Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Поиск путей индивидуализации лекарственного лечения больных колоректальным раком препаратами фторпиримидиного ряда

На правах рукописи

ФИЛИМОНЕНКО Василий Петрович

ПОИСК ПУТЕЙ ИНДИВИДУАЛИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННОГО ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ РАКОМ ПРЕПАРАТАМИ ФТОРПИРИМИДИНОВОГО РЯДА

14.00.14 - Онкология 03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

/

1 [ | I

| ООЭ1Б4иэо

Санкт-Петербург - 2007

V Чу

003164058

Работа выполнена на кафедре онкологии с курсом клинической радиологии ГОУ ДПО Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному

развитию

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор МОИСЕЕНКО Владимир Михайлович

доктор медицинских наук, профессор ИМЯНИТОВ Евгений Наумович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор БЕРШТЕЙН Лев Михайлович

доктор медицинских наук, профессор СЕМИГЛАЗОВ Владислав Владимирович

Ведущая организация: Российский Научный Центр Рентгенологии и хирургических технологий Росмедтехнологий

Защита диссертации состоится "_"_200 г в_часов

на заседании диссертационного совета Д 208 052.01 при ФГУ НИИ онкологии им проф. Н.Н. Петрова Росмедтехнологий (197758, г. Санкт-Петербург, Песочный-2, ул Ленинградская, д. 68)

С диссертацией можно ознакомиться в медицинской библиотеке ФГУ НИИ онкологии им проф Н.Н Петрова Росмедтехнологий и на сайте (www. mioncologn.ru)

Автореферат разослан "_"_2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук ОРЛОВА Рашида Вахидовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы

Лечение больных колоректальным раком (КРР) является одним из приоритетных направлений современной онкологии Актуальность сложившейся ситуации обусловлена ежегодным ростом заболеваемости КРР, трудностью своевременной диагностики, высокой стоимостью и сложностью лечения (Чиссов В И , Старинский В В ,2000, Трапезников Н Н , Аксель Е М , 2001, Давыдов М И , Аксель Е М , 2004)

Несмотря на существенный прогресс в клинической онкологии в последние годы, достигнутый благодаря модификации схем лечения, биомодуляции и комбинированию препаратов, за хирургическим методом сохраняется ведущая роль в лечении пациентов КРР Однако примерно у 50-60% радикально оперированных больных через некоторое время наблюдается прогрессирование заболевания (Моисеенко В М , Орлова Р В , 2000, Тюляндин С А, 2001) Это стало основанием для разработки дифференцированного подхода к лечению пациентов КРР с более широким использованием химиотерапии при начальных формах болезни

Несмотря на большие достижения программы профилактической химиотерапии КРР, в ней имеется множество нерешенных вопросов Главным из них является поиск маркеров наличия отдаленных микрометастазов у радикально оперированных пациентов

В связи с этим на сегодняшний день знание прогностических молекулярных маркеров может сыграть огромную роль в определении риска прогрессирования заболевания у индивидуального больного КРР после радикальной операции, что, возможно, позволит выявить категории пациентов, для которых было бы целесообразным проведение профилактической лекарственной терапии Данное обстоятельство является безусловным показанием для проведения специальных исследований

Второй важной проблемой, затронутой в нашей работе, является лекарственное лечение больных метастатическим КРР

Несмотря на имеющийся прогресс в лечении распространенных форм КРР, современная химиотерапия вообще, и терапия с применением фторпиримидинов в частности, обладает рядом существенных недостатков Главным из них является отсутствие абсолютных признаков чувствительности опухолевого процесса к цитостатикам

В настоящее время благодаря активным разработкам в области фармакогенетики удалось идентифицировать ряд генов, производные которых участвуют в реализации цитостатического эффекта лекарственных агентов, используемых при лечении КРР К ним относятся ферменты тимидилат синтетаза (ТС), тимидин фосфорилаза (ТФ) и дигидропиримидин дегидрогеназа

(ДПД)

Протеин ТС является одной из главных мишеней 5-фторурацила (5-ФУ) Блокирование этого энзима метаболитами данного цитостатика приводит к нарушению синтеза молекул ДНК в ядре опухолевой клетки, что способствует ее гибели (Leichman С G , Lenz Н J , 1997, Adlard J W , Richman S D , 2002) Белок ДПД, выступая в роли первичного и скорость-лимитирующего энзима, способствует полной деградации метаболитов фторпиримидина до неактивных форм (Solonga D, Dannenberg К D, 2000, Гарин А М, 2001) ТФ является главным ферментом активации предшественников 5-ФУ, таких как капецитабин (Pasche В , Mulcahy М , 2002, Folprecht G , Kohne С Н , 2004)

Таким образом, клинико-биологическая характеристика локализованного и диссеминированного КРР с использованием абсолютно новых возможностей изучения молекулярно-биологических маркеров может дать информацию о более точном прогнозе течения заболевания, помочь проведению рационального лечения, что и определяет чрезвычайную актуальность данного исследования

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является оптимизация лекарственного лечения больных КРР при помощи моделирования индивидуального плана терапии, основанного на клинических и молекулярно-биологических прогностических и предиктивных факторах заболевания В соответствии с этим поставлены следующие задачи

1 Оценить внутриопухолевую активность молекулярно-биологических маркеров (ТС, ТФ и ДПД) у пациентов локализованным и диссеминированным КРР

2 Сопоставить значения указанных биохимических показателей с течением болезни после хирургического лечения и результатами адьювантной химиотерапии

3 Изучить влияние клинических показателей на выживаемость (безрецидивную и общую) больных КРР

4 Определить эффективность основных методов лечения (операция, химиотерапия, комбинированное лечение) и их влияние на показатели выживаемости больных КРР

5 Оценить степень корреляции уровней внутриопухолевой экспрессии ТС, ТФ и ДПД с эффективностью лекарственной терапии фторпиримидинами у больных диссеминированным КРР

Научная новизна

Впервые на основе комбинированного обследования определены основные клинические прогностические факторы у больных КРР Показано их влияние на безрецидивную и общую выживаемость Определена роль и место молекулярно-биологических маркеров (ТС, ТФ и ДПД) в интегральной оценке прогноза заболевания у пациентов КРР Осуществлен анализ значимости их

внутриопухолевой активности в прогнозировании риска прогрессирования болезни после радикального хирургического лечения и, как следствие, целесообразности назначения адьювантной химиотерапии

Оценена возможность использования уровней экспрессии ТС, ТФ и ДПД в качестве предиктивных молекулярных маркеров у больных метастатическим КРР, позволяющих еще до начала лечения с определенной долей вероятности прогнозировать индивидуальную чувствительность опухолевого процесса к цитостатическим препаратам, в частности, к 5-ФУ и его производным

Практическая значимость работы

Внедрение в медицинскую практику результатов исследования позволит увеличить эффективность лекарственного лечения опухолей толстой кишки на основе индивидуального подбора цитостатических препаратов, а также снизит риск побочных эффектов, сопряженных с назначением химиотерапевтических агентов Кроме этого, посредством метода ПЦР в реальном времени разработаны для практического применения в онкологических учреждениях новые методики оценки экспрессии генов в минимальных количествах биологического материала, в частности, в биопсийных и цитологических препаратах

Основные положения, выносимые на защиту

1 Наряду с факторами, отражающими распространенность опухоли, ее клиническую и биохимическую активность, для прогнозирования течения заболевания принципиально важным является изучение ряда молекулярно-биологических показателей злокачественного процесса

2 Индивидуализация лечения больных КРР на основе определения молекулярно-биологических параметров (ТС, ТФ, ДПД) может оптимизировать выбор терапии и получить максимальный эффект при минимальном риске осложнений

Апробация диссертации и реализация результатов исследования

Материалы диссертации были доложены 03 октября 2007 года на объединенной научной конференции отделения биотерапии и трансплантации костного мозга, химиотерапевтического, торакального отделений, отделения детской онкологии и гематологии, отделения опухолей желудочно-кишечного тракта и отделения общей онкологии ФГУ НИИ онкологии им проф НН Петрова Росмедтехнологий совместно с Кафедрой онкологии с курсом клинической радиологии ГОУ ДПО Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 230 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы Библиографический указатель включает 207 источников, в том числе 25 отечественных и 202 зарубежных Работа иллюстрирована 36 таблицами и 79 рисунками

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

Базой для проведения настоящего исследования явились данные о 250 больном КРР, находившихся на обследовании и лечении в отделении биотерапии и трансплантации костного мозга ФГУ НИИ онкологии им проф Н Н Петрова Росмедтехнологий с 1998 г по 2005 г Программа исследования включала три основных раздела

1 Изучение корреляции клинических факторов с различными клинико-морфологическими особенностями опухоли и прогнозом течения заболевания у больных локализованным КРР (89 пациентов)

2 Анализ влияния клинических факторов на продолжительность общей выживаемости пациентов диссеминированным КРР (117 больных)

3 Исследование молекулярно-биологической структуры КРР, оценка уровней внутриопухолевой экспрессии ТС, ТФ и ДЦЦ в рамках особенностей течения заболевания и эффективности лекарственной терапии (44 пациента)

Основные характеристики исследуемых больных представлены в таблице 1

Таблица 1

Клинико-морфологическая характеристика больных колоректальным раком, включенных в исследование (п=250)

Характеристика Больные с локализованным КРР (п=89) Больные с метастатическим КРР (п=117) Больные КРР, у которых проводился молекулярный анализ (п=44)

Возраст (годы)

средний 56 55,3 55,3

диапазон 29-75 20-75 29-75

Пол мужской женский 36 (40,4%) 53 (59,6%) 55 (47%) 62 (53%) 21 (47,7%) 23 (52,3%)

Общий статус по ECOG 0 баллов 1 балл 2 балла 31 (34,8%) 58 (65,2%) 27 (23,1%) 62 (53%) 28 (23,9%) И (25%) 25 (56,8%) 8 (18,2%)

Локализация первичной опухоли ободочная кишка сигмовидная кишка прямая кишка 31 (34,8%) 31 (34,8%) 27 (30,4%) 37 (31,6%) 42 (35,9%) 38 (32,5%) 13 (29,5%) 20 (45,5%) И (25%)

Стадия заболевания Dukes' В Dukes' С Dukes' D 39 (43,8%) 50 (56,2%) 39 (33,3%) 24 (20,5%) 54 (46,2%) 14 (31,8%) 12 (27,3%) 18 (40,9%)

Степень дифференцировки опухоли низкая умеренная высокая 13 (14,6%) 69 (77,5%) 7 (7,9%) 16 (13,8%) 93 (79,5%) 2 (1,7%) 6 (13,6%) 34 (77,3%) 1 (2,3%)

Объем операции не проводилась радикальная операция полная циторедукция частичная циторедукция симптоматическая операция 89 (100%) 6 (5,1%) 63 (53,8%) 3 (2,6%) 41 (35,1%) 4 (3,4%) 3 (6,8%) 26 (59,1%) 2 (4,5%) 10 (22,7%) 3 (6,8%)

Послеоперационная терапия адъювантная химиотерапия - фторпиримидины - комбинации с фторпиримидинами - другие цитостатики лучевая терапия 47 (52,8%) 23 (48,9%) 23 (48,9%) 1 (2,2%) 7 (7,9%) 23 (19,7%) 13 (56,5%) 10 (43,5%) 7 (5%) 14 (31,8%) 10 (71,4%) 4 (28,6%)

Методика проведения количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени

Выделение РНК из архивных патоморфологических образцов Выделение РНК из архивных патоморфологических блоков производилось по модифицированному методу К Specht (Specht К et al, 2001) Гистологические срезы с целью получения участка опухоли и во избежание контаминации нормальной тканью подвергались микродиссекции Полученные таким способом срезы толщиной 10-15 мкм депарафинизировались с помощью 2-кратной обработки ксилолом при комнатной температуре Затем фрагменты ткани регидратировались с помощью последовательной промывки в 96% этаноле, затем в 85% и 75% растворах этанола - по 10 минут в каждом После тщательного удаления этанола в пробирку добавляли 180 мкл лизирующего буфера 1хТЕ (Юммоль Tris-HCl (рН=8,0), ОД ммоль ЭДТА, рН=8,0), 2% натрия додецилсульфат и 20 мкл протеиназы К (20 мг/мл) Пробирки подвергались инкубированию при t=60°C в течение 16 часов до полного растворения ткани К полученным таким образом лизатам добавляли

однократный объем кислого сатурированного фенола и 0,3 объема хлороформа После интенсивного встряхивания пробирки в течение 10 минут при комнатной температуре пробы подвергались центрифугированию при 15000 g в течение 15 минут при температуре ротора 0-2°С (Centrifuge 5415 R, Eppendorf) После центрифугирования осторожно отбирали суперфазу в новые эппендорфы и добавляли 0,3 объема хлороформа с последующим интенсивным перемешиванием и центрифугированием аналогично описанному выше К осторожно отобранной верхней фазе прибавляли 0,1 объема ЗМ ацетата натрия (рН=4,0), 1 мкл раствора гликогена (20мг/мл) в качестве ко-осадителя и 1 объем охлажденного до -20 °С изопропанола После перемешивания растворов пробы оставлялись не менее чем на 3 часа при - 20 °С Преципитат РНК осаждали центрифугированием пробы при 15000 g в течение 30 минут при температуре ротора 0-2°С После центрифугирования на дне пробирок образуется небольшое количество белого осадка После удаления изопропанола промывали осадок в 500 мкл 70% этанола в течение 10 минут при комнатной температуре, слегка встряхивая пробирку Тщательно удаляли этанол После подсушивания в термостате при 40 °С осадок растворяли в 25 мкл стерильной воды при 65 °С в течение 10 минут Раствор РНК хранили при - 20 °С до использования в реакции обратной транскрипции, но не более 2-х суток

Получение к ДНК в реакции обратной транскрипции Реакцию обратной транскрипции проводили в объеме 20 мкл К образцу РНК объемом 5 мкл добавляли 1 мкл случайных гексануклеотидов (10 ое/мл), инкубировали при +70 °С в течение 10 минут, после чего пробы быстро охлаждали на льду К смеси РНК и гексапраймеров прибавляли 14 мкл реакционной смеси буфер для обратной транскрипции - до однократного, MuMLV («Сибэнзим», Россия) - 200 единиц, dNTP - 250 мкМ Реакцию обратной транскрипции проводили в течение 1 часа при температуре 38 °С, в соответствии с рекомендациями производителя, после чего инактивировали ревертазу нагреванием образца до 90 °С в течение 10 минут Полученную кДНК до использования хранили при температуре -20 °С

Изучение уровня экспрессии мРНК генов ТС, ТФ и ДПД с помощью количественной IIIIP в реальном времени

Оценка уровня экспрессии генов в образцах кДНК проводилась на основании построения относительной стандартной кривой количества копий таргетного гена по соотношению с реферным геном (SDHA - GenBank NM_004168) в мультиплексной полуколичественной ПЦР в реальном времени с использованием флюоресцентно меченых зондов, специфичных к выбранным для амплификации участкам кДНК Анализ результатов проводили с использованием метода калибровочной кривой Праймеры для ПЦР были подобраны таким образом, чтоб исключить получение амплификата с геномной ДНК, присутствующей в пробе кДНК Образцы РНК без обратной транскрипции резервировались как отрицательный контроль в ПЦР Реакцию проводили на приборе iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, USA) в объеме 25 мкл, каждый образец в протоколе дублировался

В составе реакционной смеси был 1-кратный ПЦР-буфер с содержанием MgCl(2) 2,5 мМ, 125 мкМ dNTP, от 200 нМ каждого праймера и 500 нМ каждого из флюоресцентно меченых зондов, 1 ед термоактивируемой Taq-полимеразы «Thermostar» («Синтол», Россия) Реакцию начинали с инкубирования проб при 95 °С в течение 10 минут для активации полимеразы, затем следовали 45 циклов 95 °С - 15 сек , 60 °С - 45 сек

Результаты собственных исследований

Оценка влияния клинических и молекулярно-биологических факторов на течение заболевания у больных локализованным КРР

Анализ безрецидивной выживаемости (БРВ) 89 пациентов КРР стадии Dukes'B-C показал, что из общего числа исследуемых через 1 год после радикального хирургического лечения прогрессирование заболевания (ПЗ) было отмечено у 35% пациентов, через 3 года - уже у 67%, а через 5 лет - у 76% Вероятность развития рецидива была максимальной на 1-ом году после радикальной операции В общем, медиана БРВ пациентов локализованным КРР составила 17,6 месяцев (1,5 года)

Оценивая результаты клинических и лабораторных исследований, и сопоставляя их с выживаемостью больных, нам удалось выявить ряд прогностических факторов для КРР (табл 2)

Таблица 2

Влияние клинических прогностических факторов на течение заболевания у радикально оперированных больных КРР

Клинический признак Медиана БРВ (мес) Уровень значимости (р)

Стадия заболевания Оикез'В Оикев'С 13,5 9 0,0271

Возраст моложе 60 лет старше 60 лет 13 30 0,0091

Пол мужчины женщины 14 22 0,0503

Локализация опухоли ободочная кишка сигмовидная кишка прямая кишка 18 30 12 0,0473

Симптомность заболевания симптомное бессимптомное течение 9,5 17 0,1581

Наличие опухолевых осложнений нет есть (перфорация, непроходимость) 18 10 0,3375

Гистологический тип новообразования аденокарцинома муцинозный рак 10 19 0,1374

Степень дифференцировки опухоли низкая умеренная 12 23 0,0274

Таким образом, из клинических признаков, оказывающих неблагоприятное влияние на БРВ больных КРР стадии Dukes'B-C, следует выделить следующие метастазы в регионарных лимфатических узлах, молодой возраст пациента (менее 60 лет), низкая степень дифференцировки аденокарциномы, локализация опухоли в дистальных отделах толстой кишки и мужской пол

Однако все клинические показатели массы и активности опухоли являются косвенными параметрами агрессивности онкологического процесса Поэтому для оценки истинной активности КРР и ее прогностической роли нами были изучены молекулярно-биологические маркеры клеточной пролиферации (ферменты ТС, ТФ и ДПД)

Изучение особенностей внутриопухолевой экспрессии биохимических маркеров подтвердило индивидуальность молекулярного строения КРР в рамках распространенности злокачественного процесса и локализации опухолевого поражения Установлено, что у больных стадии Dukes'В в новообразованиях доминируют низкие и умеренные уровни активности ТС и ДПД (р=0,045) При этом у представителей КРР стадии Dukes'C структура опухоли претерпевает определенные изменения, что сопровождается ростом концентрации оцениваемых биохимических параметров Процент неоплазий с низкой активностью ТС и ТФ в данном случае приближается к минимуму Таким образом, налицо выраженная тенденция повышения внутриопухолевой активности ТС и ДПД по мере прогрессирования процесса Установленная закономерность не затрагивает фермента ТФ (р>0,05) Подобное распределение биохимических маркеров в рамках распространенности КРР объясняется их биологической ролью и, прежде всего, регуляцией процессов пролиферации опухолевых клеток за счет участия в синтезе молекул ДНК

Что касается особенностей экспрессии ТС, ТФ и ДПД в рамках топографической характеристики злокачественного поражения, то при анализе внутриопухолевой активности ферментов больных КРР стадии Dukes'B-C прослеживается явная тенденция к увеличению концентрации ТС и ТФ и снижению ДПД в дистальном направлении Поэтому, относительный дефицит ДПД на фоне высоких уровней ТС и ТФ обусловливают существующие различия в течении рака прямой и ободочной кишки

В ходе дальнейшего исследования нами было установлено, что экспрессия мРНК ферментов ТС, ТФ и ДПД в опухолевых клетках связана друг с другом Наиболее тесная прямая корреляция существует в паре ТС-ТФ (р<0,001) Подобная связь обнаружена также в комбинации ТФ-ДПД (р<0,001) Взаимоотношение ферментов в паре ТС-ДПД оказалось статистически незначимым (р>0,05) Таким образом, высокие уровни ТФ в ткани неоплазий кишечника достоверно чаще сопровождаются повышенными концентрациями ТС и ДПД Однако при максимальном значении ТС активность ДПД может быть различной

В дальнейшем в процессе изучения внутриопухолевой активности ТС, ТФ и ДПД было установлено, что уровни экспрессии этих маркеров оказывают

влияние на течение заболевания у радикально оперированных больных КРР. При анализе каждого из ферментов удалось доказать достоверную причастность к продолжительности БРВ только одного фермента - ТС (р=0,0187). Показатели выживаемости были статистически ниже у пациентов с высоким уровнем экспрессии этого протеина (медиана БРВ при ТС<1,0 = 20 мес., при ТС>1,0 = 6 мес.) (рис.1).

низкий уровень ТС (п=21)

высокий уровень ТС (п=5)

Рис.

30 40 Время, месяцы

1. Влияние уровня внутриопухолевой концентрации ТС на БРВ пациентов локализованным КРР

Несмотря на то, что полученный в ходе анализа прогностической роли ТФ коэффициент достоверности превышает уровень значимости (р=0,1235), существующая разница медиан БРВ в группах пациентов с высокой и низкой внутриопухолевой концентрацией изучаемого фермента (8 мес. и 24 мес., соответственно) демонстрирует высокий риск ПЗ в раннем послеоперационном периоде у лиц с повышенной экспрессией ТФ в аденокарциномах толстой кишки (рис.2).

-низкий уровень ТФ

(п= 19)

--высокий уровень ТФ

(п=7)

Рис

30 40 Время, месяцы

2. Влияние уровня внутриопухолевой концентрации ТФ на БРВ пациентов локализованным ККР

Величина внутриопухолевой активности ДПД не имела прогностической ценности в отношении БРВ больных локализованным КРР (р=0,3280).

Далее с целью идентификации наиболее оптимального опухолевого фенотипа в рамках анализа БРВ нами была исследована сопряженность сочетаний протеинов. Установлено, что на продолжительность БРВ пациентов локализованным КРР достоверно влияет и сочетание протеинов ТС и ТФ (р=0,0120), и комбинации всех 3-х энзимов (р=0,0295). Так, при исследовании ко-экспрессии маркеров ТС и ТФ (рис.3) отчетливо показано негативное прогностическое значение комбинации высоких концентраций этих ферментов - ТС(+)ТФ(+) (медиана БРВ=3 мес.). Сочетание низких, практически пороговых уровней экспрессии ТС и ТФ - ТС(-)ТФ(-) - явилось наиболее оптимальным фенотипом в отношении длительности БРВ (медиана БРВ=19 мес.).

— ТС(-) ТФ(-) (п=20)

.........ТС(-) ТФ(+) (п=3)

20 30 40 50 60 70 - _ ТС(+) ТФ(+) (П=4)

Время, месяцы

Рис. 3. Влияние внутриопухолевых комбинаций ТС и ТФ на БРВ больных локализованным КРР.

Исследование трехкомпонентной системы (ТС, ТФ и ДПД) позволило сделать следующие выводы: во-первых, показатели БРВ были достоверно ниже у пациентов КРР с опухолевым фенотипом ТС(+)ТФ(+)ДПД(+) (медиана БРВ= 3 мес.); во-вторых, комбинации ТС(-)ТФ(-)ДПД(-) и ТС(-)ТФ(-)ДПД(+) относятся к категории благоприятных. Именно пациенты с данной молекулярной структурой опухоли имели самую продолжительную медиану БРВ (18,5 и 30 месяцев, соответственно) (рис.4).

Таким образом, молекулярно-биологические маркеры ТС, ТФ и ДПД в ходе нашей работы доказали свою значимость в отношении прогнозирования БРВ больных локализованным КРР, и с уверенностью могут быть предложены к использованию в практической онкологии наравне с такими клиническими факторами, как стадия заболевания и морфологическая структура опухоли.

- ТС(-)ТФ(-)ДПД(-)

( п=12)

- ТС(-)ТФ(-)ДПД(+)

(п=8)

...........ТС(-)ТФ(+)ДПД(+)

(п=3)

- - ТС(+)ТФ(+)ДПД(+)

(п=4)

30 40 Время, месяцы

Рис. 4. Влияние виутриопухолевых комбинаций ТС, ТФ и ДПД на БРВ больных локализованным КРР.

Особая ценность протеинов ТС, ТФ и ДПД заключается в помощи при моделировании индивидуального адьювантного лечения. Так, больные КРР с опухолевыми фенотипами ТС(-)ТФ(-)ДРД(-) и ТС(-)ТФ(-)ДПД(+) при прочих позитивных клинических факторах не нуждаются в проведении специального профилактического лечения. В случае сочетания данных комбинаций маркеров с какими-либо другими негативными характеристиками заболевания использование стандартной фторпиримидиновой химиотерапии будет иметь максимальный эффект в отношении продолжительности БРВ. Совершенно по иному обстоят дела с фенотипом ТС(+)ТФ(+)ДПД(+). Пациенты с данным опухолевым профилем нуждаются в комплексном подходе, при этом адьювантное лечение, основанное на классических фторпиримидинах, врятли изменит ситуацию в лучшую сторону. Возможно, решение столь сложной проблемы заключается в использовании современных цитостатиков в сочетании с молекулярно-нацеленными биопрепаратами.

Анализ прогностической значимости клинических и молекулярно-биологических факторов у больных диссеминированным КРР

С целью идентификации клинических факторов, прогнозирующих закономерности течения диссеминированного процесса, нами был проведен анализ общей выживаемости (ОВ) больных генерализованной формой КРР. Из общего числа больных метастатическим КРР (117 человек) в течение года от начала лекарственной терапии оставались в живых 67,5% пациентов, но уже к концу 2-го года этот процент прогрессивно снизился до 25,8% и достиг своего минимального значения - 5,1% на 4-м году наблюдения. Вероятность летальных исходов была максимальной на 1-ом году наблюдения и минимальной на 4-ом году от начала противоопухолевой терапии. Медиана ОВ составила 13 месяцев.

Для выявления прогностической значимости отдельных факторов нами была проведена оценка влияния ряда клинических и лабораторных показателей на ОВ больных КРР (табл 3)

Таблица 3

Влияние клинических прогностических факторов на течение заболевания у больных метастатическим КРР

Клинический признак Медиана ОВ (мес) Уровень значимости (Р)

Число пораженных опухолью органов поражение одного органа полиорганное поражение 15 12 0,0768

Возраст моложе 60 лет старше 60 лет 12,5 13 0,9082

Пол мужчины женщины 13 13 0,9618

Локализация опухоли поперечно-ободочная кишка сигмовидная кишка прямая кишка 13 13,5 13,5 0,5688

Общесоматический статус ВОЗ 0 баллов 1 балл 2 балла 24 15 7 0,00001

Симптомность заболевания симптомное бессимптомное течение 13 17 0,3135

Гистологический тип новообразования аденокарцинома муцинозный рак 13 12,5 0,1963

Степень дифференцировки опухоли низкая умеренная высокая 15 13 12,5 0,6017

Результаты анализа показали, что в группе диссеминированного КРР имеется только 2 фактора, косвенно определяющих продолжительность ОВ -общесоматический статус ВОЗ (р=0,00001) и число пораженных опухолью органов (р=0,0768)

Оценка внутриопухолевой активности молекулярно-генетических маркеров (ТС, ТФ и ДПД) у больных диссеминированным КРР значительно расширило возможности прогнозирования течения заболевания Следует отметить тот факт, что параллельно с ростом опухолевой массы происходит изменение молекулярно-генетической структуры новообразований кишечника Так, при сравнении уровней экспрессии маркеров у больных КРР в направлении от Оикев'В к Оикез'Э наблюдается достоверное доминирование опухолей с высокими значениями ТС (р=0,037) и ДПД (р=0,0383) и

прогрессивное снижение числа неоплазий с низкими, практически пороговыми уровнями активности этих протеинов Распределение фермента ТФ в зависимости от стадии процесса не имеет какой-либо закономерности

Из проанализированных 3-х цитогенетических показателей достоверное влияние на ОВ больных диссеминированным КРР оказывали 2 протеина - ТС и ТФ Прогноз жизни значительно ухудшался при повышении активности названных маркеров Так, медиана ОВ при внутриопухолевом уровне ТС<1,0 равна 21 мес , а при ТС>1,0 - 9 мес (р-0,0137) (рис 5)

^ низкий уровень ТС

( п=23) ■ - высокий уровень ТС

15 20 25 30 35 40 (П=9) Время, месяцы

Рис 5 Влияние уровня внутриопухолевой концентрации ТС на ОВ больных диссеминированным КРР

В случае с маркером ТФ получены подобные значения медиана ОВ при ТФ<3,0 также соответствует 21 мес , а при активности ТФ>3,0 снижается до 11 мес (р=0,0366) (рис 6)

-низкий уровень ТФ

( п=24) - - высокий уровень ТФ

0 5 10 15 20 25 30 35 40 (П=8) Время, месяцы

Рис 6 Влияние уровня внутриопухолевой концентрации ТФ на ОВ пациентов генерализованным КРР

Что касается прогностической ценности ДЦЦ, то значимость этого фермента нивелировалась (р=0,3439)

В плане дальнейшего исследования нами была изучена степень корреляции сочетанной экспрессии энзимов и продолжительности жизни больных метастатическим КРР Были установлены достоверные различия по течению заболевания среди пациентов с опухолевыми фенотипами ТС(-)ТФ(-) и ТС(+)ТФ(+) (р=0,0386), а также ТС(-)ТФ(-) и ТС(+)ТФ(-) (р=0,0129) (рис 7)

Рис

-ТС(-)ТФ(-) (п=26)

...........ТС(+)ТФ(-) (п=2)

15 20 25 30 35 40 - - ТС(+)ТФ(+) (П=8) Время, месяцы

7 Влияние внутриопухолевых комбинаций энзимов ТС и ТФ на ОВ пациентов диссеминированным КРР

Наиболее благоприятной комбинацией энзимов считается сочетание низких уровней активности ТС и ТФ (медиана =21 мес) К неблагоприятным фенотипам относятся варианты с одним или двумя высокими показателями экспрессии данных ферментов (медиана ОВ= 9-11 мес)

Анализ сочетаний в пространстве 3-х маркеров несколько расширил диапазон опухолевых фенотипов Однако результат статистического исследования показал отсутствие достоверной прогностической ценности данных комбинаций (р=0,1874) Тем не менее, полученные в ходе работы результаты свидетельствуют о существовании разницы в продолжительности жизни между больными диссеминированным КРР с условно благоприятными опухолевыми фенотипами ТС(-)ТФ(-)ДДД(-) и ТС(-)ТФ(-)ДПД(+) и пациентами с неблагоприятными молекулярными структурами новообразований кишки типа ТС(+)ТФ(-)ДПД(+) и ТС(+)ТФ(+)ДПД(+) (рис 8)

Таким образом, определение уровней экспрессии ТС, ТФ и ДПД в опухолевой ткани больных метастатическим КРР имеет огромную практическую ценность Так, сочетание благоприятных клинических прогностических факторов заболевания с низкоуровневыми внутриопухолевыми комбинациями маркеров оказывает выраженное влияние на продолжительность жизни данной категории больных только с положительной стороны Идентификация высокой степени активности энзимов в ткани новообразований кишечника независимо от клинических параметров

заболевания свидетельствует о высоко агрессивном течении злокачественного процесса

1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 -0,1

р = 0,1874

10 15 20 25 Время, месяцы

35

40

ТС(-)ТФ(-)ДПД(-) ( П=17)

ТС(-)ТФ(-)ДПД(+) (п=9)

ТС(+)ТФ(-)ДПД(+)

(п=2)

ТС(+)ТФ(+)ДПД(+) (п=7)

Рис 8 Влияние внутриопухолевых комбинаций энзимов ТС, ТФ и ДПД на ОВ больных метастатическим КРР

Исследование клинических и молекулярно-биологических маркеров эффективности лекарственного лечения больных диссеминированным КРР

Наряду с клиническими, биологическими и морфологическими показателями опухоли на ОВ пациентов метастатическим КРР оказывает непосредственное влияние и проводимая терапия При исследовании значений выживаемости больных диссеминировалным КРР в зависимости от метода лечения (операция, системная химиотерапия) было установлено, что показатели ОВ в группах больных, которым на первом этапе комплексного лечения была выполнена полная или частичная циторедукция, достоверно различаются (р=0,0318) (рис 9)

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Время, месяцы

— полная

циторедукция ( п=5) - частичная циторедукция (п=47)

.........симптоматическая

операция (п=11)

Рис 9 Влияние объема операции на ОВ больных диссеминированным КРР

Медиана ОВ при полной циторедукции составила 34 мес., при частичной - 14 мес. Сравнительный анализ эффективности системных методов воздействия на метастатический процесс не выявил достоверного улучшения ОВ в зависимости от вида используемой в качестве I линии химиотерапии (МХТ и ПХТ фторпиримидинами, другие цитостатики) (р=0,1112). Несмотря на это, обнаруживается достоверная корреляция между эффектом противоопухолевой терапии и продолжительностью жизни (рис.10).

Рис.

- ПР + ЧР

(п=22) — стабилизация

(п=35) .......... прогрессирование

20 30 40 50 60 70 80 (П=57) Время, месяцы

10. Влияние эффективности лекарственной терапии I линии на ОВ больных метастатическим КРР

Медиана ОВ больных с объективным ответом на проводимое лекарственное воздействие (ПР+ЧР) в 2 раза превышает аналогичный показатель в группе пациентов с ПЗ (21 и 10 месяцев, соответственно) (р=0,00001). Подобные изменения выявляются и при сравнительной оценки со стабилизацией заболевания (СЗ) (медиана ОВ = 14 мес.).

Таким образом, в I линии терапии больных диссеминированным КРР статистически значимым лечебным агентом, непосредственно определяющим длительность ОВ, выступает хирургическое лечение. Именно от объема оперативного вмешательства зависит дальнейшее течение заболевания.

При анализе результатов II линии терапии установлено, что химиотерапия фторпиримидинами имеет значимое преимущество над лечением нефторпиримидиновыми препаратами (р=0,030) (рис.11).

Медиана ОВ в группе фторпиримидиновой терапии составила 22-24 месяца, а в сравниваемой когорте других цитостатиков - 13 месяцев. При этом наилучшая ОВ достигнута при использовании в качестве II линии ПХТ на основе фторпиримидинов. Так же было доказано достоверное влияние эффекта химиотерапии II линии на длительность ОВ (р=0,0006) (рис.12).

Рис

— МХТ фторпирими-динами (п=16)

— ПХТ на основе фторпиримидинов (п=11)

............Другие цитостатики

5 10 15 20 25 30 35 40 45 ( П=36) Время, месяцы

11 Влияние вида химиотерапии на ОВ больных метастатическим КРР (II линия)

1,0

* 0.8

| 0,6 I

.о

ш 0,4

к

I 0,2 в 0,0

а»

о, М

А -

с*

Ь о

8- а бл в

8„„й 9 »......87

р = 0,0006

-0,2

-ЧР + ПР

(п=9) - - стабилизация (п=17)

прогрессирование (п=37)

Рис

5 10 15 20 25 30 35 40 45 Время, месяцы

12 Влияние эффективности терапии II линии на ОВ больных КРР

В группе пациентов, ответивших на цитостатическое лечение, медиана ОВ имела максимальное значение - 28 месяцев В отличие от них среди исследуемых с дальнейшим ПЗ половина погибла в течение 13 месяцев от начала терапии Медиана ОВ в случае СЗ составила 17 месяцев

Таким образом, во II линии терапии статистически значимым лечебным агентом, непосредственно определяющим длительность ОВ, выступает системная химиотерапия При этом среди множества вариантов цитостатиков приоритетным является ПХТ на основе фторпиримидинов

Что касается анализа III линии терапии, то адекватная оценка влияния метода лечения и его эффективности на продолжительность ОВ больных диссеминированным КРР была невозможной по причине малого числа пациентов (16 человек)

Анализируя широкий спектр клинических и лабораторных параметров заболевания и сопоставляя их с эффективностью химиотерапии больных

метастатическим КРР, нами было выявлено несколько независимых предиктивных факторов (табл 4)

Таблица 4

Влияние клинических факторов на эффективность химиотерапии у больных

метастатическим КРР

Клинический признак Соотношение больных, ответивших на лечение (%) Уровень значимости (р)

ПР+ЧР СЗ ПР

Возраст моложе 60 лет старше 60 лет 24 13 22 42 54 45 0,0523

Пол мужчина женщина 19 20 31 30 50 50 0,9740

Общесоматический статус ВОЗ 0 баллов 1 балл 2 балла 21 26 4 54 32 7 25 42 89 0,00001

Локализация опухоли ободочная кишка сигмовидная кишка прямая кишка 19 23 16 31 25 37 50 52 47 0,8357

Гистологический тип аденокарцинома муцинозный рак 19 0 30 50 51 50 0,2453

Степень дифференцировки низкая умеренная 21 19 0 35 79 46 0,0033

Симптомность заболевания симптомное бессимптомное течение И 20 67 28 22 52 0,0507

Опухолевые осложнения нет есть (перфорация и др ) 19 24 32 24 49 52 0,7578

Распространенность поражение 1 органа полиорганное поражение 19 20 37 25 44 55 0,3666

Вид терапии операция + адьювантная х/т только операция 20 17 32 26 48 57 0,7791

Таким образом, к категории клинических предиктивных факторов, негативно влияющих на результаты лекарственной терапии I линии у больных диссеминированным КРР, относятся низкий общесоматический статус ВОЗ (2 балла и более), низкая степень дифференцировки опухоли кишечника, молодой возраст пациента (моложе 60 лет) и бессимптомное течение заболевания

Учитывая то обстоятельство, что базовым препаратом в лечении распространенных форм КРР является 5-ФУ и его производные, с целью идентификации наиболее чувствительных, практически абсолютных факторов ответа опухолевого процесса на лекарственное воздействие нами было проведено исследование ферментов, участвующих в реализации цитотоксического эффекта фторпиримидинов К ним относятся протеины ТС, ТФ и ДПД

Проведенный нами анализ внутриопухолевой активности ТС, ТФ и ДПД показал существование корреляции между уровнями экспрессии ферментов и эффективностью химиотерапии Статистически значимая связь в данном случае характерна только для протеина ТС (р<0,05) (рис 13)

уровень

ПР+ЧР СЗ ПЗ низкий ТС

уровень ТС

Рис. 13. Распределение значений экспрессии ТС в опухолевой ткани больных КРР в зависимости от эффективности химиотерапии

Установлено, что у больных диссеминированным КРР с ПЗ достоверно чаще наблюдалась повышенная экспрессия энзима ТС в ткани опухоли, чем в группе пациентов, где терапия оказалась эффективной. Таким образом, более высокие уровни ТС ухудшают непосредственные результаты лечения. Выявленная закономерность отражается и на продолжительности времени до прогрессирования (ВДП): пациенты с опухолевым профилем ТС(+) имели более короткое ВДП в сравнении с ТС(-) (табл. 5).

Что касается протеинов ТФ и ДПД, то, несмотря на то, что уровень значимости - р=0,1550 и р=0,0638 - не позволяет нам говорить о достоверной предиктивной значимости данных ферментов, анализ распределения экспрессии этих энзимов свидетельствует о выраженной тенденции влияния их внутриопухолевой концентрации на эффективность противоопухолевой терапии (рис.14 и 15).

Рис. 14. Распределения значений экспрессии ТФ в опухолевой ткани больных КРР в зависимости от эффективности химиотерапии

Таблица 5

Корреляция внутриопухолевой экспрессии с продолжительностью эффекта лекарственного лечения больных метастатическим КРР

Опухолевый фенотип Время до прогрессирования (месо Коэффициент достоверности (р)

ТС(+) 7,2+ 1,1 0,3223

ТС(-) 9.0 + 1,0

ТФ(+) 8.8+1,1 0.8209

ТФ(-) 8,4+1,1

ДПД(+) 9,2 ± 1.1 0,2499

ДПД(-) 7,2 ± 1,1

ТС(-)ТФ(-) 9,4+ 1,6 0,3016

ТС(-)ТФ(+) 8,4 ± 1,2

ТС(+)ТФ(-) 6,4 ± 0.9

ТС(-)ДПД(-) 9,8 ± 1,3 0,4688

ТС(-)ДПД(+) 7,2 ± 1,6

ТС(+)ДПД(-) 7,0 ±2,1

ТФС-)ДПД(-) 10,2 + 0,9 0,5650

ТФ(-)ДПД(+) 8.7 ± 1,6

ТФ(+)ДПД(-) 7,8 ± 1,3

ТС( -)ТФ(-) ДП Д (-) 10,0± 1,1 0,3234

ТС(-)ТФ(-)ДПД(+) 9,7 ± 2,0

ТС(-)ТФ(+)ДПД(-) 8,5 ± 3,5

ТС(-)ТФ(+)ДПД(+) 6,3 ± 1,9

ТС(+)ТФ(-)ДПД(-) 9,2 ± 1,6

ТС(+)ТФ(~)ДПД(+) 7,3 ± 1,2

ТС(+)ТФ(+)ДПД(-) 5,0 ± 1,0

уровень ДПД

Рис. 15. Распределение значений экспрессии ДПД в опухолевой ткани больных КРР в зависимости от эффективности химиотерапии

В обоих случаях среди пациентов с ПЗ на фоне химиотерапии доминировали больные с высоким уровнем изучаемых маркеров. Таким

образом, повышенная внутриопухолевая активность ТФ и ДПД условно относится к категории неблагоприятных предиктивных факторов.

Основываясь на том, что ферменты ТС, ТФ и ДПД в клетках новообразований кишечника достоверно связаны друг с другом (р<0,05), нами было проанализировано влияние сочетанной экспрессии энзимов на эффективность терапии фторпиримидинами больных диссеминированным КРР.

При оценке предиктивной значимости попарных комбинаций ТС-ТФ, ТС-ДПД и ТФ-ДПД оказалось, что наиболее прочная корреляция с результатами лечения характерна для двухкомпонентной системы ТС-ТФ (р=0,0506) (рис.16).

О-

:т а,

Рис. 16. Влияние внутриопухолевых комбинаций маркеров ТС и ТФ на эффективность химиотерапии у больных метастатическим КРР

Установлено, что наиболее благоприятным опухолевым фенотипом в отношении ответа заболевания на химиотерапию является комбинация низких уровней экспрессии обоих ферментов - ТС(-)ТФ(-). У большинства больных с данной молекулярной структурой (82%) удалось достичь объективного уменьшения опухолевого процесса (р=0,0041). Самым неблагоприятным вариантом сочетаний ТС и ТФ является совокупность высоких уровней экспрессии энзимов - ТС(+)ТФ(+). Практически у всех пациентов с этим опухолевым фенотипом - 84% - регистрировалось ПЗ (р=0,0299).

Что касается предиктивной значимости ко-экспрессии ТФ-ДПД и ТС-ДПД, то в ходе нашего исследования были получены подобные результаты, хотя разница ответов опухоли на проводимую химиотерапию в зависимости от направленности данных фенотипов оказалась не такой явной, как при ТС-ТФ. В обоих случаях сочетание низких значений протеинов является наиболее благоприятным с точки зрения наилучшего отклика заболевания на цитостатическое воздействие. Комбинация низкого и высокого уровня любого из ферментов приводит к значительному снижению эффективности цитостатической терапии 5-ФУ и его производными.

Фенотип опухоли, основанный на сочетании высоких значений всех трех исследуемых энзимов, выступает в роли негативного предиктивного фактора. В большей части случаев у больных с данной молекулярной структурой КРР отмечается дальнейший рост опухоли на фоне проводимой фторпиримидиновой терапии. Выявленная закономерность отражается и на продолжительности ВДП (см. табл. 5).

Анализ уровней экспрессии трех маркеров показал достоверное влияние полученных комбинаций на эффективность терапии I линии больных метастатическим КРР (р=0,00569) (рис.17).

Рис. 17. Влияние внутриопухолевых комбинаций маркеров ТС, ТФ и ДПД на эффективность химиотерапии больных КРР

Наиболее оптимальным соотношением ферментов является сочетание низких уровней экспрессии всех трех энзимов (р=0,0237). Фенотип ТС(+)ТФ(+)ДПД(+) характерен для высоко агрессивных форм КРР, что отражается практически в 100% ПЗ у пациентов с данной структурой опухоли (р=0,0043).

Что касается разноуровневых комбинаций энзимов, то в ходе исследования была установлена следующая закономерность. При наличии повышенной активности одного из протеинов на фоне низких уровней двух других соотношение положительных ответов и ПЗ повернуто в сторону первых. Сочетание низкой концентрации одного фермента с двумя высокими приводит к значительному росту числа больных с ПЗ, практически до 50%.

Интересные результаты получены при оценке связи результатов химиотерапии с условным показателем, характеризующим сумму высоких

значений ферментов внутри комбинаций. Обоснованием данного анализа явилось практически одинаковое влияние каждого из трех маркеров на эффективность лекарственного лечения больных диссеминированньш КРР. Достоверность существующей связи не вызывает сомнений (р=0,0099) (рис. 18).

80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

высокая активность<2-х высокая активность ь 2-х ферментов ферментов

Рис. 18. Влияние суммы высоких уровней внутриопухолевой активности ферментов на результаты лекарственного лечения больных КРР

В ходе анализа было установлено, что в группе больных КРР, у которых удалось получить объективный ответ, в 68% случаев опухолевый фенотип представлен комбинацией низких уровней экспрессии всех 3-х ферментов или высокой концентрацией любого одного из них (р=0,0177). В тоже время у больных с ПЗ в 77% случаев молекулярная структура опухоли была представлена сочетанной экспрессией двух или всех трех высоких значений исследуемых маркеров (р=0,0078). Ценность подобной оценки заключатся в возможности экспресс прогнозирования эффективности химиотерапии 5-ФУ у больных распространенным КРР.

Таким образом, ферменты ТС, ТФ и ДПД являются достоверными предиктивными факторами, и определение уровней внутриопухолевой экспрессии этих маркеров служит инновационным направлением современной онкологии, способствующим моделированию индивидуального противоопухолевого лечения больных КРР.

ВЫВОДЫ

I. КРР представляет собой гетерогенную группу, имеющую наряду с морфологическими особенностями ряд отличительных клинических, биохимических, цитогенетических и молекулярно-биологических характеристик. Рациональное использование, как традиционных показателей, так и молекулярно-генетических, способствует адекватному

построению прогноза относительно интенсивности прогрессирования и выживаемости конкретного больного КРР

2 Высокий уровень экспрессии ТС соответствует более частому появлению метастазов в послеоперационном периоде у больных КРР стадии Dukes' В-С (р=0,0187) Отрицательное влияние на показатели ОВ пациентов диссеминированным КРР оказывает повышенная внутриопухолевая активность ТС (р=0,0137) и ТФ (р=0,0366)

3 При КРР стадии Dukes'B-C наличие в опухолевой ткани высокой экспрессии протеинов ТС и ТФ коррелирует со значительным уменьшением безрецидивной выживаемости (медиана БРВ=3 мес) в отличие от больных, оперированных в той же стадии, но с молекулярным профилем аденокарциномы ТС(-)ТФ(-) (медиана БРВ=18 мес) (р=0,0120)

4 Наиболее благоприятный прогноз в отношении продолжительности БРВ отмечен у больных КРР, оперированных в стадии Dukes'B-C, с фенотипами ТС(-)ТФ(-)ДПД(-) (медиана БРВ=18,5 мес) и ТС(-)ТФ(-)ДПД(+) (медиана БРВ=13,5 мес) в сравнении с пациентами, оперированными в той же стадии, но с опухолевой структурой ТС(+)ТФ(+)ДПД(+) (медиана БРВ=3 мес) (р=0,0295)

5 Высокая эффективность цитостатического лечения 5-ФУ и его производными достигалась только в ТС(-) случаях метастатического КРР (ПР+ЧР+СЗ=77%) При наличии повышенной внутриопухолевой концентрации ТС лечебный эффект нивелировался (П3=62%) (р<0,05)

6 Отсутствие экспрессии ТС и ТФ в первичной опухоли прогнозирует высокую терапевтическую активность фторпиримидинов (ПР+ЧР+СЗ=82%) у больных диссеминированным КРР (р=0,0041) Совокупность положительных значений ферментов соответствует неблагоприятному исходу лечения (П3=84%) (р=0,0299) Подобная закономерность характерна и для двух других типов ко-экспрессии маркеров - ТС-ДПД и ТФ-ДПД (р<0,05)

7 Высокая концентрация ТС в первичной опухоли в сочетании с повышенной активностью ТФ и ДПД является достоверным фактором прогноза наиболее низкого ответа генерализованного КРР на 5-ФУ и его производные (П3=100%) (р=0,0043) Наиболее благоприятным опухолевым фенотипом в отношении ожидаемого результата лекарственного лечения и продолжительности времени до прогрессирования является комбинация ТС(-)ТФ(-)ДПД(-) (ПР+ЧР+СЗ=60%) (р=0,0237)

8 Анализ суммы высоких значений ТС, ТФ и ДПД внутри комбинаций показал, что у пациентов диссеминированным КРР, положительно ответивших на лечение, в 68% случаев опухолевый фенотип представлен сочетанием низких уровней экспрессии всех трех ферментов или высокой концентрацией любого одного (р=0,0177) При ПЗ в 77% образцов неопластической ткани отмечается сочетанная экспрессия двух или всех трех высоких значений данных энзимов (р=0,0078)

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В комплекс диагностических мероприятий при постановке диагноза колоректального рака наряду с рутинными методами исследования следует включать молекулярно-генетический анализ уровней внутриопухолевой экспрессии ТС, ТФ и ДПД для оценки прогноза заболевания и выбора потенциально эффективного лечения

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Поиски путей индивидуализации лечения больных колоректальным раком препаратами фторпиримидинового ряда / В.П. Филимоненко, В В Егоренков, К Г Буслов, В M Моисеенко, Е H Имянитов // Медицинский академический журнал материалы научной конференции молодых ученых Северо-Западного региона - СПб - 2004 - приложение 5 - том 4 - С 190191

2 РНК-анализ экспрессии генов метаболизма цитостатиков в архивном патоморфологическом материале / КГ Буслов, А Г Иевлева, В.П. Филимоненко и др // Вопросы онкологии - СПб - 2006 - том 52 - №1 - С 9-10

3 Экспрессия DPD, TS и TP коррелируют с противоопухолевым эффектом фторпиримидинов / А Г Иевлева, К Г Буслов, В.П. Филимоненко и др // Вопросы онкологии - СПб - 2006 - том 52 - №1 - С 16

4 Measurement of DPD and TS Transcripts Aimed to Predict Clinical Benefit from Fluoropyrimidines Confirmation of the Trend in Russian Colorectal Cancer Series and Caution Regarding the Gene Referees / Aglaya G Iyevleva, Konstantin G Buslov, Alexandr V Togo, Dmitry E Matsko, Yasily P. Filimonemko, Vladimir M Moiseyenko, Evgeny N Imyanitov // Onkologie - 2007 - №30 - P

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю искреннюю признательность научным руководителям диссертационной работы, доктору медицинских наук, профессору Владимиру Михайловичу Моисеенко и доктору медицинских наук, профессору Евгению Наумовичу Имянитову

Приношу глубокую благодарность сотрудникам отделения биотерапии и трансплантации костного мозга ФГУ НИИ онкологии им проф H H Петрова Росмедтехнологий д м н PB Орловой, к м н CA Проценко, Т Д Михальниченко, к м н Г M Телетаевой, к м н А И Семеновой, к м н AB Новикову, Т X Ногаевой, H В Тюкавиной за практическую помощь в осуществлении работы

Выражаю сердечную благодарность сотрудникам лаборатории молекулярной онкологии ФГУ НИИ онкологии им проф H H Петрова Росмедтехнологий к м н К Г Буслову, к м н E H Суспицыну, А Г Иевлевой и

сотрудникам патологоанатомической лаборатории с прозектурой под руководством д м н , проф Д Е Мацко за поддержку и помощь в выполнении работы

Подписано в печать 28 11.2007. Формат 60x84 1/16. Бумага "SvetoCopy". Гарнитура «Times». Ризография Тираж 100 экз Зак. 732

Отпечатано в ЗАО «Полиграфическое предприятие №3» 191104, Санкт-Петербург, Литейный пр., 55

Актуальность проблемы

Колоректальный рак (КРР) является одной из важнейших проблем современной онкологии, актуальность которой определяется ростом заболеваемости населения опухолями этой локализации, трудностью своевременной диагностики, высокой стоимостью и сложностью лечения, большим уровнем инвалидизации.

Скудная клиническая картина ранних форм заболевания, сходство симптоматики КРР с проявлением различных патологических состояний толстой кишки, поздняя обращаемость пациентов за квалифицированной медицинской помощью являются причиной того, что только 30-40% больных в дальнейшем подвергаются радикальному лечению. При этом у лиц с локализованной формой болезни остается высокой вероятность наличия отдаленных субклинических микрометастазов. Пятилетняя выживаемость больных КРР едва достигает 40% (Кныш В.И., 1997).

Таким образом, неуклонный рост заболеваемости и чрезвычайно низкая выявляемость ранних форм КРР, а также малоутешительные результаты хирургического вмешательства заставляют искать новые и совершенствовать традиционные методы комбинированного и комплексного лечения с включением в лечебный план лучевой и химиотерапии. В столь сложной ситуации только успехи лекарственного лечения могут существенным образом улучшить отдаленные результаты и увеличить продолжительность жизни этой категории пациентов.

Несмотря на имеющиеся успехи при лечении больных КРР, современная химиотерапия вообще, и с применением фторпиримидинов в частности, обладает рядом недостатков. Главным из них является эмпиричность назначений различных комбинаций цитостатиков. Как правило, выбор схемы лечения основывается на достаточно косвенных показателях, таких как общее состояние пациента, клиническая картина заболевания, стадия процесса и морфологическая характеристика опухоли. Однако клиническое течение КРР различается даже в пределах однородной группы пациентов. Подобная гетерогенность течения заболевания и, как следствие, ответа на терапию связана со сложностью внутриклеточных взаимодействий, мозаичностью новообразований толстой кишки, обусловленной поликлональностью с различными биологическими характеристиками и чувствительностью к лекарственным агентам.

По-видимому, под видом одного и того же морфологического типа опухолей скрывается несколько разновидностей заболевания, отличающихся по своему молекулярному патогенезу (Имянитов E.H., 2005; Houlston R.S., 2001). Поэтому, знание молекулярно-биологических и генетических особенностей КРР может способствовать оптимизации лекарственного лечения пациентов данной нозологической группы.

Благодаря достижениям современной фармакогенетики было обнаружено несколько полиморфизмов генов, кодирующих белки, которые участвуют в метаболизме лекарственных агентов, используемых при лечении КРР. Наибольшие успехи в этой области были достигнуты в отношении терапевтического применения фторпиримидинов. Идентифицирован целый спектр ферментов, влияющих на фармакокинетику 5-ФУ и его производных.

В частности, эффективность лечения в существенной степени зависит от внутриопухолевой активности дигидропиримидин дегидрогеназы (ДПД) -ключевого фермента инактивации фторпиримидинов. Новообразования, характеризующиеся высокой активностью ДПД, редко регрессируют в ответ на стандартные дозы фторпиримидинов в связи с недостаточной внутриопухолевой концентрацией цитостатика. В тоже время крайне низкий уровень рассматриваемого белка, доходящий до его дефицита, может проявляться серьезной, потенциально опасной для жизни токсичностью после введения 5-ФУ или связанного с ним препарата (Гарин A.M., 2001; Solonga D., Dannenberg K.D., 2000).

Другим важным ферментом, ассоциированным с эффективностью лечения, является тимидилат синтетаза (ТС). ТС считается одной из главных мишеней 5-ФУ. Многие исследования свидетельствуют, что низкий уровень экспрессии ТС злокачественными клетками коррелирует с высокой противоопухолевой активностью фторпиримидинов, вероятно за счет достаточного «насыщения» энзима цитостатическим препаратом. Однако далеко не все эксперименты подтверждают эти наблюдения (Leichman C.G., Lenz H.J., 1997; Adlard J.W., Richman S.D., 2002).

И, наконец, большое внимание клиницистов привлекает протеин тимидин фосфорилаза (ТФ). Вероятно, высокий уровень активности ТФ свидетельствует о нецелесообразности применения «классических» фторпиримидинов, в частности, 5-ФУ. В тоже время, сверхэкспрессия ТФ опухолью предполагает исключительно благоприятное соотношение между лечебным и побочными эффектами при назначении предшественников фторурацила (капецитабин), которые активируются посредством фосфорилирования (Pasche В., Mulcahy М., 2002; Folprecht G., Kohne С.Н., 2004).

Определение внутриопухолевой активности перечисленных ферментов может помочь в решении проблемы индивидуализации лечения больных КРР. На сегодняшний день относительно воспроизводимые результаты получены только для ДПД, в то время как реальная клиническая значимость тестов на ТС и ТФ остается под вопросом.

Таким образом, клинико-биологическая характеристика локализованного и диссеминированного КРР с использованием абсолютно новых возможностей изучения молекулярно-биологических маркеров может дать информацию о более точном прогнозе течения заболевания, помочь проведению рационального, индивидуально смоделированного лечения, что и определяет чрезвычайную актуальность данного исследования.

Цель работы

Основной целью исследования является оптимизация лекарственного лечения больных метастатическим КРР при помощи моделирования индивидуального плана терапии, основанного на клинических и молекулярно-биологических прогностических и предиктивных факторах заболевания.

Задачи исследования

1. Оценить внутриопухолевую активность молекулярно-биологических маркеров (ТС, ТФ и ДПД) у пациентов локализованным и диссеминированным КРР.

2. Сопоставить значения указанных биохимических показателей с течением болезни после хирургического лечения и результатами адьювантной химиотерапии.

3. Определить эффективность основных методов лечения (операция, химиотерапия, комбинированное лечение) и их влияние на показатели выживаемости больных КРР.

4. Изучить влияние клинических показателей на выживаемость (безрецидивную и общую) больных КРР.

5. Оценить степень корреляции уровней внутриопухолевой экспрессии ТС, ТФ и ДПД с эффективность лекарственной терапии фторпиримидинами у больных диссеминированным КРР.

Научная новизна

Впервые на основе комбинированного обследования определены основные клинические прогностические факторы у больных КРР. Показано их влияние на безрецидивную и общую выживаемость.

Определена роль и место молекулярно-биологических маркеров (ТС, ТФ и ДПД) в интегральной оценке прогноза заболевания у пациентов КРР. Осуществлен анализ значимости их внутриопухолевой активности в прогнозировании риска прогрессировать болезни после радикального хирургического лечения и, как следствие, целесообразности назначения адьювантной химиотерапии.

Оценена возможность использования уровней экспрессии ТС, ТФ и ДПД в качестве предиктивных молекулярных маркеров у больных метастатическим КРР, позволяющих еще до начала лечения с определенной долей вероятности прогнозировать индивидуальную чувствительность опухолевого процесса к цитостатическим препаратам, в частности, к 5-ФУ и его производным.

Практическая значимость работы

Внедрение в медицинскую практику результатов исследования позволит увеличить эффективность лекарственного лечения опухолей толстой кишки на основе индивидуального подбора цитостатических препаратов, а также снизит риск побочных эффектов, сопряженных с назначением химиотерапевтических агентов.

Кроме этого, посредством метода ПЦР в реальном времени разработаны для практического применения в онкологических учреждениях новые методики оценки экспрессии генов в минимальных количествах биологического материала, в частности, в биопсийных и цитологических препаратах.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Наряду с факторами, отражающими распространенность опухоли, ее клиническую и биохимическую активность, для прогнозирования течения заболевания принципиально важным является изучение ряда молекулярно-биологических показателей злокачественного процесса.

2. Индивидуализация лечения больных КРР на основе определения молекулярно-биологических параметров (ТС, ТФ, ДПД) может оптимизировать выбор терапии и получить максимальный эффект при минимальном риске осложнений.

Апробация и реализация результатов исследования

Материалы диссертации были доложены октября 2007 года на объединенной научной конференции отделения биотерапии и трансплантации костного мозга, химиотерапевтического, торакального отделений, отделения детской онкологии и гематологии, отделения опухолей желудочно-кишечного тракта и отделения общей онкологии ФГУ НИИ онкологии им. проф. H.H. Петрова Росмедтехнологии совместно с Кафедрой онкологии с курсом клинической радиологии Медицинской академии последипломного образования (МАЛО).

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 230 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Библиографический указатель включает 207 источников, в том числе 25 отечественных и 202 зарубежных. Работа иллюстрирована 35 таблицами и 77 рисунками.

ВЫВОДЫ

Колоректальный рак (КРР) представляет собой гетерогенную группу, имеющую наряду с морфологическими особенностями ряд отличительных клинических, биохимических, цитогенетических и молекулярно-биологических характеристик. Рациональное использование, как традиционных показателей, так и молекулярно-генетических, способствует адекватному построению прогноза относительно интенсивности прогрессирования и выживаемости конкретного больного КРР. Высокий уровень экспрессии ТС соответствует более частому появлению метастазов в послеоперационном периоде у больных КРР стадии Dukes' В-С (р=0,0187). Отрицательное влияние на показатели ОВ пациентов диссеминированным КРР оказывает повышенная внутриопухолевая активность ТС (р=0,0137) и ТФ (р=0,0366). При КРР стадии Dukes'B-C наличие в опухолевой ткани высокой экспрессии протеинов ТС и ТФ коррелирует со значительным уменьшением безрецидивной выживаемости (медиана БРВ=3 мес.) в отличие от больных, оперированных в той же стадии, но с молекулярным профилем аденокарциномы ТС(-)ТФ(-) (медиана БРВ=18 мес.) (р=0,0120). Наиболее благоприятный прогноз в отношении продолжительности БРВ отмечен у больных КРР, оперированных в стадии Dukes'B-C, с фенотипами ТС(-)ТФ(-)ДПД(-) (медиана БРВ=18,5 мес.) и ТС(-)ТФ(-)ДПД(+) (медиана БРВ=13,5 мес.) в сравнении с пациентами, оперированными в той же стадии, но с опухолевой структурой ТС(+)ТФ(+)ДПД(+) (медиана БРВ=3 мес.) (р=0,0295).

Высокая эффективность цитостатического лечения 5-ФУ и его производными достигалась только в ТС(-) случаях метастатического КРР (ПР+ЧР+СЗ=77%). При наличии повышенной внутриопухолевой концентрации ТС лечебный эффект нивелировался (П3=62%) (р<0,05).

Отсутствие экспрессии ТС и ТФ в первичной опухоли предсказывает высокую терапевтическую активность фторпиримидинов (ПР+ЧР+СЗ=82%) у больных диссеминированным КРР (р=0,0041). Совокупность положительных значений ферментов соответствует неблагоприятному исходу лечения (П3=84%) (р=0,0299). Подобная закономерность характерна и для двух других типов ко-экспрессии маркеров - ТС-ДПД и ТФ-ДПД (р<0,05).

Высокая концентрация ТС в первичной опухоли в сочетании с повышенной активностью ТФ и ДПД является достоверным фактором прогноза наиболее низкого ответа генерализованного КРР на 5-ФУ и его производные (П3=100%) (р=0,0043). Наиболее благоприятным опухолевым фенотипом в отношении ожидаемого результата лекарственного лечения и продолжительности времени до прогрессирования является комбинация ТС(-)ТФ(-)ДПД(-) (ПР+ЧР+СЗ=60%) (р=0,0237).

Анализ суммы высоких значений ТС, ТФ и ДПД внутри комбинаций показал, что у пациентов диссеминированным КРР, положительно ответивших на лечение, в 68% случаев опухолевый фенотип представлен сочетанием низких уровней экспрессии всех трех ферментов или высокой концентрацией любого одного (р=0,0177). При ПЗ в 77% образцов неопластической ткани отмечается сочетанная экспрессия двух или всех трех высоких значений данных энзимов (р=0,0078).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В комплекс диагностических мероприятий при постановке диагноза колоректального рака наряду с рутинными методами исследования следует включать молекулярно-генетический анализ уровней внутриопухолевой экспрессии ТС, ТФ и ДЦД для оценки прогноза заболевания и выбора потенциально эффективного лечения.