Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Молекулярно-генетические механизмы формирования эозинофилии при туберкулезе легких

На правах рукописи

МИХЕЕВ А КСЕНИЯ ОЛЕГОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ЭОЗИНОФИЛИИ ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ ЛЕГКИХ

14.03.03 - патологическая физиология 03.03.04 — клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 Р ' .,13

Томск-2013

005052294

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ

Новицкий

Вячеслав Викторович

доктор медицинских наук, профессор

Уразова Ольга Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры морфологии и общей патологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России

Хлусов

Игорь Альбертович

доктор медицинских наук, заведующий лабораторией нейробиологии ФГБУ «НИИПЗ» СО РАМН

Солонский

Анатолий Владимирович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет», г. Новосибирск.

Защита состоится: $»г. на заседании диссертационного совета Д 208.096.01 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 634050, г. Томск, Московский тракт, 2

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России (г. Томск, проспект Ленина, 107)

Автореферат разослан (^¿-2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ¿/а^ И.В.Петрова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Согласно современным представлениям, туберкулез легких (ТЛ) может сопровождаться эозипофильной реакцией крови. Большинство исследователей связывают возникновение эозинофилии с прямым действием противотуберкулезных препаратов, однако эозинофильная реакция крови нередко возникает у больных TJI до назначения специфического лечения [Мишин В. Ю. и соавт., 2004; Kirman J. et al., 2009; Legrand F. et al., 2009; Михеева О. М. и соавт., 2010; Meló R. С. N. et al., 2010]. Все исследователи, описывающие высокое содержание эозинофилов в периферической крови у больных TJI, лишь констатируют факт гемической эозинофилии, не акцентируясь на механизмах формирования и биологической целесообразности данной гематологической реакции при туберкулезной инфекции [Kirman J. et al., 2009]. Известно, что эозинофилы являются агрессивными клетками, цитотоксический потенциал которых за счет различных механизмов микробицидности может быть направлен в отношении разнообразных антигенных структур, в том числе и Mycobacterium tuberculosis [Rothenberg М. Е. et al., 2007; Driss V. et al., 2009; Meló R. C. N. et al., 2010; Cook E. B. et al., 2012].

Формирование эозинофилии крови при патологических процессах связывают с гиперпродукцией ключевых медиаторов пролиферации, дифференцировки и рекрутирования эозинофильных гранулоцитов -интерлейкина 5 (IL-5) и эотаксина, индуцирующих при взаимодействии со специфическими клеточными рецепторами (IL-5RA и CCR3) хемотаксис и эффекторные функции клеток [Wise Е. L. et al., 2010; Endo Y. et al., 2011; Fukushima Y. et al., 2012; Zafra M. P. et al., 2012].

Одним из главных факторов, оказывающих влияние на активность цитокинов и их рецепторов у отдельного индивида, является аллельный полиморфизм иммунорегуляторных генов. Необходимо отметить, что наибольшее количество аллельных вариантов генов цитокинов и их рецепторов установлено для их промоторов. Мутации в промоторах, влияя на уровень экспрессии контролируемого гена, не изменяют структуру кодируемых генами продуктов [Кононенков В. И. и соавт., 2006; Pullat et al., 2007]. В современной литературе представлены многочисленные данные о наличии ассоциативных связей аллельных вариантов генов цитокинов и их рецепторов с характером экспрессии соответствующих белковых продуктов и предрасположенностью к той или иной патологии [Онищенко Г. Г. и соавт., 2008; Attab К. А., 2008; Ризванова Ф. Ф. и соавт., 2010; Шевченко А. В. и соавт., 2010; Wise Е. L. et al.,

2010; Zhu \V. et al., 2010; Цыган В. H. и соавт., 2011]. Так, показано, что полиморфные сайты С-703Т гена IL5, G-80A гена IL5R, A-384G гена эотаксииа и Т-51С гена CCR3 ассоциированы с уровнем продукции соответствующих цитокинов, экспрессией рецепторов и количеством эозинофилов в периферической крови [Карпова А. В., 2009; Al-Abdulhadi S. A. et al., 2010; Wang T.-N. et al., 2010; Innoue N. et ai., 2011].

В свете изложенного представляется весьма актуальным изучение роли IL-5 и эотаксина в ассоциации с экспрессией комплементарных рецепторов и генетическим полиморфизмом вышеназванных ключевых медиаторов, регулирующих гомеостаз системы эозинофильных гранулоцитов, в развитии гемической эозинофилии при туберкулезной инфекции.

Цель исследования: охарактеризовать молекулярно-генетические механизмы формирования эозинофилии крови при туберкулезе легких.

Задачи исследования:

1. Оценить содержание IL-5 (в крови, супернатантах культуральных суспензий интактных и BCG-индуцированных эозинофилов), эотаксина (в крови) и экспрессию на эозинофилах комплементарных им рецепторов (JL5RA, CCR3) у больных туберкулезом легких с эозинофилией и без таковой.

2. Проанализировать у больных туберкулезом легких ассоциацию аллельных вариантов промоторных регионов G-80A гена ILSRA, Т-51С гена CCR3, С-703Т гена IL5 и A-384G гена эотаксина с экспрессией на эозинофилах соответствующих рецепторов, концентрацией цитокинов и содержанием эозинофильных гранулоцитов в крови.

3. Оценить значение IL-5 и эотаксина, экспрессируемых эозинофилами рецепторов (JL5RA, CCR3) и полиморфизма их генов в развитии эозинофилии при туберкулезе легких.

4. Охарактеризовать параметры Thl- и ТЬ2-ассоциированного иммунного ответа у больных туберкулезом легких с эозинофилией крови.

Научная новизна. Впервые проведено исследование молекулярно-генетических механизмов формирования эозинофильной реакции крови при туберкулезе легких. Показано, что эозинофилия, сопровождающая течение туберкулеза легких, обусловлена повышением содержания IL-5 и эотаксина в крови, гиперсекрецией IL-5 и активацией экспрессии комплементарных ему рецепторов (IL-5RA) эозинофильными гранулоцитами. Оценена связь аллельного полиморфизма генов (IL 5, IL5RA, эотаксина и CCR3) с концентрацией соответствующих цитокинов, экспрессией цитокиновых рецепторов и количеством эозинофильных гранулоцитов в периферической

крови при туберкулезе легких. Показано, что эозинофилия крови при туберкулезе легких сопряжена с носительством генотипов СС (С-703Т) гена IL5, GG (A-384G) гена эотаксина и СС (T-S1C) гена CCR3. Установлена ассоциация генотипов СС (Ç-703T) гена IL5 и GG (A-384G) гена эотаксина с повышенным содержанием IL-5 и эотаксина в крови у больных туберкулезом легких. При этом выявлено, что увеличение числа 1Ь-5ЯА-позитивных эозинофилов в крови при туберкулезе легких, сопровождающемся эозинофилией, не связано с аллельным полиморфизмом G-80A гена IL5RA. Впервые проведен анализ отдельных параметров клеточного (Thl-ассоциированного). и гуморального (ТЬ2-ассоциированного) иммунного ответа у больных туберкулезом легких в зависимости от наличия эозинофильной реакции крови. Установлено, что эозинофилия при туберкулезе легких сочетается с повышением абсолютного содержания ÇD20+ В-лимфоцитов и концентрации IL-5 в условиях дефицита IFN-y в крови, что может свидетельствовать о способности эозинофилов при повышении их количества смещать ТЫ/ТЬ2-баланс, поляризуя иммунный ответ в направлении гуморальных (ТЬ2-ассоциированных) реакций.

Практическое и теоретическое значение работы. Полученные данные фундаментального характера значительно расширяют представления о молекулярно-генетических механизмах формирования эозинофильной реакции крови при туберкулезе легких. Результаты исследования аллельного полиморфизма генов (IL5, IL5RA, эотаксина, CCR3) в ассоциации с концентрацией соответствующих цитокинов в крови и экспрессией их рецепторов. представляются актуальными для формирования новых знаний о генетически детерминированном развитии гемической эозинофилии при туберкулезной инфекции с целью разработки патогенетически обоснованных способов коррекции данной гематологической реакции.

Положения, выносимые на защиту:

1. Эозинофилия у больных туберкулезом легких до лечения противотуберкулезными препаратами сопряжена с гиперсекрецией эозинофильными гранулоцитами IL-5, увеличением содержания эотаксина, IL-5 и IL-SRA-экспрессирующих эозинофилов в крови, а также с носительством аллеля С и генотипа СС (С-703Т) гена IL5, аллеля G и генотипа GG (A-384G) гена эотаксина и аллеля С и генотипа СС (Т-51С) гена CCR3.

2. Сочетанная роль повышенной секреции IL-5 и экспрессии IL-5RA эозинофилами в развитии гемической эозинофилии при туберкулезе легких

подтверждается отсутствием их у больных без эозинофилии и еще более выраженным повышением при индукди эозинофилов in vitro рекомбинантным IL-5 и антигеном (BCG).

3. У больных туберкулезом легких с эозинофилией повышенное содержание IL-5 и эотаксина в крови ассоциировано с генотипами СС (С-703Т) гена ILS и GG (A-384G) гена эотаксина. При этом увеличение содержания IL-5RA-экспрессирующих эозинофилов в крови не связано с полиморфизмом G-80A гена IL5RA.

4. Гемическая эозинофилия при туберкулезе легких сочетается с увеличением абсолютного содержания CD20+ В-лимфоцитов и концентрации IL-5 в условиях дефицита IFN-y в крови.

Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на IX Российско-германской научно-практической конференции им. Р. Коха и И.И. Мечникова «Новые горизонты: инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении» (Новосибирск,

2010); Всероссийской научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии -2011» (Санкт-Петербург, 2011); XVII Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии - 2011» (Санкт-Петербург,

2011); IX Съезде фтизиатров России (Москва, 2011); XII Российском конгрессе молодых ученых с международным участием «Науки о человеке» (Томск, 2011); на научно-образовательных семинарах «Патофизиология системы крови и иммунитета» при Центре компетенции по проблеме инфекционных болезней им. И.И. Мечникова и Р. Коха ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России (Томск, 2010 - 2012), на научных семинарах кафедр патофизиологии, фтизиатрии и пульмонологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России (Томск, 2010-2012).

Исследования проведены при финансовой поддержке Совета по грантам Президента Российской Федерации в рамках грантов для государственной поддержки молодых российских ученых - кандидатов медицинских наук (Договор №14.124.13.3383-МК «Роль эозинофилыюй реакции крови в патогенезе инфекционного процесса», руководитель — канд. мед. наук Ю.В. Колобовникова) и для государственной поддержки ведущих научных школ (НШ-614.2012.7 «Идентификация молекулярных мишеней регуляции апоптоза, пролиферации и дифференцировки клеток крови при патологии инфекционного и неинфекционного генеза», руководитель — академик РАМЫ В.В. Новицкий).

Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедр патофизиологии, фтизиатрии и пульмонологиии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 8 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 8 рисунками и 17 таблицами. Библиографический указатель включает 192 источника, из них 61 отечественных и 131 зарубежных авторов.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации. Соискателем лично выполнены анализ данных литературы по теме диссертации, планирование, постановка цели и задач исследования, пробоподготовка, выделение и культивирование эозинофильных гранулоцитов, иммуноферментный анализ, выделение ДНК, ПДРФ-анализ, статистический анализ результатов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу работы положены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 217 пациентов (149 мужчин и 68 женщин) европеоидного происхождения в возрасте от 18 до 55 лет (средний возраст 41,94±10,63 лет), проживающих на территории г. Томска и Томской области, с распространенными деструктивными формами впервые выявленного туберкулеза легких (ТЛ). Пациенты находились на стационарном лечении во фтизиотерапевтическом отделении №1 (зав. отд. — О. И. Новосельцева) Томской областной туберкулезной клинической больницы (гл. врач - канд. мед. наук Г. В. Янова).

Диагноз ТЛ устанавливался на основании клинической картины заболевания, рентгенологического исследования легких, данных микроскопического и бактериологического исследования мокроты.

Для решения поставленных задач были сформированы две основные группы исследования: первую группу составили 102 больных ТЛ, сопровождающимся эозинофилией, вторую — 115 больных ТЛ без эозинофилии. Внутри каждой группы были сформированы подгруппы больных с инфильтративным (146 человек) и диссеминированным (71 человек) ТЛ. Оценка ассоциаций носительства отдельных полиморфизмов генов с изменением цитокинопродукции и экспрессии рецепторов на мембране эозинофильных гранулоцитов in vitro проводилась у больных ТЛ с учетом

наличия либо отсутствия у них гемической эозинофилии.

Инфильтративный туберкулез легких (ИТЛ) был диагностирован у 146 (67,3%) пациентов и характеризовался на рентгенограмме наличием одной или нескольких неоднородных теней туберкулезного инфильтрата диаметром от 5 до 7 см с очагами распада и обсеменения.

Диссеминированный туберкулез легких (ДТЛ) был выявлен у 71 (32,7%) больных, рентгенологическим признаком которого являлось наличие в одном или обоих легких мелких и среднеочаговых изменений неоднородной структуры за счет инфильтрации и распада.

Все пациенты с TJI были обследованы при поступлении на стационарное лечение до назначения терапии.

Критериями исключения больных TJ1 из исследования служили возраст менее 18 или более 55 лет, проведение вакцинации или ревакцинации (в течение менее 3-х лет до момента начала исследования), менее 3-х месяцев назад перенесенная инфекция, острые и хронические (в стадии обострения) сопутствующие инфекционные и соматические заболевания.

В контрольную группу были включены 120 здоровых доноров (91 мужчина и 29 женщин) с сопоставимыми характеристиками по возрасту, не предъявлявшие на момент обследования жалоб соматического профиля, не имеющие в анамнезе хронических инфекционных заболеваний.

Все обследованные лица отрицали наличие в анамнезе аллергических заболеваний, в том числе лекарственной и пищевой аллергии, и отягощенной наследственности. При проведении иммуноферментного анализа у всех обследованных лиц диагностически значимых титров антител (иммуноглобулинов класса G) к антигенам описторхисов, трихинелл, токсокар и эхинококков в крови не было выявлено.

Определение общего количества лейкоцитов в периферической крови и подсчет лейкоцитарной формулы проводили общепринятыми гематологическими методами.

Выделение эозинофильных гранулоцитов из периферической крови выполняли на ступенчатом градиенте плотности Percoll (р=1,133 г/л) («SigmaLifeScience», США).

Определение концентрации IL-5 в супернатантах кулътуральных суспензий, а также содержания IL-5, IFN-y и эотаксина в крови проводили с помощью твердофазного иммуноферментного «сэндвичевого» метода. Процедуру анализа выполняли согласно инструкциям, предлагаемым

производителями тест-систем («Протеиновый контур», Россия; «Biosource», США).

Определение рецепторов к IL-5 (IL-5RA) и эотаксину (CCR3) на эозинофшьных гранулоцитах проводили методом проточной цитометрии с использованием мопоклональных антител (МКАТ), меченных флуоресцентной меткой FITC (Fluorescein isothiocianat), согласно протоколам фирм-производителей («R&D Systems», США и «Caltag Laboratories», США).

Выделение ДНК из периферической крови проводили сорбентным методом, согласно инструкции, прилагаемой к набору «ДНК-сорб-В» («ИнтерЛабСервис», Россия).

Исследование полиморфных участков генов цитокинов и их рецепторов проводили с использованием рестрикционного анализа продуктов амплификации специфических участков генома (ПДРФ-анализ).

Амплификацию осуществляли согласно инструкции, прилагаемой к набору «АмплиСенс PCR» («ИнтерЛабСервис», Россия), в пробирках типа «Эппендорф» путём полимеразиой цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе, учитывая применение амплификатора «Терцик МС2» («ДНК-технология», Россия). Было исследовано четыре полиморфных сайта: С-703Т гена IL5, G-80A гена IL5RA, A-384G гена эотаксина и Т-51С гена CCR3. Амплификат подвергали гидролизу соответствующей рестриктазой. Визуализацию продуктов амплификации и рестрикции исследуемых генов проводили с помощью электрофореза в агарозном геле.

Определение CD3- и СD2 0*-лимфоцитов в периферической крови проводили лимфоцитотоксическим методом с использованием наборов моноклональных антител (ООО «Сорбент», Россия).

Статистическая обработка результатов производилась с использованием пакета программ Statistica 6.0. Проверку нормальности распределения количественных показателей осуществляли по критерию Шапиро-Уилка W. Для оценки достоверности различий выборок, подчиняющихся закону нормального распределения, использовали t-критерий Стъюдента, не имеющих нормального распределения - U-критерий Манна-Уитни. Различие двух сравниваемых величин считали достоверным при уровне значимости р<0,05. С целью выявления взаимосвязей между показателями применяли коэффициент ранговой корреляции Спирмена (г) [Боровиков В. В., 2001]. Распределение генотипов по исследуемым полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга с помощью точного

теста Фишера. Для сравнения частот аллелей использовали критерий %2 Пирсона с поправкой Йетса. Обработка результатов генетических исследований осуществлялась с использованием критерия отношения шансов OR с расчетом для него 95% доверительного интервала [Флейс Дж„ 1989].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Содержание эозинофилов в периферической крови при туберкулезе легких (ТЛ) может варьировать от повышенного до анэозинофилии [Rothenberg М. Е., 2007; Simon D. et al., 2007]. Большинство исследователей связывают развитие эозинофилии крови лишь с побочным действием проводимой противотуберкулезной химиотерапии и исходной аллергической настроенностью организма. Согласно результатам анализа медицинских карт пациентов, находящихся на стационарном лечении во фтизиотерапевтическом отделении №1 (зав. отд. — О. И. Новосельцева) Томской областной туберкулезной клинической больницы (гл. врач - канд. мед. наук Г. В. Янова), эозинофильная реакция крови регистрировалась в 30% случаев туберкулезной инфекции (30 человек на 100 обследованных лиц) на фоне проводимой специфической химиотерапии препаратами основного (первого) ряда (изониазид, рифампицин, стрептомицин, пиразинамид и этамбутол).

Наряду с лекарственной эозинофилией, в клинической практике врачей-фтизиатров нередко регистрируются случаи эозинофильной реакции крови у больных ТЛ до назначения специфической терапии. В ходе настоящего исследования умеренная эозинофилия крови (абсолютное содержание эозинофилов (0,921 ±0,120)х 109/л) регистрировалась в 18% случаев ТЛ до назначения противотуберкулезных препаратов. Максимальное увеличение абсолютного числа эозинофилов (до 2,020х 109/л) было зарегистрировано у больных с диссеминированной формой ТЛ.

Изучение молекулярных механизмов формирования реактивной эозинофилии крови при патологии, в том числе при ТЛ, предполагает оценку ключевых факторов, регулирующих гомеостаз эозинофильных гранулоцитов: IL-5 и эотаксина. Эти медиаторы принимают активное участие в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки, апоптоза, дегрануляции, осуществлении механизмов цитотоксичности и хемотаксиса лейкоцитов эозинофильного ряда [Morshed М. et al., 2012].

Эозинофилактивирующие свойства 1L-5 подтверждались и в ходе настоящего исследования, согласно результатам которого достоверное повышение концентрации IL-5 в крови было зарегистрировано лишь у

пациентов с инфильтративным ТЛ (ИТЛ) и диссеминированным ТЛ (ДТЛ), ассоциированными с эозинофилией, тогда как содержание данного медиатора в крови у больных ТЛ без эозинофилии не отличалось от контрольных значений (табл. 1).

Таблица 1

Содержание IL-5 и эотаксина в крови (пг/мл) у больных _туберкулезом легких (Me (Q1-Q3)) _

Группы обследованных лиц IL-5 Эотаксин

Здоровые доноры 7,99 (7,56-19,44) 25,19 (18,27-34,31)

Больные туберкулезом легких с эозинофилией Ипфильтративиый 52,96 (35,65-64,81) р,<0,05 42,52 (26,09-51,38) pi<0,05

Диссемшшрованный 64,02 (38,09-75,18) pi <0,05 Рз<0,05 51,08 (41,78-56,49) р,<0,05

Больные туберкулезом легких без эозинофилии Инфильтративный 10,80 (8,64-36,73) р2<0,05 28,21 (25,37-37,96) р2<0,05

Диссеминированный 8,22 (7,31-10,81) р2<0,05 39,56 (29,45-48,51) pi<0,05 р2<0,05 рз<0,05

Примечание: Р1 (здесь и далее в табл.) - уровень статистической значимости различий по сравнению с аналогичными параметрами у здоровых доноров; рг-у больных туберкулезом легких с эозинофилией; рз-у пациентов с инфильтративным туберкулезом легких.

Повышенный уровень IL-5 в крови у больных ТЛ с эозинофилией может поддерживаться за счет секреторной активности многих клеток-продуцентов данного цитокина: ТЬ2-лимфоцитов, B-лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов и NK-клеток - основных участников противотуберкулезного иммунного ответа. IL-5 способны секретировать и сами эозинофильные гранулоциты [Lintomen L. et al., 2007; Johnson V. J. et al., 2008; Mirza S. et al., 2010; Wise E. L. et al., 2010]. Как показали результаты проведенного исследования, содержание IL-5 в интактной культуре эозинофильных гранулоцитов оказалось повышенным лишь у больных ТЛ, ассоциированным с эозинофилией крови (табл. 2).

Помимо оценки базальной продукции IL-5 проводилась инкубация эозинофильных гранулоцитов с вакцинным штаммом BCG in vitro. В ходе проведенного исследования BCG-индуцированная секреция IL-5 в in vitro

культуре эозинофилов периферической крови оказалась достоверно выше у пациентов с ТЛ, ассоциированным с эозинофилией крови, по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров и у пациентов с ТЛ без эозинофилии (табл. 2).

Таблица 2

Содержание IL-5 в супернатантах культуральных суспензий эозинофильных

гранулоцитов (пг/мл) у больных туберкулезом легких с эозинофилией __(Me (Q1-Q3)) __

Группы обследованных лиц Культура эозинофилов крови in vitro

Иптактная BCG-индуцированная

Здоровые доноры 6,225(3,131-10,753) 9,157(4,510-12,618) р3<0,05

Инфильтративный 15,617 (14,696-19,080) pi<0,05; рз<0,05 28,273 (26,834-31,081) pi<0,05; pj<0,05; рз<0,05

Диссеминированный 14,565(11,673-17,345) pi<0,05; р2<0,05 27,589 (24,736-28,604) Pi<0,05; Р2<0,05; р3<0,05

Примечание: р2 - по сравнению с группой больных туберкулезом легких без эозинофилии; рз — с интактной культурой клеток внутри одной группы обследованных.

Реактивный характер эозинофилии крови при ТЛ подтверждается также результатами количественной оценки другого эозинофил-активирующего медиатора — эотаксина. В ходе настоящего исследования было зарегистрировано значительное повышение содержания эотаксина в крови у больных ТЛ, сопровождающимся эозинофилией (табл. 1).

Известно, что эозинофильные гранулоциты выступают в качестве активных продуцентов эотаксина, избыточная концентрация которого может активировать механизмы, обеспечивающие накопление эозинофилов в крови. Однако у больных ДТЛ без эозинофилии концентрация эотаксина в крови оказалась сопоставимой с таковой у больных ТЛ, в крови которых количество эозинофилов превышало норму (табл. 1).

Одним из возможных факторов избыточного содержания эотаксина в крови у больных ТЛ может быть опосредованное влияние IL-4 и IL-13, которые в дозовременной зависимости стимулируют экспрессию мРНК эотаксина в фибробластах кожи [Atasoy U. et al., 2003; Zafra M. Р. et al., 2012].

Резюмируя вышеизложенное, следует подчеркнуть, что повышенный уровень эотаксина в крови, зарегистрированный у пациентов с ТЛ независимо от наличия эозинофильной реакции крови, подтверждает скорее хемотаксические свойства этого медиатора, способного вызывать миграцию клеток в зону гранулематозного воспаления. В связи с этим, в качестве

основного фактора эозинофилии при ТЛ, по-видимому, следует рассматривать, прежде всего, IL-5, концентрация которого в крови была повышенной лишь у пациентов с эозинофилией (табл. 1).

Общеизвестно, что действие цитокинов реализуется при взаимодействии со специфическими их рецепторами на поверхности клеток-мишеней [Kabesch М. et al., 2007]. При изучении механизмов формирования эозинофилии крови несомненный интерес представляет оценка экспрессии рецепторов для эозинофил-специфичных цитокинов (IL-5 и эотаксина), количество которых значительно возрастает на мембране клетки после ее активации антигеном [Rothenberg М. Е. et al., 2007].

С использованием метода проточной цитофлуориметрии нами была проведена оценка in vitro экспрессии на эозинофилах, выделенных из крови больных TJT, ассоциированным с эозинофилией крови и без таковой, рецепторов к IL-5 (IL-5RA) и эотаксипу (CCR3). В результате было показано достоверное повышение количества эозинофилов, несущих IL-5RA, в интактной культуре клеток у больных с эозинофилией при ИТЛ (абсолютное содержание 0,209 (0,118-0,270)х106/мл; относительное - 20,86 (16,20-23,35) %) и ДТЛ (абсолютное содержание 0,292 (0,198-0,386)х106/мл; относительное -14,61 (9,89-19,32) %), что может быть связано с опосредованным влиянием комплементарного цитокина, избыточные концентрации которого были обнаружены в крови лишь у пациентов данных групп.

При добавлении в культуру клеток рекомбииантного IL-5 (rIL-5) повышение содержания IL-5RA+ эозинофилов устанавливалось у всех больных ТЛ независимо от наличия эозинофилыюй реакции крови. При определении соотношения числа клеток, несущих IL-5RA, в базальной и rIL-5-индуцированной культуре было показано увеличение индекса стимуляции у больных ИТЛ с эозинофилией и без нее. Данное обстоятельство позволяет думать о том, что гиперэкспрессия эозинофилами IL-5RA может быть как следствием повышения концентрации IL-5 в крови, так и одной из причин повышенной чувствительности клеток к IL-5 при туберкулезной инфекции.

Анализ содержания ССКЗ-экспрессиругощих эозинофилов у больных ТЛ позволил установить его увеличение в интактной культуре клеток in vitro лишь в группе пациентов без эозинофилыюй реакции крови. Известно, что CCR3 in vivo опосредует хемотаксис эозинофилов в ткани при действии эотаксина [Miyagaki Т. et al., 2010; Tedeschi Л. et al., 2012]. По всей видимости, повышенное число эозинофильных лейкоцитов, экспрессирующих CCR3, в сочетании с высоким уровнем эотаксина в крови у больных ТЛ без

эозинофилии указывает на ключевую роль комплекса «эотаксин - ССЮ» в механизмах рекрутирования эозинофилов в зону гранулематозного воспаления.

В ходе настоящего исследования у больных ИТЛ с эозинофилией и у пациентов без эозинофильной реакции крови также было зарегистрировано увеличение количества ССЯЗ-позитивиых эозинофилов в культуре клеток с rlL-5 относительно их базального уровня. Индексы стимуляции экспрессии CCR3 у пациентов данных групп были сопоставимыми с нормой. Полученные результаты свидетельствуют о сохранении резерва рецептор-экспрессирущей способности эозинофильных гранулоцитов у больных ТЛ.

Таким образом, анализ ключевых эозинофил-активирующих медиаторов, реализующих свое действие через специфические рецепторы, позволяет заключить, что высокое содержание IL-5 в периферической крови и гиперэкспрессия IL-5RA на мембране эозинофилов составляют основу пролонгированного пребывания эозинофильных лейкоцитов в кровотоке при туберкулезной инфекции.

Анализируя причины повышенного содержания эозинофил-активирующих цитокинов в крови и количества эозинофилов, несущих IL-5RA и ССЮ, у больных ТЛ, необходимо учитывать тот факт, что уровень медиаторов, выделяемых клетками, и уровень экспрессии их рецепторных структур генетически детерминированы. В литературе представлены многочисленные данные о наличии ассоциативных связей аллельных вариантов генов цитокинов с характером экспрессии соответствующих белковых продуктов и предрасположенностью к той или иной патологии [Фрейдин М.Б. и соавт., 2004; June-Hyuk Lee et al., 2007; Namkung J. H. et al., 2007].

В ходе проведенного исследования было показано, что у больных ТЛ с эозинофилией распределение аллелей и генотипов полиморфных сайтов генов исследуемых цитокинов и их рецепторов значимо отличалось от такового в группе здоровых доноров и больных ТЛ без эозинофилии (табл. 3). ,

Известно, что в промоторной области гена IL5 идентифицирован полиморфный сайт в положении -703, единичная замена нуклеотида в котором оказывает влияние на наработку белкового продукта. В ходе настоящего исследования у больных ТЛ было установлено изменение распределения аллельных вариантов полиморфного сайта С-703Т гена IL5, заключающееся в преобладании гомозиготного генотипа СС над гетерозиготным СТ и гомозиготным ТТ генотипами. При статистическом исследовании были показаны значимые различия в распределении генотипов между здоровыми

донорами и больными ТЛ, сопровождающимся эозинофилией, а также между больными ТЛ с эозинофилией и без нее (табл. 3).

Таблица 3

Распределение генотипов и аллелей полиморфизмов генов цитокинов и их рецепторов (% (абс.)) у больных туберкулезом легких

Полиморфизм Генотипы и аллели Здоровые доноры п=120 Больные туберкулезом легких с эозинофилией п=102 х2 Больные туберкулезом легких без эозинофилии п=115 х2

С-703Т гена 1L5 СС 49,2% (59) 67,6% (69) 10,37 pi<0,05 50,4% (58) 3,31 pi>0,05 6,61 р2<0,05

СТ 44,2% (53) 23,5% (24) 36,5% (42)

тт 6,7% (8) 8,8% (9) 13,0% (15)

с 71,3% 79,4% 3,92 Р 1=0,05 68,7% 0,36 Pi>0,05 6,41 Р2<0,05

т 28,8% 20,6% 31,3%

G-S0A гена 1L5RA GG 52,5% (63) 54,9% (56) 4,38 Pi>0,05 57,4% (66) 0,91 pi>0,05 2,21 р2>0,05

GA 42,5% (51) 33,3% (34) 36,5% (42)

АА 5,0% (6) 11,8% (12) 6,1% (7)

G 73,75% 71,6% 0,26 pi >0,05 75,7% 0,22 Pi>0,05 0,93 Р2>0,05

А 26,25% 28,4% 24,3%

A-384G гена эотаксина АА 58,3% (70) 44,1% (45) 10,18 pi<0,01 51,3% (59) 2,12 pi>0,05 3,33 Р2>0,05

AG 32,5% (39) 31,4% (32) 33,9% (39)

GG 9,2% (11) 24,5% (25) 14,8% (17)

А 74,6% 59,8% 11,03 pi<0,001 68,3% 2,30 Pi>0,05 3,37 р2>0,05

G 25,4% 40,2% 31,7%

Т-51С гена CCR3 ТТ 51,7% (62) 42,2% (43) 6,10 P 1=0,05 56,5% (65) 0,94 pi >0,05 10,85 р2<0,01

ТС 34,2% (41) 30,4% (31) 33,1% (38)

СС 14,2% (17) 27,5% (28) 10,4% (12)

Т 68,8% 57,4% 6,18 p i=0,01 73,0% I,05 Pi>0,05 II,81 р2<0,001

С 31,2% 42,6% 27,0%

Примечание: pi -по сравнению с группой больных туберкулезом легких с эозинофилией.

Проведенный анализ распределения аллелей и генотипов полиморфизма С-703Т гена IL5 позволил установить при ТЛ положительную ассоциацию гомозиготного генотипа СС, а также аллеля С с эозинофильной реакцией крови

и, соответственно, протективный в отношении эозинофилии эффект генотипов СТи ТТ, атакжеаллеля Г (рис. 1).

СС S i J 2>05

< .. .. .... СТ î г 1 - 0,53

î ТТ „ _J°>65

О 0,5 1 1,5 2 2,5

Рис. I. Показатели относительного риска развития эозинофилии при туберкулезе легких в зависимости от генотипа полиморфного сайта С-703Т гена ILS. Слева генотипы полиморфного сайта С-703Т, справа - значения критерия отношения шансов (OR)

В ходе исследования зависимости концентрации IL-5 в крови от варианта полиморфного сайта С-703Т гена IL5 было установлено, что у индивидов с генотипом СС полиморфизма С-703Т гена IL5 она достоверно превышала таковую у пациентов с генотипами СТ и ТТ. Таким образом, у больных TJI генотип СС полиморфного сайта С-703 Т гена JL5 ассоциирован с повышенным содержанием IL-5 в крови.

Как упоминалось ранее, действие IL-5 осуществляется посредством связывания со специфическим рецептором IL-5RA. Проведенное исследование полиморфизма G-80A гена IL5RA не выявило существенных различий в распределении аллелей и генотипов у больных TJI с эозинофилией и без таковой относительно аналогичных параметров у здоровых доноров, а также при сравнении групп больных TJI в зависимости от наличия эозинофильной реакции крови (табл. 3). Анализ зависимости содержания 1Ь-511А-позитивных эозинофилов от варианта полиморфного сайта G-80A соответствующего гена также не выявил каких-либо достоверных различий у больных ТЛ - носителей разных генотипов.

Другим кандидатом, ответственным за развитие эозинофильной реакции крови, является эотаксин. В ходе проведенного иммуногенетического анализа полиморфизма A-384G гена эотаксина было установлено, что среди пациентов с ТЛ, сопровождающимся эозинофилией, достоверно чаще встречались носители гомозиготного генотипа АА, реже — носители гомозиготного генотипа GG (табл. 3). Зарегистрированы статистически значимые различия в распределении аллелей и генотипов полиморфного сайта A-384G гена эотаксина у больных ТЛ с эозинофилией и у здоровых доноров. Кроме того,

найдена положительная ассоциация аллеля й и генотипа (70 (Л-384С) гена эотаксина с эозинофилией при ТЛ, что свидетельствует о предрасполагающем влиянии данного полиморфизма к формированию эозинофилыюй реакции крови при туберкулезной инфекции (рис. 2).

АА j 0,54

!

0,1 2 3 4

Рис. 2. Показатели относительного риска развития эозинофилии при туберкулезе легких в зависимости от генотипа локуса А-384 G гена эотаксина. Слева генотипы полиморфного сайта А-384 G, справа - критерий отношения шансов (OR)

При анализе концентрации эотаксина в крови в зависимости от аллельных вариантов полиморфизма A-384G гена эотаксина у больных ТЛ с эозинофилией было показано, что у гомозигот по аллелю G отмечался максимальный, а у гомозигот по аллелю А и гетерозигот AG — минимальный уровень эотаксина в крови. Следовательно, наличие у больного ТЛ генотипа GG полиморфного сайта A-384G гена эотаксина в ассоциации с повышенным содержанием эотаксина в крови может лежать в основе развития эозинофилии при туберкулезной инфекции.

Как упоминалось ранее, действие эотаксина осуществляется через специфический рецептор CCR3, экспрессированный на эозинофильных гранулоцитах. При статистическом анализе установлены значимые различия в распределении аллелей и генотипов полиморфного сайта Т-51С гена CCR3 у больных ТЛ, сопровождающимся эозинофилией, и без таковой (табл. 3).

Выявлена ассоциация аллеля С и генотипа СС (OR=3,25) полиморфизма Т-51С гена CCR3 с развитием эозинофильной реакции крови при ТЛ и, соответственно, протективный эффект генотипов ТС (OR=0,88), ТТ (OR=0,56) и аллеля Г полиморфизма Т-51С гена CCR3.

Анализ зависимости содержания ССКЗ-позитивных эозинофилов в in vitro культуре эозинофилов крови от варианта полиморфного сайта Т-51С соответствующего гена не выявил каких-либо достоверных различий у больных ТЛ — носителей разных генотипов. Следовательно, аллельный полиморфизм Т-

51С гена CCR3 не оказывает существенного влияния на уровень экспрессии рецептора к эотаксину. Описанные выше изменения количества эозинофилов, несущих рецептор к эотаксину, у больных ТЛ, по всей видимости, не связаны с исследуемым полиморфизмом гена CCR3.

Следует отметить, что на сегодняшний день не существует единого мнения о целесообразности возникновения и значении эозинофильной реакции крови при туберкулезной инфекции. Для уточнения влияния эозинофильной реакции крови на течение инфекционного процесса, вызванного М. tuberculosis, на втором этапе настоящего исследования была проведена сравнительная оценка отдельных параметров клеточного (Thl-ассоциированного) и гуморального (ТЬ2-ассоциированного) иммунного ответа у больных ТЛ, сопровождающимся эозинофилией, и без эозинофилии.

Как показали результаты проведенного исследования, абсолютное содержание лимфоцитов у больных ТЛ без эозинофилии и ДТЛ с эозинофилией значимо не отличалось от контрольных значений, а у больных ИТЛ, сопровождающимся эозинофилией, достоверно увеличивалось. При изучении субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у больных ДТЛ, независимо от количества эозинофильных лейкоцитов в периферической крови, было зарегистрировано статистически значимое снижение (по сравнению с контрольными значениями) относительного и абсолютного числа CD3+ Т-лимфоцитов (соответственно до (0,92±0,19)х109/л и (40,93±3,84) % у больных ДТЛ с эозинофилией и до (0,82±0,11)хЮ9/л и (51,43±5,15) % у больных ДТЛ без эозинофилии).

В целом снижение содержания CD3+ Т-лимфоцитов при ДТЛ можно рассматривать как проявление Т-клеточного дефицита, связанного с угнетением формирования клона антиген-специфичных Т-лимфоцитов, либо с их быстрой элиминацией из периферической крови в очаг воспаления или посредством индукции апоптоза [Воронкова О. В. и соавт., 2007]. Вместе с тем, дефицит CD3+ Т-лимфоцитов может быть опосредован развивающимся в ходе длительной персистенции М. tuberculosis дибалансом продукции цитокинов.

Ключевым цитокином, обеспечивающим протекцию при туберкулезной инфекции, является IFN-y, обладающий способностью повышать антигенпрезентирующую и микробицидную функции макрофагов и усиливать цитотоксические реакции, опосредованные Т-лимфоцитами и NK-клетками [Салина Т. Ю. и соавт., 2012]. При этом в ходе проведенного исследования было зарегистрировано статистически значимое снижение концентрации IFN-y в крови у больных ТЛ, ассоциированным с эозинофилией (6,15 (3,86-7,31)

пг/мл у больных ИТЛ и 4,95 (3,86-6,21) пг/мл у больных ДТЛ), и найдена отрицательная корреляция между количеством IFN-y и эозинофильных гранулоцитов в крови (г=-0,731, р<0,05). Вероятно, это обусловлено гиперпродукцией ТЬ2-ассоциированных иммунорегуляторных цитокинов, подавляющих пролиферацию Thl-лимфоцитов и секрецию ими основных медиаторов противотуберкулезного иммунитета.

Необходимо отметить, что в комплексе защитных реакций при ТЛ механизмы хуморального иммунного ответа играют немаловажную роль, однако поляризация иммунного ответа в направлении ТЬ2-реакций с одновременным угнетением Thl-ответа - фактор неблагоприятный, способствующий прогрессированию патологического процесса. Так, в ходе настоящей работы у больных ТЛ с эозинофильной реакцией было установлено статистически значимое повышение абсолютного числа CD20+ В-лимфоцитов (до (0,59±0,04)х109/л у больных ИТЛ и (0,53±0,09)х107л у больных ДТЛ) и найдена положительная корреляция между их количеством и содержанием эозинофильных гранулоцитов в крови (г=0,620, р<0,05). Выраженные изменения содержания CD20+ В-лимфоцитов именно у больных ТЛ с эозинофилией могут быть обусловлены, в том числе, влиянием IL-5, концентрация которого в крови у данной группы пациентов оказалась достоверно выше таковой у больных без эозинофилии. В частности R. G. Wolterink et al. [2012] показана способность IL-5 влиять не только на эозинофилы, но и усиливать пролиферацию и дифференцировку активированных В-лимфоцитов, продукцию ими цитокинов и иммуноглобулинов.

Подводя итог полученным результатам, следует заключить, что эозинофильная реакция крови при ТЛ носит реактивный характер, механизм формирования которой опосредован гиперсекрецией клетками крови ключевых эозинофил-активирующих медиаторов (IL-5 и эотаксина), а также избыточной экспрессией IL-5RA на мембране эозинофильных гранулоцитов (рис. 3). Предрасполагающим фактором к развитию гемической эозинофилии при ТЛ является носительство генотипов СС полиморфного участка С-703Т гена IL5 и GG полиморфизма A-384G гена эотаксина, ассоциированных с гиперпродукцией IL-5 и повышением содержания IL-5 и эотаксина в крови, т.е. эозинофильная реакция крови при туберкулезной инфекции может иметь генетически детерминированный характер. ТЬ2-поляризацию иммунного ответа при ТЛ, ассоциированном с эозинофильной реакцией крови, следует рассматривать, по-видимому, как следствие эозинофилии (в виду

гиперсекреции эозинофилами IL-5), а также как фактор ее прогрессирования. В целом, полученные в настоящем исследовании результаты существенно расширяют представления о механизмах развития эозинофилии крови при TJI и могут явиться основой для разработки критериев прогноза течения и иммунотерапии данной патологии.

ВЫВОДЫ

1. Эозинофильная реакция крови при иифильтративном и диссеминированном туберкулезе легких до проведения химиотерапии опосредована увеличением содержания эотаксина, IL-5 и числа 1Ь-5КА-экспрессирующих эозинофилов в крови.

2. Ведущая роль IL-5 и рецептора к IL-5 (IL-5RA) в развитии гемической эозинофилии при туберкулезе легких подтверждается увеличением секреции цитокина in vitro, содержания его и IL-SRA-экспрессирующих эозинофилов в крови только у больных с зозинофилией, в то время как повышенное содержание эотаксина и CCR3+ эозинофилов в крови выявляется у больных с эозинофилией и без таковой.

3. Повышенная реактивность (гиперэргия) эозинофильных гранулоцитов у больных туберкулезом легких с эозинофилией проявляется в условиях индукции in vitro увеличением секреции клетками IL-5 (при действии BCG) и экспрессии IL-5RA (при действии рекомбинантного IL-5). При этом изменения со стороны экспрессии CCR3 отсутствуют.

4. Развитие эозинофильной реакций крови при туберкулезе легких ассоциировано с аллелем С и генотипом СС (С-703TJ гена JL5, аллелем G и генотипом GG (A-384G) гена эотаксина, аллелем С и генотипом СС (Т-51С) гена CCR3.

5. Повышенное содержание IL-5 и эотаксина в крови у больных туберкулезом легких, сопровождающимся эозинофилией, сопряжено с носительством генотипа СС полиморфного участка С-703Т гена IL5 и генотипа GG полиморфизма A-384G гена эотаксина. Гиперэкспрессия на эозинофилах рецепторов к IL-5 и эотаксину не связана с полиморфными вариантами G-80А гена 1L5RA и Т-51С гена CCR3.

6. Увеличение абсолютного количества CD20+ В-лимфоцитов и концентрации IL-5 в условиях дефицита IFN-y в крови у больных туберкулезом легких с гемической эозинофилией свидетельствует о ТЬ2-поляризации иммунного ответа.

Угнетение иммунного Th 1 -ответа

Аллель G и генотип GG по ik\K>p<|'l

гена joniiiKCUHa

Дисбаланс Thl/Th2

Наработка эозинофил-активирующих ТЬ2-медиаторов

Активация иммунного ТЬ2-ответа

Аллель С п гатотни СС

ИИ li!U ipijlll ¡V , О J '

гена 115

Рекрутирование эозинофилов из тканей в кровоток

Угнетение апоптоза эозинофилов Высвобождение зрелых и созревающих форм эозинофилов в кровоток

-

Стимуляция финальных стадий эозинофилопоэза в костном мозге

ЭОЗИНОФИЛИЯ КРОВИ

Рис. 3. Молекулярно-генетические механизмы развития эозинофилии при туберкулезе легких (по данным О. В. Воронковой и соавт., 2007; И. В. Лядовой, В. Я. Гергерт, 2009; М. Е. Rothenberg et al„ 2007; Н. F. Rosenberg et al, 2009; R. Shamri et a!., 2010 и результатам собственных исследований (выделено серым цветом))

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Молекулярно-генетические аспекты туберкулеза легких / ЕЛ. Никулина, КО. Михеева, Н.А. Сухаленцева и др. // Материалы XV межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», г. Санкт-Петербург, 22-23 апреля 2009 г.-СПб., 2009.-С. 85-86.

2. Аллельный полиморфизм reua IFNQ при туберкулезе легких / Е.Л. Никулина, И.О. Наследникова, О.И. Уразова, О.В. Воронкова, В В. Новицкий, Е В. Некрасов, О.В. Филинюк, Е.Г. Чурина, КО. Михеева, P.P. Хасанова, В.А. Серебрякова, Н А. Сухаленцева // Медицинская иммунология (0,271). -2010. -Т. 12, X» 3. - С. 259-264.

3. Иммуногенетические маркеры социально значимых инфекций / В.А. Серебрякова, И.О. Наследникова, О.И. Уразова, А.С. Чернов, Н.В. Шперлинг, В.В. Новицкий, Е.Л. Никулина, Н.А. Сухаленцева, КО Михеева, О.В. Воронкова, Ю.В. Колобовникова, Т.В. Федорович, Е.Н. Чернова // Материалы докладов всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии», г. Новосибирск, 15-17 сентября 2010 г. - Новосибирск, 2010. - № 3: - С. 7071.

4. Роль IL-5 в формировании эозинофильной реакции крови при туберкулезе легких / Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, О.В. Воронкова, И.О. Наследникова, КО. Михеева //Материалы IX российско-германской научно-практической конференции им. Р. Коха и И.И. Мечникова «Новые горизонты: инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении», г. Новосибирск, 8-9 декабря 2010 г. - Новосибирск, 2010. -С. 226-228.

5. Эозинофил и его роль в патологии / Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, Л.С. Литвинова, И.О. Наследникова, О.В. Воронкова, КО. Михеева // Иммунопатология, аллергология, инфектология (0). -2011. -№ 2. - С. 12-17.

6. Роль интерлейкина-5 и'эотаксина в формировании эозинофильной реакции крови при туберкулезе легких / Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, Л.С. Литвинова, О.В. Воронкова, И.О. Наследникова, К.О. Михеева, М.В. Игнатов // Медицинская иммунология (0,271). - 2011. - Т. 13, № 2-3. - С. 273-278.

7. Цитокинопосредованные механизмы формирования эозинофильной реакции крови при инфекционной патологии / Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, О.В. Воронкова, И.О. Наследникова, Л.С. Литвинова, К.О. Михеева, М.В. Игнатов // Материалы всероссийской научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии - 2011», г. Санкт-Петербург, 34 февраля 2011 г. - Спб„ 2011. - С. 89.

8. Особенности продукции TNF-a эозинофилами крови in vitro при туберкулезе легких / КО. Михеева, Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, М.В. Игнатов, М.Д. Гончаров // Материалы XVII межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии - 2011», г. Санкт-Петербург, 20-21 апреля 2011 г. - Спб., 2011. -С. 110-112.

9. Роль эотаксина в формировании эозинофилии крови при туберкулезе легких / Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, КО. Михеева // Материалы IX съезда

фтизиатров России, г. Москва, 1-3 июня 2011 г. - Туберкулез н болезни легки* (0,341). -2011.-№4.-С. 199.

10. Цитокинопосредованные механизмы эозинофилии при туберкулезе легких / К.О. Михеева, Ю.В. Колобовникова, М.В. Игнатов, М.Д. Гончаров // Материалы XII Российского конгресса молодых ученых с международным участием «Науки о человеке», г. Томск, 26-27 мая 2011 г. - Томск, 2011. - С. 67-68.

11. Показатели клеточного и гуморального иммунного ответа при туберкулезе легких, сопровождающемся эозинофилией / Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В В. Новицкий, О.В. Воронкова, КО. Михеева, М.В. Игнатов, О.В. Филинюк, О.И. Новосельцева, Е.П. Степанова//Бюллетень сибирской медицины (0,199).-2012.-№ 1.-С. 39-45.

12. Цитокинсекретирующая активность эозинофилов крови при туберкулезе легких / Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В В. Новицкий, О.В. Воронкова, И.О. Наследникова, К.О. Михеева, М.В. Игнатов // Бюллетень экспериментальной биологии н медицины (0,465).-2012.-Т. 153, №3.-С. 296-299.

13. Молекулярные механизмы формирования эозинофилии крови при туберкулезе легких / Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, КО. Михеева, М.Д. Гончаров // Вестник РАМН (0,375). - 2012. -№ 5. - С. 58-62.

14. Роль полиморфизма генов IL5 (-703) и IL5RA (-S0) в формировании эозинофилии крови при туберкулезе легких / КО. Михеева, В.В. Новицкий, О.И. Уразова, Ю.В. ■ Колобовникова, М.Д. Гончаров, И.О. Наследникова // Бюллетень сибирской медицины (0,199). - 2012. - № 4. - С. 57-63.

15. Роль полиморфизма генов эотаксина (■-384') и CCR3 (-51) п формировании эозинофилии крови при туберкулезе легких / К.О. Михеева, Ю.В. Колобовникова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, О.В. Филинюк, М.Д. Гончаров, И.О. Наследникова // Бюллетень сибирской медицины (0,199).-2012.-№ 6.-С.213-215.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ: ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДТЛ - диссеминированный туберкулез легких ИТЛ - инфильтративный туберкулез легких МБТ — микобактерии туберкулеза мРНК - матричная рибонуклеиповая кислота ПДРФ — полиморфизм длнп рестрикционных фрагментов TJI - туберкулез легких

BCG (Bacillus Calmette-Guerin) - бацилла Кальметта-Герена

CCR3 (С-С chemokine receptor type 3) — хемокиновый рецептор типа 3

CD (clusters of differentiation) — дифференцировочные антигены

FITC (fluorescein isothiocianat) - флуоресцеина изотиоционат

IFN (interferon) - интерферон

Ig (immunoglobulin) - иммуноглобулин

IL (interleukin) — интерлейкин

NK (natural killers) - натуральные киллеры

Th - (T-lielpers) — Т-лимфоциты-хелперы

\

Vх

Отпечатано в ООО «НИП», г.Томск, ул. Советская, 47,,тел.: 53-14-70. Тираж 100 экз.