Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Поиск Высокоэффективных противопаркинсонических средств в ряду монотерпеноидов

На правах рукописи

ПАВЛОВА АЛЛА ВИКТОРОВНА

ПОИСК ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ ПРОТИВОПАРКИНСОНИЧЕСКИХ СРЕДСТВ В РЯДУ МОНОТЕРПЕНОИДОВ

14.03.06. - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск-2010

004614181

Работа выполнена в Новосибирском институте органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Толстикова Татьяна Генриховна Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Поветьева Татьяна Николаевна доктора биологических наук Новожеева Татьяна Петровна

Ведущая организация: Институт физиологически активных веществ РАН, г. Москва

Защита состоится "_"_2010 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 001.031.01 при НИИ фармакологии СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ фармакологии СО

РАМН.

Автореферат разослан

2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Болезнь Паркинсона (БП) — второе по частоте после болезни Альцгеймера нейродегенеративное заболевание позднего возраста, которое встречается во всех человеческих популяциях мира. Его распространенность составляет 1-2% среди лиц старше 50 лет (Korrell et al., 2005). Актуальность проблемы БП возрастает в связи с неуклонным старением населения в мире. Согласно последнему прогнозу Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в последующие два десятилетия в развитых странах до 20% населения станет старше 65 лет. Это неизбежно приведет к увеличению числа больных паркинсонизмом (Полевая с соавт., 2004). Следует подчеркнуть, что, не смотря на традиционные представления о «возрастозависимом» характере БП, молодые случаи уже давно не являются редкостью: считается, что каждый десятый пациент заболевает БП до 50 лет, а каждый двадцатый - до 40.

Как известно, в соответствии с нейрохимическими механизмами развития болезни Паркинсона лекарственное лечение паркинсонизма заключается в активации дофаминергических, блокаде глутаматергических и холинергических влияний. Необходимо подчеркнуть, что все применяемые на практике средства для лечения БП, не обладают эгаотропными свойствами, а лишь ослабляют или устраняют проявления заболевания на время приема. Медиахорные механизмы, на которые воздействуют противопаркинсонические препараты вовлечены в регуляцию широкого спектра психических и висцеральных процессов, что является причиной развития серьезных побочных эффектов при длительной (пожизненной) терапии болезни Паркинсона (Иллариопшш, 2008).

Таким образом, вполне очевидны высокая медицинская и социальная значимость данной патологии и то исключительное внимание, которое уделяется БП в современной нейрофармакологии. Однако, несмотря на наличие достаточного ассортимента фармпрепаратов, важную роль отводят разработке малотоксичных и высокоэффективных, полученных на основе растительного сырья лекарственных средств.

Достаточно упомянуть, что более половины низкомолекулярных лекарственных средств, созданных с 1981 по 2006 гг., так или иначе связаны с природными метаболитами (Newman, 2008). Известно, что терпеновые соединения, выделенные га растений, обладают широким спектром биологического действия, что делает их перспективными для поиска новых лекарственных препаратов. Наиболее изученными свойствами этих соединений являются болеутоляющие, противовоспалительные, антимикробные, противогрибковые, противовирусные, гипотензивные,

противоопухолевые, седативные, спазмолитические и др. (Galeotty et al., 2002; Grodnitzky et al., 2002; Murakami et al., 2004; Han, 2005). Сравнительно недавно появились данные о влиянии монотерпеноидов на центральную нервную систему, а именно на ГАМКергическую и холинергическую систему мозга (Miyazawa et al., 1997; Hall et al., 2004; Silva et al., 2009), описаны их нейропротективные свойства (Chang et al., 2007).

В Новосибирском институте органической химии СО РАН синтезированы гидрокси производные соединения пара-ментанового ряда на основе широко распространенного в природе монотерпеновда (-)-вербенола.

Как известно, вербенол представляет большой интерес как вещество, обладающее в том числе и нейропротективной активностью (Chang et al., 2007). В этой связи, было принято решение провести углубленное исследование фармакологической активности новых производных, полученных на основе вербенола.

Целью данной работы является изучение кислородсодержащих производных иара-ментанового ряда, . полученных на основе вербенола, на противопаркинсоническую активность. Проведение расширенного фармакологического исследования для наиболее перспективного агента. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить противопаркинсоническую активность новых кислородсодержащих производных na/за-ментанового ряда на модели паркинсонического синдрома, вызванного системным введением МФТП, а также противосудорожную активность. Выбрать наиболее перспективный агент для дальнейших исследований.

2. Оценить влияние наиболее перспективного агента кислородсодержащих производных яара-ментанового ряда (диола) на холинергическую и дофаминергическую нейромедиаторные системы головного мозга.

3. Исследовать противопаркинсоническую активность диола при однократном и длительном способах введения.

4i Определить зависимость противопаркинсонической активности от абсолютной конфигурации химической структуры диола.

5. Оценить влияние длительного введения диола на жизненно важные органы и системы организма животных.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые обнаружена группа кислородсодержащих производных монотерпенового ряда перспективных в качестве противосудорожных, противопаркинсонических, анальгетических агентов. Среди кислородсодержащих производных пара-ментанового ряда выявлен низкотоксичный политаргстный агент - диол, обладающий одномоментно противопаркинсонической, противосудорожной и анальгетической активностью. Его противопаркинсоническое действие, вероятно, обусловлено дофаминомиметическими и холинолитическими свойствами, способствующими восстановлению нарушенного баланса мевду дофаминергической и холинергической медиаторными системами головного мозга. Впервые показана зависимость степени выраженности противопаркинсонической активности от абсолютной конфигурации химической структуры диола.

Научно-практическая ценность работы. Диол предложен в качестве низкотоксичного полифункционального средства для лечения паркинсонического синдрома, не уступающего по противопаркинсонической активности существующим средствам дофаминзамещающей терапии и выгодно отличающийся от других средств, наличием обезболивающего и противосудорожного действия.

Положения, выносимые на защиту. 1. Выявлен новый высокоактивный противопаркинсонический агент среди производных иаро-ментанового ряда - диол.

2. Установлена связь противопаркинсонического действия диола с пространственным строением соединения.

3. Противопаркинсоническое действие агента обусловлено влиянием на дофаминергическую и холинергическую системы головного мозга.

4. Диол - низкотоксичный, полифункциональный агент, обладающий противосудорожным и анальгетическим эффектом.

5. Диол не обладает токсическим воздействием на организм животных и может быть предложен в качестве перспективного политаргетного препарата для расширенного доклинического исследования.

Апробация результатов. Основные результаты работы были представлены на «5-м Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Украина, Крым, Судак, 2009г), ежегодной конференции «Медицинская геномшса и протеомика», (Новосибирск, 2009), дважды на «Конкурсе молодых ученых НИОХ СО РАН» (Новосибирск, 2008, 2009гг.), на «6-м Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Украина, Крым, Судак, 20 Юг),

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 4 - в журналах, рекомендованных перечнем ВАК.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 08-03-13516-офи_ц «Создание новых низкодозных малотоксичных противоэпилептических агентов на основе растительных метаболитов» (2008-2009); программ Президиума РАН: «Фундаментальные науки - медицине», «Разработка низкодозных антиаритмических и гипотензивных препаратов на основе комплексов растительных гликозидов» (2008, 2009). Междисциплинарных проектов СО РАН: № 54 -«Научные основы разработки новых лекарственных препаратов. Перспективы использования возобновляемого сырья»; № 93- «Развитие исследований в области медицинской химии и фармакологии как научной основы разработки отечественных лекарственных препаратов».

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований и обсуждение, выводы и список цитируемой литературы, включающий 214источника. Работа изложена на 118 страницах, содержит 13 рисунков и 22 таблицу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальные животные. Исследования проводили на самцах мышей инбредной линии С57В1/6 массой тела 20-22г., белых беспородных мышах весом 20-25г., белых крысах линии Вистар массой тела 200-250г., полученных из вивария Института цитологии и генетики СО РАН и содержащихся во время эксперимента в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и стандартному гранулированному корму. Группы животных формировали по 8-10 особей в каждой. Всего в работе использовано 554 беспородные белые мыши, 260 мышей линии С57В1/6 и 206 крыс. Работы с животными проводили в строгом соответствии с законодательством Российской Федерации, положениями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986), требованиями и

рекомендациями «Руководства по содержанию и использованию лабораторных животных».

Исследуемые соединения. Представленные для исследования соединения пара-ментанового ряда были синтезированы в Лаборатории лесохимии и химии природных биологически активных соединений Института органической химии СО РАН (зав. лаб. - д. х. н. Салахутдинов Н. Ф.) Синтез соединений был осуществлен исходя из распространенного монотерпеноида (-)-вербенола в соответствии с ранее разработанными методиками (АМа^оУ е1 а1., 2007; П'ша й а1., 2007)

1П 85:15 1 IV 99:1 |

»он

Цл *он

ж VIII 100 ж IX 99:1

гУ ►он

•он у^'ои

XII хш

99:1

99:1

XI

99:1

Модели и тесты

Исследуемые вещества растворяли в воде с Твином-80 и вводили перорально в дозах, указанных для казвдой модели (по 0,2 мл на 10 г массы мыши и по 0,2 мл на 100 г массы крысы). Оценку фармакологического действия соединений проводили согласно методическим указаниям по изучению противосудорожной и противопаркинсонической активности фармакологических веществ Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (Хабриев, 2005).

Определение острой токсичности. Острая токсичность исследована в опытах на белых беспородных мышах обоего пола в соответствии с методическими

рекомендациями. Параметры среднесмертельной дозы (LD50) рассчитывали по методу Кербера (Беленький, 1963).

Скрининговые модели для оценки воздействия исследуемых агентов на центральную нервную систему. Фармакологический скрининг исследуемых агентов проводили на белых беспородных мышах при однократном внугрижелудочном способе введения в дозе 10 мг/кг с применением ниже представленных экспериментальных тестов. Животных формировали в группы по 10 особей в каждой.

Тест «открытое попе». Через час после введения исследуемых веществ животных помещали в центр фотосенсорной установки Тш Scan (Coulboum, США), где в течение 2 минут регистрировали показатели вертикальной и горизонтальной активности. Эта модель позволяет оценить влияние исследуемых соединений на двигательно-исследовательскую активность животных (Howard et al., 1997).

«Коразоловые судороги» вызывали внутрибрюшинным введением 90 мг/кг коразола через 1 час после введения исследуемого агента, эффект оценивали по проценту гибели животных в группе, которая возникает в результате блокады ГАМКа-рецепторов (Головина, Андреева, 1986). «Никотиновые судороги», вызванные возбуждением Н-холинорецепторов, воспроизводили подкожным введением никотина в дозе 20 мг/кг через 1 час после введения исследуемого агента и оценивали по проценту летальности животных (Машковский с соавт., 1983). «Ареколиновый тремор», отражающий возбуждение М-холинорецепторов, вызывали внутрибрюшинным введением ареколина в дозе 25 мг/кг через 1 час после введения исследуемого агента. Эффект оценивали по продолжительности тремора (Ускова, Антслова, 1977).

«Хлоралгидратовый сон» вызывали внутрибрюшинным введением снотворного препарата хлоралгидрата в дозе 325 мг/кг, реализующего свои эффекты через кору головного мозга через 1 час после введения исследуемого агента Критерием оценки эффекта служили время утраты и восстановления рефлекса переворачивания мышей из бокового положения (Каминка с соавт., 1982).

Взаимодействие с L-ДОФА (Лаврецкая, 1985), вводимым в дозе 200 мг/кг внутрибрюшинно, характеризующее воздействие на дофаминергическую (адренергическую) системы, определяли по изменению показателей двигательно-исследовательской активности в модели «открытое поле», регистрируемых на установки Tru Scan (США). Исследуемые вещества вводили за час до инъекции L-ДОФА, тестирование проводили через час после введения L-ДОФА.

Йохимбиновую токсичность определяли по проценту гибели животных в группе после введения йохимбина в дозе 40 мг/кг внутрибрюшинно. Исследуемый агент вводили за час до инъекции йохимбина. Данная модель позволяет оценить выявить адренергический компонент в фармакологической активности вещества (Lapin, 1980).

Оценка противопаркинсонической активности.

1. Модель Паркинсонического синдрома (ПС) у мышей и крыс, вызванного введением нейротоксина МФТП (1-метил-4-фенил-1,2,3,б-тетрагидропиридина). Данная модель является наиболее адекватной моделью ПС, поскольку МФТП вызывает избирательное повреждение дофаминергических нейронов черной субстанции. МФШ вводят внутрибрюшинно мышам линии C57BI/6 в дозе 30 мг/кг

или крысам в дозе 40 мг/кг за 15 мин до введения исследуемых веществ. Оценку экстрапирамидных нарушений начинали сразу же после введения нейротоксина и продолжали наблюдение в течение 2 часов. Эффективность исследуемых препаратов оценивали по способности ослаблять проявления ПС, вызванного введением МФТП: олигокинезии, ригидности и тремора, а так же регистрировали наличие и выраженность слюнотечения и пилоэрекции. Оценку вызванной введением нейротоксина олигокинезии производили с помощью модели «открытое поле» через 1,5 часа после инъекции МФТП, регистрируя параметры двигательно-исследовательской активности. Для количественной оценки ригидности использовали симптом «горбатости», выраженность которого зависит от мышечной ригидности и определяется по укорочению расстояния от шеи до основания хвоста за счет сгорбленности животного (ригидность оценивали по бальной системе: 0 - отсутствие ригидности, 1 - укорочение расстояния менее чем на 3 см, 2 - более чем на 3 см). Тремор оценивали по выраженности в баллах: 0 — отсутствие тремора, 1 - локальный мелкоамплитудный тремор головы, передних лап и хвоста, 2 - локальный среднеамплитудный тремор, 3 - генерализованный мелко- или среднеамплитудный тремор и по продолжительности. Пилоэрекцию (взъерошивание шерсти) оценивали в альтернативной форме по наличию или отсутствию у крысы этого признака. Саливацию (слюноотделение) оценивали по размеру мокрого пятна на шее животного в баллах: 0 - отсутствие эффекта, 1 - до 0,5 см, 2 - до 1 см, 3 - до 2 см. (Воронина с соавт., 2000).

Было проведено несколько серий экспериментов с использованием данной модели ПС: I). Исследование противопаркинсонической активности при однократном введении нейротоксина МФТП. Эксперименты проводили на самцах мышей линии С57В1/6. Индукцию ПС осуществляли путем внутрибрюшинного введения МФТП в дозе 30 мг/кг, группе контроля вводили физиологический раствор. Исследуемый агент в дозе 10 и 20 мг/кг вводили перорально через 15 минут после воспроизведения модели ПС. Олигокинезию оценивали через 1,5 часа после инъекции МФТП по двигательно-исследовательской активности в тесте «открытое поле». 2). Исследование противопаркинсонической активности при трехдневном введении нейротоксина МФТП. Эксперименты проводили на мышах самцах линии С57В1/6. Индукцию ПС осуществляли путем внутрибрюшинного введения МФТП в дозе 30 мг/кг в течении трех дней. Агент в дозе 20 и 30 мг/кг вводили перорально через 24 часа после последней инъекции МФТП. Олигокинезию оценивали через 1,5 часа после инъекции МФТП по двигательно-исследовательской активности в тесте «открытое поле». 3). Исследование противопаркинсонической активности агента при десятидневном введении нейротоксина МФТП. Индукцию ПС осуществляли путем внутрибрюшинного введения мышам самцам линии С57В1/6 нейротоксина МФТП в дозе 25 мг/кг в течение 10 дней. Агент в дозе 20 мг/кг вводили перорально ежедневно через 4 часа после инъекции нейротоксина, препарат сравнения леводопу в дозе 20 мг/кг. Использовали четыре группы мышей по 10 цгг: 1-я (контроль I) группа -животные, которым вводили физ. раствор, 2-я (контроль II) - животные, получавшие инъекцию МФТП внутрибрюшинно ежедневно, 3-я и 4-я группы - животные, которым вводили исследуемое соединение и препарат сравнения соответственно, на фоне индуцированного ПС. Оценивали выживаемость животных в каждой группе,

изменение параметров двигательной активности регистрировали на установке Tru Scan (США). 4). Исследование противопаркинсонической активности агента, при хроническом (30 дней) введении нейротоксина МФТП. Индукцию ПС осуществляли путем внутрибрюшинного введения МФТП крысам самцам линии Вистар в дозе 40 мг/кг ежедневно в течение 30 дней. Агент в дозе 20 мг/кг вводили перорально ежедневно через 4 часа после инъекции нейротоксина, препарат сравнения леводопу в дозе 20 мг/кг ежедневно через 4 часа после индукции ПС. Использовали 6 групп крыс по 10 пгг: 1-я (контроль I) группа - интактные животные; 2-я (контроль II) - животные , получавшие инъекцию МФТП внутрибрюшинно ежедневно; 3-я - животные, получавшие исследуемый агент на фоне индуцированного ПС; 4-я - животные, получавшие исследуемый агент ежедневно; 5-я - животные, получавшие в качестве лечения индуцированного ПС эталон сравнения леводопа; 6-я - животные, получавшие только леводопу ежедневно. Оценку олигокинезии проводили на 31 день от начала эксперимента, регистрируя параметры двигательно-исследовательской в тесте «открытое поле».

2. Стандартные модели для изучения противопаркинсонического действия исследуемых соединений (Хабриев, 2005) .В описанных ниже моделях исследуемый агент вводили в дозе 20 мг/кг перорально.

Модель каталепсии, вызванной трифтазином. Для создания выраженных экстрапирамидных нарушений трифтазин вводят белым беспородным крысам-самцам внутрибрюшинно в дозе 2 мг/кг через 30 минут после введения исследуемого агента. Каталепсию оценивают через 30, 60, 120 и 180 мин после введения трифтазина по методу Morpurgo (Morpurgo, 1964). Модель каталепсии, вызванной галоперидолом (Ossowska et al., 1998). Исследования проводили на беспородных крысах-самцах. Для создания выраженных экстрапирамидных нарушений галоперидол ■ вводили внутрибрюшинно в дозе 1,5 мг/кг. Галоперидол вводили одновременно с исследуемым агентом. Каталепсию оценивали через 60,120 и 180 мин после введения галопервдола с использованием параллельных перекладин. «Ареколиновый тремор». Эксперименты проводили на белых беспородных мышах. Ареколин вводили подкожно в дозе 25 мг/кг через 20 мин после введения исследуемого агента, регистрировали латентный период и продолжительность тремора (сек).

Содержание дофамина (ДА) в стриатуме определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (Клодт с соавт., 2005).

Оценка влияния длительного введения исследуемого агента на жизненно важные органы и системы. Влияние длительного внутрижелудочного введения изучали на самцах крыс линии Вистар в течение 30 дней. Животные были рандомизированы по группам: 1-я (контроль I) группа - животные, получавшие физ. раствор; 2-я (контроль II) - животные, получавшие инъекцию МФТП внутрибрюшинно ежедневно; 3-я - животные, получавшие исследуемый агент на фоне индуцированного ПС; 4-я - животные, получавшие исследуемый агент ежедневно; 5-я - животные, получавшие в качестве лечения индуцированного ПС эталон сравнения леводопу; 6-я - животные, получавшие только леводопу ежедневно. Нейротоксин вводили внутрибрюшинно в дозе 40 мг/кг, диол и референс препарат (леводопа) вводили в дозе 20 мг/кг per os. На 30-й день от начала эксперимента была взята

периферическая кровь для общего анализа из сосудов хвоста Для биохимического анализа была забрана кровь из шейных сосудов. Для гистологического исследования были взяты жизненно-важные органы: легкие, сердце, печень и почки. Воздействие агентов на сердечнососудистую систему оценивали при внутрижелудочном введении в дозе 5 мг/кг крысам по изменению артериального давления (АД) и частоты сердечных сокращений (ЧСС). Регистрацию показателей вели на протяжении часа после введения агентов. Показатели регистрировали с помощью прибора фирмы «Coulbourn instruments» (США). (Хабриев, 2005).

Гистологическое исследование. Полученный для морфологического исследования материал подвергали гистологической обработке на комплексе MICROM («Карл Цейс» Германия) по стандартной методике.Ократенные препараты исследовали методом световой микроскопии в проходящем свете, а сердце - дополнительно в поляризованном свете на микроскопе Axioskop 40 (Cari Zeiss, Germany), с последующим микрофотографировшшем с использованием фотокамеры AxioCam MRc и программного обеспечения AxioVision 4.5.

Исследование показателей крови. Гематологические показатели периферической крови, взятой из хвоста животных, определяли на газоанализаторе «Medonic» СА 530» (Швеция). Для биохимического анализа была забрана кровь из шейных сосудов. Биохимические показатели крови: аланинаминопрансферазы (АЛТ), аспаргагаминотрансферазы (АСТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), малонового диалвдепзда (МДА) и общего белка определяли с использованием стандартных диагностических наборов фирмы "Ольвекс-диагностикум" на фотометре - 5010 «Boehringer Mannheim» (Германия).

Исследование анальгетической активности. Уксусные корчи вызывали внутрибрюшинным введением уксусной кислоты (0,75% по 0,1 мл/мышь), в течение 3-х мин через 5 мин после введения кислоты регистрировали вызванные корчи (Koster et al., 1959). Активность агентов на висцеральную боль представлена в виде среднего количества корчей в группе. «Горячая пластина». Животных помещали на медную пластину, нагретую до 54 ± 0,5° С, ограниченную цилиндром из оргстекла (15 см х 15 см), и фиксировали латентное время болевой реакции - облизывание лапы или подпрыгивание (Eddy, Leimbach, 1953). «Отдергивание хвоста». Данный тест моделирует спинальный рефлекс отдергивания хвоста. С помощью анальгезиметра YLS-12A (China) регистрировали время отдергивания хвоста от момента воздействия на него сфокусированного пучка цвета, оценивали латентное время болевой реакции (Колик с соавт, 2007).

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку данных вели с помощью стандартной программы Statistica 6.0, достоверность определяли по t-критерию Стьюдента и непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Первичный скрининг соединений, и исследование связи «структура-активность» среди соединений группы лара-ментадиола.

Влияние агентов 1-У на коразоловую и никотиновую токсичность.На основании первичного скрининга новых производных пара-ментанового ряда в дозе 10 мг/кг на противосудорожный эффект была выявлена связь «структура-активность».

Так, базисное вещество (-)-карвеол I показал довольно умеренную противосудорожную активность в тестах «коразоловая токсичность» (рис. 1.) и «никотиновая токсичность» (рис 2.). Введение в молекулу (-)-карвеола I еще одной гидроксильной группы при переходе к соединению II приводит к значительному увеличению противосудорожной активности в обоих тестах. В частности, соединение II полностью блокировало развитие судорог, вызванных коразолом, и значительно снижало процент гибели животных в тесте «никотиновые судороги» Установлено, что в результате ацилирования гидроксигрупп (соединение Ш) наблюдается усиление токсического эффекта коразола и, следовательно, увеличение процента гибели животных (рис. 1.). Однако противосудорожная активность в тесте «никотиновая токсичность» сохраняется на высоком уровне

II III

агенты ■контроль - никотин 20 мг/кг в никотин 20 мг/кг + агент 10 мг/кг

Рисунок 2. Влияние агентов 1-У на летальность животных в тесте «никотиновая токсичность» **р<0,01; ***р<0,001 достоверность по сравнению с контрольной группой)

II III агенты

■контроль - коразол 90 мг/кг акоразол 90 мг/кг + агент 10 мг/кг Рисунок 1. Влияние агентов 1-У на летальность животных в тесте «коразоловая токсичность » (**р<0,01; ***р<0,001 достоверность по сравнению с контрольной группой)

Такая же тенденция по проявлению активности наблюдается для соединения IV в результате превращения одной гидрокси-группы в кето-групп. Показано, что гидрирование 8,9-двойной связи при переходе от соединения II к V привело к полному исчезновению активности в обоих тестах. Таким образом, наличие 8,9-двойной связи является важным условием для проявления противосудорожных свойств.

Влияние агентов 1-У на двигателъно-исследовательскую активность. Известно, что некоторые монотерпеноиды могут оказывать достаточно сильное влияние на поведенческие реакции животных (итеги е1 а1., 2001). Результаты наших исследований показали, что соединения 1-У в дозе 10 мг/кг не оказывали влияния на параметры двигательно-исследовательской активности лабораторных животных в тесте «открытое поле» (таб. 1.). Отсюда можно сделать вывод, что сами по себе исследуемые соединения не оказывают влияние на двигательно-исследовательскую активность животных.

Для дальнейшего изучения фармакологической активности было выбрано соединение II, в молекуле которого содержится две гадрокси-группы и двойная связь в 8,9-положении, что обусловливает его высокую противосудорожную активность в тестах: «коразоловая токсичность», «никотиновая токсичность». Для удобства соединение II будем называть «диол».

Исследование острой токсичности диола. В результате изучения острой токсичности для диола была определена среднесмертельная доза (ЪГ)50) при однократном внутрижелудочном способе введения, которая составила 4250 мг/кг. Полученные данные позволяют отнести вышеуказанное соединение к 3-му классу умеренно токсических веществ. Для сравнения, фенобарбитал и диазенам являются намного более токсичными, а значение их среднесмертельной дозы равно 123 и 615 мг/кг соответственно (Колла, Шеленкова, 2006).

Воздействие диола на центральную нервную систему. Влияние диола на эффекты ареколина. Ареколин влияет на центральную холинергическую систему, являясь агонистом мускариновых рецепторов. Введение мышам ареколина вызывает у них длительный тремор и приводит к летальным исходам (Лукомская, 2007). Поэтому, по изменению эффектов ареколина, вызванному введением диола, можно судить о влиянии агента на данную нейромедиаторную систему.

Рисунок 3. Влияние диола на продолжительность ареколинового тремора (*р<0,05 по сравнению с контрольной группой)

Основным показателем

активности ареколина является продолжительность (сек) вызванного им тремора. Введение диола в дозе 10 мг/кг приводит к достоверному уменьшению продолжительности судорожного эффекта ареколина на 20% (рис 3.), тем самым оказывая М-холинолитический эффект.

Взаимодействие диола со снотворным препаратом

хлоралгидратам.Одиъол из тестов, позволяющих оценить влияние соединений на кору головного мозга, является изучение их взаимодействия с хлоралгидратом. На модели хлоралгидратового сна показано, что введение диола приводит к увеличению периода засыпания животных и уменьшению длительности бокового положения, вызванного введением хлоралгидрата (таб. 1.), что свидетельствует о стимулирующем влиянии диола на центральную нервную систему. В группе с референс препаратом -диазепамом, напротив, наблюдалось сильное потенцирование действия снотворного препарата (таб. 1.).

диол

700

600

500 -

400

300 200

100

И контроль - ареколин 25 мг/кг Нареколин 25 мг/кг + диол 20 мг/кг

*Р<0.05 по сравнению с контрольной группой

Влияние диола на угнетение двигательной активности мышей, вызванное Ь-ДОФА .В нейрофармакологии большое значение имеет тест взаимодействия исследуемых соединений с предшественником дофамина - Ь-ДОФА. Введение Ь-ДОФА индуцирует гиперактивность дофаминергической системы головного мозга, что приводит к возникновению определенных морфохимических сдвигов в двигательных структурах головного мозга и нарушению двигательной активности животных (Сергутина, 2004). В условиях нашего эксперимента этот тест может показать влияние диола на дофаминергическое звено.

Таблица 2. Влияние диола на э< >фекты L-ДОФА

Показатель Лгент Двигательная активность Неподвижный момент (сек) Дистанция (см) Скорость движения (см/с) Количество обследованных отверстий Количество вертикальных вставаний

контроль 106,2 ± 2,4 13,8 ±2,4 375,0 ±3,1 3,1 ±0,4 2,8 ±0,0 13,2 ±1,6

L-ДОФА 21,0 ±2,4 99,0 ±2,4 34,2 ±5,4 0,28±0,05 0,0 ±0,0 0,0 ±0,0

L-ДОФА + диол 13.0 ±1.8* 107.0 ±1.8* 19.2 ±2.4* 0.14 ±.02 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0

* Р < 0.05 по сравнению с группой ¿-ДОФА

Было показано, что диол в дозе 10 мг/кг способствует усилению угнетающего действия предшественника дофамина (таб. 2.), проявляющегося в достоверном увеличении неподвижного момента и резком снижении времени двигательной активности, тем самым проявляя однонаправленное с L-ДОФА действие на дофаминергические структуры головного мозга животных. Таким образом, можно предположить, что исследуемое нами соединение является агонистом дофаминергической системы.

Исследование противопаркинсонической активности диола в методах, основанных на угнетении дофаминергической передачи.

Исследование противопаркинсонической активности диола, на модели ПС, вызванного системным введением МФТП. Было проведено несколько серий эксперимента с использованием модели Паркинсонического синдрома, вызванного системным введением нейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МФТП). МФТП - высоко липофильное вещество, хорошо проникающее сквозь гематоэнцефалический барьер и клеточные мембраны и в астроцитах под воздействием фермента МАО-В превращается в >1-метил-4-фенил-253-дигкдропиридин, который окисляется в активный метаболит 1-метил-4-фенилпиридиния (МФП+), а он, в свою очередь, с помощью дофаминового транспортера захватывается дофаминергическими нейронами и вызывает энегргетическую недостаточность за счет ингибирования комплекса-1 дыхательной цепи митохондрий (Калинина с соавт., 2005), вызывая гибель дофаминергических нейронов черной субстанции головного мозга (Jackson-Lewis et al, 2007). МФТП пока

группа время засыпания, мин длительность сна, мин

Контроль (хлоралгидрат) Хлоралгидрат + диол Хлоралгидрат + диазепам 3.88 ±0.13 5.0 ±0.46* 4.00 ±0.15 94.4 ±6.6 76.63 ±10.15 240.0 ± 10.40*

остается единственным известным химическим веществом, способным в эксперименте на лабораторных животных вызывать неврологические проявления паркинсонизма.

Исследование противопаркинсонической активности при однократном введении МФТП.В первой серии эксперимента (таб. 3.) было обнаружено, что диол в дозе 20 мг/кг на фоне однократного введения МФТП проявляет выраженную достоверную противопаркинсоническую активность, характеризующуюся усилением двигательной активности (общей двигательной активности, пройденной дистанции, скорости движения, времени двигательной активности) животного, а также увеличением количества исследованных отверстий и вертикальных стоек. В то время, как диол в дозе 10 мг/кг оказал достоверное положительное влияние на общую двигательную активность и ее продолжительность, а также на количество вертикальных стоек. В данном эксперименте диол в дозе 20 мг/кг с большей достоверностью устранял проявления олигокинезии у животных, вызванные введением МФТП, восстанавливая показатели локомоторной активности до уровня таковых у интакгных животных и оказывая положительный эффект на исследовательскую активность.

Таблица 3. Влияние диола на двигательно-исследоваггельскую активность мышей с индуцированным Паркинсоническим синдромом при однократном введении МФТП _

^Показатель Агент Общая двигательная акгавность Двигательная активность (сек) Дистанция (см) Скорость движения (см/с) Количество вертикальных стоек Количество исследованных отверстий

контроль 82 ± 1,97 ** 66,6 ±2,31 ♦** 309,3 ± 17,94*** 2,54 ± 0,14*** 4,7 ±0,96 >-* * н-

МФТП 59 ±3,8 39,8 + 5,8 171,4 + 37 1,3 + 0,3 5 + 1,6 4,9 ±0,9

МФТП + диол 10 мг/кг 77,2 + 5 *» 57 ±5,3 * 2573 ±9,5 2,1 ±0,2 5,8 ±1,8 7,7 +1,07 ♦

МФТП + диол 20 мг/кг 80,7 + 4 *» 59 + 4 ** 276,5 ±24 2,25 ± ОД ** 8,5 ±2 * 7,6 ±1,7 *

* Р< 0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001 по сравнению с группой МФТП Исследование противопаркинсонической активности диола в трехдневном эксперименте.

Результаты вышеописанного эксперимента подтвердились в опыте с трехдневным введением нейротоксина. Трехкратное введение МФТП в значительной степени усиливает повреждение дофаминергических нейронов черной субстанции головного мозга (Serra et al, 2008), тем самым позволяет смоделировать in vivo поздние стадии Паркинсонического синдрома, практически не поддающегося лечению в медицинской практике. Результаты эксперимента показали, что диол и в этом случае в дозе 20 мг/кг достоверно улучшал показатели двигательной активности, скорости движения, пройденного животным расстояния, а также исследовательской активности, выраженной в увеличении числа исследованных отверстий и количества вертикальных стоек (таб. 4.), тем самым, проявляя выраженную противопаркинсоническую акгавность при практически полной гибели дофаминергических нейронов черной субстанции головного мозга.

14

А в дозе 30 мг/кг исследуемый агент в меньшей степени устраняет проявления олигокинезии (таб. 4.) и не влияет на показатели исследовательской активности.

Таблица 4. Влияние диола на двигатсльно-исследовательскую активность мышей с индуцированным Паркинсоническим синдромом в трехдневном эксперименте. _

^'Цоказатель Агент Двигательная активность Время агаивн. (сек) Дистанция (см) Скорость движения (см/с) Количество вертикальных стоек Количество исследованных отверстий

Ингактная группа 88,1+2,4 *** 70,2 + 3,6*** 361,6 + 32,4*** 2,9 + 0,3 ** 15 + 3,9 7,8+1,1 ***

МФТП 43,4 ±4,7 55,5 ±6 264,5 ±4,8 2,2 ±0,3 12,2 ±2 1,8 ±0,6

МФТП + диол 20 мг/кг 81,9±3,7 *** 70,1 ± 3,9** 351,8 ± 26,4** 2,9 ±0,2 ** 11,1 ±0,9 8,8 ±1

МФТП + диол 30 мг/кг 81,8 ±2,6 »* 66,8 ± 3,7* 335,5 ± 28,9* 2,7 ±0,2 13 ±1,7 3,8 ± 0,6 *

* Р< 0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001 по сравнению с группой МФТП На основании проведенных двух серий экспериментов по выявлению блокирующего действия диолом эффекта нейротоксина МФТП на дофаминергическую систему для диола была выявлена высокая антипаркинсоническая активность, имеющая куполообразную дозозависимость. Наиболее высокая противопаркинсоническая активность исследуемого агента проявилась в дозе 20 мг/кг, для которой и были проведены дальнейшие исследования

О роли стереоизомерии при исследовании противопаркинсонической активности оптических изомеров диола.

Известно, что абсолютная конфигурация играет важную роль в проявлении их фармакологической активности химическими соединениями (ЕНег « а1., 1994). Для изучения влияния роли стереоизомерии на активность было синтезировано 8 оптических изомеров (соединения У1-Х1П) выбранного диола (рис 4.) и исследовано на модели паркинсонического синдрома (ПС), вызванного введением нейротоксина

Рисунок 4. Сгереоизомеры диола

По результатам

проведенного эксперимента нами была установлена связь «струтура-акгивность», а именно зависимость

противопаркинсонической активности от

пространственного расположения гидроксильных групп в 5-м и 6-м положении, а также изопропенилыгой группы в 4-

МФТП.

XIII

м положении (рис. 5.).

Эффективнее всего снимает проявления экспериментального ПС соединение 7 VI (таб. 5.), составляющее основную часть (85%) от диола

(соединения П). Соединение VI полностью снимал проявления олигокинезии, восстанавливая показатели двигательно-исследовательской активности до уровня таковых у животных контрольной группы (таб. 5). При изменении конфигурации гидроксильной группы в 5-м положении с R на S (переход от соединения VI к VII) приводит к полному исчезновению влияния на развитие олигокинезии и большему угнетению исследовательской активности (таб. 6.). Изменение конфигурации гидроксильной группы в 6-м положении (переход от VI к IX) привело к противоположному эффекту. То есть, соединение IX достоверно усугубляло проявления симптомов ПС, в 2,9 раза снижая показатели двигательной активности по сравнению с контрольной группой животных, получавших лишь инъекции МФТП, в 12 раз количество вертикальных стоек (таб. 7.), показывая тем самым выраженный седативный эффект.

Одновременное изменение положения обеих гидрокси-групп (переход от VI к VIII ) привело к исчезновению противопаркинсонической активности соединения VIII (таб. 7.).

Большое значение имеет абсолютная конфигурация изопропенильной группы. Соединения с R расположением данной группы не проявляют достоверной противопаркинсонической активности. Так, соединения XI-XIII, независимо от расположения гидроксильных групп, не оказали влияния на двигательно-исследовательскую активность (таб. 5, 6 и 7.) животных с шщуцированным ПС. А соединение X потенцировало угнетение исследовательской активности и незначительно усугубляло проявление олигокинезии (таб. 7.), вызванной введением МФТП.

Таблица 5. Противопаркинсоническая активность оптических изомеров диола на модели ПС, вызванного однократным введением МФТП___

Показатель Агент Двигательная активность Время активности (сек) Дистанция (см) Скорость движения (см/с) Количество вертикальных стоек Количество исследованных отверстий

контроль 84Д ± 1.9 *** 58,3 ±3,9 *** 276,8 + 27,8*« 23 ±0,2 ** 15,6 + 3,28 6,5 ± 1,3

МФТП 50,6 ±8,1 27,8 ±4,8 107,8 ± 20,6 0,9 ±0,2 2,6 ±0,8 2,8 ±0,9

МФТП + VI 78,6 ±5 ** 64,0 ±5,5 *** 332,6 ± 39,6*** 2,7 ±0,3 **+ 13,1 ±2,5 *** 3,2 ±0,9

МФТП + XI 57,9 ±6,0 34,9 ±4,3 147,8 ± 20,3 1,13 ± 0,2 4,4 ±1,4 2,5 ±0,9

* Р < 0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001 по сравнению с группой МФТП

Таким образом, показано, что абсолютная конфигурация диола оказывает решающее влияние на его противопаркинсоническую активность в тесте с МФТП, от практически полного устранения до резкого усиления симптомов ПС. На основе

9 10

Рисунок 5.

проведенного исследования был сделан вывод о перспективности дальнейших исследования соединения II (диола) в качестве агента для лечения БП, так как он, с одной стороны, на 85% состоит из наиболее активного стереоизомера (VI) и на 15% из изомера, обладающего тенденцией к проявлению противопаркинсонической активности (XI), а с другой, обладает широкой ресурсной базой (то есть может быть синтезирован из отечественного скипидара с природной оптической чистотой).

Таблица 6. Противопаркинсоническая активность оптических изомеров диола на

модели ПС, вызванного однократным введением МФТП.

Показатель \гент Общая двигательная активность Двигательная активность (сек) Дистанция (см) Скорость движения (см/с) Количество вертикальных стоек Количество исследованных отверстий

контроль 84,1 + 1,9 *** 58,3 ±3,9 *** 276,8 + 27,8** 2,3 ±0,2 ** 15,6±ЗД8 ** 6,5 ± 1,3 ***

МФТП 71,8 ±6,4 47,9 ±4,5 218,1 ±6,2 1,8 ±0,2 8,9 ± 1,5 1,9 ±0,5

МФТП + УП 64,9 ±8,7 45,5 ±8,2 212,4 ±8,7 1,7 ±0,4 3,5 ± 1,0 4,0 ±1,3

МФТП + ХП1 80,2 ±6,2 * 55,6 ±6,9 245,9 ± 34,6* 1,2 ±0,2 14,4 ±3,6 ** 3,11 ±0,6 *

* Р < 0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001 по сравнению с группой МФТП

Таблица 7. Противопаркинсоническая активность оптических изомеров диола на модели ПС, вызванного однократным введением МФТП.

Указатель Агент Общая двигательная активность Двигательная активность (сек) Дистанция (см) Скорость движения (см/с) Количество вертикальных стоек Количество исследованных отверстий

контроль 83,0 ±2,36 *** 75,9+1,2 *** 417,1 + 21,2** 3,43 ±0,2 ** 17,6 ±5,4 5,4 ± 1,0

МФТП 69,9 ±4,7 46,8 ±4,4 211,8 ± 9,1 1,7 ±0,3 11,3 ±3,8 6,3 ± 1,8

МФТП + X 65,5 ±8,8 46,9 ±6,0 158,8 ±2,7 1,3 ±0,3 3,9 ±1,4 4,7 ±2,1

МФТП+ III 77,4 ± 8,2 55,7 ±7,4 253,3 ± 8,1 2,1 ± 0,3 8,1 ± 1,6 10,3 ±1,0

МФТП +ХП 82,4 ±5,8 56,6 ± 6,2 257,7 ±6,6 2,1 ± 0,3 8,1 ±2,0 7,9 ± 1,6

МФТП+ IX 28,5 ±10,1 * 15,0 ±5,4 *** 55,9 ±20,9 *** 0,4 ±0,2 ** 0,9 ±0,6 * 1,7 ±0,6 *

*Р< 0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001 по сравнению с группой МФТП

Следующие эксперименты направлены на более углубленное изучение противопаркинсонической активности перспективного агента - диола.

Влияние диола на развитие экстрапирамидных нарушений в модели ПС. вызванного введением МФТП. В предыдущих сериях экспериментов на крысах показано влияние диола на развитие олигокинезии, вызванной введением МФТП. В последующих сериях исследовалась способность диола ослаблять такие проявления ПС, вызванные введением нейротоксина, как ригидность, наличие и выраженность тремора, пилоэрекции и слюнотечения.

Исследуемый агент оказал положительное коррелирующее действие на вегетативные нарушения, развитие тремора и ригидности, вызванных введением МФТП. Тремор и ригидность у крыс развивались сразу после применения МФТП и были характерны для всех животных, кроме контрольной группы. Применение диола значительно снижало проявления ригидности и тремора у животных с индуцированным ПС (таб. 8.). Кроме того, введение исследуемого агента полностью устраняло проявления саливации, а также уменьшало процент животных в группе с развившейся пилоэрекцией

Таблица 8. Влияние диола на развитие паркинсонических симптомов, вызванных ___введением МФТП_

Группы Проявления ПС

тремор ригидность (ср. балл) саливация пилоэрекция

(ср. балл) (ср. балл) (% в группе)

контроль 0 0 0 0

МФТП 1,6 1 2,75 100

МФТП + диол 0,25 0,38 0 20

Исследование противопаркинсонической активности диола на модели ПС. вызванного десятидневным введением МФТП с сравнении с эталонным препаратом леводопой. Известно, что развитие паркинсонического синдрома может заканчиваться летальным исходом, поэтому критерий выживаемости является одним из существенных показателей динамики развития заболевания (Лукьянова с соавт., 2007). В следующей серии экспериментов мышам линии С57В1/6 в течение 10 дней внутрибрюшинно вводили МФТП в дозе 20 мг/кг. Показано, что в группе животных, которым вводили только нейротоксин, число погибших к концу эксперимента составило 60%, а в группе животных, которым на фоне интоксикации МФТП в течение 10 дней вводили диол в дозе 20 мг/кг - только 10 % (таб. 9.).

Таблица 9. Исследование противопаркинсонической активности диола при десятидневном введении МФТП._

Контроль физ. р-р Контроль, МФТП 30 мг/кг МФТП 30 мг/кг + диол 20 мг/кг МФТП 30 мг/кг + леводопа 20 мг/кг

Летальность, % 0 60 10 20

Отметим, что диол превосходил в этом тесте по эффективности «золотой стандарт» лечения болезни Паркинсона - препарат леводопа, вводимый в дозе 20 мг/кг. Гибель животных под влиянием леводопы составила 20%. Таким образом, курсовое применение исследуемого диола существенно, чем леводопа, снижало смертность мышей в динамике развития Паркинсонического синдрома.

Исследование профилактического действия диола при однократном введении МФТП. Определяли возможность применения данного агента в качестве профилактического средства, для предотвращения развития симптомов болезни Паркинсона. Для этого животным вводили исследуемый агент в течение 10 дней в дозе 20 мг/кг и на 11 сутки моделировали ПС, посредством введения нейротоксина МФШ. Результаты показали, что такая схема введения диола не оказывает влияния на проявление экспериментального ПС, не изменяя показатели двигательной активности и эмоционального статуса животных по сравнению с группой, которой вводили

МФТП. (таб. 10.). Таким образом, введение диола в дозе 20 мг/кг не оказывает профилактического действия в предотвращении развития симптомов БП.

Таблица 10. Показатели двигательно-исследовательской активности при

Показатель Общая Двигательная Дистанция Скорость Количество Количество

двигательная активность (см) движения вертикальных исследованных

Агент активность (сек) (см/с) стоек отверстий

контроль 80,3 + 2,5 69,7+2,4 347,5 + 3,0 + 0,2 14,6 + 1,8 4,6+0,9

*** *** 20,5»* •* •**

МФТП 50,6 ±8,1 27,8 ±4,8 107,8 ±0,6 0,9 ±0,2 2,6 ±0,8 2,8 ±0,9

МФТП + 47,4 ±7,9 32,4 ±9,5 106,8 ±3,6 0,8 ± 0,2 2,0 ±1,3 1,9 ±0,8

диол

180 мин

**Р<0,01; ***Р<0,001 по сравнению с группой МФТП Ниже представлены результаты тестов, рекомендованных руководством по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ, чтобы подтвердить обнаруженную противопаркинсоническую активность диола.

Влияние диола на развитие каталепсии, вызванной трифтазином. Трифтазин является типичным нейролептиком - производным фенотиазина, обладает выраженным дофаминблокирующим и слабым адренолитическим действием, способствует развитию лекарственного паркинсонизма. В больших дозах трифтазин вызывает отчетливые экстрапирамидные расстройства (Машковский, 2005), в результате которых у экспериментальных животных развивается каталепсия.

Рисунок 6. Влияние диола на продолжительность каталепсии,

вызванной трифтазином

В наших исследованиях показано, что диол уменьшает продолжительность каталепсии, вызванной введением трифтазина, тем самым предотвращая развитие экстрапирамидных расстройств (рис.6.). В то время как эталонный препарат леводопа замедляет развитие каталепсии, но полностью не устраняет каталепсического эффекта трифтазина (рис. 6).

Влияние диола на развитие каталепсии, вызванной галоперидолом. Галоперидол - нейролептик, производное бутиферона, вызывает блокаду постсинаптических 02-дофаминовых рецепторов, проявляет центральное а-адреноблокирующее действие, нарушая процесс обратного нейронального захвата и депонирование адреналина, но практически не влияет на холинергическую активность (Харкевич, 2005). Наиболее частыми побочными эффектами галоперидола являются развитие лекарственного паркинсонизма и экстрапирамидных расстройств, вызывающих каталепсию у животных (Mohajjel Nayebi, 2010).

трифтазин 2 мг/кг

—*—трифтазин* диол 20 мг/кг

— трифтази н + леводопа 20 мг/кг

время

И галоперидол 1,5 мг/кг мин мин мин мин мин

■ галоперидол 1,5 мг/кг + диол20 мг/кг _ время

В галоперидол 1,5 мг/кг В галоперидол 1,5 мг/кг + диол 20 мг/кг Рисунок 7. Влияние диола на продолжительность Рисунок В. Процент каталептических каталепсии, вызванной галоперидолом животных в группе.

Исследуемый диол практически полностью предотвращает развитие каталепсии, вызванной галоперидолом, проявляющейся в значительном снижении общей продолжительности каталепсии у животных (рис. 7.), сокращении периода действия галоперидола и уменьшении процента животных с каталепсией (рис. 8.).Таким образом, полученные результаты доказывают, что диол оказывает потенцирующее действие на дофаминергическую систему головного мозг.

Исследование противопаркинсонической активности в методах, основанных на активации холинергической системы.

Рисунок 9. Влияние диола на продолжительность ареколинового тремора (***р<0,001 по сравнению с группой ареколина).Влияние диола на развитие тремора, вызванного ареколином.

В результате исследования выявили, что диол в дозе 20 мг/кг достоверно уменьшает продолжительность судорог, вызванных м-холиномиметиком ареколином, проявляя М-холинолитическое действие (рис. 9.).

Основываясь на полученных данных, можно предположить, что одним из возможных щ кош-роль - ареколин 25 мг/кг механизмов воздействия диола на центральную

Г* арена-!;:» 25 мг/кг + диол 20 мг/кг -

15- нервную систему является его блокирующее влияние

на мускариновые рецепторы.

Влияние диола на развитие тремора, вызванного никотином. Диол в дозе 20 мг/кг уменьшал процент гибели животных, в 2,2 раза, снижая токсическое действие никотина (таб. 11.). Этот факт может служить подтверждением его I антагонистических свойств по отношению к никотиновым холинорецепторам.

20 I

Таблица 11. Влияние диола на летальность Таким образом, диол

одномоментно оказывает воздействие на разные нейромедиаторные системы головного мозга, проявляя

дофаминомиметический, М- и Н-холинолитический эффект. Данные свойства подтверждают проявление высокой противопаркинсонической активности диола.

Исследование взаимодействия диола с йохимбином. Известно, что вещества, не являющиеся ингибиторами фермента МАО-B, усиливают токсичность йохимбина у мышей (Машковский, 1983). Также усиление йохимбиновой токсичности у мышей выявляет адренергический компонент в фармакологической активности исследуемого агента (Lapin, 1980).

Таблица 12. Влияние диола на токсический эффект С целью уточнения

йохимбина проявления диолом

противопаркинсонической активности проведены специальные исследования по взаимодействию последнего с йохимбином. На основании этих экспериментов установлено, что диол потенцирует действие йохимбина, увеличивая процент летальности животных (таб. 12.). Данные исследования подтверждают, что диол не является ингибитором МАО-В и проявляет, именно, противопаркинсоническую активность.

Исследование противопаркинсонической активности диола в длительном эксперименте. Влияние диола на содержание дофамина в стриатуме головного мозга крыс.С целью изучения лечебного действия диола в дозе 20 мг/кг проведены исследования при длительном введении (в течение 30 дней) на крысах линии Вистар в сравнении с референс препаратом леводопой.

Таблица 13. Противопаркинсоническая активность диола на модели ПС, в длительном (30 дней) эксперименте._____

Показатель Агент ^v^ Общая двигательная активность Двигательная активность (сек) Дистанция (см) Скорость движения (см/с) Количество вертикальных стоек Количество исследованных отверстий

контроль 81,5 ±2,2 * 77,3 ±3,3 ** 424,8 + 28,5** 3,5 ± 0,2 * 10,1+0,7 6,5 ± 1,3 ***

МФТП 66,4 ±5,8 52,4 ± 7,7 264,6 ± 50,0 2,16 ±0,4 6,5 ±2 1,5 ±0,7

МФТП + диол 77,2 ±4,0. * 68,0 ±3,5 * 360,3 ± 29,4** 2,94 ±2,0 * 9,2 ±1,2 .2,4 ±0,7

МФТП + леводопа 73,4 ±4,1 * 63,2 ± 5,2 * 320,9 ± 33,6* 1,6 ±0,3 * 7,1 ± 1,7 2 ±0,9

Диол 72,9 ± 3,2# 65,1 ±3,2 343,1 ±3,6 2,8 ±0,2 8,6 ± 1,7 1,9 ± 0,5##

леводопа 72,7 ± 3,5# 62,4 ± 3,6# 329,7 ± 24,7# 2,7 ±0,2 8,7 ± 1,8 1,7 ± 0,5##

* Р < 0,05; **Р<0,01; по сравнению с гр. МФТП; # Р < 0,05; П Р<0,01; по сравнению контрольной гр.

Исследование противопаркинсонической активности. Эффективность противопаркинсонической активности и диола в сравнении с эталонным препаратом

животных в тесте «никотиновая токсичность»

Гибель животных в %

контроль - никотин никотин + диол 20 мг/кг

56 25

Гибель животных в %

контроль - йохимбин йохимбин + диол 20 мг/кг

40 80

леводопа оценивали по изменению двигательной и исследовательской активности в установке Tru Scan на 30-й день эксперимента. Диол, аналогично препарату сравнения леводопе, снимал проявления олигокинезии и восстанавливал показатели двигательной активности, но при этом не оказывал влияния на исследовательскую активность (таб. 13.), проявляя аналогичную леводопе противопаркинсоническую активность. Полученные данные еще раз подтверждают, что исследуемый нами диол действует однонаправлено с леводопой и, вероятно, способствует восполнению утраченного дофамина, тем самым снимая проявления ПС.

Влияние диола на содержание дофамина в стриатуме головного мозга крыс в длительном (30 дней) эксперименте. С помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией было установлено, что введение нейротоксина МФТП в течение 30 дней снижало содержание дофамина в стриатуме более чем в 2 раза (рис. 10.). При длительном введении диол на фоне МФТП, аналогично леводопе, значительно ослаблял действие нейротоксина, вызывающего снижение содержания дофамина в стриатуме головного мозга крыс.

Рисунок 10. Содержание дофамина в стриатуме (*р<0,05 по сравнению с контрольной гр.; # р<0,05 по сравнению с группой МФТП).

Известно, что

дегенерация дофаминергических нейронов черной субстанции головного мозга, являющаяся основной причиной развития

паркинсонизма, приводит к дисбалансу дофаминергической и

холинергической медиаторкых Ш МФТП ш МФ1Т1 + леводопа 20 мг/кг систем головного мозга (Savitt et al., 2006). Полученные нами данные также подтверждают, что возможным механизмом действия диола, вероятно, является восстановление баланса между упомянутыми нейромедиаторными системами головного мозга.

Анальгетическая активность диола. Анальгетическая активность была изучена на модели химического болевого раздражения - «уксусные корчи» (УК), и моделях термического болевого раздражения - «горячая пластина» и «отведение хвоста» (ГП и ОХ).

Таблица 14. Анальгетическая активность диола в дозе 10 мг/кг.

Горячая пластина (время, сек.) Отдергивание хвоста (время, сек) Уксусные корчи (кол-во)

контроль диол контроль диол контроль диол

21,37 + 1,15 15,75 ±2,75 4,99 + 0,75 5,68 + 0,87 12,75 + 0,65 8,25+ 1,33**

•е-

§

16000 -■/ 14000 12000 10000 8000 " 6000 4000-К

2000 к

о

соджержание дофамина в стриатуме крыс Ц контроль Ц МФТП + диол 20 мг/кг

**р<0,01 относительно контроля

Исследование анальгетической активности диола показало, что данный агент в дозе 10 мг/кг проявил селективную анальгетическую активность только в тесте на висцеральную боль, достоверно уменьшая количество уксусных корчей (таб. 14).

Однако стоит отметить тенденцию к усилению ноцицегщии в моделях термического болевого раздражения.

Влияние диола на жизненно важные органы и системы в длительном эксперименте.

Влияния на общие физиологические показатели животных.Введеше агента в дозе 20 мг/кг (аналогично референс препарату леводопе) не оказывало существенного влияния на состояние и поведение животных. На протяжении всего периода введения диола внешний вид, потребление воды и пищи, состояние кожного и шерстного покровов, слизистых оболочек крыс опытных групп, за исключением группы МФТП, не отличались от интактного контроля. У животных в группе, получавшей инъекции МФТП отмечалась ярко выраженная пилоэрекция, и мелкоамплигудный тремор на протяжении всего эксперимента. В период введения агента не отмечено статистически значимых различий в динамике массы тела подопытных крыс всех групп по сравнению с этими же показателями в контроле. Прибавка в весе была равномерной во всех группах. В течение опыта не было отмечено колебаний средней температуры тела ни в опытных, ни в контрольных группах. Исследуемые соединения не оказывают влияния на артериальное давление и на электрофизиологические параметры сердца крыс. Таким образом, ежедневное внутрижелудочное введение диола, в дозе 20 мг/кг не вызвало интоксикации животных, изменения их состояния и поведения, не оказало заметного патологического влияния на такие интегральные показатели, как температура и масса тела.

Влияние диола на показатели периферической крови.В результате анализа показателей периферической крови установлено, что в течение всего опыта в каждой группе крыс имели место колебания отдельных показателей, которые, однако, не выходили за пределы физиологической нормы для данного вида животных (Даренская и соавт., 2004).

Анализ лейкоцитарной формулы крови, проведенный через 30 дней от начала введения, показал отсутствие статистической разницы в клеточном составе между опытными и контрольными животными.

Таким образом, в результате гематологического исследования не было выявлено значимых изменений в картине периферической крови под влиянием длительного введения диола в дозе 20 мг/кг, как и в других группах животных.

Влияние длительного введения диола на функцию печени оценивали по активности её основных ферментов-маркёров в сыворотке крови.

Сравнительный анализ биохимических показателей крови исследуемых агентов показал небольшие колебания, которые являются физиологичными (Даренская и соавт., 2004) и показывают на отсутствие токсического воздействия исследуемого диола на функцию печени.

Результаты макро- и микроскопического исследования влияния длительного (30 дней) введения диола. На основании проведенного патоморфологического исследования показано, что длительное (30 дневное) введение диола в терапевтической дозе ( 20 мг/кг) не оказывает токсического воздействия на функции жизненно важных органов - печень, почки, сердце.

выводы.

1. В результате фармакологического скрининга было выбрано перспективное производное пара-менганового рада (диол), проявляющее высокую противопаркинсоническую и противосудорожную активность. Установлено, важным условием для проявления противосудорожной активности является наличие двух гвдрокси-групп и 8,9-двойной связи в структуре соединения.

2. Установлено, что диол проявляет выраженный М- и Н-холинолитический, дофаминомиметический и анальгетический эффект, а так же блокирует развитие гипнотического действия снотворного препарата.

3. Впервые показано, что диол при различной длительности введения (однократном, трехдневном, десятидневном и 30-и дневном) проявляет высокую противопаркинсоническую активность в дозе 20 мг/кг, аналогичную препарату сравнения леводопе.

4. Впервые установлено, что абсолютная конфигурация диола оказывает решающее влияние на его противопаркинсоническую активность (от практически полного устранения до резкого усиления симптомов экспериментального паркинсонического синдрома).

5. Установлено, что внутрижелудочное введение диола крысам в течение 30 дней в дозе 20 мг/кг не вызывает токсических изменений в жизненно важных органах и системах.

6. Основаваясь на вышеизложенном, диол может быть предложен в качестве перспективного политаргетного препарата для расширенного доклинического исследования.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Конева Е.А., Волчо К.П., Салахутдинов Н.Ф., Долгих М.П., Толстикова Т.Г., Болкунов AB., Морозова Е.А., Павлова AB. Противосудорожное средство // Патент № 2370260, 2009. -Бюл. № 29

2. Толстикова Т.Г., Морозова Е.А., Павлова AB., Болкунов A.B., Долгих М.П., Конева Е.А, Волчо К.П., Салахутдинов Н.Ф., Толстяков Г.А Производные аминокислот пинанового ряда - новые противосудорожные агенты // Доклады академии наук. - 2008. - Т. 422. - № 4. - С. 490-492.

3. Khomenko Т.М., Toistikova T.G., Bolkunov AV., Dolgikh M.P., Pavlova A.V., Korchagina D.V., Volcho K.P., Salakhutdinov N.F. 8-(TrifluoromethyI)-l,2,3,4,5-benzopentathiepin-6-an)ine: novel aminobenzopentathiepine having m vivo anticonvulsant and anxiolytic activities // Lett. Drag Design & Discovery. - 2009. - Vol. 6. - № 6. - P. 464-467

4. Толстикова Т.Г., Павлова A.B., Долгих М.П., Ильина И.В., Ардашов О.В., Волчо К.П., Салахутдинов Н.Ф., Толсгиков Г.А Новый противосудорожный агент (4S,5R,6R)-«úpa-менга-1,8-диен-5,6-диол // Доклады академии наук. - 2009. - Т. 429. - № 1. - С. 139-141.

5. Толсгакова Т. Г., Павлова А. В., Волчо К. П., Ильина И. В., Ардашов О. В. Производные ментадиола - новая группа высокоэффективных противосудорожных средств // Тезисы дошщов «V Международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». - Украина. - Крым. - Судак. - 2009. - С 222-223.

6. Толстикова Т. Г., Павлова А В., Волчо К. П., Ильина И. В., Ардашов О. В. (4S,5R,6R)-napa-Мента -1,8-диен-5,6-диол - перспективный агент для разработки иротивопаркинсонических средств // Тезисы докладов научной конференции «Медицинская геномика и протеомика». -Новосибирск. -2009. ~С. 79.

7. Толстикова Т. Г., Павлова А. В., Волчо К. П., Ильина И. В., Ардашов О. В З-метил-6-(пропен-1-ен-2-ил)-щпслогексен-Зч;н-1Д-диол - новый высокоэффективный

противосудорожный агент // Тезисы докладов научной конференции «Медицинская геномика и протеомика». - Новосибирск. - 2009. - С. 139.

8. Павлова А.В. Толстикова Т.Г., Волчо К.П. (48,5К,611)-иа/и-Мента -1,8-диен-5,6-диол -первспективный агент для разработки противопаркинсонических средств // Сборник тезисов VI Международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». - Украина. - Крым. - Судак. - 2010. - С 227-228.

9. Павлова А. В., Толстикова Т. Г., Волчо К. П., Ильина И. В., Ардашов О. В., Шишкина Г.Т., Дыгало Н.Н. Диол - новый высокоэффективный противопаркинсонический агент // Тезисы докладов научной конференции «Фундаментальные науки - медицине». - Новосибирск. -

2010.-С. 30.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

АД - аретриальное давление АЛТ - аланинаминспрансфераза ACT - аспартатаминотрансфераза БП - болезнь Паркинсона ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ГАМК - гамма-аминомасляная кислота ГП - горячая пластина ДА-дофамин

МДА - малоновый диальдегид МФП+ -1 -метил-4-фенилпиридиний

МФТП- 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-

тетрагидропиридин

НПВС - нестероидные

противовоспалительные средства

ОХ - отдергиваше хвоста

ПС - паркинсонический синдром

УК - уксусные корчи

ЦНС - центральная нервная система

ЧСС - частота сердечных сокращений

ЩФ - щелочная фосфатаза

Формат бумаги 60x841/16

Объем 1,6 печ. л. Тираж 100 экз.

Отпечатано на ротапринте Новосибирского института органической химии им. H.H. Ворожцова СО РАН. 630090, г. Новосибирск, пр. Лаврентьева, 9.

Актуальность проблемы.

Болезнь Паркинсона (БП) — второе по частоте после болезни Альцгеймера нейродегенеративное заболевание позднего возраста, которое встречается во всех человеческих популяциях мира. Его распространенность составляет 1-2% среди лиц старше 50 лет (КоггеП et а1., 2005). Актуальность проблемы БП возрастает в связи с неуклонным старением населения в мире. Согласно последнему прогнозу Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в последующие два десятилетия в развитых странах до 20% населения станет старше 65 лет. Это неизбежно приведет к увеличению числа больных паркинсонизмом (Полевая с соавт., 2004). Следует подчеркнуть, что, не смотря на традиционные представления о «возрастозависимом» характере БП, молодые случаи уже давно не являются редкостью: считается, что каждый десятый пациент заболевает БП до 50 лет, а каждый двадцатый - до 40.

Как известно, в соответствии с нейрохимическими механизмами развития болезни Паркинсона лекарственное лечение паркинсонизма заключается в активации дофаминергических, блокаде глутаматергических и холинергических влияний. Необходимо подчеркнуть, что все применяемые на практике средства для лечения БП, не обладают этиотропными свойствами, а лишь ослабляют или устраняют проявления заболевания на время приема. Медиаторные механизмы, на которые воздействуют противопаркинсонические препараты, вовлечены в регуляцию широкого спектра психических и висцеральных процессов, что является причиной развития серьезных побочных эффектов при длительной (пожизненной) терапии болезни Паркинсона (Иллариошкин, 2008).

Таким образом, вполне очевидны высокая медицинская и социальная значимость данной патологии и то исключительное внимание, которое уделяется БП в современной нейрофармакологии. Однако, несмотря на 5 наличие достаточного ассортимента фармпрепаратов, важную роль отводят разработке малотоксичных и высокоэффективных, полученных на основе растительного сырья лекарственных средств.

Достаточно упомянуть, что более половины низкомолекулярных лекарственных средств, созданных с 1981 по 2006 гг., так или иначе связаны с природными метаболитами (Newman, 2008). Известно, что терпеновые соединения, выделенные из растений, обладают широким спектром биологического действия, что делает их перспективными для поиска новых лекарственных препаратов. Наиболее изученными свойствами этих соединений являются болеутоляющие, противовоспалительные, антимикробные, противогрибковые, противовирусные, гипотензивные, противоопухолевые, седативные, спазмолитические и др. (Galeotty et al., 2002; Grodnitzky et al., 2002; Murakami et al., 2004; Han, 2005). Сравнительно недавно появились данные о влиянии монотерпеноидов на центральную нервную систему, а именно на ГАМКергическую и холинергическую систему мозга (Miyazawa et al., 1997; Hall et al., 2004; Silva et al., 2009), описаны их нейропротективные свойства (Chang et al., 2007).

В Новосибирском институте органической химии СО РАН синтезированы гидрокси производные соединения ияря-ментанового ряда на основе широко распространенного в природе монотерпеноида (-)-вербенола.

Как известно, вербенол представляет большой интерес как вещество, обладающее в том числе и нейропротективной активностью (Chang et al., 2007). В этой связи, было принято решение провести углубленное исследование фармакологической активности новых производных, полученных на основе вербенола.

Целью данной работы является изучение кислородсодержащих производных иаря-ментанового ряда, полученных на основе вербенола, на противопаркинсоническую активность. Проведение расширенного фармакологического исследования для наиболее перспективного агента. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить противопаркинсоническую активность новых кислородсодержащих производных иара-ментанового ряда на модели паркинсонического синдрома, вызванного системным введением МФТП, а также противосудорожную активность. Выбрать наиболее перспективный агент для дальнейших исследований.

2. Оценить влияние наиболее перспективного агента кислородсодержащих производных газра-ментанового ряда (диола) на холинергическую и дофаминергическую нейромедиаторные системы головного мозга.

3. Исследовать противопаркинсоническую активность диола при однократном и длительном способах введения.

4. Определить зависимость противопаркинсонической активности от абсолютной конфигурации химической структуры диола.

5. Оценить влияние длительного введения диола на жизненно важные органы и системы организма животных.

Научная новизна работы.

В настоящей работе впервые обнаружена группа кислородсодержащих производных монотерпенового ряда перспективных в качестве противосудорожных, противопаркинсонических, анальгетических агентов.

Среди кислородсодержащих производных иа/?а-меитанового ряда выявлен низкотоксичный политаргетный агент - диол, обладающий одномоментно противопаркинсонической, противосудорожной и анальгетической активностью. Его противопаркинсоническое действие, вероятно, обусловлено дофаминомиметическими и холинолитическими свойствами, способствующими восстановлению нарушенного баланса между 7 дофаминергической и холинергической медиаторными системами головного мозга. Впервые показана зависимость степени выраженности противопаркинсонической активности от абсолютной конфигурации химической структуры диола.

Научно-практическая ценность работы.

Диол предложен в качестве низкотоксичного полифункционального средства для лечения паркинсонического синдрома, не уступающего по противопаркинсонической активности существующим средствам дофаминзамещающей терапии и выгодно отличающийся от других средств, наличием обезболивающего и противосудорожного действия.

Положения, выносимые на защиту.

1. Выявлен новый высокоактивный противопаркинсонический агент среди производных ш/?а-ментанового ряда - диол.

2. Установлена связь противопаркинсонического действия диола с пространственным строением соединения.

3. Противопаркинсоническое действие агента обусловлено влиянием на дофаминергическую и холинергическую системы головного мозга.

4. Диол - низкотоксичный, полифункциональный агент, обладающий противосудорожным и анальгетическим эффектом.

5. Диол не обладает токсическим воздействием на организм животных и может быть предложен в качестве перспективного политаргетного препарата для расширенного доклинического исследования.

Апробация результатов. Основные результаты работы были представлены на «5-м Международном междисциплинарном конгрессе

Нейронаука для медицины и психологии» (Украина, Крым, Судак, 2009г), ежегодной конференции «Медицинская геномика и протеомика»,

Новосибирск, 2009), дважды на «Конкурсе молодых ученых НИОХ СО РАН» 8

Новосибирск, 2008, 2009гг.), на «6-м Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Украина, Крым, Судак, 20 Юг), на ежегодной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 4 - в журналах, рекомендованных перечнем ВАК.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 08-03-13516-офиц «Создание новых низкодозных малотоксичных противоэпилептических агентов на основе растительных метаболитов» (2008-2009); программ Президиума РАН: «Фундаментальные науки - медицине», «Разработка низкодозных антиаритмических и гипотензивных препаратов на основе комплексов растительных гликозидов» (2008, 2009). Междисциплинарных проектов СО РАН: № 54 -«Научные основы разработки новых лекарственных препаратов. Перспективы использования возобновляемого сырья»; № 93-«Развитие исследований в области медицинской химии и фармакологии как научной основы разработки отечественных лекарственных препаратов».

Структура и объем работы.

выводы.

1. В результате фармакологического скрининга было выбрано перспективное производное гсара-ментанового ряда (диол), проявляющее высокую противопаркинсоническую и противосудорожную активность. Установлено, важным условием для проявления противосудорожной активности является наличие двух гидрокси-групп и 8,9-двойной связи в структуре соединения.

2. Установлено, что диол проявляет выраженный М- и Н-холинолитический, дофаминомиметический и анальгетический эффект, а так же блокирует развитие гипнотического действия снотворного препарата.

3. Впервые показано, что диол при различной длительности введения (однократном, трехдневном, десятидневном и 30-и дневном) проявляет высокую противопаркинсоническую активность в дозе 20 мг/кг, аналогичную препарату сравнения леводопе.

4. Впервые установлено, что абсолютная конфигурация диола оказывает решающее влияние на его противопаркинсоническую активность (от практически полного устранения до резкого усиления симптомов экспериментального паркинсонического синдрома).

5. Установлено, что'внутрижелудочное введение диола крысам в течение 30 дней в дозе 20 мг/кг не вызывает токсических изменений в жизненно важных органах и системах.

6. Основаваясь на вышеизложенном, диол может быть предложен в качестве перспективного политаргетного препарата для расширенного доклинического исследования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Паркинсонизм - хронический прогрессирующий нейродегенеративный синдром, характеризующийся двигательными расстройствами, такими как гипокинезия, тремор и ригидность мышц; нарушениями вегетативной регуляции и умственной деятельности вследствие поражений экстрапирамидной системы (Голубев с соавт., 1999).

По данным Всемирной организации здравоохранения, различными формами паркинсонизма страдает более 3,7 млн человек, а ежегодно регистрируется более 300 тысяч случаев. Принимая во внимание, что заболевание представляет проблему не только для самого пациента, но и для его близких, которые несут дополнительные экономические и социальные нагрузки, то актуальность болезни Паркинсона очень высока.

В основе заболевания лежит дегенерация дофаминергических нейронов черной субстанции и снижение уровня дофамина в базальных ганглиях. Помимо этого в патогенезе заболевания имеют значение относительный избыток ацетилхолина и глутамата, а также недостаточный синтез норадреналина и серотонина.

В лечении БП можно выделить два основных направления: нейропротекция и симптоматическая терапия. Целью нейропротекции является замедление дегенерации нейронов головного мозга. Исходя из известных в настоящее время механизмов развития БП, в качестве нейропротекторов изучаются препараты, действие которых направлено на уменьшение окислительного стресса, токсического действия глутамата и стимуляцию нейротрофических процессов. Согласно экспериментальным данным, нейропротекторными свойствами обладают ингибиторы моноаминооксидазы типа В (МАО-B), амантадины и агонисты дофаминовых рецепторов (Hall et al., 1996;).

Наиболее разработанным направлением лечения БП является симптоматическая терапия. Поскольку основные проявления заболевания

89 связаны со снижением содержания дофамина в базальных ганглиях, лечение должно быть нацелено на повышение активности дофаминергической системы. По общему мнению, заместительная терапия леводопой является общепринятым «золотым стандартом» лечения болезни Паркинсона (в том числе в связи с тем, что уменьшение симптоматики паркинсонизма на фоне приема леводопы является одним из критериев, подтверждающих диагноз болезни Паркинсона). Леводопа - биологический предшественник нейромедиатора дофамина, дефицит которого лежит в основе основных клинических проявлений болезни Паркинсона (Goole, 2009). В дополнение к заместительной терапии для повышения активности дофаминовой системы головного мозга применяются лекарственные средства следующих групп:

• Агонисты дофаминовых рецепторов (АДР) — непосредственно стимулируют рецепторы дофамина (Suchowersky et al., 2006).

• Ингибиторы МАО-B - уменьшают распад дофамина в синапсах (Maraganore et al., 2005).

• Ингибиторы катехол-О-метилтрансферазы (КОМТ) - уменьшают периферическое разрушение леводопы, удлиняют период ее полужизни в плазме крови (Savitt et al., 2006).

Кроме дофаминергических препаратов в лечении БП используются средства, подавляющие избыточную холинергическую активность: холинолитики и снижающие активность глутаматергической системы — препараты амантадина (Иллариошкин, 2008).

Стандартная терапия БП, проводимая с применением препаратов леводопы, позволяет продлить активную жизнь пациентов и увеличить продолжительность их жизни (Olanow et al., 2004). Недостатками содержащих леводопу препаратов являются (Иллариошкин, 2004): 1) при первичном назначении препарат высокоэффективен только у 1/3 пациентов и менее эффективен еще у Г/3, остальные либо не переносят препарат, либо не испытывают никакого эффекта; 2) наличие большого количества побочных

90 эффектов (анорексия, рвота, тахикардия, дискенизия, возникающая почти у 80% пациентов, психические нарушения и т.д.); 3) колебания реакции на препарат, заключающиеся во флуктуации двигательных симптомов (синдром «включения-выключения»); 4) через 3-4 года терапии эффективность леводопы часто снижается, вплоть до полной потери чувствительности.

Первоначально АДР были синтезированы в качестве дополнительного средства терапии развернутых стадий БП в комбинации с препаратами леводопы. Однако, как было показано в дальнейшем, данный класс препаратов является достаточно эффективными и часто используется в виде монотерапии на ранних стадиях заболевания, особенно у пациентов молодого возраста, ориентированных на многолетнюю перспективу противопаркинсонической терапии. Новая волна интереса к использованию АДР возникла в последние годы в связи с экспериментальными доказательствами нейропротекторного действия данных препаратов. Однако большое количество побочных эффектов требует весьма 'длительного наращивания общей суточной дозы препарата, что осложняет проведение противопаркинсонической терапии.

Применение ингибиторов МАО-B позволяет пролонгировать эффекты синаптического дофамина, в чем и состоит теоретическое обоснование использования данного класса препаратов при БП. Однако в связи с достаточно слабым симптоматическим эффенктом и недоказанностью нейропротекторного действия ингибиторы МАО-B стремительно теряют свою популярность.

Ингибиторы КОМТ практически не оказывают непостердственно противопаркинсонического эффекта. Данная группа препаратов была синтезирована для борьбы с осложнениями длительной терапии леводопой, реализация которой осуществляется за счет торможения катехол-О-метилтрансферазы — фермента, способствующего метилированию леводопы в периферических тканях.

Механизм действия холинолитических препаратов связан с восстановлением баланса между активностью холинергической и дофаминергической систем в стриатуме головного мозга. В настоящее время препараты этой группы применяются редко. Их назначение лимитируется большим количеством побочных эффектов.

Противопаркинсонический эффект амантадинов носит комплексный характер и основан на следующих свойствах: блокирование МуГОА-рецепторов глутамата, повышение синтеза дофамина в нигральных нейронах, усиление высвобождения и блокирование обратного захвата дофамина. Однако противопаркинсонический эффект у данных препаратов выражен слабо, поэтому их целесообразно назначать только в качестве дополнения к заместительной терапии леводопой.

Не смотря на разнообразие применямых проивопаркинсонических препаратов, терапевтические возможности все еще не позволяют с. достаточной эффективностью предотвращать дальнейшую дегенерацию дофаминергических нейронов и прогрессирование болезни. В связи с этим проблема разработки1 эффективных препаратов для терапии болезни Паркинсона и синдрома Паркинсонизма, обладающих минимальными побочными действиями, остается актуальной для фармакологов и специалистов медицинской химии.

Согласно известной точке зрения (КаБсо1, 2005) «идеальный» противопаркинсонический препарат должен обеспечивать:

1) контроль основных симптомов БП

2) предотвращение и/или контроль двигательных осложнений проводимого лечения

3) уменьшение выраженности немоторных симптомов БП

4) предотвращение (или как минимум замедление) прогрессирования болезни.

Ни одна из вышеописанных групп препаратов полностью не соответствуют данным требованиям, поэтому вопрос о создании «идеального» противопаркинсонического препарата остается открытым.

В данной работе представлены результаты углубленного изучения противопаркинсонической активности диола (гидроксипроизводного пара-ментанового ряда природного происхождения), выбранного среди кислородсодержащих производных шрз-ментанового ряда в результате скрининга на противосудорожную активность, как обладающего наиболее выраженным противосудорожным эффектом в тестах «коразоловая токсичность» и «никотиновая токсичность.».

При исследовании фармакологической активности диола было обнаружено, что он оказывает потенцирующее действие на дофаминовую систему головного мозга, вероятно являясь дофаминомиметиком. В дополнение к этому в тестах с ареколином и никотином он проявил антагонистические свойства по отношению к М- и Н- холинорецепторам. Совокупность вышеперечисленных свойств послужили основанием для изучения противопракинсонической активности диола.

Установили, что диол обладает выраженной противопаркинсонической активностью во всех проведенных экспериментах. Введение диола в дозе 20 мг/кг практически полностью устраняет олигокинезию, вызванную введением нейротоксина МФТП, а также препятствует развитию пилоэрекции и саливации. На фоне диола значительно снижается выраженность тремора и ригидности, вызванные введением нейротоксина МФТП. При этом его эффект развивается аналогично таковому препарата сравнения леводопы. А в тесте с десятидневным введением нейротоксина, критерием оценки которого явился процент гибели животных, диол превосходил по эффективности «золотой стандарт» лечения БП.

При исследовании противопаркинсонической активности в тридцатидневном эксперименте диол проявил выраженную противопаркинсоническую активность. Также установили, что данный агент действует однонаправлено с референс препаратом - леводопой, повышая уровень дофамина в стриатуме головного мозга крыс, уменьшая токсическое действие МФТП.

Противопракинсоническое действие диола подтвердили в экспериментах с нейролептиками трифтазином и галоперидолом, оказывающих блокирующее действие на Б2-до ф ам иновые рецепторы, что провоцирует развитие экстрапирамидных нарушений. Применение данных препаратов приводит к развитию лекарственного паркинсонизма. Диол полностью устранял развитие галоперидоловой каталепсии и сокращал продолжительность трифтазиновой каталепсии, что доказывает его противопаркинсоническую активность. Ещё одним доказательством проявления противопаркинсонической активности диола является отсутствие у него ингибирующего действия на МАО.

Кроме этого, для диола была обнаружена ещё и анальгентическая активность в тесте на висцеральную боль «уксусные корчи». Обнаруженные свойства являются большим плюсом, так как большинство больных БП испытывают боли, связанные с ригидностью и дискинезией мышц.

Безвредность диола была изучена в длительном эксперименте на крысах - животным ежедневно в течение 30 дней внутрижелудочно вводили агент. В результате эксперимента по показателям периферической крови, биохимического анализа крови, гистологического исследования внутренних органов крыс (легкие, сердце, печень и почки) доказано отсутствие токсического воздействия диола на жизненно важные органы крыс.

При исследовании острой токсичности было установлено, что 1Л35о диола составляет 4250 мг/кг при однократном внутрижелудочном введении для мышей, в то время как для леводопы при аналогичном способе введения

1Л)5о = 2363 мг/кг. что в ниже, чем леводопы. Снижение среднесмертельной дозы в 1,8 раза удовлетворяет ещё одному требованию, предъявляемому ко

94 всем лекарственным препаратам и позволяет увеличить широту его терапевтического действия.

Таким образом, проведенное углубленное исследование фармакологической активности диола показали его полифункциональность, проявляющуюся в одномоментом проявлении яркой противопаркинсонической активность, а также противосудорожного и анальгетического эффекта.

Диол - соединение растительного происхождения, обладает широкой ресурсной базой и его возможно синтезировать из отечественного скипидара (получаемого при переработке хвойных деревьев) с высокой природной чистотой. В то время как леводопа - препарат биогенного происхождения. В данной работе установили, что диол состоит на 85% из стереоизомера, единственного среди восьми исследовнных, проявившего достоверный противопаркинсонический эффект ' (восстанавливая двигательно-исследовательскую активность животных до уровня контрольных животных) и его зеркального оптического изомера, для которого была обнаружена тенденция к проявлению противопаркинсонической активности.

На основании вышеизложенного, диол можно рекомендовать для дальнейших доклинических испытаний в качестве нового противопаркинсонического средства.