Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Поиск потенциальных антиагрегационных средств среди вновь синтезированных дериватов пиридин-3-карбоновой кислоты

На правах рукописи УДК:616.151.5-085.1-085.22

ГРИГОРЬЕВ Георгий Константинович

ПОИСК ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ АНТИАГРЕГАЦИОННЫХ СРЕДСТВ СРЕДИ ВНОВЬ СИНТЕЗИРОВАННЫХ ДЕРИВАТОВ ПИРИДИН-3-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ

14 00 25 - «Фармакология, клиническая фармакология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ООЗ176596

Москва - 2007

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный медико стоматологический университет Росздрава»

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Александр Георгиевич Муляр

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Д Б Утешев

доктор медицинских наук, профессор А С Кинзирский

Ведущее учреждение: ГНЦ РАМН

Защита состоится » 2008 г

в \Ь часов на заседании диссертационного совета Д 208 041 01 при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» по адресу 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20/1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского Государственного Медико-стоматологического Университета по адресу 127206, г. Москва, ул. Вучетича, д. 10а

Автореферат разослан « О» ЪЗч 2007 г

Ученый секретарь совета

доктор медицинских наук, профессор М.В. Балуда

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ

АДФ - Аденозиндифосфорная кислота; АФК - Активные формы кислорода, -ФЛА2 - Фосфолипаза А2,

[Са2+] 1 - Внутриклеточный уровень свободного кальция в

цитоплазме лимфоцитов, FMLP - Формилпептид,

LD5o - Острая токсичность, при которой происходит гибель 50%

животных, РМА - Форболовый эфир

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Активация гемостаза, вызванная агрегацией тромбоцитов, сопровождается развитием острого коронарного синдрома, нарушением мозгового кровообращения, эмболиями и др, приводящими к высокой смертности [ВП Балуда, 1997, ММ Дейл, Дж К Формен 1998, РГ Органов 1999, Т Brock, R McNish, 1999, Y-P Wu etal 2000]

Перспективным направлением в лечении этих заболеваний является применение лекарственных препаратов, изменяющих соотношение между продуктами метаболизма арахидоновой кислоты - простациклином и тромбоксаном А2 в сторону увеличения первого, что вызывает антиагрегационный эффект Способностью регулировать баланс между данными простаноидами обладают ацетилсалициловая кислота, пентоксифиллин, тиклопидин, клопидогрел, абциксимаб и др, хотя их применение не всегда достаточно эффективно и может спровоцировать различные осложнения [М Д Машковский 1997, 2001, Б Г Катцунг 1998,3 С Баркаган 2002, PJIC энциклопедия лекарств 2007]

Избирательное влияние на систему метаболизма арахидоновой кислоты, способствующее антиагрегационному действию, оказывает пиридин-3-карбоновая кислота, которая угнетает активность тромбоксансинтетазы и снижает уровень тромбогенного фактора - ТхА2, не влияя на синтез простациклина [A. Nagai et al 1994, KM Shakir et al 1995, A Pigazzi et al 1999]

Необходимо отметить, что выраженный эффект достигался применением достаточно высоких доз этого лекарства, способного вызвать нежелательные побочные действия [X Р Накопия 2002]

В тоже время имеются исследования, свидетельствующие, что по силе и продолжительности антиагрегационного эффекта пиридин-3-карбоновую

кислоту превосходили ее дериваты [Т Л. Конищева, С А. Макаров 1991, Л Ф Легонькова, М И Бушма 1997]

Все вышеизложенное послужило основанием для проведения экспериментов, связанных с поиском новых перспективных противотромботических лекарственных препаратов из выше указанного класса соединений, а также изучению некоторых аспектов механизма их действия.

Создание высокоэффективного и малотоксичного антиагреганта среди производных пиридин-3-карбоновой кислоты позволит предложить для клинической практики медикаментозное средство, предназначенное для борьбы с тромбозами и различными сердечно-сосудистыми заболеваниями

Данная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» по проблеме «Лекарственная регуляция гемостаза», № Госрегистрации 01200100390

Цель исследования

Цель исследования - скрининг новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты для последующего отбора и создания перспективного противотромботического лекарственного препарата

Задачи исследования

Для достижения намеченной цели были поставлены задачи

1 Изучить влияние 13 новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты (в сравнении с эталонной субстанцией) на агрегацию тромбоцитов, индуцируемую аденозиндифосфорной кислотой в условиях in vitro

2 Определить наиболее активное соединение, подавляющее агрегацию тромбоцитов, в условиях in vivo

3. Исследовать влияние перспективного антиагреганта на уровень свободного кальция [Ca2+]i в цитоплазме лимфоцитов доноров

4. Оценить возможность регуляции данньм соединением активности нейтрофилов доноров и больных, страдающих сердечно-сосудистой патологией

5. Определить острую токсичность (LD50) наиболее активного антиагрегационного соединения - деривата пиридин-3-карбоновой кислоты.

Научная новизна

Впервые проведен скрининг антиагрегационной активности 13 новых дериватов пиридин-3-карбоновой кислоты Отобрано вещество, способное угнетать активность тромбоцитов, как в условиях in vitro, так и при пероральном введении

Наиболее выраженным эффектом при данном пути введения обладает гидрохлорид диэтилового эфира Ы-(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты с условным шифром ИФК-366.

Доказано, что это вещество подавляет обмен ионов Са2+ в цитоплазме лимфоцитов здорового человека, за счет снижения выхода этих ионов из внутриклеточных депо, угнетает транспорт данного катиона через кальциевые каналы плазматических мембран клеток, по-видимому, через ингибирование активности Са2+-АТФ -азы

Установлено, что ИФК-366 не только в образцах крови доноров, но и у больных, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями (острый инфаркт миокарда, гипертоническая болезнь II ст ), подавляет образование нейтрофилами супероксид анион радикалов, не уступая по выявленному антиоксидантному эффекту ивдапамида

Результаты исследований, изложенные в диссертации, имеют существенную теоретическую значимость, они могут быть использованы при поиске новых противотромботических средств среди новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты.

Еще одним доказательством, подтверждающим необходимость внедрения потенциального антиагреганта в клиническую практику, является его низкая острая токсичность, что позволяет отнести данное вещество к IV классу токсичности Практическая значимость

Полученные данные позволили выявить среди новых дериватов пиридин-3-карбоновой кислоты вещества с антиагрегационными свойствами

Наиболее выраженной способностью подавлять агрегацию тромбоцитов (по сравнению с эталонным веществом) обладает гидрохлорид диэтилового эфира №(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты (ИФК-366) После соответствующих исследований по параметрам хронической токсичности это соединение может быть предложено для первой фазы клинических испытаний

Практическая значимость данного исследования определяется перспективами создания нового эффективного антиагреганта, что позволит снизить частоту осложнений основных сердечно-сосудистых заболеваний, повысить эффективность их первичной и вторичной профилактики, оптимизировать лечение и улучшить прогноз

Основные положения, выносимые на защиту

• Выявлено антиагрегационное действие новых производных

пиридин-3-карбоновой кислоты в условиях m vitro,

• Доказана высокая специфическая активность наиболее перспективного соединения в условиях перорального введения,

• Установлены некоторые аспекты механизма действия нового активного производного пиридин-3-карбоновой кислоты (снижение уровня [Ca2+]i в лимфоцитах доноров и подавление активности нейтрофилов у доноров и больных с острым инфарктом миокарда и гипертонической болезнью II ст),

• Определена низкая острая токсичность перспективного антиагрегационного средства Внедрение в практику

Результаты работы используются при чтении лекций и проведения семинарских занятий по темам. «Средства, влияющие на свертывание крови», «Противотромботические препараты» у студентов лечебного и стоматологического факультетов на кафедрах фармакологии и клинической фармакологии МГМСУ

Личный вклад автора

Для оценки антиагрегационной активности было использовано достаточное количество лабораторных животных и кровь доноров, больных с инфарктом миокарда, гипертонической болезнью II ст Автором самостоятельно освоены и лично проводились современные методики исследования метод Борна для исследования агрегации тромбоцитов, метод хемилюминесценции для оценки активности нейтрофилов, метод спектрофлуометрии для измерения уровня концентрации внутриклеточного кальция и метод оценки острой токсичности Апробация диссертации

Основные положения диссертации были обсуждены на совместном заседании кафедр фармакологии и клинической фармакологии Московского Государственного медико-стоматологического университета (протокол № 7 от 04 05 2007г) Публикации

Результаты исследований по теме диссертации изложены в 7 печатных научных работах, в том числе 1 работа в журнале, рекомендованном ВАК Минобразования РФ

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 107 страницах машинописного текста и состоит из введения, описания материалов и методов исследования,

трех глав собственных исследований, заключения и выводов, содержит 22 рисунка, 7 таблиц Список используемой литературы включает 59 отечественных и 106 зарубежных источников

Материалы и методы исследования

В ходе опытов использовались 78 кроликов, 72 мыши, кровь здоровых доноров и кровь больных, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями

Было исследовано 16 химических веществ - производных пиридин-3-карбоновой кислоты Данные химически чистые вещества были синтезированы старшим научным сотрудником НИИ Фармакологии РАМН Е А Кузнецовой и любезно предоставлены для исследований 13 из них растворимы в Н20 (ИБХФ-21, ИБХФ-22, ИБХФ-24, ИБХФ-20, ИФК-393, ИФК-309, ИФК-367, ИФК-321, ИФК-472, ИФК-366, ЛБК-10, ЛБК-78, ЛБК-149) и 3 вещества (ИБХФ-23, ИФК-406, ИФК-392) нерастворимы не только в Н20, но и в ТВИН и ДМСО

Исследование агрегации тромбоцитов

Исследование агрегации тромбоцитов проводилось по методу Born GVR (1962) До начала опыта и в конце его в каждом образце плазмы подсчитывалось количество тромбоцитов Если она содержала большее количество тромбоцитов, ее разводили до нужной концентрации плазмой, бедной тромбоцитами, которую получали центрифугированием крови при 650g (3000 об /мин) в течение 10 минут

Исследование агрегации тромбоцитов проводилось на агрегометре фирмы «Chrono-log» (США)

Исследуемые вещества изучались в концентрациях 10'3, 10"4 и 10"5М, при необходимости их концентрации последовательно уменьшали до той, при которой действие АДФ восстанавливалось до контрольных значений (in vitro) или для доз через определенные промежутки времени (30, 60, 120, 180 и 240 минут) после перорального введения животным (in vivo) В качестве

препарата сравнения использовалась пиридин-3-карбоновая кислота с ранее установленным антиагрегационным эффектом Индуктором агрегации была выбрана АДФ - НПО «Ренам», Россия; (серийный № 0902) - в концентрации 10"5М

Полученные данные обрабатывалась методом вариационной статистики Достоверность полученных результатов оценивалась с применением критерия Стыодента-Фишера В работе был принят уровень вероятности р< 0,05

Регистрация образования активных форм кислорода «Дыхательный взрыв»

Для определения АФК использовался чувствительный метод хемилюминисценции люминофоров - соединений, возбуждающихся в результате взаимодействия с радикалами кислорода и затем люминесцирующих в более длинноволновой области спектра при их рекомбинации В качестве люминофора использовался люцигенин, конечная концентрация которого в пробе составила 20 мкМ Хемилюмининсценция регистрировалась в виде количества импульсов в минуту на люминометре «Биотокс-7», соединенным с персональным компьютером. Эксперименты проводились на образцах неразведенной периферической цельной крови здоровых доноров и крови больных острым инфарктом миокарда и гипертонической болезнью II стадии Кровь бралась непосредственно перед экспериментом в шприц, стенки которого предварительно обрабатывались гепарином (500 МЕ/мл)

Изучение концентрации свободного кальция [Ca2+li в лимфоцитах здорового человека

Величина концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме клеток оценивалась с помощью флуоресцентного индикатора ионов кальция Fura-2M Измерение флуоресценции проводилось на спектрофлуориметре Hitachi F-4000 (Япония).

Определение острой токсичности

Острая токсичность (LD5o) исследуемого соединения определялась на мышах массой 20+2 г при постоянной температуре окружающей среды (20-22°С).

LDjo рассчитывалась по методу Кербера, спустя 24 часа после введения вещества.

Результаты исследования

Распространенность тромбозов, занимающих существенное место среди непосредственных причин смерти больных при различных сердечнососудистых заболеваниях, диктует необходимость поиска новых эффективных противотромботических веществ, в тч антиагрегантов для профилактики и лечения осложнений основных заболеваний сердечнососудистой системы Целесообразность проведения исследований производных пиридин-3-карбоновой кислоты обусловлена тем, что ее дериваты обладают широким спектром биологической активности

В соответствии с этим первая серия опытов была посвящена изучению влияния 13 новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов в условиях in vitro по сравнению с эталонным препаратом - пиридин-3-карбоновой кислотой. Выбор данной модели стимуляции тромбоцитов был обусловлен тем, что АДФ является одним из наиболее мощных активаторов данных форменных элементов крови Исследуемые субстанции использовались в концентрациях от 10*6 до 10"3М(табл 1, рис 1)

В результате опытов было установлено, что 3 вещества в разной степени угнетали АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов. Наиболее выраженной способностью подавлять основную функцию тромбоцитов, обладало вещество ИФК-366 В концентрации 10"3М оно снижало показатель агрегации, т.е процент падения оптической плотности плазмы на 27% по сравнению с контролем В концентрации Ю^М действие АДФ еще больше

ослабевало и составило 34% от первоначальных значений Данный эффект был в 1,9 раза был выше, чем у пиридин-3-карбоновой кислоты в концентрации 10'3М (18%)

Таблица 1

Влияние новых производных пиридин-З-карбоновой кислоты на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов кроликов в условиях ш

vitro.

№ № Вещества % падения оптической плотности плазмы, богатой тромбоцитами

Концентрации исследуемых веществ

Контроль (АДФ) 10~JM /А% ЮЛМ/А% 10"5М/Д% ю-^м/ А%

1 ИФК-309 58,7±1,7 57,5+2,2 58,6±2,1 59,9+2,4 -

2 ИФК-393 59,1±2,3 61,4±2,9 61,6±2,9 62,8±2,1 -

3 ИФК-367 53,2±1,9 55,8±2,1 58,4±2,1 56,0±1,9 -

4 ИФК-321 48,4±1,3 42,0±1,7*/13 44,7±1,7 46,3±1,8 -

5 ИФК-472 49,8+2,0 42,4±2,0*/15 37,4±М*/25 39,2±1,4*/21 48,7±2,5

6 ИФК-366 48,8±0,8 35,6±1,9*/27 32,2±1Д#/34 39,7±2,4*/19 51,1+1,8

7 ИБХФ-20 53,4±1,2 54,6±1,3 53,7±0,7 53,2±1,7 -

8 ИБХФ-24 57,3+1,8 58,5±1,3 58,2±1,8 57,7±1,3 -

9 ИБХФ-22 55,3±0,7 56,8±1,7 55,0±1,8 58,0+2,1 -

10 ИБХФ-21 60,7±1,2 53,6±2,1 62,3±1,6 62,1±1,7 -

11 ЛБК-10 60,2+2,6 62,2±2,6 64,5±2,8 65,7±2,4 -

12 ЛБК-78 65,6±1,8 66,0+2,0 66,2+2,3 67,2±2,4 -

13 ЛБК-149 54,6±1,7 52,2±1,9 55,3±2,2 54,2±1,7 -

14 Пнрвдин-3-карбоновая кислота 56,6±1,7 46^±1,8»/18 56,5±1,4 57,9±2,2

Примечание: * - достоверно по сравнению с контролем при р<0,05,

А - эффективность, по сравнению с контролем (в %)

При использовании ИФК-366 в концентрации 10"5М наблюдалось ослабление антиагрегационного эффекта, тк процент падения оптической плотности плазмы, обогащенной тромбоцитами, не превышал 19% по сравнению с таковым одного АДФ Более низкая концентрация изучаемого вещества (10" 6М) не оказывала ожидаемого эффекта

Вещество ИФК-472 наиболее активно подавляло склеивание тромбоцитов в концентрации Ю^М (25% от исходных значений) При последующем десятикратном разведении этот процесс практически сохранялся и составил 21% В концентрации Ю^М действие ИФК-472 прекращалось

Соединение ИФК-321 инициировало антиагрегационное действие (13% от контроля, при р<0,05) только в концентрации 10'3М

Остальные изученные вещества (ИФК-309, 393, 367, ЛБК-10, 78, 149, ИБХФ-20, 21, 22 и 24) по отношению к изучаемой функции тромбоцитов были инертны

Учитывая, что 2 соединения из 13 изученных новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты (ИФК-366 и ИФК-472) были наиболее активны и подавляли АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов в условиях in vitro в диапазоне концентраций от 10"5 до 10'3М, именно они были отобраны для последующего этапа опытов в условиях живого организма (in vivo)

В постановке данного эксперимента дозы изучаемых веществ рассчитывались с учетом максимально эффективных концентраций, найденных в опытах in vitro, с последующей аппроксимацией на массу тела кроликов, при этом объем крови считался равным 10% от веса животного

Разовая доза исследуемых веществ варьировала в соответствии с их молекулярной массой и вводилась перорально

т ю-зм

т 10-4М □ 10-5М

ИФК-321 ИФК-472 ИФК-366

Рис. 1. Изменение оптической плотности плазмы, обогащенной тромбоцитами, под влиянием ИФК-321, ИФК-472 и ИФК-366 (в % по отношению к контролю).

Использование вещества ИФК-472 во всех изученных дозах (4, 8 и 16 мг/кг) в течение всего периода наблюдения (240 мин ), не сопровождалось подавлением агрегации тромбоцитов кроликов

Введение ИФК-366 в дозе 2 мг/кг на всех этапах опыта, не оказывало антиагрегационного эффекта

Применение ИФК-366 в дозе 4 мг/кг через 90 мин после перорального введения, снижало процент падения оптической плотности плазмы, обогащенной тромбоцитами по сравнению с контролем в 2 раза Еще через 30 мин опыта эффект незначительно ослабевал и сохранялся на протяжении трех часов наблюдения Последующий забор крови через 240 мин после начала эксперимента не выявил каких-либо значимых различий по сравнению с действием одного АДФ (рис 2)

При увеличении дозы ИФК-366 в 2 раза активность тромбоцитов, индуцированная АДФ, снизилась через час после перорального введения в 1,4 раза, а еще через 30 мин. функция данных форменных элементов крови восстановилась

Таким образом, можно утверждать, что новое производное пиридин-3-карбоновой кислоты подавляет индуцированную агрегацию тромбоцитов как в условиях m vitro, так и in vivo.

Этот факт послужил основанием для продолжения исследований с целью уточнения некоторых механизмов его антиагрегационного действия

48,2

I 52,9

; —2мг/кг;

4мг/кг ~й~8мг/кг

контроль 30 мин 60 мин 90 мин 120 мин 180 мин 240 мин

Рис. 2. Влияние ИФК-366 на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов кроликов при пероральном введении.

Примечание: * - достоверно, по сравнению с контролем, при р< 0,05.

Была сделана попытка определить изменение уровня свободного кальция [Ca2+]i в цитоплазме лимфоцитов доноров под влиянием ИФК-366, учитывая, что данный ион играет ведущую роль в процессах тромбообразования Лимфоциты были выбраны в качестве объекта исследования не случайно, т к вследствие сходных с тромбоцитами механизмов кальциевого обмена они являются более стабильными клетками крови и меньше реагируют на центрифугирование и другие механические воздействия при обработке

Известно, что повышение внутриклеточного Са2+ приводит к активации Са2+-зависимой ФЛА2, отщеплению от мембранных фосфолипидов арахидоновой кислоты и последующему образованию из нее тромбоксана А2, который по принципу положительной обратной связи способствует дальнейшему усилению стимуляции и вовлечению в процесс тромбообразования новых циркулирующих тромбоцитов

С помощью метода спектрофлуометрии при изучении ИФК-366 на [Ca2+]i в цитоплазме лимфоцитов доноров было установлено, что данное производное пиридин-3-карбоновой кислоты подавляет его исходный уровень, по-видимому, угнетая активность SOC каналов (store operated Са2+ channels), которое было повышено тапсигаргином (стандартный либератор Са2+)

Принимая во внимание способность ИФК-366 снижать [Ca2+]i на примере лимфоцитов, можно высказать предположение, что антиагрегационный эффект изученного вещества реализуется через регуляцию уровня данного катиона

«Дыхательный взрыв» имеет большое значение при патологии сердечно-сосудистой системы Образующиеся в результате этого процесса АФК, обладают выраженным реакционным действием и могут изменять

активность и структуру многих макромолекул в клетках различных органов и тканей

Кроме того, избыток данных пероксидных анионов может повышать агрегацию тромбоцитов

Было доказано, что ИФК-366 в широком диапазоне концентраций угнетает образование АФК, индуцированное различными дозами стандартных агентов - FMLP и РМА в образцах цельной крови не только здоровых доноров, но и больных, страдающих инфарктом миокарда и гипертонической болезнью II ст (рис 3) Этот эффект по силе действия не уступает аналогичному у индапамида, как известно, обладающего не только диуретическим эффектом, но и антиоксидантным действием.

ТО

кда

■ А'

V \

К 4

„v-f* :

\r

- /

/

y"---:

г

\ t

■30

■(m)

Рис. 3. Влияние бактериального трипептида - формил-метионин-лецил-фенилаланина (FLMP), форболового эфира (РМА) и с ИФК-366 на образование АФК в образце цельной крови больного острым инфарктом миокарда.

FMLP - ЗмкМ, РМА - 1мкМ, ИФК-366 - 50 мкМ

По оси абсцисс - время в мин. (10,20 и 30 мин.)

По оси ординат - количества имп. в мин.

Повышенная активность указанного вещества (антиагрегационный

эффект, угнетение образования активных форм кислорода нейтрофилами человека) может быть объяснена высокой степенью стерического (конформационного) соответствия данного рецепторного аппарата и ИФК-366 и, как следствие, эффективным биологическим ответом.

При определении острой токсичности было установлено, что LD50 ИФК-366 составляет 3334 мг/кг, что позволяет отнести его по классификации Hodge и Sterner к IV классу, т.е. к группе относительно безвредных веществ (И.В. Саноцкий, 1997).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о высокой антиагрегационной эффективности ИФК-366 и диктуют необходимость изучения хронической токсичности ИФК-366 с целью получения разрешения на клинические испытания в качестве противотромботического (антиагрегационного) средства

Выводы

1 При скрининге антиагрегационной активности 13 новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты у 3 ее производных (ИФК-321, ИФК-472 и ИФК-366) выявлено ослабление АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в условиях in vitro

2 При пероральном введении кроликам, лишь гидрохлорид диэтилового эфира К-(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты (ИФК-366) ингибировал агрегацию тромбоцитов

3 Гидрохлорид диэтилового эфира М-(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты угнетает транспорт Са2+ через кальциевые каналы плазматических мембран лимфоцитов доноров и снижает [Ca2+]i в данных форменных элементах крови

4 Гидрохлорид диэтилового эфира >1-(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты подавляет образование активных форм кислорода в образцах цельной крови доноров и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями (инфаркт миокарда, гипертоническая болезнь Пет), не уступая индопамиду

5 Потенциальный антиагрегант - гидрохлорид диэтилового эфира Ы-(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты относится к группе относительно безвредных соединений (LD50 -3334 мг/кг)

Практические рекомендации

Результаты исследований позволили дать рекомендации химикам для продолжения синтеза химических соединений среди производных пиридин-3-карбоновой кислоты с заданной биологической активностью в целях дальнейшего поиска перспективных противотромботических лекарственных препаратов

Полученные результаты являются основной частью пакета документов для получения в МЗ и СР РФ разрешения на клинические исследования гидрохлорида диэтилового эфира М-(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты (ИФК - 366) для последующего внедрения его в медицинскую практику, как эффективного антиагрегационного средства

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Григорьев Г К, Муляр А Г, Гасанов М Т, Изюмов Е Г / Влияние нового производного пиридин-3-карбоновой кислоты на образование активных радикалов кислорода фагоцитами крови здоровых и больных людей, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями и изменение уровня внутриклеточного кальция в цитоплазме лимфоцитов человека// Материалы научно-практической конференции «Общество Здоровье Лекарство» - Саранск - 2005 - С 42

2 Муляр А Г , Гасанов М Т, Григорьев Г К, Кириллова А В / Сравнительная оценка антиагрегационной активности новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты// Материалы научно-практической конференции «Общество Здоровье Лекарство» - Саранск -2005 -С 76-77

3 Григорьев Г К, Гасанов М Т / Изучение влияния новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты на тромбоцитарный гемостаз// Материалы конференции «Молодежная наука и современность» - Курск - 2006 - С 67

4 Муляр А Г, Григорьев Г К, Гасанов М Т , Авфукова ЮС/ Поиск новых антиагрегантов среди производных пиридин-3-карбоновой кислоты//

Сборник материалов XIII национального конгресса «Человек и Лекарство» -Москва-2006-С 561

5. Муляр А.Г., Григорьев Г.К., Гасанов М.Т., Кириллова A.B./ Пути лекарственной профилактики и лечения тромбозов с помощью новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты// Нижегородский медицинский журнал.- Нижний Новгород.- 2006. - №7.- С. 115-117

6. Гасанов М.Т, Муляр А Г, Григорьев Г К , Кириллова А В , Останин А А/ Новые производные пиридин-3-карбоновой кислоты, как источник получения новых противотромботических средств// Сборник материалов XIV национального конгресса «Человек и Лекарство» - Москва - 2007 - С 811

7 Останин А А, Муляр А Г, Гасанов М.Т., Григорьев Г.К / Экспериментальное исследование противотромботической активности новых дериватов пиридин-3-карбоновой кислоты// Материалы 9-го Всероссийского научно-образовательного форума «Кардиология 2007» - Москва - 2007 - С 222-223

Заказ № 546 Объем 1 п л. Тираж 100 ж;

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Активация гемостаза, вызванная агрегацией тромбоцитов, сопровождается развитием острого коронарного синдрома, нарушением мозгового кровообращения, эмболиями и др., приводящими к высокой смертности населения [16, 33, 38, 84, 88, 138].

Перспективным путем в лечении этих заболеваний, является применение лекарственных препаратов, изменяющих соотношение между продуктами метаболизма арахидоновой кислоты, т.е. простациклина' и, тромбоксана А2, в сторону увеличения первого, и вызывающих, антиагрегационный эффект. Такой возможностью регулировать баланс между указанными простаноидами обладают ацетилсалициловая кислота, пентоксифиллин, тиклопидин, клопидогрел, абциксимаб и др. В то же время их применение не всегда- достаточно эффективно и' может спровоцировать различные осложнения [3, 5, 19, 24, 25, 42, 97].

Избирательным влиянием на систему метаболизма арахидоновой кислоты, способствующим антиагрегационному действию, обладает пиридинкарбоновая кислота, которая! угнетает активность тромбоксансинтетазы и снижает уровень тромбогенного фактора — ТхА2, не влияя на синтез простациклина [132^ 133, 134].

Однако, необходимо отметить, что выраженный эффект достигался применением достаточно высоких доз этого лекарства, способного вызвать нежелательные эффекты [30]'.

В тоже время имеются публикации, которые свидетельствуют, что по силе и продолжительности антиагрегационного эффекта, пиридин-3-карбоновую кислоту превосходили ее дериваты [21, 22].

Все выше изложенное, послужило основанием для проведения наших экспериментов, связанных с поиском новых, перспективных противотромботических лекарственных препаратов из выше указанного класса соединений, а так же изучению некоторых аспектов механизма их действия.

Таким образом, успешное решение создания высокоэффективного и малотоксичного антиагреганта среди производных пиридин-3-карбоновой кислоты, позволит предложить для клинической практики медикаментозное средство, предназначенное для борьбы с тромбозами и различными сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Данная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» по проблеме «Лекарственная регуляция гемостаза», № Госрегистрации 01200100390.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель исследования < — скрининг новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты для последующего отбора и создания перспективного противотромботического лекарственного препарата.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Для достижения намеченной цели были поставлены задачи:1

1. Изучить влияние 13 новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты (в сравнении с эталонной субстанцией) на агрегацию тромбоцитов, индуцируемую аденозиндифосфорной кислотой в условиях in vitro.

2. Определить наиболее активное соединение, подавляющее агрегацию тромбоцитов, в условиях in'vivo.

3. Исследовать- влияние перспективного антиагреганта на о I уровень свободного кальция [Са ]i в цитоплазме лимфоцитов доноров.

4. Оценить возможность регуляции данным соединением активности нейтрофилов доноров и больных, страдающих сердечно-сосудистой патологией.

5. Определить острую токсичность (LD5o) наиболее активного антиагрегационного соединения - деривата пиридин-3-карбоновой кислоты.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЙ

Впервые проведен скрининг антиагрегационной активности 1 13 новых дериватов пиридин-3-карбонвой кислоты. Отобрано вещество, способное угнетать активность тромбоцитов, как в условиях in vitro, так и при пероральном введении.

Наиболее выраженным эффектом при данном пути введения обладает гидрохлорид диэтилового эфира 1ЧГ-(5-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты с условным шифром ИФК-366.

Доказано, что это вещество подавляет обмен ионов Са в лимфоцитах здорового человека, за счет снижения выхода этих ионов из внутриклеточных депо, угнетает транспорт данного катиона через кальциевые каналы плазматических мембран клеток, по-видимому, через ингибирование активности

Са -АТФ

-азы.

Установлено, что ИФК-366 не только в образцах крови доноров, но и у больных, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями-(острый инфаркт миокарда, гипертоническая болезнь II ст.), подавляет образование нейтрофилами человека супероксид анион радикалов, не уступая по выявленному антиоксидантному эффекту индапамиду.

Результаты исследований, изложенные в диссертации, существенную теоретическую значимость: они могут быть использованы при поиске новых противотромботических средств среди новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты.

Еще одним доказательством, подтверждающим необходимость внедрения потенциального антиагреганта в клиническую практику, является его низкая острая токсичность, позволяющая отнести данное вещество к IV классу токсичности.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ Полученные данные позволили выявить среди новых дериватов пиридин-3-карбоновой кислоты вещества с антиагрегационными свойствами. измерения уровня концентрации внутриклеточного кальция и метод изучения острой токсичности.

Апробация диссертации

Основные положения диссертации были обсуждены на совместном заседании кафедр фармакологии и клинической фармакологии Московского Государственного медико-стоматологического университета (протокол № 7 от 04.05.2007г. 2007г.)

Публикации

Результаты исследований по теме диссертации изложены в 7 печатных научных работах, в том числе 1 работа в журнале, рекомендованном ВАК Минобразования РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 103 страницах машинописного текста и состоит из введения, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения и выводов, содержит 21 рисунок, 7 таблиц. Список используемой литературы включает 59 отечественных и 106 зарубежных источников.

ВЫВОДЫ

1. При скрининге антиагрегационной активности 13 новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты у 3 ее производных (ИФК-321, ИФК-472 и ИФК-366) выявлено ослабление АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в условиях in vitro.

2. При пероральном введении кроликам, лишь гидрохлорид диэтилового эфира №(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты (вещество ИФК-366) ингибировал агрегацию тромбоцитов.

3. Гидрохлорид диэтилового эфира 1чГ-(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты угнетает транспорт Са2+ через кальциевые каналы плазматических мембран лимфоцитов доноров и снижало [Ca2+]i в данных форменных элементах крови.

4. Гидрохлорид диэтилового эфира №(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты подавляет образование активных форм кислорода в образцах цельной крови доноров и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями (инфаркт миокарда, гипертоническая болезнь Пет.), не уступая индопамиду.

5. Потенциальный антиагрегант - гидрохлорид диэтилового эфира >1-(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты относится к группе малотоксичных соединений (LD50 - 3334 мг/кг).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Результаты исследований позволили дать рекомендации химикам для продолжения синтеза химических соединений среди производных пиридин-3-карбоновой кислоты с заданной биологической активностью в целях дальнейшего поиска перспективных противотромботических лекарственных препаратов.

Полученные результаты являются основной частью пакета документов для получения в МЗ РФ и CP разрешения на клинические исследования гидрохлорида диэтилового эфира Ы-(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты (ИФК — 366) для последующего внедрения его в медицинскую практику, как эффективного антиагрегационного средства.