Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Биотрансформация и фармакокинетика нового противопаркинсонического препарата гимантана

На правах рукописи

005013687

ЛИТВИН ЕВГЕНИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

БИОТРАНСФОРМАЦИЯ И ФАРМАКОКИНЕТИКА НОВОГО ПРОТНВОПАРКИНСОНИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ГИМАНТАНА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 м р Ж1

Москва-2012

005013687

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательском институте фармакологии имени В.В.Закусова" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИ фармакологии имени В.В.Закусова" РАМН)

Научный руководитель: Доктор биологических наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ

Жердев Владимир Павлович

Колыванов Геннадий Борисович

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории психофармакологии ФГБУ "НИИ фармакологии

имени В.В.Закусова" РАМН Гарибова Таисия Леоновна

Доктор биологических наук, главный эксперт лаборатории химико-фармацевтических препаратов № 2 испытательного центра ФГБУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения"

Минздравсоцразвития РФ Соколов Андрей Владимирович

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России

Защита диссертации состоится «_»_2012 г. в_час иа

заседании диссертационного совета Д. 001.024.01 на базе ФГБУ "НИИ фармакологии имени В.В. Закусова" РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомился в ученой части ФГБУ "НИИ фармакологии имени В.В. Закусова" РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8.

Автореферат разослан «_»_2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор Вальдман Елена Артуровна

Общаа характеристика работы

Актуальность проблемы

Болезнь Паркинсона-хроническоепрогрессирукмцеенейродегенеративное заболевание. По распространенности болезнь Паркинсоиа стоит на втором месте после болезни Альцгеймера, встречается примерно в 1% популяции старше 55 лет. Несмотря на наличие целого ряда противопаркинсонических препаратов, способных снижать симптоматику заболевания, поиск новых более эффективных средств патогенетической терапии остается актуальным.

В НИИ фармакологии имени В.В.Захусова РАМН в ряду производных 2-аминоадамантана было выявлено активное соединение N-2-адамантил-гексаметиленимина(гимантан) [Морозов И..С. и др. 2000]. В экспериментальных исследованиях показана его высокая активность на моделях паркинсонизма, превосходящая таковую препарата сравнения амантадина [Неробхова JI.H. и др., 2000; Вальдман Е.А. 2000, 2001; Вальдман Е.А., Воронина Т.А., 1999; Капица И .Г. и др. 2005]. Было показано, что гимантан имеет сходные с амактадином свойства неконкурентного низкоаффинного блокатора ионного канала NMDA рецепторов [Елшанская М.В. и др. 2001]. Наряду сэтим, был установлен ряд других компонентов механизма действия и спектра фармакологической активности гимантана, что, возможно, обеспечивает ему более высокую специфическую активность, установленную в эксперименте [Вальдман Е.А., 2001; Вальдман Е. А. и др. 2004; Абаимов Д.А. и др.; Зимин И.А. и др., 2010, Ковалев Г. И., 2007].

Фаршкокинетические исследования гимантана у экспериментальных животных методом радиоизотопной метки РН] показали, что препарат хорошо всасывается кз ЖКТ и очень медленно выводится из организма (период полувыведения составляет 360-402 ч, aero среднее время удерживания колеблется от 526 до 580 часов в зависимости от способа введения) [Петренко Е. С., 2003]. Метод радиоизотопной метки РН] не обладает достаточной селективностью, так как тритий может распределяться и в отдельных компонентах биологической матрицы. Это приводит к завышенным концентрациям определяемого вещества и, как следствие, к установлению завышенных величин фармакокинетических

3

параметров.

В опытно-технологическом отделе ФГБУ «Научно-исследовательского института фармакологии имени В. В. Закусова» РАМН (руководитель профессор Б.М. Пятин) была разработана лекарственная форма гимантана -таблетки по 0,05 г [Цветкова Е. А., Волкова М. Ю. и др., 2002]. Показано, что по фармакодинамическим и фармакокинетическим свойствам она полностью соответствует субстанции препарата.

Пилотное клиническое исследование гимантана проведено у пациентов с ранними стадиями болезни Паркинсона. Определена оптимальная эффективная, переносимая и безопасная доза гимантана для лечения начальных форм болезни Паркинсона - 25 мг, однократно в утренние часы. Установлено, что повышение дозировки сопровождается развитием побочных эффектов центрального и периферического характера. Подтверждена целесообразность дальнейшего изучения гимантана на разных стадиях болезни Паркинсона, в том числе в составе комбинированной фармакотерапии [Катунина Е.А. и др. 2008].

Необходимой составляющей тагах исследований является наличие данных о фармакокинетике препарата у пациентов. Ранее использованный метод радиоизотопной метки [3Н] нельзя применять у людей. В связи с вышеизложенным ш озникаетнеобходимость в разработке новой безопасной, высокочувствительной и селективной методики количественного определения гимантана в биоматериале.

Данные о биотрансформации и фармакокинетике в эксперименте позволяют получить представления о путях метаболизма нового препарата, возможных лекарственных взаимодействиях и подойти к решению проблемы индивидуализации фармакотерапии.

Диссертация выполнена в соответствии с плановой темой НИР ФГБУ «Научно-исследовательского института фармакологии имени В.В.Закуеова» РАМН "Изучение механизмов эндо и экзогенной регуляции функций ЦНС, разработкановых оригинальных нейропсихотропных средств" (№ госрегистрации 01.2006 06601).

Целью работы явилось экспериментальное изучение биотрансформации «шантана и его фармако кинетики.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать аналитический метод количественного определения гимантана и его метаболитов в биологическом материале на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии.

2. Изучить фзрмакокинетику гимантана и его основных метаболитов в гошме крови и мозге крыс после однократного внутривенного и перорального введения.

3. Изучить фармахокинетику гимантана и его основных метаболитов в плазме крови кроликов после различных способов введения.

4. Определить абсолютную биологическую доступность гимантана.

5. Провести на кроликах сравнительное, перекрестное, открытое фармакокииетичесхое исследование гимантана после однократного введения таблетокгимантана25мг,приготовленныхпоразнымтехнологиям. Определить относительную биологическую доступность гимантана.

6. Изучить экскрецию неизмененного препарата и его метаболитов с мочой и калом крыс.

Научная новизна работы

Впервые изучена биотрансформация и фармако кинетика нового противопаркннсонического препарата гимантана у крыс и кроликов на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детеетированием, определены стандартные фармакокинетические параметры. Установлено, что при различных путях введения гимантан подвергается интенсивной биотрансформации, и уже в первые минуты в плазме крови и мозге крыс, а также плазме крови кроликов регистрируются значительные концентрации его метаболитов. По данным масс-спектральных характеристик были обнаружены 3 метаболита гимантана с m/z 250, m/z 266 и m/z 282, по-видимому, соответствующих гидроксилированным продуктам метаболизма, которые определяются в плазме крови кроликов в течение 24 часов, а у крыс - в

течение 6 часов. В результате проведенного исследования установлено, что для гимаитана характерна высокая степень проникновения в орган-мишень мозг и относительно высокая абсолютная биодоступность.

П [»¡паи ческа я значимость работы

На основании данных исследований методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спсктрометричсским детектированием обнаружены метаболиты гимаитана. Перспектива создания лекарственных форм для орального применения гимаитана подтверждена его относительно высокой степенью абсолютной биодоступности в эксперименте.

На основании определения относительной биологической доступности гимаитана у кроликов после однократного введения таблеток, приготовленных по различным технологиям, дана оценка целесообразности использования тех или иных лекарственных форм.

Личный вклад автора

Автором самостоятельно разработана методика количественного определения гимаитана в биоматериале, проведены исследования по изучению фармакокинетики и биотрансформации гимаитана у крыс и кроликов; обработаны результаты, сформулированы выводы. При активном участии автора подготовлены публикации по результатам работы.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на конференции "Фармация и общественное здоровье" (Екатеринбург, 2009, 2010 г.), V Международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (Москва, 2010 г.), XI Региональном Конгрессе Европейской коллегии по нейропсихофармакологии (Санкт-Петербург, 2011), на конференции в лаборатории фармакокинетики ФГБУ «НИИ фармакологии им. В .В. Закусова» РАМН (Москва, 2011).

Положения, выносимые на защиту • Разработана и метрологически охарактеризованамгтодика количественного определения гимаитана и его метаболитов в биоматериале.

• Масс-спектрометрически идентифицированы три гидрокси-производных метаболита гимантана.

• Изучена фармакокинетика гимантана у кроликов и крыс после различных способов введения. Установлены межвидовые различия в фармакокинетических параметрах гимантана и з интенсивности его биотрансформации.

• Неизмененное вещество и один из его продухгов превращения проникают через гемаго-энцефзлическнй барьер.

• Целесообразность создания пероральных лекарственных форм гимантана подтверждена его достаточно высокой абсолютной биодоступностью.

• Изучена относительная биодоступность двух таблетированных прописей гимантана и рекомендовано дальнейшее изучение одной из них.

• Гимантан полностью всасывается из желудочно-кишечного тракта в портальный кровоток и выводится из организма крыс в незначительных количествах как в нензменененном виде, так и в виде метаболитов.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 работ (3 статьи - в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией, 4 тезисов - в материалах российских и международных научных конференций). Одна статья принята в печать.

Объем и структура диссертации

Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, 3 главы результатов собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические рекомендации, библиографический указатель, включающий работы на русском (50) и иностранных языках (40), 19 таблиц, 17 рисунков. Диссертация изложена на 94 страницах машинописного текста.

Экспериментальная часть Материалы и методы

Гимантаи (рисунок 1) - Ы-(2-адамантил) гексаметиленимино гидрохлорид, C|(iH27N • HCl. Представляет собой кристаллический порошок белого цвета, обладающий легкой растворимостью в воде, этаноле, метаноле, хлороформе. Субстанция разработана в ФГБУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова» РАМН как потенциальное противопаркинсоническое средство [Вальдман Е. А. и др. 1999, Вальдман Е. А., 2000].

№

Рисунок 1 - Структурная формула гимантаиа гидрохлорида

Для исследований использовали раствор для инъекций гимантана гидрохлорида в ампулах в концентрации 25 мг/мл, а также таблетки гимантана, полученные влажным гранулированием (Т-1), и полученные методом прямого прессования (Т-2), с одинаковым содержанием препарата в каждой прописи (0,025 г).

Все лекарственные формы гимантана произведены в лаборатории готовых лекарственных форм ФГБУ «НИИ фармакологии им. В. В. Закусова» РАМН.

Экспериментальные животные

Крысы. Изучение фармакокинетики препарата, его выведения и распределения в мозге проводили на самцах беспородных крыс, полученных из питомника «Столбовая» РАМН, в диапазоне масс от 180 до 220 г. Препарат вводили крысам однократно перорально в виде водного раствора субстанции в дозе 50 мг/кг и внутривенно в дозе 25 мг/кг.

Кролиики. Фармакокинегика гимантана изучалась на беспородных

кроликах-самцах массой 2,2 - 3,2 кг перекрестным дизайном, животным были

присвоены соответствующие порядковые номера. Животных содержали в

стандартных условиях вивария ФГБУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова»

РАМН при 12-ти часовом световом режиме. За 12 часов до эксперимента животных

лишали корма. Гимаитан вводили в виде водных растворов однократно в дозе 50

8

мг внутривенно (инъекционная ЛФ) в краевую ушную вену и перорально в дозе 100 мг (в среднем 40 мг/кг). Таблетки гимантана вводили через зонд по четыре штуки, чтобы достичь дозы в 100 мг. Через две недели введение лекарственных форм гимантана повторяли в обратном порядке.

Метод количественного определения гимантана в биологических образцах. Для количественного определения гимантана и его метаболитов в плазме крови животных и экскретах использовали оригинальный метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором (ВЭЖХ-МС/МС) на хроматографе «Agilent Technologies», серии 1200 (США).

Условия хроматографирования: аналитическая колонка «Zorbax 300SB» («Agilent», США) С18 - 150x2,1 мм, диаметр частиц - 5 мкм. Колонку термостатировали при 40° С. Подвижная фаза: раствор А и раствор В в соотношении 1:1. Раствор А: 25 мл 0,1 М раствора аммония ацетата и 2,5 мл концентрированной муравьиной кислоты, разведенные в 0,5 л воды. Раствор В: 25 мл 0,1 М раствора аммония ацетата и 2,5 мл концентрированной муравьиной кислоты, разведенные в 0,5 л ацетонитрила. Скорость потока подвижной фазы - 0,4 мл/мин. Скорость подачи азота - 12 л/мин, температура испарителя 350°С, напряжение на капилляре составляло 3500 В [Shudan F., Yuan Т. et al, 2009].

Детектирование проводили ионной ловушкой в режиме позитивной ионизации по полному ионному току в диапазоне масс от 53 до 300 m/z, атахже по изолированным ионам с соотношением массы к заряду, равными 234,264,250, 266 и 282. Хромагографический анализ проводили при комнатной температуре (22-24°С). Перед хроматограф»рованием подвижную фазу дегазировали на ультразвуковой бане и фильтровали.

В этих условиях времена удерживания составили, соответственно, для гимантана- 4,7 мин, для метаболита с m/z266-3,9 мин, для метаболита с m/z250 -3,4 мин, для метаболита с m/z 282 - 3,9 мин. Время удерживания внутреннего стандарта (трамадола г/х) составило 3,2 мин [Литвин Е. А., Бочков П.О. и др., 2010].

В изучаемом диапазоне концентраций (Сх) между концентрациями анализируемых соединений и соответствующих площадей пиков отмечена

линейная зависимость, которая описывалась следующим уравнением для калибровки ио внешнему стандарту: S=-2,95*106+0,6729xl0sxCx (r=0,9998), где - площадь хроматографического пика гимантана. Либо SJ Srara = -0,214x1 ОНО,027х 106хС., ще 8х/Зтсг-отношение площади хроыато-графического пика гимантана к площади хроматографического пика внутреннего стандарта. Концентрации метаболитов гимантана рассчитывали по калибровочной кривой неизмененного соединения.

Фармакокинетические параметры, используемые для интерпретации полученных данных. Основные фармакокинетические параметры лекарственного вещества (ЛВ) и его метаболитов рассчитаны модельно-независимым методом:

АиС0„о (нг/мл*ч) - площадь под фармакокикетической кривой (площадь под кривой концентрация лекарственного вещества -время) после внутривенного и перорального введения. AUC^ рассчитывается от момента введения до бесконечности;

С0 (нг/мл) - концентрация препарата в плазме крови после внутривенного введения в нулевой момент времени;

Т^ (ч) - время достижения максимальной концентрации препарата в плазме крови после перорального введения;

Ста (иг/мл) - максимальная концентрация ЛВ в плазме крози после перорального введения;

С /AUC (ч"')- параметр, характеризующий скорость всасывания препарата в системный кровоток;

MRT (ч) - среднее время пребывания ЛВ в организме;

k£l (ч1) - константа скорости элиминации, параметр, характеризующий скорость выведения препарата из организма;

tJM (ч) - период, за который выводится половина введенной и всосавшейся дозы ЛВ;

f - тканевая доступность, рассчитывается по формуле: fT= где

AUCT(W> - AUC в ткани, AUCp0jo- AUC в плазме крови;

f - абсолютная биодоступность, рассчитывалась по формуле:

10

f = Alicia xD • где AUCpo0-» ~ AUC в "Л33"6 КР°ВИ после

пероралыюго введения препарата, AUC^ ^ - AUC в плазме крови после внутривенного введения препарата, Djv - введенная внутривенно доза, D^ -введенная пероралыю доза.

F - относительная биодоступность, рассчитывалась по формуле:

F = - х 100 %, где AUC, - площадь под фармакокинетической

AUCS х D,

кривой таблеток тест-препарата, AUCf - площадь под фармакокинетической кривей после введения таблеток стандарт-препарата), D, - доза таблеток тест-препарата, Ds - доза таблеток стандарт-препарата.

AUC^/AUC^ - степень превращения фармакологического вещества в метаболит, где AUCul)^ - площадь под фармакокинетической кривой метаболита; AUC^ - площадь под фармакокинетической кривой исходного соединения [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005].

Статистическая обработка полученных результатов. Полученные экспериментальные данные подвергнуты математической статистической обработке с помощью программы «Origin Pro v.7.0».

Результаты исследований н их обсуждение

Биотрансформациа гимантана

Изучена фармакокинегика и биотрансформация гимантана в плазме крови крыс после разных способов его введения. Препарат и его метаболиты определяются в течение 6 часов.

В результате исследований биотрансформации гимантана после его введения крысам в плазме крови и экскретах животных обнаружены неизмененное соединение и три продукта его биотрансформации. Выявленные вещества обозначены в соответствии с увеличением молекулярной массы (Mw) к заряду, т.е. значения m/z. Для удобства изложения им присвоены условные обозначения:

метаболиту с. m/z 250 - М-1, метаболиту с m/z 266 - М-2, а метаболит с m/z 282 обозначен в тексте как М-3.

Молекулярный ион неизмененного соединения характеризуется величиной m/z 234. Точное строение метаболитов не установлено, можно предположить, что соединение с m/z 250 представляет собой моно гидроксшшрованную молекулу гимантана, так как отличается от гимантана на 16 углеродных единиц. Метаболит с m/z 266 - вероятно молекула гимантана, гидроксилированнал в двух разных положениях. М-3 - метаболит, гидроксилированный по трем разным положениям.

ВопытесприменениемР-пиокуронидазы показано, чтозначимоувеличиваются концентрации только метаболита с m/z 282, по-видимому, остальные производные с глюкуроновой кислотой не связываются. Для установления точной структуры необходимо провести встречный химический синтез.

Фармакокинстика гимантана у крыс

Фармакокинетика гимантана и его метаболитов после внутривенного введения крысам в дозе 25 мг/кг.

При внутривенном введении гимантана в плазме крови крыс наряду с неизмененным веществом обнаруживается метаболит М-1 на третьей минуте, а на шестой - метаболит М-2 (рисунок 2 (I)).

Степень превращения неизмененного гимантана в М-1 характеризуется

г

•е

2 та

И

-о-а

—А—В —7-Г

1

=4

1

Рисунок 2 — Фармакокинетические кривые неизмененного гимантана (в) и его метаболитов М-2 (б), М-1 (а) и М-3 (г) после однократного внутривенного введения препарата крысам (П в дозе 25 мг/кг и перорального введения (II) в дозе 50 мг/кг

(п=8; ±БО) 12

величиной 0,21, а в М-2 - 3,07 для внутривенного введения. Таким образом, гймантан в значительно большей степени метаболизируется с образованием основного метаболита с m/z 266, в меньшей степени - с m/z 250.

Гймантан и М-2 быстро выводятся из организма. Так период полувыведения неизмененного препарата составил 2,03 ч, его MRT - 2,95 ч; М-2 -1,29 ч, а MRT -2,73. В то же время М-1 элиминирует из плазмы крови животных более чем в два раза медленнее по сравнению с неизмененным соединением. Его t1/2sl составил 4,64 ч, MRT - 6,90 ч.

Рассчитанная величина тканевой доступности (f) гимантана в мозге составила 2,2,8. Из полученных данных следует, что гймантан обладает высокой интенсивностью проникновения в орган-мишень мозг. В мозге крыс отсутствуют метаболиты М-2 и М-3. Содержание метаболита с m/z 250 в мозге гораздо ниже, чем в плазме крови, что может быть объяснено его более высокой гидрофильностыо.

MRT и t, „. гимантана в мозге значительно меньше аналогичных параметров,

IflSl

рассчитанных по плазме крови после внутривенного введения (1,29 ч и 1,50 ч против 2,03 ч и 2,95 ч, соответственно).

Фармакокинетика гимантана и его метаболитов после перорапьного введения крысам в дозе 50 мг/кг.

Фармакокинетика гимантана после его перорапьного введения крысам (рисунок 2 (И)) существенно отличается от кинетики внутривенного введения, прежде всего более низкими концентрациями неизмененного препарата и

абсолютнойвеличииойплощад11подфармакокннетическойкривой.АиСгимштш[а

после перорапьного введения в 3,5 раза меньше, чем после внутривенного, что объясняется «эффектом первого прохождения». При приеме гимантана внутрь значения концентраций метаболитов выше, чем при внутривенном введении, ош обнаруживаются па шестой минуте, их концентрации нарастают в течение часа. Концентрации М-2, в несколько раз превышают содержание самого гимантана. Метаболит М-3 регистрируется только при пероралыюм введении.

Время достижения максимальной концентрации неизмененного соединен™

составило 0,25 ч, а ее величина 91,11 нг/мл. Фармакокинетический параметр, характеризующий скорость всасывания препарата из ЖКТ в системный кровоток (CWAUC.jJ составил 0,416 Ч"1. Выведение неизмененного гимантана из плазмы крови, так же как и после внутривенного введения, носит двухфазный характер. Дня метаболитов отмечены разные времена достижения Стм (1,5 ч - доя метаболита с m/z 250 и 1 ч - для метаболитов М-2 и М-3).

Полученные результаты позволяют заключить, что гимантан и его метаболиты выводятся из организма с различными скоростями, на что указывают значения констант скорости элиминации из плазмы крови (ка), которые составили для гимантана 0,158 ч'1 и для метаболитов 0,164 ч"1 (m/z 250), 0,145 ч"' (m/z 282) и 0,412 ч"1 (m/z266) соответственно. Выявленные зависимости отражаются в величинах среднего времени удерживания препарата/метаболитов в организме - 5,38 ч для гимантана и для М-1- 6,51 ч и периода полувыведения препарата из организма -3,63 ч для гимантана и для М-2 и М-3 - около 4,5 ч, соответственно. Однако MRT соединения с m/z 266 составляет 2,44 ч и время его полувыведения - 1,68 ч.

При сравнении величин констант скорости элиминации гимантана после внутривенного и перорального путей введения видно, что препарат выводится быстрее из организма животных после внутривенного введения (kcI после внутривенного введения больше кс1 после перорального в 1,7 раза), в то время как для метаболитов отмечается обратная зависимость. Следует иметь в виду, что введение внутрь отличается от внутривенного наличием фазы всасывания, что в конечном итоге сказывается на продолжительности пребывания ЛС в организме животных.

Полученные результаты по изучению фармакокинетики гимантана после его внутривенного и перорального введения позволяютзаключить, что лекарственное вещество элиминирует из организма животных с высокой скоростью и его можно отнести к группе препаратов с короткой продолжительностью пребывания в организме.

Абсолютная биодоступность гимантана после перорального введения крысам составляет 14,1%.

Устаиошіеио, что гимантан обладает высокой интенсивностью проникновения в орган-мишень - мозг, в то время как метаболиты проникают через ГЭБ плохо. Препарат подвергается эффекту первого прохождения через печень после его перорального введения.

Фармакокнкетикя гимантана у кроликов

Фармакокинеткческие кривые гимантана и его метаболитов при разных

способах введения представлены на рисунке 3.

1 II

Рисунок 3 - Фармакокинегические кривые гимантана (а) и его метаболитов: М-1 (б), М-2 (в) в плазме крови кроликов после однократного внутривенного введения препарата в дозе 50 мт (I) и перорального введения раствора субстанции а дозе 100 мг (II)

Анализ полученныхпараметров кинетики гимантанапослеразлнчных способов его введения кроликам позволяет заключить, что гимантан быстро выводится из их организма, на что указывает среднее значение константы скорости элиминации (ке|), которое составило 0,255 ч*1 для перорального способа введения и 0,247 ч-1 для внутривенного.

Содержание гимантана в плазме крови кроликов после перорального введения достигает максимума в среднем через 0,85 ч. Затем наблюдается двухфазное снижение концентрации неизмененного гимантана. Быстрое выведение препарата из организма характеризуется также такими величинами фармакокинетмчеоккх параметров, как среднее время удерживания препарата в организме (MRT) - 5,04 ч к период полувыведения препарата из организма (tial) - 3,39 ч. Однако при сравнении

этих величии для внутривенного и перорального путей введения видно, что дольше препарат выводится из организмаживотных после перорального введения (tWtJ per os больше t1/Jcl iv в 1,2 раза, а значение MRT для внутривенного способа введения меньше перорального в 2,17 раз). Известно, что в идеальном случае эти параметры, полученные на одном виде животных, не должны значительно отличаться друг от друга. В нашем исследовании такую разницу в величинах Хтй и MRT можно объяснить малой выборкой животных (п=5), недостаточной для более объективной статистической оценки.

После внутривенного введения AUC0-o гимантана в среднем составляет 1328,6 нг/млхч, а М-2 - 429,59 нг/млхч, что приблизительно в 3 раза меньше величины AUC^ неизмененного вещества. Однако после перорального способа введения гимантана величина AUC^ метаболита М-2 превышает аналогичный параметр (после внутривенного) в десять раз. С^ гимантана при пероральном введении в среднем составляет 68,04 нг/мл, а метаболита М-2 - 788,83 нг/мл, при незначительном содержании метаболита М-1, что указывает на основной путь метаболизма гимантана с образованием метаболита М-2.

По-видимому, после перорального введения, полностью всосавшись »з желудочно-кишечного тракта кроликов в портальный кровоток, гимантан подвергается «эффекту первого прохождения», в результате чего в системный кровоток посту пает менее 7,95±5,02% от введенной дозы препарата (абсолютная биодоступность).

И гимантан, и метаболиты выводятся из организма кроликов с высокой скоростью. Через 24 ч регистрировались лишь следовые концентрации исследуемых веществ.

После внутривенного введения гимантан интенсивнее превращается в метаболит М-1 (степень превращения 0,498), чем в М-2 (0,323). М-3 в плазме крови кроликов не регистрировался даже в следовых количествах. Вследствие «эффекта первого прохождения» абсолютная величина степени превращения гимгнтаиа в М-2 после перорального введения раствора в 30 раз выше аналогичной величины, полученной после внутривенного введения.

Фармакокииетическая оценка гимантана в таблетках, приготовленных, по различным технологиям.

Целью этого этапа исследования стало фармакокинетнческое изучение гимантана в таблетках в сравнении между собой и субстанцией в эксперименте на кроликах. На рисунке 4 представлены усредненные фармакокинетнческне кривые гимантана в плазме крови кроликов после однократного пероралыюго введения животным таблеток Т-1 в дозе 100 мг и таблеток Т-2 в дозе 100 мг.

Исследование проведено на 8 кроликах-самцах массой тата 2,75 і 0,19 кг. В случайном порядке животным с помощью зонда внутрь вводили четыре таблетки прописи Т-1 (итоговая доза составляла 100 мг) или чеггыре таблетки Т-2 (для достижения итоговой дозы 100 мг). Спустя десять дней порядок введения исследуемых препаратов животным меняли на обратный.

Время достижения максимальной концентрации (Гта<) для таблеток Т-1 наступало через 0,53±0,31 ч и для таблеток Т-2 - через 0.69±0,26 ч. Между величинами скоростей всасывания, ЛиС()> и Тшах таблеток гимантана, приготовленных влажным гранулированием и таблеток гимантана, приготовленных прямым прессованием, достоверные различия не выявлены ({-критерий Стьюдента, р~0,95).

Оценка параметра, характеризующего продолжительное выведения препарата из организма, показала, что величина полупериода глнмннацки для Т-1 составила 1,37±1,04 ч и для Т-2 -1,35±0,91 ч.

Средняя максимальная концентрация гимантана, определяемая в плазме крови кроликов (С ) для композиции Т-1 составила 36,45±10,2С мкг/мл, а для таблеток Т-2 - 35,05±3,87 мкг/мл.

Помимо неизмененного вещества в плазме крови кроликов обнаружен метаболит М-2, остальные продукты биотрансформации отсутствуют, либо определяются в следовых количествах. Степени превращения гимантана в М-2 составляют 4,75 и 4,45 для Т-1 и Т-2 соответственно, что в два раза меньше аналогичной величины, полученной после нерорального введения раствора, но г. 15 раз выше относительно внутривенного введения. Известно, чтобиодоступность

лекарственных препаратов, а также их биотрансформация в значительной степени зависят от таких биофармацевтических факторов, как вид вспомогательного вещества, его количество и технология получения готовой лекарственной формы [Frick А., Moller Н. et al, 1998, Iongejan G. А. M., Smit 1.С.А. et al, 1989]. По-видимому, вспомогательные вещества в таблетках гимантана оказывают влияние на биотрансформацию исходного соединения. Возможно, образуется комплекс гимантан-вспомогательные вещества, предохраняющий от ферментативного воздействия исходное соединение на фазе всасывания из ЖКТ и эффекта первого прохождения.

Относительная биологическая доступность (F) гимантана, определяемая отношением индивидуальных значений AUC^ с учетом вводимых доз, для таблеток Т-1 по отношению к Т-2, оказалась близкой и составила в среднем 104,15±9,99%

Для оценки качества таблетированных лекарственных форм гимантана были проведены исследования их биодоступности относительно субстанции гимантана. Данные представлены в табл. 1.

Таблица I - Относительная биодоступность (F; %) гимантана после введения кроликам субстанции перорально в дозе 100 мг и таблеток различных

прописей

Т-1 Т-2

Субстанцій 101,46 104,76

Т-1 - 104,15

Т-2 95,84 -

В результате установлено, что АиС0^ гимантана в виде любой из прописей таблеток не отличается от водного раствора, что указывает на хорошее высвобождение вещества из лекарственной формы.

Поэтому, целесообразно отдать предпочтение той таблетированной лекарственной форме, технология которой более экономична и проста.

s

п;

£ 40-

0 4 8 12 16 20 24

Время (ч)

Рисунок 4 - Фармамшшетические профили гимантана в плазме крози кроликов после однократного введения таблеток гимантана, приготовленных по различным технологиям

Межиндогме различия в биотрансформащш и фармякоглшетшгг гнмантама

Сравнительный анализ направлений биотрансформации гамантгна показал, что у крыс в плазме крови после его внутривенного введения, регистрируются два метаболита: с m/z250, который, вероятно, предиавляет собой моногидроксилированную молекулу гимантана и метаболит с m/z 266 - молекулу гимантана, гидроксилированную в двух разных положениях. После пероргльного введения исследуемого вещества крысам кроме М-1 и М-2 определяется метаболит с m/z 282 - гидроксилированный по трем разным положениям. В плазме крови кроликов после любого способа введения метаболит М-3 не обнаруживается, а при пероральном способе введения отсутствует также и метаболит М-1. После внутривенного введения гимантана концентрации двух метаболитов в плазме крови кроликов значительно ниже, чем в плазме крови крыс.

Оценивая интенсивность метаболизма гимантана у крыс и кроликов,

19

необходимо отметить следующее: абсолютная величина степени превращения гимантана в основной метаболит М-2 у крыс превышает аналогичный параметр после внутривенного введения у кроликов в 9,5 раз и после пероральнош введения в - 2,2 раза. Однако величина степени превращения гимантана в метаболит M-I после внутривенного введения больше у кроликов в 2,3 раза по сравнению с крысами.

В целом, как показали проведенные исследования, интенсивность биотрансформации гимантана выше у крыс, чем у кроликов. Что, видимо, связано с эволюционными особенностями работы микросомальных ферментов у данных биологических видов.

При сравнении дозонезависимых фармакокипетических параметров как гимантана, так и его метаболитов у крыс и кроликов были выявлены межвидовые различия.

Гимантан выводится га организма крыс и кроликов примерно с одинаковой скоростью (tlßtl составляет 3,63 ч для крыс и 3,39 ч для кроликов, MRT - 5,38 ч и 5,04 ч соответственно). В тоже время выведение метаболита М-2 у крыс происходит в 1,5 разабыстрее, чем у кроликов. По-видимому, это связано с тем, что у крыс метаболит М-2 подвергается дальнейшему превращению с образованием метаболита М-3.

Биодоступность гимантана у крыс в 1,27 раза выше, чем у кроликов, максимальная концентрация препарата в плазме крови после пероралького введения быстрее достигается также у крыс (15 минут) по сравнению с кроликами (50 минут).

Сравнивая AUC0^, можно заключить, что бнодоступность возрастает в ряду: кролик - крыса. У крыс отмечается два максимума, что может говорить о наличии энтеропатической циркуляции препарата [Koolman ]., 1990].

Экскреция гимантана и его метаболитов с мочой и калом крыс.

Результаты исследования по выведению гимантана с мочой и калом крыс после однократного внутривенного и перорапьного введения препарата в дозе 25 мг/кг представлены в табл. 2.

Помимо неизмененного гимантана в моче и кале крыс выявлены продукты его биотрансформации, которые уже обнаруживались б плазме крови. Исследуемые соединения получили условные обозначения по такому же принципу, который применялся для обозначения метаболитов в плазме крови: М-1, М-2 и М-3. Возрастание массы метаболитов на 16, 32 и 48 соответственно, позволяет предположить, что образуются оксо- или гидрокси-производные [Петренко Е. С., 2003].

В качестве основного метаболита в моче и кале животных можно считать соединение с 250 rn/z, вследствие его высоких концентраций со всех образцах экскрементов. Из таблицы 4 видно, что в капе после виутривеного введения количество М-1 в 1,9 раза меньше, чем после перорального введения. Подобная тенденция наблюдалось и для М-2 (3,9 раз). Полученные результаты свидетельствуют о выраженном эффекте первого прохождения гимантша через печень после перорального способа введения. Однако метаболит М-3 при пероральном введении препарата обнаружен не был.

Поскольку после внутривенного введения количество гимантана в кале в 4,3 раза выше, чем после перорального введения, можно сделать вывод, что препарат полностью всасывается из желудочно-кишечного тракта в системный кровоток.

Таблица 2- Процент от введенной дозы препарата гимантана и его метаболитов в суточной моче и кале крыс после различных способов а ведения

Исследуемые соединения % от введенной дозы (+ SD)

Моча, в/в введение Кал, в/в ведение Кал, п/о введение

гимантан 0,306±0,187 0,042±0,093 0,0098±0,009

М-1 0,400±0,185 0,105±0,125 0,2182±0,1863

М-2 0,034±0,067 0,007±0,005 0,0265±0,0206

М-3 0,007±0,007 0,002±0,001 -

После инкубации пробы с Р-птюкуронидазой

М-1 0,380±0,188

М-2 0,093±0,065 - -

М-3 0,011±0,008 - -

После добавления к пробам мочи р-глюкуронидазы и проведения гидролиза количество М-1 и М-2 достоверно не увеличилось (при Р> 0,95), в отличие от М-3. По-видимому, далеко не все метаболиты гимантана образуют гшокуроноконыогаты.

Полученные результаты подтверждают литерапурные данные о том, что выведение производных адамантана происходит за счет образования гндроксилированных метаболитов [Петренко Е. С., 2003].

Анализ процессов экскреции гимантана и его метаболитов с мочой и калом крыс позволяет заключить, что элиминация препарата из организма животных происходит почти полностью за счет его биотрансформадии в печени: суммарное выведение метаболитов в течение суток с мочой в среднем в 9-10 раз выше по сравнению с экскрецией с калом, а основное направление метаболизма, по-видимому, - гидроксилирование.

Выводы

1. Разработай и метрологически охарактеризован аналитический метод количественного определения гимантанаи его метаболитов в биологическом материале на основе ВЭЖХ с масс-спектрометр ическим детектированием.

2. Обнаруясенотри метаболита гимантана, предположительно гадрокси-производные с m/z 250, 266 и 282. Их точное строение можно подтвердить при наличии стандартов, полученных встречным синтезом.

3. Обнаружены различия в количественных соотношениях и величинах дозозависимых фармакокинетических параметров гимшггана и его метаболитов при разных способах введения. При перорапьнсм введении биотрансформация гимантана протекает интенсивнее, что вероятно обусловлено «эффектом первого прохождения» через печень.

4. Определена абсолютная биологическая доступность гимантана у крыс (14,1 %) и у кроликов (7,95%), на основании чего оправдано применение таблетированныхлекарственныхформ гимантана. Не выявлено статистически значимых отличий в фармакокинетических параметрах и относительной биодосчупности между разными прописями таблеток гамантана. Целесообразно отдать предпочтение прописи, приготовленной прямым прессованием, вследствие технологических факторов ее производства.

5. Неизмененный гимантан обладает высокой интенсивностью проникновения в орган-мишень (мозг).

6. В неизмененном виде исходное соединение определялось в моче и кале крыс в чрезвычайно малых количествах от введенной дозы после внутривенного и иерорального способов введения. Последнее говорит о том, что гнмантан практически полностью всасывается из желудочно-кишечного тракта крыс в портальный кровоток.

Список публикаций по теше диссертации

1. Литвин, Е. А. Изучение влияния вспомогательных веществ на технологические характеристики таблеток гимантана [Текст] / Е. А. Литвин, Е. В. Бпыисквя, К. В. Алексеев // Сборник материалов науч.-практ. конференции «Кластерные подходы к в современной фармации и фарм. образовании», г. Белгород, 2008 г. - Белгород: изд-во БелГУ, 2008. - С. 183.

2. Литвин, Е. А- Методика количественного определения гимантана в плазме крови кроликов [Текст] / Е. А. Литвин, П.О. Бочков, А. И. Посконный, Д. В. Бастрыгин, М.И. Емельянов, В.П. Жердев // Материалы ежегодной конференции "Фармация и общественное здоровье". - Екатеринбург, 2010. - С. 78-80.

3. Литвин, Е. А. Количественное определение гимантана в биоматериале методом ВЭЖХ-МС [Текст] / Д. В. Бастрыгин, В. П. Жердев, Г. Б. Колыванов, К. В. Алексеев, Е. А. Литвин // Материалы 5-ой международной конференции ' Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам", Москва, 2010. - М.: изд-во Фолиум, 2010. - С. 57.

4. Литвин, Е. А. Количественное определение гимантана в плазме крови крыс [Текст] / Е. А. Литвин, Д. В. Бастрыгин, Г. Б. Колыванов, К. В. Алексеев // Вестник МГУ. Химия. - 2011. - Т. 66, №3. - С. 194-197.

5. Litvin, Е. A. Pharmacokinetics of himantane in rabbits [Текст] / E. A. Lilvin, P. O. Bochkov, D. V. Basbygin, V. P. Zherdev // Russian abstract book "XI ECNP Regional Meeting" 14-16 apr., 2011 St. Petersburg. - St Petersburg, 2011. - P. 155.

6. Литвин E. А. Фармакокииетика гимантана у крыс [Текст] / Е.

A. Литвин, Д. В. Бастрыгин, Г. Б. Колыванов, К. В. Алексеев, В. П. Жердев // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2011. - Т. 74, № 11. - С. 2428.

7. Литвин Е. А. Абсолютная биодоступность гимантана у кроликов [Текст] / Е. А. Литвин, Д. В. Бастрыгин, Г. Б. Колыванов, К. В. Алексеев, В. П: Жердев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - Т. 153, №2.-С. 171-174.

8. Литвин Е. А. Экскреция гимантана и его метаболитов с мочой и калом крыс [Текст] / Е. А. Литвин, Д. В. Бастрыгин, Г. Б. Колыванов, К. В. Алексеев,

B. П. Жердев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. Принята в печать.

Подписано в печать 01.03.2012 г.

Заказ № 316 Типография ООО "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел. (499)152-00-16 Тираж 100 шт.