патоген в процессе фагоцитоза [Cherny V.V. et al., 2001]. Эозинофильные гранулоциты являются микрофагами, которые мигрируют из циркуляции в очаг воспаления, где поглощают гранулы тучных клеток, иммунные комплексы, бактерии и др. [Park Y.M., Bochner B.S., 2010]. После поглощения объекта происходит активация гексозомонофосфатного шунта, генерирующего восстановленный NADP, с последующим образованием супероксидных и нитроксидных радикалов, которые инициируют процессы перекисного окисления мембранных липидов клеточной стенки микроорганизмов [Lacy Р. et al., 2003]. Имеются отдельные сообщения о способности эозинофилов осуществлять активное поглощение вирулентных и авирулентных штаммов М tuberculosis и М. bovis in vitro [Kirman J. et al., 2009; LinchN.S. et al., 2009].

В ходе настоящего исследования мы оценивали фагоцитарную активность клеток в культуре эозинофилов in vitro по способности поглощать Е. coli, меченные флуоресцентной меткой FITC. У всех больных ТЛ независимо от количества эозинофилов в крови, формы заболевания и чувствительности МБТ к противотуберкулезным препаратам было зарегистрировано увеличение числа

фагоцитирующих эозинофилов (рис. 4). Примечательно, что у больных TJI с эозинофилией содержание фагоцитирующих клеток достоверно превышало их уровень у больных, в крови которых количество эозинофилов соответствовало норме. Выявленные изменения могут быть следствием активирующего влияния IL-5 и CCL11/эотаксина, способных усиливать экспрессию на мембране эозинофилов молекул адгезии, опосредовать их хемотаксис и поглощение патогена с последующим выбросом протеолитических ферментов в фагосому и во внеклеточное пространство. Подтверждением этому явилась положительная корреляционная зависимость между содержанием CCL11/эотаксина в крови и количеством эозинофилов, фагоцитировавших бактерии, при ДТЛ с эозинофилией (г=0,89, р<0,05). Одновременно с этим была установлена положительная корреляционная связь между количеством CD18+ клеток и числом фагоцитирующих эозинофилов (г=0,67, р<0,05) при ИТЛ, сопровождающимся эозинофилией.

Согласно современным представлениям, эозинофильные гранулоциты реализуют не только эффекторные функции в патогенезе многих защитно-приспособительных реакций макроорганизма, но и проявляют регуляторную активность [Hogan S.P., 2006; Hogan S.P. et al., 2008; Speirs R.S. et al., 2009; Akuthota P. et al., 2013; Reece P. et al., 2013]. В экспериментах продемонстрирована антигенраспознающая их функция. На мембране эозинофилов идентифицированы паттерн-распознающие структуры типа TLR2 и комплекс ySTCR-CD3, связывающие небелковые антигенные детерминанты, что позволяет эозинофилам реализовывать свои потенции на этапе доиммунных реакций [Legrand F, et al., 2009; Reece P. et al., 2013]. По данным некоторых авторов, эозинофилы способны также осуществлять процессинг и презентацию антигенов клеткам иммунной системы и тем самым проявлять антигенпредставляющую функцию [Shi П., 2005].

Наряду с этим, эозинофильные гранулоциты продуцируют цитокины с провоспалительной (IL-2, IL-12, IL-17A, IFNy, TNFa), противовоспалительной (IL-4, IL-5, IL-13) и иммуносупрессорной (IL-10, TGFp) активностью, участвующие в реализации и регуляции иммунного ответа макроорганизма [Park Y.M., Bochner B.S., 2010; Xue F.M. et al., 2012; Al-Muhsen S. et al., 2013; Esnault S. et al., 2013].

В связи с этим, в настоящем исследовании проводилась оценка концентрации некоторых иммунорегуляторных медиаторов в ишактной культуре эозинофилов и при добавлении в культуральную суспензию вакцинного штамма BCG (живой атгенуированный штамм М bovis). Выбор индуктора производили с учетом данных литературы, отражающих способность эозинофильных лейкоцитов взаимодействовать с микобактериями различных видов с последующим высвобождением цитокинов [Legrand F. et al., 2009; Корецкая Н. М., 2011].

Известно, что значительную роль в патогенезе TJ1 играет IL-2 - ключевой ростовой фактор Т-лимфоцитов, направляющий дифференцировку лимфоцитов из ThO в Thl и регулирующий клеточно-опосредованные реакции иммунитета на М. tuberculosis [Воронкова О.В. и соавт., 2007; Сахно Л.В. и соавт., 2011; Симбирцев A.C., 2011].

В результате исследования in vitro у больных ТЛ были зарегистрированы разнонаправленные изменения базальной продукции эозинофилами IL-2: гипопродукция IL-2 при ИТЛ с эозинофилией и, напротив, гиперсекреция цитокина при ДТЛ, сопровождающимся эозинофилией; у больных ТЛ без эозинофилии независимо от клинической формы и варианта устойчивости МБТ к ПТП уровень базальной продукции IL-2 соответствовал норме (табл. 4). Однозначная интерпретация изменений IL-2-секреторной функции эозинофилов при ТЛ представляется затруднительной. Снижение базальной секреции IL-2 in vitro, вероятно, может быть результатом токсического действия М. tuberculosis на эозинофильные грапулоциты, которые способные активно взаимодействовать с микобактериями различных видов. Гиперсекреция IL-2 эозинофилами крови при ДТЛ, характеризующимся более выраженным иммунологическим дисбалансом, по всей видимости, связана не только с реализацией данным медиатором функции лимфоцитарного фактора роста, но и активацией регуляторных Т-клеток (Treg), проявляющих иммуносупрессорные свойства [Malek Т., Bayer А., 2004].

Еще одним медиатором, секретирусмым эозинофилами и участвующим в регуляции механизмов антибактериальной резистентности макроорганизма, является TNFa. Локальное высвобождение данного цитокина приводит к усилению хемотаксиса лейкоцитов, активации поглотительной и переваривающей функций фагоцитирующих клеток, а также сдвигу цитокинового баланса в направлении Thl [Herbein Н, Brien W.A., 2000; Temkin V., Levi-Schaffer F., 2001].

В результате проведенного исследования in vitro установлено увеличение базатыюй секреции TNFa эозинофильными гранулоцитами только у больных ИТЛ и ДТЛ с эозинофилией (табл. 4). Полученные данные укладываются в представления об эозинофил-активирующих свойствах данного цитокина, способного продлевать время пребывания эозинофильных гранулоцитов в циркуляциии путем стимуляции секреции GM-CSF [Temkin V., Levi-Schafler F., 2001]. Установлена положительная корреляционная зависимость между содержанием эозинофилов в крови и базальной продукцией TNFa у больных ЛУ ИТЛ с эозинофилией (г=0,67, р<0,05). В условиях гиперсекреции TNFa может дополнительно активировать процессы адгезии, миграции и дегрануляции эозинофилов, усиливая тем самым эффекторный потенциал клеток. У больных ДТЛ, сопровождающимся эозинофилией, была выявлена отрицательная

корреляционная связь между концентрацией ТОРа в интактной культуре клеток и активностью пероксидазы в эозинофилах (г=-0,75, р<0,05).

Таблица 4

Содержание цитокинов в супернатантах культуральных суспензий

эозинофильных гранулоцитов у больных туберкулезом легких (пг/мл) (Ме ((ЗгОз))

1 Группы 1 обследованных лиц 11.-2 ТЫРа 11,-5

Интактная ВСО-индуцированная Интактная ВСО-индуцированная Интактная НСО-индуцированная

Здоровые I доноры 52,29 (24,45-69,50) 57,35 (30,70-65,76) 615,25 (553,501014,20) 855,44 (622,901352,00) р4<0,05 (3.-0,5) I (Л

I я в 1 и ■■■ 1 с; н К 38,37 (22,3049,02) Р[<0,05 44,35 (28,99-50,27) Р1<0,05 881,38 (659,841559,04) Р|<0,05 1665,83 (662,852295,01) Р. <0,05 р4<0,05 15,61 (12,6919,08) р,<0,05 28,27 (22,03-36,08) р,<0,05 р4<0,05

§ и х з с: о и и Ч н ч 76,63 (51,50-80,15) р,<0,05 Рз<0,05 67,05 (60,10-71,50) р,<0,05 964,02 (655,981533,93) р,<0,05 1025,00 (817,322140,00) р,<0,05 р3<0,05 14,56 (11,67-гО,34) р,<0,05 27,58 (24,73-28,60) р,<0,05 р4<0,05

Больные туберкулезом легких без эозинофилии с? Ё 57,15 (24,75-70,24) р2<0,05 40,25 (23,06-62,04) р,<0,05 Рг<0,05 р4<0,05 645,70 (554,23987,25) рг<0,05 1381,40 (827,201640,10) р,<0,05 р4<0,05 4,16 (2,31-12,80) р,<:0,05 рг<0,05 4,92 (1,61-7,45) Р1<0,05 Рг<0,05

И 50,65 (23,42-71,35) Р2<0,05 52,25 (39,74-59,74) р2<0,05 рз<0,05 641,90 (347,391028,00) р2<0,05 833,55 (432,641794,20) Рг<0,05 р3<0,05 р,<0,05 4,99 (2,52-10,53) Рз<0,05 4,50 (2,13-9,45) р,<0,05 Рг<0,05

Примечание: р/ - уровень статистической значимости различий по сравнению с аналогичными параметрами у здоровых доноров; Р2 — У больных туберкулезом легких с эозинофилией; рз-у больных инфшьтративным туберкулезом легких; р4 - по сравнению с интактной культурой клеток внутри одной группы обследованных.

Наряду с провоспалительными медиаторами эозинофильные гранулоциты секретируюг цитокины, опосредующие гуморальные реакции иммунитета. Представителем цитокинов, направляющих дифференцировку лимфоцитов из ТЬО в ТЬ2, является 1Ь-5, который стимулирует процессы пролиферации и дифференцировки В-лимфоцитов посредством усиления экспрессии рецептора к 1Ь-2 на В-клетках, а также индуцирует продукцию В-клетками цитокинов и (при

трансформации их в плазматические клетки) иммуноглобулинов различных классов [Woerly G. et. а!., 1999; Lacy P., Moqbel R., 2000].

Как показали результаты проведенных нами исследований, спонтанная секреция IL-5 эозинофильными гранулоцитами периферической крови оказалась достоверно выше у больных ИТЛ и ДТЛ, сопровождающимся эозинофилией (табл. 4). В связи с этим, важно отметить, что гиперпродукция ТЬ2-цитокинов клетками крови ассоциирована с прогрессирующим течением ТЛ с преобладанием деструктивных изменений в легочной ткани [Howard A.D., Zwilling B.S., 1999].

Исследование цитокинсекреторной активности эозинофильных гранулоцитов при добавлении в культуральную суспензию клеток вакцинного штамма BCG позволило констатировать достоверное повышение уровней BCG-индуцировашюй in vitro продукции IL-5 и TNFa у больных ИТЛ и ДТЛ с эозинофилией, уровень BCG-индуцированной секреции IL-2 увеличивался лишь у пациентов с диссеминированной формой ТЛ (табл. 4). Выявленные изменения свидетельствуют, на наш взгляд, о повышенной реактивности эозинофильных клеток, способных регулировать процессы адаптивного противотуберкулезного иммунитета при дополнительной антигенной нагрузке.

Таким образом, эозииофильные гранулоциты крови при ТЛ (особенно сопровождающимся эозинофилией) характеризуются высокой активностью в отношении экспрессии рецепторов, опосредующих длительное пребывание их в кровотоке с последующей миграцией в очаг воспаления. Это в сочетании с истощением пероксидазной активности клеток в условиях активации их фагоцитарной функции свидетельствует об участии эозинофилов в реализации эффекторных механизмов противотуберкулезной резистентности. Гиперсекреция эозинофилами медиаторов Thl- и ТЬ2-профиля подтверждает их иммунорегуляторные свойства и способность вносить вклад в общий цитокиновый дисбаланс, формирующийся при туберкулезной инфекции.

Роль эозинофилии крови в развитии иммунопатологических изменений при туберкулезе легких

На сегодняшний день не существует единого мнения, касающегося влияния эозинофильных гранулоцитов (в условиях их избыточного содержания в крови) на состояние иммунитета, течение и исход ТЛ. Сложившиеся представления о прогностическом значении гемической эозинофилии при ТЛ носят весьма противоречивый характер. Одни исследователи утверждают, что эозинофилия крови в сочетании с лимфоцитозом является показателем адекватного противотуберкулезного иммунного ответа, определяющего благоприятное течение туберкулезной инфекции, а возникновение анэозинофилии является негативным прогностическим симптомом [Мишин В. Ю. и соавт., 2004]. Другое указывают на

то, что эозинофильная реакция крови, напротив, сопровождает деструктивные формы ЛУ ТЛ, характеризующегося более тяжелым течением [Полосухин В.В., 1997; Кшпап .К й а1., 2009].

В связи с этим, в настоящем исследовании проведена сравнительная оценка основных параметров иммунного ответа, проанализированы особенности клинической картины и рентгенологических проявлений ТЛ в зависимости от количества эозинофилов в периферической крови с учетом формы заболевания и чувствительности возбудителя к ПТП.

Известно, что течение ТЛ сопровождается выраженной депрессией клеточного звена иммунитета со снижением общего числа лимфоцитов в периферической крови, дисбалансом отдельных субпопуляций Т-лимфоцитов, угнетением их функциональной активности [Кноринг Б.Е. и соавт., 1998, 2001; Воронкова О.В. и соавт., 2007; Лядова И.В., Гергерт В.Я., 2009].

Как показали результаты проведенного нами исследования, абсолютное содержание лимфоцитов в крови у больных ТЛ без эозинофилии и ДТЛ с эозинофилией значимо не отличалось от контрольных значений, а у больных ИТЛ, сопровождающимся эозинофилией, достоверно увеличивалось. При изучении субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у больных ДТЛ независимо от количества эозинофильных лейкоцитов в периферической крови было зарегистрировано статистически значимое снижение (по сравнению с контрольными значениями) относительного и абсолютного числа СБЗ+ Т-лимфоцитов (соответственно до (0,92±0,19)х 109/л и (40,93±3,84) % у больных ДТЛ с эозинофилией и до (0,82±0,11)х109/л и (51,43±5,15) % у больных ДТЛ без эозинофилии).

Одновременно с этим, у всех больных ТЛ было установлено статистически значимое повышение относительного числа СБ20+лимфоцитов в крови. При этом абсолютное их содержание увеличивалось только у пациентов с ИТЛ ((0,59±0,09) х109/л) и ДТЛ ((0,53±0,09)хЮ9/л), сопровождающимся эозинофилией, что свидетельствует о более выраженной активации гуморального звена иммунной системы в условиях развития эозинофильной реакции крови. У пациентов данных групп наблюдения эозинофильные гранулоциты крови секретировали повышенное количество 11,-5 (табл. 4) - медиатора, способного усиливать пролиферацию и дифференцировку активированных В-лимфоцигов за счет индукции экспрессии рецептора к 11,-2 на этих клетках, активации продукции В-клетками цитокинов и иммуноглобулинов. В свою очередь, известно, что иммуноглобулины различных классов обнаруживаются в периферической крови при любых формах ТЛ. Анализ суммарного пула специфичных к антигенам микобактерий иммуноглобулинов класса О, М и Л у больных ТЛ выявил присутствие противотуберкулезных

антител в сыворотке крови у 40 % пациентов с эозинофилией, что не имело статистически значимых различий с группой больных, в крови которых количество эозинофилов соответствовало контрольным значениям.

Приоритет в модуляции функций иммунокомпетентных клеток в реализации противотуберкулезного иммунитета, безусловно, принадлежит цитокинам.

Ключевым цитокином, обеспечивающим протективный иммунный ответ при туберкулезной инфекции, является IFNy. Последний обладает широким спектром свойств, включая активацию микробицидных свойств макрофагов (посредством усиления продукции TNFa, IL-1, IL-6 и др.), усиление синтеза оксида азота и кислородных радикалов клетками, индукцию экспрессии антигенов МНС класса II на антигенпрезентирующих клетках (АПК) и др.

В результате проведенного исследования было зарегистрировано статистически значимое снижение концентрации IFNy в крови у больных TJI, ассоциированным с эозинофилией (5,85 (3,86-7,31) пг/мл у больных ИТЛ и 4,95 (3,86-6,21) пг/мл у больных ДТЛ). Дефицит IFNy в сочетании с высоким числом эозинофилов в крови при ТЛ обусловлен, вероятно, преобладанием иммунорегуляторных цитокинов, опосредующих формирование гуморального иммунитета, подавляющих пролиферацию Thl-лимфоцитов и их способность секретировать основные противотуберкулезные медиаторы. Следует отметить, что недостаток IFNy может выступать в качестве фактора, способствующего развитию эозинофилии в крови и тканях при ТЛ [Kirman J. et al. 2000]. В настоящем исследовании была установлена отрицательная корреляционная связь между содержанием IFNy и количеством зозинофильных гранулоцитов в периферической крови при ТЛ (г=-0,87, р<0,05).

Наряду с IFNy в комплексе защитных реакций при туберкулезной инфекции важную роль играет IL-2. Основная функция данного медиатора заключается в активации пролиферации лимфоцитов, стимулированных антигеном. Действуя через специфические рецепторы на клетках, IL-2 инициирует реализацию функций Т-лимфоцитов-хелперов и цитотоксических лимфоцитов, направляя иммунный ответ по Thl-зависимому пути [Галактионов В.Г., 1998; Кашкин К.П., 1998; Симбирцев A.C., 2004; Суркова Л.К. и соавт., 2007; Симбирцев A.C., 2011].

При исследовании in vitro продукции 1L-2 мононуклеарными лейкоцитами при ТЛ нами было установлено снижение базальной продукции медиатора только у больных ТЛ в сочетании с эозинофилией, в то время как угнетение BCG-индуцированной секреции IL-2 отмечалось у всех пациентов. Наиболее выраженное снижение продукции IL-2 было зарегистрировано при ДТЛ, сопровождающимся эозинофилией (табл. 5).

Таблица 5

Содержание цитокинов в культуре мононуклеарных лейкоцитов in vitro у больных туберкулезом легких

(пг/мл) (Me (Q1-Q3))

IL-2 IL-4 IL-10 TGFP

Обследованные лица Икгактная BCG-юадуциро-ванная Интактная BCG-индуциро-ванная Икгактная BCG-индуциро-ванная Интактная BCG-индуциро-ванная

Здоровые доноры 22,26 (10,82-30,18) 69,36 (13,94-165,80) р4<0,05 39,98 (21,14-55,04) 43,69 (26,46-68,55) р„<0,05 25,29 (13,50-33,56) 26,21 (22,74-60,22) 1108,75 (929,80-1487,20) 1087,80 (500,00-1412,60)

Больные туберкулезом легких с эозинофилией ИТЛ 14,26 (10,34-20,78) Pi<0,05 32,26 (24,45-61,04) Pi<0.05 р4<0,05 60,23 (35,56-81,34) р,<0,05 62,64 (41,94-80,45) Pl<0,05 21,79 (13,37-30,02) 42,06 (31,12-64,00) р,<0,05 р4<0,05 1318,80 (640,23-1403,07) р,<0,05 683,90 (542,50-743,86) р, <0,05 pj<0,05

дгл 10,59 (6,74-14,26) Р!<0,05 33,85 (15,60-52,10) р,<0,05 р<<0,05 58,64 (23,54-64,30) Pi <0,05 р3<0,05 61,36 (39,11-79,32) р,<0,05 19,34 (16,40-25,27) 48,28 (23,71-72,25) Pi<0,05 р4<0,05 1434,39 (764,93-2159,11) р,<0,05 1293,67 (714,45-1793,00) р3<0,05

Больные туберкулезом легких без эозинофилии ИТЛ 20,11 (16,52-26,73) ра<0,05 14,29 (9,36-23,52) Pi<0,05 Рз<0,05 35,45 (16,26-52,27) р2<0,05 26,53 (19,53-52,67) р,<0,05 Р2<0,05 52,29 (27,73-61,06) Pi<0,05 р3<0,05 59,27 (42,63-65,18) Pi<0,05 рз<0,05 812,83 (471,52-1079,10) р,<0,05 р,<0,05 955,30 (317.46-1147,26) р,<0,05

дгл 23,67 (20,99-44,34) р,<0,05 26,10 (18,74-34,39) р,<0,05 Р2<0,05 Рз<0,05 54,82 (39,71-78,20) Pi<0,05 Р2<0,05 pj<0,05 59,72 (44,12-89,88) р,<0,05 р3<0,05 19,20 (11,43-32,17) Рз<0,05 26,63 (21,57-44,23) рз<0,05 PJ<0,05 1227,72 (751,30-1676,20) р2<0,05 р3<0,05 712,70 (642,50-789,56) р,<0,05 р3<0,05 Рз<0,05 pj<0,05

Примечание: р! -уровень статистической значимости различий по сравнению с аналогичными параметрами у здоровых доноров; Р2-У больных туберкулезом легких с эозинофилией; рз- у больных инфшьтративным туберкулезом легких; р4 - по сравнению с гттактной культурой клеток внутри одной группы обследованных, ИТЛ — ипфильтративный туберкулез легких; ДТП — диссеминированный туберкулез легких.

Выявленная нами гипопродукция TL-2 мононуклеарами крови при ТЛ, с одной стороны, может быть результатом токсического влияния М. tuberculosis на процессы синтеза и высвобождения цитокина иммунокомпетентными клетками, а с другой, - проявлением функциональной анергии Т-клеток, ассоциированной с тяжестью заболевания [Сахно Л.В. и соавт., 2004; Черных Е.Р. и соавт., 2002]. По результатам исследования, регистрировалось менее выраженное снижение BCG-индуцированной секреции IL-2 от vitro при лекарственно-резистентном ИТЛ и ДТЛ с эозинофилией и ИТЛ без эозинофилии, чем при лекарственно-чувствительном варианте заболевания.

Многогранность функционального потенциала IL-2 в формировании адаптивного противотуберкулезного иммунитета проявляется в том, что он выполняет не только функции ростового фактора, но и осуществляет контроль за гиперактивацией иммунной системы посредством стимуляции дифференцировки Treg-лимфоцитов [Malek T., Bayer А., 2004]. На сегодняшний день хорошо изучены две разновидности Treg - естественные тимические (Тпг) и индуцированные на периферии (Tir) [Lee D.C. et al., 2010; Хаитов P.M. и соавт., 2011]. Показано, что Treg несут различные поверхностные (CD25, CTLA-4) и внутриклеточные (транскрипционный фактор Foxp3) молекулы, благодаря которым осуществляется их иммуносупрессорный эффект. Важным механизмом супрессии Treg является лизис иммунокомпетентных клеток за счет продукции гранзимов А и В, а также подавление функциональной активности эффекторных Т-клеток путем секреции угнетающих иммунный ответ цитокинов (IL-10 и TGFß) [Хайдуков C.B., Зурочка A.B., 2011].

По мнению исследователей, избыточная активность Treg обусловливает снижение интенсивности протективного иммунного ответа в борьбе макроорганизма с М. tuberculosis [Lee D.C. et al., 2010; Чурина Е.Г. и соавт., 2012].

Учитывая изложенное выше, в настоящем исследовании была предпринята попытка оценить содержание регуляторных Т-клеток, экспрессирующих молекулу Foxp3, у больных ТЛ в зависимости от числа эозинофилов в периферической крови. При этом было выявлено достоверное повышение количества CD4+CD25+Foxp3+ Treg у всех пациентов с ТЛ, тогда как содержание CD25-негативных Treg-лимфоцитов, экспрессирующих внутриклеточный маркер Foxp3, возрастало только у больных ЛУ ДТЛ без эозинофилии. Обращало на себя внимание достоверное увеличение численности Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+CD25+Foxp3+ при ТЛ, сопровождающимся эозинофилией (6,28 (4,02-9,00) % у больных ИТЛ и 6,72 (3,92-11,56) % у больных ДТЛ), при этом более выраженные изменения количества Treg были обнаружены при лекарственно-устойчивом варианте заболевания (7,04 (6,78-11,48) %, р4<0,05).

Следует отметить, что у больных ТЛ с эозинофилией увеличение содержания Foxp3+ Treg-лимфоцитов в крови происходило на фоне гипосекреции мононуклеарными лейкоцитами in vitro IL-2 - ключевого фактора, опосредующего процесс пролиферации регуляторных меток [Thornton A.M., 2006]. В то же время, у больных ДТЛ в сочетании с эозинофилией был зарегистрирован высокий уровень продукции IL-2 в интактной культуре эозинофильных гранулоцитов ш vitro. Гиперсекреция IL-2 эозинофильными гранулоцнгами в условиях повышенного их содержания в крови, по-видимому, может обусловливать конверсию Т-хелперов в CD4+CD25+Foxp3+ Treg-лимфоциты при ТЛ (рис. 5).

Лимфоцит I 1L_2

>1ГШМ1|ф

11<фнл ^^

T-reg клетка

тэхрЗ}>

IL-2

■ CD4 -- J CD25

VCTLA4

CITR TCFP IL-IO

л So!

CD125

Рис. 5. Секреция цитокинов эозинофильными гранулоцитами и регутторными Т-клетками при туберкулезе легких

Способность эозинофильных гранулоцитов опосредовать накопление Treg в крови при ТЛ подтверждается наличием положительной корреляционной зависимости между базальной секрецией IL-2 в культуре эозшюфилов in vitro и содержанием CD4+CD25+Foxp3+ Treg при ЛУ ДТЛ (г=0,79, р<0,05).

Показано, что реализация супрессорного потенциала Treg может происходить при непосредственном контакте между клетками (конкурентное CTLA4/B7 взаимодействие) или за счет секреции цитокинов-иигибиторов иммунного ответа (BL-10 и TGFp) [Talcahashi Т. et al„ 1998; Salcaguchi S. 2004; Nishikawa H„ Salcaguchi

S„ 2005; ЧуринаЕ.Г., 2012].

В ходе настоящего исследования в условиях in vitro было зарегистрировано увеличение уровня спонтанной и BCG-индуцированной секреции IL-10 мононуклеарными лейкоцитами при ЛЧ ИТЛ без эозинофилии (табл. 5). Установлена отрицательная корреляция между повышенной концентрацией НЛО в интактной культуре мононуклеарных лейкоцитов и содержанием IL-5 в крови у пациентов данной группы (г=-0,67, Р<0,05), что подтверждает супрессорные свойства цитогшна, способного подавлять продукцию IL-5 ТЬ2-лимфоцитами. У больных ТЛ, сопровождающимся эозинофилией, независимо от формы заболевания и лекарственной чувствительности возбудителя к ПТП на фоне

высокого уровня IL-5 в крови базальная секреция IL-10 соответствовала контрольным значениям, а уровень BCG-индуцированной секреции этого медиатора достоверно превышал таковой у здоровых лиц (табл. 5).

Следует отметить, что при TJI с эозинофилией нормальный уровень секреции IL-10 in vitro сочетался с высоким числом CD4+CD25+Foxp3+ Т-лимфоцитов и низкой концентрацией IFNy в крови и IL-2 в интактной культуре мононуклеарных лейкоцитов in vitro. Учитывая, что IL-10 - это не единственный антагонист цитокинов клеточного звена иммунитета (IFNy, IL-12 и IL-2) и активатор супрессорных механизмов, установленное нами противоречие можно объяснить включением в регуляцию ТЬ1/ТЬ2-баланса при туберкулезной инфекции с эозинофилией других цитокинов, в частности TGFß, главным свойством которого является супрессия всех типов иммунного ответа [Ярилин A.A., 2010; Симбирцев A.C., 2011].

Согласно результатам, полученным в настоящем исследовании, уровень базальной продукции TGFß в культуре мононуклеарных лейкоцитов у больных ТЛ, сопровождающимся эозинофилией, достоверно превышал контрольные значения и параметры спонтанной секреции медиатора при ТЛ без эозинофилии (табл. 5). Максимальный уровень базальной и индуцированной in vitro продукции TGFß регистрировался при ЛУ ДТЛ с эозинофилией (1632,12 (774,90-2005,78) пг/мл, р4<0,05). Профицит секреции TGFß у больных ТЛ в сочетании с эозинофилией, по всей видимости, является проявлением гиперфункции основных клеток-продуцентов этого цитокина. Учитывая, что TGFß является цитокином, опосредующим пролиферацию, дифференцировку Treg и одновременно реализацию ими иммуносупрессорных свойств, избыточные концентрации медиатора при ТЛ могут, с одной стороны, быть причиной увеличения численности субпопуляции Treg, а с другой, - следствием избыточного содержания последних в крови. Накопление Treg-лимфоцитов в сочетании с высоким уровнем TGFß может быть механизмом иммуносупрессии при ТЛ (в частности при ДТЛ), течение которого сопряжено с эозинофильной реакцией крови. Вместе с тем, эозинофильные гранулоциты сами являются источником TGFß, особенно при заболеваниях, сопровождающихся эозинофилией [Lacy Р., Moqbel R., 1997; Meló R.C. et al., 2005,2008; Spencer L.A. et al„ 2009].

Еще одним антагонистом Thl-цитокинов является IL-4 - ключевой цитокин ТЬ2-зависимого иммунного ответа, который стимулирует пролиферацию В-лимфоцитов и их дифференцировку в плазматические клетки, усиливает экспрессию генов иммуноглобулинов и тем самым обеспечивает наработку антител при воспалении. Кроме этого, IL-4 наряду с IL-2 участвует в регуляции баланса механизмов активации и супрессии иммунного ответа [McCoy М.Е. et al.,

2010].

Как показали результаты проведенного нами исследования, уровень базальной секреции IL-4 мононуклеарными лейкоцитами in vitro достоверно превышал показатель нормы у всех больных ТЛ с эозинофилией независимо от клинической формы заболевания и чувствительности возбудителя к ПТП (табл. 5), в то время как у больных без эозинофилии повышение базальной секреции цитокина регистрировалось только при ЛУ ДТЛ. У больных ТЛ в сочетании с эозинофилией была установлена положительная корреляция между базальной гиперсекрецией IL-4 мононуклеарными лейкоцитами in vitro и концентрацией IL-5 (медиатора гуморального иммунного ответа) в крови (г=0,88, р<0,05 и г=0,74, р<0,05 при ИТЛ и ДТЛ соответственно). У пациентов данных групп наблюдения было зарегистрировано достоверное увеличение абсолютного числа CD20* В-лимфоцитов, что, с одной стороны, может быть причиной, а с другой, - следствием повышенной наработки медиаторов гуморального звена иммунной системы в условиях эозинофилии крови.

Таким образом, ТЛ в сочетании с эозинофильной реакцией крови характеризуется снижением концентрации ключевых цитокинов противотуберкулезного иммунитета на фоне увеличения продукции медиаторов с иммуносупрессорной активностью в сочетании с повышением содержания В-лимфоцитов и Treg в крови. Выявленные изменения указывают на превалирование специфического иммунного ТЪ2-ответа, выполняющего скорее вспомогательную роль в механизмах защиты макроорганизма от МБТ. Преобладание гуморального звена иммунного ответа в сочетании с активацией клеток-супрессоров при ТЛ является неблагоприятным фактором, определяющим более тяжелое прогрессирующее течение заболевания [Комогорова Е.Э. и соавт., 2005; Пичугин A.B., 2005; Левашов Ю.Н., Репин Ю.М., 2008; Сахно Л.В. и соавт., 2011].

Клиническое течение туберкулезной инфекции определяется многими факторами и зависит от площади повреждения ткани легких, патогенности МБТ, а также от состояния общей иммунологической реактивности макроорганизма.

В результате проведенного нами исследования установлено, что у больных ТЛ с эозинофилией и без таковой острый характер начала заболевания с проявлениями интоксикационного синдрома (повышение температуры тела, ночные поты, слабость, повышенная утомляемость, снижение или отсутствие аппетита, потеря массы тела) сочетался с симптомами воспалительных изменений в легочной ткани (кашель, выделение мокроты, кровохарканье, одышка), что отражает значительный характер распространенности процесса в легких.

Сравнительный анализ рентгенологических проявлений туберкулезной инфекции в зависимости от числа эозинофилов в периферической крови с учетом

вариантов клинических форм заболевания позволил установить, что при ДТЛ с эозинофилией очаги деструкции регистрировалась у 100,00±0,00 % больных; у пациентов с ТЛ без эозинофилии деструктивные изменения легочной ткани обнаруживались лишь в 60,35±7,37 % случаев (р<0,001) (табл. 6).

По результатам сравнительного анализа деструктивных поражений легочной ткани была установлена достоверная взаимосвязь между наличием деструкции в легких и эозинофилией в периферической крови (га=0,50, р<0,05 при ИТЛ и га=0,71, р<0,05 при ДТЛ).

Таблица 6

Рентгенологические проявления у больных туберкулезом легких (%)

Рентгенологические проявления патологического процесса в легких Больные инфильтративным туберкулезом легких Больные диссеминированным туберкулезом легких

С эозинофилией (п=62) Без эозинофилии (п=70) С эозинофилией (п=40) Без эозинофилии (п=45)

Площадь поражения от 2 до 4 сегментов 8,06±3,48 10,00±6,67 7,00±2,64 12,50±4,67

более 4 сегментов в пределах одного легкого 75,71±4,76 69,43±4,50 25,33±6,96 40,16±4,62

оба легких 16,23±4,72 20,57±4,24 67,51±6,43 47,34±4Д4 р<0,05

Характер образований очаги 59,86±4,20 66,35±5,67 67,74±7,48 62,50±7,75

инфильтраты 40,14±6,27 33,65 ±5,68 32,26±ЗД7 37,50±4,63

Деструктивные изменения в легочной ткани 70,00±5,89 61,50±5,84 100,00±0,00 60,35±7,37 р<0,001

Темпы рассасывания очагово- инфильтративных образований в легких быстрый (до 3 мес.) 10,00±3,85 50,07±6,02 р<0,001 0,00±0,00 25,00±6,52 р<0,001

средний (3-6 мес.) 59,76±6,28 31,63 ±5,58 р<0,001 0,00±0,00 12,50 ±5,58 р<0,001

медленный (6 и более мес.) 30,24±3,12 18,30±4,65 100,00±0,00 62,5±7,30 р<0,001

Остаточные изменения в ткани легких (очаги фиброза) 60,00±6,27 77,10 ±4,86 48,43±7,56 50,06 ±7,53

Примечание: р - уровень статистической значимости различий по сравнению с аналогичными параметрами у больных туберкулезом легких с эозинофилией.

Способность эозинофильных гранулоцитов инициировать повреждение легочной ткани при аккумуляции в очаге гранулематозного воспаления [Lasco Т.М. et al., 2004; Kirman J. et al., 2009; Linch N.S. et al., 2009; Hattori Y. et al., 2011] может быть обусловлена широким спектром агрессивных цитотоксических факторов, содержащихся в гранулах этих клеток. Следствием дегрануляции эозинофилов в тканях макроорганизма при эозинофил-ассоциированных

заболеваниях является деструкция эпителия воздухоносных путей, эпителия желудочно-кишечного тракта, эндотелия, тканей эндокарда, легких и др. [Ольшанская Ю.В. и соавт., 2005; Rothenberg М.Е., Hogan S.P., 2006; Lucendo AJ. et al., 2007; Miyoshi R. et al„ 2007; Baandrup U„ 2012].

Факт деструкции тканей при гиперэозинофилиях некоторые исследователи ассоциируют с высоким уровнем TNFa, цитотоксическая активность которого опосредована активацией ЕРО [Бережная Н.М., 2000]. Последний тезис позволяет интерпретировать возможные механизмы деструктивных изменений в легочной ткани при ТЛ. У больных ТЛ с эозинофилией установлена гиперсекреция TNFa in vitro на фоне снижения активности пероксидазы в эозинофильных гранулоцитах. Обнаружена отрицательная корреляция между концентрацией TNFa в интактной культуре клеток и активностью пероксидазы в эозинофилах (i=-0,75, р<0,05 при ДТЛ). Подтверждением деструктивного потенциала TNFa при туберкулезной инфекции является выявленная нами достоверная взаимосвязь между базальным уровнем медиатора и наличием деструкции в легких при ТЛ (г„=0,59, р<0,05).

Известно, что преобладание альтеративных изменений в тканях сопряжено с замедлением репаративных явлений и положительной динамики развития инфекционного процесса. Анализ сроков рассасывания очагово-инфильтративных поражений в легочной ткани у больных ТЛ в зависимости от числа эозинофилов в крови показал, что при ИТЛ, сопровождающимся эозинофилией, преобладали средние его темпы, а при ДТЛ, ассоциированным с эозинофилией, в 100,00±0,00 % случаев регистрировались медленные темпы восстановления легочной ткани (табл. 6). В результате проведенного нами корреляционного анализа была установлена достоверная взаимосвязь между средними и медленными темпами рассасывания очагово-инфильтративных образований и эозинофилией крови (га=0,66, р<0,05 при ИТЛ и га=0,87, р<0,01 при ДТЛ).

Рассасывание инфильтратов с трансформацией грануляций в соединительную ткань может привести к развитию фиброзных изменений (остаточных поспуберкулезных изменений) в ткани легких. Локальные фиброзные изменения с отсутствием специфической грануляционной ткани в очагах являются критерием благополучного завершения туберкулезного воспаления и подтверждением клинического излечения пациента [Перельман М.И., 2001; Блум Б.Р., 2002; Кошсчкин В.А., Иванова З.А., 2007]. В фиброзировании гранулематозных очагов участвуют фибробласты, активирующим фактором которых является TGFß, способный стимулировать метаболизм соединительной ткани и восстановление исходной структуры органа [Ярилин A.A. и соавт., 2010].

В ходе проведенного нами исследования при ТЛ установлено увеличение числа эозинофильных гранулоцитов в крови и секреции TGFß in vitro. Это

указывает на возможность развития более выраженных фиброзных изменений при ТЛ, течение которого сопряжено с эозинофилией крови. Однако у больных ТЛ достоверной взаимосвязи между наличием фиброза и эозинофилией крови выявлено не было.

Учитывая способность эозинофильных гранулоцитов участвовать в патогенезе туберкулезной инфекции, нами была проанализирована связь эозинофильной реакции крови со сроками негативации мокроты у больных ТЛ. Согласно рекомендациям специалистов ВОЗ, конверсия мокроты — прекращение выделения МБТ с мокротой (абациллирование), регистрируемое по результатам микроскопического исследования мазка мокроты и результатам посева мокроты на питательные среды, является промежуточным индикатором и критерием эффективности лечения больных ТЛ [Нок/ Т.Н. е{ а1., 2006; Кауа1 V. й а1., 2006; Филинюк О.В., 2011].

При проведении сравнительного анализа сроков негативации мокроты в зависимости от числа эозинофильных гранулоцитов в крови при ТЛ достоверных отличий зарегистрировано не было. У больных ТЛ с эозинофилией сроки абациллирования соответствовали (2,20±1,50) мес., у пациентов с ТЛ без эозинофилии -(3,10±2,01) мес.

При сопоставлении сроков негативации мокроты с количеством эозинофильных гранулоцитов в крови было показано, что при ТЛ, сопровождающимся эозинофилией, на момент абациллирования абсолютное и относительное количество эозинофилов оказалось равным (0,476±0,099) * 109/л и 5,63±2,03 % соответственно. При этом высокое содержание эозинофилов в крови на момент абациллирования регистрировалось лишь у 37,58±6,11 % больных ТЛ с гемической эозинофилией. У 62,42±4,53 % пациентов с ТЛ, в крови которых содержание эозинофилов до лечения было повышенным, в период негативации мокроты отмечалось снижение содержания этих клеток до нормального уровня ((0,264±0,102)х107л и 3,10±1,93 %).

Таким образом, ТЛ, сопровождающийся эозинофилией крови, характеризуется преобладанием отрицательной динамики клинико-реотгенологических признаков распространенного деструктивного процесса в легочной ткани. Это в сочетании с участием эозинофилов в реализации механизмов иммуносупрессии и деструкции легочной ткани, а также выявленного по итогам настоящего исследования дисбаланса иммунного ответа по пути доминирования ТИ2-реакций и факторов иммуносупрессии обосновывает негативную роль эозинофильной реакции крови в иммунопатогенезе ТЛ.

Генетически детерминированная дизрегуляция иммунного ответа

Аллель G генотип GG (А-384 G)

т

Аллель С генотип СС (С-703 Т)

fЭотаксин

т

\ IL-S

Аллель G генотип GG (G-80A)

Аллель С генотип СС (Т-51С)

flL-SRA

Эозинофильная реакция крови при туберкулезе легких

CCR3

Активация

эоэинофилов 4 +

Адгезия эозинофилов к эндотелию Ф

Хемотаксис эоэинофилов

tIL-S, Эотаксин tIL-5RA<--эозинофилов

\ CD1S -эозинофилов

i

|ССЯЗ+-эозинофилов (при индукции r-XL-5)

Í Количество фагоцитирующих эозинофилов

Цитокины, секретируемые эозинофилами

Цитотоксические протеины

I Эозинофильная * пероксидаза

Резервуар персистенции М. tuberculosis Подавление жизнедеятельности М. tuberculosis

♦ 1

Диссеминапия инфекции Негатпвация мокроты

Дисбаланс Thl/Th2

Угнетение иммунного Thl-ответа

HFNy, 1IL-2

Активация иммунного ТЬ2-ответа

TCD20, TIL-5, TIL-4

Иммуносупрессия

tCD4"CD25-Foxp3"Trec tTGFß

Замедление темпов рассасывания инфильтратов в легких

Развитие фиброза в ткани легких

Рис. 8. Феномен эозинофилии при туберкулезе легких (по данным М.Е. Rothenberg, S.P. Hogan, 2006; S.P. Hogan et al., 2008; J. Kirman et al., 2009; N.S. Linch et al., 2009; Y. Hattori et al., 2011; V. Driss et al., 2012 и результатам собственных исследований (выделено бежевым цветом))

Выводы

1. Эозинофильная реакция крови при инфильтративном и диссеминированном лекарственно-чувствительном и лекарственно-устойчивом туберкулезе легких до проведения противотуберкулезной химиотерапии опосредована увеличением содержания CCL11/эотаксина, IL-5 и количества 1Ь-5ЯА-позитивных эозинофилов в крови.

2. Развитие эозинофилии крови при туберкулезе легких ассоциировано с носительством генотипов СС полиморфного участка С-703Т гена 1L5 и GG полиморфизма A-384G гена CCL11, детерминирующих высокий уровень IL-5 и CCL11/эотаксина в крови. Гиперэкспрессия рецепторов к IL-5 (IL-5RA) и эотаксину (CCR3) на эозинофилах крови не связана с полиморфными сайтами G-80А гена IL5RA и СС (Г-51С) гена CCR3.

3. Туберкулез легких с эозинофилией характеризуется повышением секреции эозинофилами IL-5, TNFa и IL-2 (при диссеминированной форме) in vitro, а также более высокой, чем в отсутствие эозинофилии, фагоцитарной активностью клеток (в условиях менее значимого снижения активности внутриклеточной пероксидазы) при повышении числа эозинофилов, экспрессирующих IL-5RA и молекулы адгезии CD 18. При этом количество CD9+ и CCR3+ эозинофилов сохраняется в пределах нормы.

4. Повышенное содержание IL-5 и IL-5RA+ эозинофилов в крови у больных туберкулезом легких с эозинофилией при отсутствии сочетанного увеличения концентрации CCL11/эотаксина и CCR3+ клеток свидетельствует о ведущей роли IL-5 в развитии эозинофилии при туберкулезной инфекции.

5. Эозинофильные гранулоциты при туберкулезе легких с эозинофилией независимо от клинической формы заболевания и устойчивости возбудителя к противотуберкулезным препаратам проявляют повышенную реактивность (гиперэргию) в условиях индукции in vitro, выражающуюся в увеличении секреции клетками IL-5 и TNFa (при действии BCG) и экспрессии IL-5RA и CCR3 (при действии рекомбинантного IL-5).

6. У больных туберкулезом легких с эозинофилией увеличение содержания иммуносупрессорных CD4+CD25+Foxp3+ Treg-лимфоцитов в периферической крови (более выраженное, нежели в отсутствие эозинофильной реакции крови) ассоциировано со снижением базальной и BCG-индуцированной секреции IL-2 мононуклеарными лейкоцитами in vitro и (при диссеминированном туберкулезе легких) повышением его базальной in vitro секреции эозинофильными гранулоцитами.

7. Высокое содержание Treg-лимфоцитов в крови при туберкулезе легких с эозинофилией вне зависимости от лекарственной чувствительности возбудителя

заболевания сопряжено с гиперсекрецией in vitro цитокинов с супрессорной активностью - IL-10 (при индукции BCG у больных инфильтративным и диссеминированным вариантами) и TGFß (базальной и при индукции BCG).

8. Активация иммуносупрессорных Treg-лимфоцитов и гиперсекреция IL-4 мононуклеарными лейкоцитами in vitro у больных туберкулезом легких с эозинофилией в сочетании с повышением содержания в их крови CD201 В-лимфоцитов и IL-5 на фоне дефицита IFNy подтверждают иммуномодулирующий эффект эозинофилыюй реакции крови при туберкулезной инфекции, проявляющийся иммунным отклонением в направлении Т1)2-ответа.

9. Эозинофильная реакция крови при инфильтративном и диссеминированном туберкулезе легких ассоциирована с деструктивными изменениями и замедлением темпов рассасывания инфильтратов в легочной ткани, но не оказывает значимого влияния на сроки негативации мокроты.

10. Признаки иммунного ТЫ/ТЬ2-дисбаланса в условиях супрессии Thl-ответа и отрицательная динамика клинико-рентгенологических проявлений патологического процесса у больных туберкулезом легких с высоким содержанием эозинофилов в крови свидетельствуют о негативной роли эозинофилии в патогенезе туберкулезной инфекции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Особенности иммунного дисбаланса при различных клинико-патогенетических вариантах остропрогрессирующего туберкулеза легких / О.В. Воронкова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, Е.Г. Чурина, P.P. Хасапова, И.О. Наследникова, О.В. Филишок, В.А. Серебрякова, ГО.В. Колобовникова, Е.Л. Никулина, Н.П. Пирогова, И.В. Березко // Бюллетень сибирской медицины (0,750). - 2010. - №3. - С. 42-50.

2. Реактивность иммунокомпетентных клеток при туберкулезе легких: молекулярно-генетическое исследование / О.И. Уразова, В.В. Новицкий, О.В. Воронкова, P.P. Хасапова, И.О. Наследникова, Е.Л. Никулина, Е.Г. Чурина, Ю.В. Колобовникова, В.В. Серебрякова // Вестник Уральской медицинской академической науки (0,444). - 2010. - Т. 32, №4. - С. 104-107.

3. Иммуногенетические маркеры социально значимых инфекций / В.А. Серебрякова, И.О. Наследникова, О.И. Уразова, A.C. Чернов, Н.В. Шперлинг, В.В. Новицкий, Е.Л. Никулина, H.A. Сухаленцева, К.О. Михеева, О.В. Воронкова, Ю.В. Колобовникова, Т.В. Федорович, E.H. Чернова // Материалы докладов всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы

функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии». - Новосибирск, 2010. - Цитокины и воспаление. - 2010. - Т. 9, №3. - С. 70-71.

4. Цитокин-продуцирующая активность мононуклеарных лейкоцитов периферической крови при лекарственно-устойчивом туберкулезе легких / Е.Г. Чурина, О.В. Воронкова, О.И. Уразова, И.О. Наследникова, В.В. Новицкий, Ю.В. Колобовникова, В.В. Серебрякова, О.В. Филинюк // Материалы докладов всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии». - Новосибирск, 2010. - Цитокины и воспаление. - 2010. - Т. 9, №3. - С. 74.

5. Роль IL-5 в формировании эозинофильной реакции крови при туберкулезе легких / Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, О.В. Воронкова, И.О. Наследникова, К.О. Михеева // Материалы IX российско-германской научно-практической конференции им. Р. Коха и И.И. Мечникова «Новые горизонты: инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении». - Новосибирск, 2010. - С. 226-228.

6. Функциональный полиморфизм гена IL-2 при туберкулезе легких / И.О. Наследникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, E.JI. Никулина, H.A. Сухаленцева, Ю.В. Колобовникова, О.В. Воронкова, В.А. Серебрякова, Е.Г. Чурина // Материалы IX российско-германской научно-практической конференции им. Р. Коха и И.И. Мечникова «Новые горизонты: инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении». - Новосибирск, 2010. - С. 234-236.

7. Цитокин-продуцирующая активность мононуклеарных лейкоцитов периферической крови у больных фиброзно-кавернозным туберкулезом легких / А.Е. Колосова, О.И. Уразова, Е.Г, Чурина, О.В. Воронкова, Ю.В. Колобовникова II Материалы XI конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». -Томск,2010.-С. 57-58.

8. Эозинофил и его роль в патологии / Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, JI.C. Литвинова, И.О. Наследникова, О.В. Воронкова, К.О. Михеева // Иммунопатология, аллергология, иифектология (0,857). - 2011. - №2. - С. 12-17.

9. Роль интерлейкина-5 и эотаксина в формировании эозинофильной реакции крови при туберкулезе легких / Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, Л.С. Литвинова, О.В. Воронкова, И.О. Наследникова, К.О. Михеева, М.В. Игнатов // Медицинская иммунология (0,750). - 2011. - Т. 13, №2-3. - С. 273-278.

10. Цитокинопосредованные механизмы формирования эозинофильной реакции крови при инфекционной патологии / Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, О.В. Воронкова, И.О. Наследникова, Л.С. Литвинова, К.О. Михеева, М.В. Игнатов И Материалы всероссийской научной конференции молодых ученых

с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии -2011». - Санкт-Петербург, 2011. - С. 89.

11. Особенности продукции TNF-a эозинофилами крови in vitro при туберкулезе легких / К.О. Михеева, Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, М.В. Игнатов, М.Д. Гончаров // Материалы XVII межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии - 2011». - Санкт-Петербург, 2011. -С. 110-112.

12. Роль эотаксина в формировании эозинофилии крови при туберкулезе легких / Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, К.О. Михеева // Материалы IX съезда фтизиатров России. — Туберкулез и болезни легких (0,250). - 2011. -№4. - С. 199.

13. Цитокинопосредованные механизмы эозинофилии при туберкулезе легких / К.О. Михеева, Ю.В. Колобовникова, М.В. Игнатов, М.Д. Гончаров // Материалы XII Российского конгресса молодых ученых с международным участием «Науки о человеке». - Томск, 2011. - С. 67-68.

14. Субпопуляционный состав регуляторных Т-клеток крови у больных туберкулезом легких с множественной лекарственной устойчивостью / Е.Г. Чурина, В.В. Новицкий, О.И. Уразова, О.В. Воронкова, Ю.В. Колобовникова // Бюллетень сибирской медицины (0,800). - 2011. - № 4. - С. 183-186.

15. Показатели клеточного и гуморального иммунного ответа при туберкулезе легких, сопровождающемся эозинофилией / Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, О.В. Воронкова, К.О. Михеева, М.В. Игнатов, О.В. Филшпок, О.И. Новосельцева, Е.П. Степанова// Бюллетень сибирской медицины (0,778). - 2012. - №1. - С. 39-45.

16. Эозинофил: современный взгляд на кинетику, структуру и функцию / Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, JI.C. Литвинова, С.П. Чумакова // Гематология и трансфузиологня (1,400). - 2012. - №1. - С. 30-36.

17. Цитокинсекретирующая активность эозинофилов крови при туберкулезе легких / Ю.В. Колобовннкова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, О.В. Воронкова, И.О. Наследникова, К.О. Михеева, М.В. Игнатов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины (0,571). - 2012. - Т. 153, №3. - С. 296299.

18. Изменение бактерицидных свойств эозинофильных гранулоцитов при туберкулезе легких / Ю.В. Колобовннкова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий // Материалы I Международной интернет-конференции: «Медицина в XXI веке: традиции и перспективы». - Казань, 2012. - С. 115-117.

19. Молекулярные механизмы формирования эозинофилии крови при туберкулезе легких / Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, К.О. Михеева, М.Д. Гончаров // Вестник РАМН (1,0). - 2012. - №5. - С. 58-62.

20. Роль полиморфизма генов IL5 (-703) и IL5RA (-80) в формировании эозинофилии крови при туберкулезе легких / К.О. Михеева, В.В. Новицкий, О.И. Уразова, Ю.В. Колобовникова, М.Д. Гончаров, И.О. Наследникова // Бюллетень сибирской медицины (1,167). - 2012. - №4. - С. 57-63.

21. Роль полиморфизма генов эотаксина (-384) и CCR3 (-51) в формировании эозинофилии крови при туберкулезе легких / К.О. Михеева, Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, О.В. Филинюк, М.Д. Гончаров, И.О. Наследникова // Бюллетень сибирской медицины (0,429). - 2012. - №6. - С. 213-215.

22. Изменение эффекторных свойств эозинофильных гранулоцитов при туберкулезе легких / Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, С.П. Чумакова, В.В. Новицкий // Фундаментальные исследования (1,25). - 2012. - №8, Часть 2. - С. 339-343.

23. Клинико-рентгенологические особенности туберкулеза легких, сопровождающегося эозинофилией крови / Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, О.В. Филинюк, Е.В. Некрасов, М.Д. Гончаров // Бюллетень сибирской медицины (0,666). - 2012. -№6. - С. 207-210.

24. Роль регуляторных Т-клеток и эозинофилов в механизмах модуляции иммунного ответа при туберкулезе легких / В.В. Новицкий, Е.Г. Чурина, О.И. Уразова, Ю.В. Колобовникова, Т.Е. Кононова, О.В. Воронкова // Иммунология (0,830).-2012,-№4.-С. 184-188.

25. Факторы аккумуляции и миграции эозинофильных гранулоцитов при туберкулезе легких / Ю.В. Колобовникова // Фундаментальные исследования (5,0). - 2013. - №3, Часть 2. - С. 307-311.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДТЛ - диссеминированный туберкулез легких ИТЛ - инфильтративный туберкулез легких ЛУ - лекарственная устойчивость ЛЧ-лекарственная чувствительность МБТ - микобактерии туберкулеза

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ПТП - противотуберкулезные препараты ТЛ - туберкулез легких

BCG (Bacillus Calmette-Guerin) - бацилла Кальметта-Герена

CCL (chemokine ligand) - хемокиновый лиганд, содержащий два остатка цистеина подряд

CCR (С-С chemokine receptor type) - хемокиновый рецептор CD (clusters of differentiation) - дифференцировочные антигены CR (complement rcceptor) - рецептор к компонентам комплемента ЕРО (eosinophil peroxidase) - эозинофильная пероксидаза IFN (interferon) - интерферон IL (interleukin) - интерлейкин

Мас-1 (macrophage-1 antigen) - мембранный белок, гетеродимерный интегрин подсемейства р2-интегринов

МСР (macrophage chemotactic protein) - протеин-хемоатграктант для моноцитов

LFA-1 (lymphocyte function-associated antigen 1) - мембранный белок,

гетеродимерный интегрин подсемейства р2-интегринов

PAF (platelet activated factor) - фактор активации тромбоцитов

RANTES (regulated on activation normal T-cell expressed and secreted) - регуляция

активации, экспрессии и секреции нормальных Т-клеток

TGF (transforming growth factor) - трансформирующий фактор роста

TNF (tumor necrosis factor) - фактор некроза опухоли

Th (T-helpers) - Т-лимфоциты-хелперы

Treg (regulatory T-cells) - регуляторные Т-клетки

VCAM (vascular cell adhesion molecule) - молекулы адгезии сосудистого эндотелия VLA (very late antigen) - антигены на поверхности клеток на поздней стадии клеточной активации

Подписано в печать 05.08. 2013 г. Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии СибГМУ 634050, г. Томск, Московский тракт, 2, тел. 53-04-08 Заказ № 182 Тираж 120 экземпляров