Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Поиск потенциальных антиагрегационных средств среди вновь синтезированных дериватов пиридин-3-карбоновой кислоты

ДИССЕРТАЦИЯ
Поиск потенциальных антиагрегационных средств среди вновь синтезированных дериватов пиридин-3-карбоновой кислоты - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
Поиск потенциальных антиагрегационных средств среди вновь синтезированных дериватов пиридин-3-карбоновой кислоты - тема автореферата по медицине
Григорьев, Георгий Константинович Москва 2008 г.
Ученая степень
кандидата медицинских наук
ВАК РФ
14.00.25
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Поиск потенциальных антиагрегационных средств среди вновь синтезированных дериватов пиридин-3-карбоновой кислоты

На правах рукописи УДК:616.151.5-085.1-085.22

ГРИГОРЬЕВ Георгий Константинович

ПОИСК ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ АНТИАГРЕГАЦИОННЫХ СРЕДСТВ СРЕДИ ВНОВЬ СИНТЕЗИРОВАННЫХ ДЕРИВАТОВ ПИРИДИН-3-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ

14 00 25 - «Фармакология, клиническая фармакология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ООЗ176596

Москва - 2007

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный медико стоматологический университет Росздрава»

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Александр Георгиевич Муляр

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Д Б Утешев

доктор медицинских наук, профессор А С Кинзирский

Ведущее учреждение: ГНЦ РАМН

Защита состоится » 2008 г

в \Ь часов на заседании диссертационного совета Д 208 041 01 при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» по адресу 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20/1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского Государственного Медико-стоматологического Университета по адресу 127206, г. Москва, ул. Вучетича, д. 10а

Автореферат разослан « О» ЪЗч 2007 г

Ученый секретарь совета

доктор медицинских наук, профессор М.В. Балуда

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ

АДФ - Аденозиндифосфорная кислота; АФК - Активные формы кислорода, -ФЛА2 - Фосфолипаза А2,

[Са2+] 1 - Внутриклеточный уровень свободного кальция в

цитоплазме лимфоцитов, FMLP - Формилпептид,

LD5o - Острая токсичность, при которой происходит гибель 50%

животных, РМА - Форболовый эфир

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Активация гемостаза, вызванная агрегацией тромбоцитов, сопровождается развитием острого коронарного синдрома, нарушением мозгового кровообращения, эмболиями и др, приводящими к высокой смертности [ВП Балуда, 1997, ММ Дейл, Дж К Формен 1998, РГ Органов 1999, Т Brock, R McNish, 1999, Y-P Wu etal 2000]

Перспективным направлением в лечении этих заболеваний является применение лекарственных препаратов, изменяющих соотношение между продуктами метаболизма арахидоновой кислоты - простациклином и тромбоксаном А2 в сторону увеличения первого, что вызывает антиагрегационный эффект Способностью регулировать баланс между данными простаноидами обладают ацетилсалициловая кислота, пентоксифиллин, тиклопидин, клопидогрел, абциксимаб и др, хотя их применение не всегда достаточно эффективно и может спровоцировать различные осложнения [М Д Машковский 1997, 2001, Б Г Катцунг 1998,3 С Баркаган 2002, PJIC энциклопедия лекарств 2007]

Избирательное влияние на систему метаболизма арахидоновой кислоты, способствующее антиагрегационному действию, оказывает пиридин-3-карбоновая кислота, которая угнетает активность тромбоксансинтетазы и снижает уровень тромбогенного фактора - ТхА2, не влияя на синтез простациклина [A. Nagai et al 1994, KM Shakir et al 1995, A Pigazzi et al 1999]

Необходимо отметить, что выраженный эффект достигался применением достаточно высоких доз этого лекарства, способного вызвать нежелательные побочные действия [X Р Накопия 2002]

В тоже время имеются исследования, свидетельствующие, что по силе и продолжительности антиагрегационного эффекта пиридин-3-карбоновую

кислоту превосходили ее дериваты [Т Л. Конищева, С А. Макаров 1991, Л Ф Легонькова, М И Бушма 1997]

Все вышеизложенное послужило основанием для проведения экспериментов, связанных с поиском новых перспективных противотромботических лекарственных препаратов из выше указанного класса соединений, а также изучению некоторых аспектов механизма их действия.

Создание высокоэффективного и малотоксичного антиагреганта среди производных пиридин-3-карбоновой кислоты позволит предложить для клинической практики медикаментозное средство, предназначенное для борьбы с тромбозами и различными сердечно-сосудистыми заболеваниями

Данная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» по проблеме «Лекарственная регуляция гемостаза», № Госрегистрации 01200100390

Цель исследования

Цель исследования - скрининг новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты для последующего отбора и создания перспективного противотромботического лекарственного препарата

Задачи исследования

Для достижения намеченной цели были поставлены задачи

1 Изучить влияние 13 новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты (в сравнении с эталонной субстанцией) на агрегацию тромбоцитов, индуцируемую аденозиндифосфорной кислотой в условиях in vitro

2 Определить наиболее активное соединение, подавляющее агрегацию тромбоцитов, в условиях in vivo

3. Исследовать влияние перспективного антиагреганта на уровень свободного кальция [Ca2+]i в цитоплазме лимфоцитов доноров

4. Оценить возможность регуляции данньм соединением активности нейтрофилов доноров и больных, страдающих сердечно-сосудистой патологией

5. Определить острую токсичность (LD50) наиболее активного антиагрегационного соединения - деривата пиридин-3-карбоновой кислоты.

Научная новизна

Впервые проведен скрининг антиагрегационной активности 13 новых дериватов пиридин-3-карбоновой кислоты Отобрано вещество, способное угнетать активность тромбоцитов, как в условиях in vitro, так и при пероральном введении

Наиболее выраженным эффектом при данном пути введения обладает гидрохлорид диэтилового эфира Ы-(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты с условным шифром ИФК-366.

Доказано, что это вещество подавляет обмен ионов Са2+ в цитоплазме лимфоцитов здорового человека, за счет снижения выхода этих ионов из внутриклеточных депо, угнетает транспорт данного катиона через кальциевые каналы плазматических мембран клеток, по-видимому, через ингибирование активности Са2+-АТФ -азы

Установлено, что ИФК-366 не только в образцах крови доноров, но и у больных, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями (острый инфаркт миокарда, гипертоническая болезнь II ст ), подавляет образование нейтрофилами супероксид анион радикалов, не уступая по выявленному антиоксидантному эффекту ивдапамида

Результаты исследований, изложенные в диссертации, имеют существенную теоретическую значимость, они могут быть использованы при поиске новых противотромботических средств среди новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты.

Еще одним доказательством, подтверждающим необходимость внедрения потенциального антиагреганта в клиническую практику, является его низкая острая токсичность, что позволяет отнести данное вещество к IV классу токсичности Практическая значимость

Полученные данные позволили выявить среди новых дериватов пиридин-3-карбоновой кислоты вещества с антиагрегационными свойствами

Наиболее выраженной способностью подавлять агрегацию тромбоцитов (по сравнению с эталонным веществом) обладает гидрохлорид диэтилового эфира №(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты (ИФК-366) После соответствующих исследований по параметрам хронической токсичности это соединение может быть предложено для первой фазы клинических испытаний

Практическая значимость данного исследования определяется перспективами создания нового эффективного антиагреганта, что позволит снизить частоту осложнений основных сердечно-сосудистых заболеваний, повысить эффективность их первичной и вторичной профилактики, оптимизировать лечение и улучшить прогноз

Основные положения, выносимые на защиту

• Выявлено антиагрегационное действие новых производных

пиридин-3-карбоновой кислоты в условиях m vitro,

• Доказана высокая специфическая активность наиболее перспективного соединения в условиях перорального введения,

• Установлены некоторые аспекты механизма действия нового активного производного пиридин-3-карбоновой кислоты (снижение уровня [Ca2+]i в лимфоцитах доноров и подавление активности нейтрофилов у доноров и больных с острым инфарктом миокарда и гипертонической болезнью II ст),

• Определена низкая острая токсичность перспективного антиагрегационного средства Внедрение в практику

Результаты работы используются при чтении лекций и проведения семинарских занятий по темам. «Средства, влияющие на свертывание крови», «Противотромботические препараты» у студентов лечебного и стоматологического факультетов на кафедрах фармакологии и клинической фармакологии МГМСУ

Личный вклад автора

Для оценки антиагрегационной активности было использовано достаточное количество лабораторных животных и кровь доноров, больных с инфарктом миокарда, гипертонической болезнью II ст Автором самостоятельно освоены и лично проводились современные методики исследования метод Борна для исследования агрегации тромбоцитов, метод хемилюминесценции для оценки активности нейтрофилов, метод спектрофлуометрии для измерения уровня концентрации внутриклеточного кальция и метод оценки острой токсичности Апробация диссертации

Основные положения диссертации были обсуждены на совместном заседании кафедр фармакологии и клинической фармакологии Московского Государственного медико-стоматологического университета (протокол № 7 от 04 05 2007г) Публикации

Результаты исследований по теме диссертации изложены в 7 печатных научных работах, в том числе 1 работа в журнале, рекомендованном ВАК Минобразования РФ

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 107 страницах машинописного текста и состоит из введения, описания материалов и методов исследования,

трех глав собственных исследований, заключения и выводов, содержит 22 рисунка, 7 таблиц Список используемой литературы включает 59 отечественных и 106 зарубежных источников

Материалы и методы исследования

В ходе опытов использовались 78 кроликов, 72 мыши, кровь здоровых доноров и кровь больных, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями

Было исследовано 16 химических веществ - производных пиридин-3-карбоновой кислоты Данные химически чистые вещества были синтезированы старшим научным сотрудником НИИ Фармакологии РАМН Е А Кузнецовой и любезно предоставлены для исследований 13 из них растворимы в Н20 (ИБХФ-21, ИБХФ-22, ИБХФ-24, ИБХФ-20, ИФК-393, ИФК-309, ИФК-367, ИФК-321, ИФК-472, ИФК-366, ЛБК-10, ЛБК-78, ЛБК-149) и 3 вещества (ИБХФ-23, ИФК-406, ИФК-392) нерастворимы не только в Н20, но и в ТВИН и ДМСО

Исследование агрегации тромбоцитов

Исследование агрегации тромбоцитов проводилось по методу Born GVR (1962) До начала опыта и в конце его в каждом образце плазмы подсчитывалось количество тромбоцитов Если она содержала большее количество тромбоцитов, ее разводили до нужной концентрации плазмой, бедной тромбоцитами, которую получали центрифугированием крови при 650g (3000 об /мин) в течение 10 минут

Исследование агрегации тромбоцитов проводилось на агрегометре фирмы «Chrono-log» (США)

Исследуемые вещества изучались в концентрациях 10'3, 10"4 и 10"5М, при необходимости их концентрации последовательно уменьшали до той, при которой действие АДФ восстанавливалось до контрольных значений (in vitro) или для доз через определенные промежутки времени (30, 60, 120, 180 и 240 минут) после перорального введения животным (in vivo) В качестве

препарата сравнения использовалась пиридин-3-карбоновая кислота с ранее установленным антиагрегационным эффектом Индуктором агрегации была выбрана АДФ - НПО «Ренам», Россия; (серийный № 0902) - в концентрации 10"5М

Полученные данные обрабатывалась методом вариационной статистики Достоверность полученных результатов оценивалась с применением критерия Стыодента-Фишера В работе был принят уровень вероятности р< 0,05

Регистрация образования активных форм кислорода «Дыхательный взрыв»

Для определения АФК использовался чувствительный метод хемилюминисценции люминофоров - соединений, возбуждающихся в результате взаимодействия с радикалами кислорода и затем люминесцирующих в более длинноволновой области спектра при их рекомбинации В качестве люминофора использовался люцигенин, конечная концентрация которого в пробе составила 20 мкМ Хемилюмининсценция регистрировалась в виде количества импульсов в минуту на люминометре «Биотокс-7», соединенным с персональным компьютером. Эксперименты проводились на образцах неразведенной периферической цельной крови здоровых доноров и крови больных острым инфарктом миокарда и гипертонической болезнью II стадии Кровь бралась непосредственно перед экспериментом в шприц, стенки которого предварительно обрабатывались гепарином (500 МЕ/мл)

Изучение концентрации свободного кальция [Ca2+li в лимфоцитах здорового человека

Величина концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме клеток оценивалась с помощью флуоресцентного индикатора ионов кальция Fura-2M Измерение флуоресценции проводилось на спектрофлуориметре Hitachi F-4000 (Япония).

Определение острой токсичности

Острая токсичность (LD5o) исследуемого соединения определялась на мышах массой 20+2 г при постоянной температуре окружающей среды (20-22°С).

LDjo рассчитывалась по методу Кербера, спустя 24 часа после введения вещества.

Результаты исследования

Распространенность тромбозов, занимающих существенное место среди непосредственных причин смерти больных при различных сердечнососудистых заболеваниях, диктует необходимость поиска новых эффективных противотромботических веществ, в тч антиагрегантов для профилактики и лечения осложнений основных заболеваний сердечнососудистой системы Целесообразность проведения исследований производных пиридин-3-карбоновой кислоты обусловлена тем, что ее дериваты обладают широким спектром биологической активности

В соответствии с этим первая серия опытов была посвящена изучению влияния 13 новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов в условиях in vitro по сравнению с эталонным препаратом - пиридин-3-карбоновой кислотой. Выбор данной модели стимуляции тромбоцитов был обусловлен тем, что АДФ является одним из наиболее мощных активаторов данных форменных элементов крови Исследуемые субстанции использовались в концентрациях от 10*6 до 10"3М(табл 1, рис 1)

В результате опытов было установлено, что 3 вещества в разной степени угнетали АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов. Наиболее выраженной способностью подавлять основную функцию тромбоцитов, обладало вещество ИФК-366 В концентрации 10"3М оно снижало показатель агрегации, т.е процент падения оптической плотности плазмы на 27% по сравнению с контролем В концентрации Ю^М действие АДФ еще больше

ослабевало и составило 34% от первоначальных значений Данный эффект был в 1,9 раза был выше, чем у пиридин-3-карбоновой кислоты в концентрации 10'3М (18%)

Таблица 1

Влияние новых производных пиридин-З-карбоновой кислоты на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов кроликов в условиях ш

vitro.

№ № Вещества % падения оптической плотности плазмы, богатой тромбоцитами

Концентрации исследуемых веществ

Контроль (АДФ) 10~JM /А% ЮЛМ/А% 10"5М/Д% ю-^м/ А%

1 ИФК-309 58,7±1,7 57,5+2,2 58,6±2,1 59,9+2,4 -

2 ИФК-393 59,1±2,3 61,4±2,9 61,6±2,9 62,8±2,1 -

3 ИФК-367 53,2±1,9 55,8±2,1 58,4±2,1 56,0±1,9 -

4 ИФК-321 48,4±1,3 42,0±1,7*/13 44,7±1,7 46,3±1,8 -

5 ИФК-472 49,8+2,0 42,4±2,0*/15 37,4±М*/25 39,2±1,4*/21 48,7±2,5

6 ИФК-366 48,8±0,8 35,6±1,9*/27 32,2±1Д#/34 39,7±2,4*/19 51,1+1,8

7 ИБХФ-20 53,4±1,2 54,6±1,3 53,7±0,7 53,2±1,7 -

8 ИБХФ-24 57,3+1,8 58,5±1,3 58,2±1,8 57,7±1,3 -

9 ИБХФ-22 55,3±0,7 56,8±1,7 55,0±1,8 58,0+2,1 -

10 ИБХФ-21 60,7±1,2 53,6±2,1 62,3±1,6 62,1±1,7 -

11 ЛБК-10 60,2+2,6 62,2±2,6 64,5±2,8 65,7±2,4 -

12 ЛБК-78 65,6±1,8 66,0+2,0 66,2+2,3 67,2±2,4 -

13 ЛБК-149 54,6±1,7 52,2±1,9 55,3±2,2 54,2±1,7 -

14 Пнрвдин-3-карбоновая кислота 56,6±1,7 46^±1,8»/18 56,5±1,4 57,9±2,2

Примечание: * - достоверно по сравнению с контролем при р<0,05,

А - эффективность, по сравнению с контролем (в %)

При использовании ИФК-366 в концентрации 10"5М наблюдалось ослабление антиагрегационного эффекта, тк процент падения оптической плотности плазмы, обогащенной тромбоцитами, не превышал 19% по сравнению с таковым одного АДФ Более низкая концентрация изучаемого вещества (10" 6М) не оказывала ожидаемого эффекта

Вещество ИФК-472 наиболее активно подавляло склеивание тромбоцитов в концентрации Ю^М (25% от исходных значений) При последующем десятикратном разведении этот процесс практически сохранялся и составил 21% В концентрации Ю^М действие ИФК-472 прекращалось

Соединение ИФК-321 инициировало антиагрегационное действие (13% от контроля, при р<0,05) только в концентрации 10'3М

Остальные изученные вещества (ИФК-309, 393, 367, ЛБК-10, 78, 149, ИБХФ-20, 21, 22 и 24) по отношению к изучаемой функции тромбоцитов были инертны

Учитывая, что 2 соединения из 13 изученных новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты (ИФК-366 и ИФК-472) были наиболее активны и подавляли АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов в условиях in vitro в диапазоне концентраций от 10"5 до 10'3М, именно они были отобраны для последующего этапа опытов в условиях живого организма (in vivo)

В постановке данного эксперимента дозы изучаемых веществ рассчитывались с учетом максимально эффективных концентраций, найденных в опытах in vitro, с последующей аппроксимацией на массу тела кроликов, при этом объем крови считался равным 10% от веса животного

Разовая доза исследуемых веществ варьировала в соответствии с их молекулярной массой и вводилась перорально

т ю-зм

т 10-4М □ 10-5М

ИФК-321 ИФК-472 ИФК-366

Рис. 1. Изменение оптической плотности плазмы, обогащенной тромбоцитами, под влиянием ИФК-321, ИФК-472 и ИФК-366 (в % по отношению к контролю).

Использование вещества ИФК-472 во всех изученных дозах (4, 8 и 16 мг/кг) в течение всего периода наблюдения (240 мин ), не сопровождалось подавлением агрегации тромбоцитов кроликов

Введение ИФК-366 в дозе 2 мг/кг на всех этапах опыта, не оказывало антиагрегационного эффекта

Применение ИФК-366 в дозе 4 мг/кг через 90 мин после перорального введения, снижало процент падения оптической плотности плазмы, обогащенной тромбоцитами по сравнению с контролем в 2 раза Еще через 30 мин опыта эффект незначительно ослабевал и сохранялся на протяжении трех часов наблюдения Последующий забор крови через 240 мин после начала эксперимента не выявил каких-либо значимых различий по сравнению с действием одного АДФ (рис 2)

При увеличении дозы ИФК-366 в 2 раза активность тромбоцитов, индуцированная АДФ, снизилась через час после перорального введения в 1,4 раза, а еще через 30 мин. функция данных форменных элементов крови восстановилась

Таким образом, можно утверждать, что новое производное пиридин-3-карбоновой кислоты подавляет индуцированную агрегацию тромбоцитов как в условиях m vitro, так и in vivo.

Этот факт послужил основанием для продолжения исследований с целью уточнения некоторых механизмов его антиагрегационного действия

48,2

I 52,9

; —2мг/кг;

4мг/кг ~й~8мг/кг

контроль 30 мин 60 мин 90 мин 120 мин 180 мин 240 мин

Рис. 2. Влияние ИФК-366 на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов кроликов при пероральном введении.

Примечание: * - достоверно, по сравнению с контролем, при р< 0,05.

Была сделана попытка определить изменение уровня свободного кальция [Ca2+]i в цитоплазме лимфоцитов доноров под влиянием ИФК-366, учитывая, что данный ион играет ведущую роль в процессах тромбообразования Лимфоциты были выбраны в качестве объекта исследования не случайно, т к вследствие сходных с тромбоцитами механизмов кальциевого обмена они являются более стабильными клетками крови и меньше реагируют на центрифугирование и другие механические воздействия при обработке

Известно, что повышение внутриклеточного Са2+ приводит к активации Са2+-зависимой ФЛА2, отщеплению от мембранных фосфолипидов арахидоновой кислоты и последующему образованию из нее тромбоксана А2, который по принципу положительной обратной связи способствует дальнейшему усилению стимуляции и вовлечению в процесс тромбообразования новых циркулирующих тромбоцитов

С помощью метода спектрофлуометрии при изучении ИФК-366 на [Ca2+]i в цитоплазме лимфоцитов доноров было установлено, что данное производное пиридин-3-карбоновой кислоты подавляет его исходный уровень, по-видимому, угнетая активность SOC каналов (store operated Са2+ channels), которое было повышено тапсигаргином (стандартный либератор Са2+)

Принимая во внимание способность ИФК-366 снижать [Ca2+]i на примере лимфоцитов, можно высказать предположение, что антиагрегационный эффект изученного вещества реализуется через регуляцию уровня данного катиона

«Дыхательный взрыв» имеет большое значение при патологии сердечно-сосудистой системы Образующиеся в результате этого процесса АФК, обладают выраженным реакционным действием и могут изменять

активность и структуру многих макромолекул в клетках различных органов и тканей

Кроме того, избыток данных пероксидных анионов может повышать агрегацию тромбоцитов

Было доказано, что ИФК-366 в широком диапазоне концентраций угнетает образование АФК, индуцированное различными дозами стандартных агентов - FMLP и РМА в образцах цельной крови не только здоровых доноров, но и больных, страдающих инфарктом миокарда и гипертонической болезнью II ст (рис 3) Этот эффект по силе действия не уступает аналогичному у индапамида, как известно, обладающего не только диуретическим эффектом, но и антиоксидантным действием.

ТО

кда

■ А'

V \

К 4

„v-f* :

\r

- /

/

y"---:

г

\ t

■30

■(m)

Рис. 3. Влияние бактериального трипептида - формил-метионин-лецил-фенилаланина (FLMP), форболового эфира (РМА) и с ИФК-366 на образование АФК в образце цельной крови больного острым инфарктом миокарда.

FMLP - ЗмкМ, РМА - 1мкМ, ИФК-366 - 50 мкМ

По оси абсцисс - время в мин. (10,20 и 30 мин.)

По оси ординат - количества имп. в мин.

Повышенная активность указанного вещества (антиагрегационный

эффект, угнетение образования активных форм кислорода нейтрофилами человека) может быть объяснена высокой степенью стерического (конформационного) соответствия данного рецепторного аппарата и ИФК-366 и, как следствие, эффективным биологическим ответом.

При определении острой токсичности было установлено, что LD50 ИФК-366 составляет 3334 мг/кг, что позволяет отнести его по классификации Hodge и Sterner к IV классу, т.е. к группе относительно безвредных веществ (И.В. Саноцкий, 1997).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о высокой антиагрегационной эффективности ИФК-366 и диктуют необходимость изучения хронической токсичности ИФК-366 с целью получения разрешения на клинические испытания в качестве противотромботического (антиагрегационного) средства

Выводы

1 При скрининге антиагрегационной активности 13 новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты у 3 ее производных (ИФК-321, ИФК-472 и ИФК-366) выявлено ослабление АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в условиях in vitro

2 При пероральном введении кроликам, лишь гидрохлорид диэтилового эфира К-(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты (ИФК-366) ингибировал агрегацию тромбоцитов

3 Гидрохлорид диэтилового эфира М-(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты угнетает транспорт Са2+ через кальциевые каналы плазматических мембран лимфоцитов доноров и снижает [Ca2+]i в данных форменных элементах крови

4 Гидрохлорид диэтилового эфира >1-(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты подавляет образование активных форм кислорода в образцах цельной крови доноров и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями (инфаркт миокарда, гипертоническая болезнь Пет), не уступая индопамиду

5 Потенциальный антиагрегант - гидрохлорид диэтилового эфира Ы-(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты относится к группе относительно безвредных соединений (LD50 -3334 мг/кг)

Практические рекомендации

Результаты исследований позволили дать рекомендации химикам для продолжения синтеза химических соединений среди производных пиридин-3-карбоновой кислоты с заданной биологической активностью в целях дальнейшего поиска перспективных противотромботических лекарственных препаратов

Полученные результаты являются основной частью пакета документов для получения в МЗ и СР РФ разрешения на клинические исследования гидрохлорида диэтилового эфира М-(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты (ИФК - 366) для последующего внедрения его в медицинскую практику, как эффективного антиагрегационного средства

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Григорьев Г К, Муляр А Г, Гасанов М Т, Изюмов Е Г / Влияние нового производного пиридин-3-карбоновой кислоты на образование активных радикалов кислорода фагоцитами крови здоровых и больных людей, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями и изменение уровня внутриклеточного кальция в цитоплазме лимфоцитов человека// Материалы научно-практической конференции «Общество Здоровье Лекарство» - Саранск - 2005 - С 42

2 Муляр А Г , Гасанов М Т, Григорьев Г К, Кириллова А В / Сравнительная оценка антиагрегационной активности новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты// Материалы научно-практической конференции «Общество Здоровье Лекарство» - Саранск -2005 -С 76-77

3 Григорьев Г К, Гасанов М Т / Изучение влияния новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты на тромбоцитарный гемостаз// Материалы конференции «Молодежная наука и современность» - Курск - 2006 - С 67

4 Муляр А Г, Григорьев Г К, Гасанов М Т , Авфукова ЮС/ Поиск новых антиагрегантов среди производных пиридин-3-карбоновой кислоты//

Сборник материалов XIII национального конгресса «Человек и Лекарство» -Москва-2006-С 561

5. Муляр А.Г., Григорьев Г.К., Гасанов М.Т., Кириллова A.B./ Пути лекарственной профилактики и лечения тромбозов с помощью новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты// Нижегородский медицинский журнал.- Нижний Новгород.- 2006. - №7.- С. 115-117

6. Гасанов М.Т, Муляр А Г, Григорьев Г К , Кириллова А В , Останин А А/ Новые производные пиридин-3-карбоновой кислоты, как источник получения новых противотромботических средств// Сборник материалов XIV национального конгресса «Человек и Лекарство» - Москва - 2007 - С 811

7 Останин А А, Муляр А Г, Гасанов М.Т., Григорьев Г.К / Экспериментальное исследование противотромботической активности новых дериватов пиридин-3-карбоновой кислоты// Материалы 9-го Всероссийского научно-образовательного форума «Кардиология 2007» - Москва - 2007 - С 222-223

Заказ № 546 Объем 1 п л. Тираж 100 ж;

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

 
 

Оглавление диссертации Григорьев, Георгий Константинович :: 2008 :: Москва

ВВЕДЕНИЕ.

1. Обзор литературы.

1.1 Роль тромбоцитов в гемостазе и фармакологическая регуляция их гиперактивности. jq

1.2 Фармакологическая регуляция повышенной функциональной активности тромбоцитов.

1.3 Производные пиридин-3-карбоновой кислоты и ее дериватов. Свойства и применение в медицинской практике.

1.4 Производные пиридин-3-карбоновой кислоты и ее дериватов. Свойства и применение в медицинской практике.J*

2. Материалы и методы исследования.

2.1 Характеристика используемого материала.

2.2 Методы исследования.

2.2.1 Изучение агрегации тромбоцитов.

2.2.2 Регистрация образования активных форм кислорода «Дыхательный взрыв».

2.2.3 Определение базального уровня кальция [Са+2 ]i в цитоплазме лимфоцитов человека.

2.2.4 Определение острой токсичности потенциального антиагреганта.^

3. Результаты собственных исследований.

3.1 Способность новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты угнетать агрегацию тромбоцитов.

3.1.1 Эксперименты в условиях in vitro.

3.1.2 Эксперименты в условиях in vivo.

3.2 Влияние ИФК-366 на образование радикалов кислорода фагоцитами крови здоровых доноров и больных, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями (инфаркт миокарда, гипертоническая болезнь Ист.).

3.3 Влияние ИФК-366 на образование радикалов кислорода фагоцитами крови здоровых доноров и больных, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями инфаркт миокарда, гипертоническая болезнь Ист.).

3.4 Определение острой токсичности ИФК-366.

 
 

Введение диссертации по теме "Фармакология, клиническая фармакология", Григорьев, Георгий Константинович, автореферат

Активация гемостаза, вызванная агрегацией тромбоцитов, сопровождается развитием острого коронарного синдрома, нарушением мозгового кровообращения, эмболиями и др., приводящими к высокой смертности населения [16, 33, 38, 84, 88, 138].

Перспективным путем в лечении этих заболеваний, является применение лекарственных препаратов, изменяющих соотношение между продуктами метаболизма арахидоновой кислоты, т.е. простациклина' и, тромбоксана А2, в сторону увеличения первого, и вызывающих, антиагрегационный эффект. Такой возможностью регулировать баланс между указанными простаноидами обладают ацетилсалициловая кислота, пентоксифиллин, тиклопидин, клопидогрел, абциксимаб и др. В то же время их применение не всегда- достаточно эффективно и' может спровоцировать различные осложнения [3, 5, 19, 24, 25, 42, 97].

Избирательным влиянием на систему метаболизма арахидоновой кислоты, способствующим антиагрегационному действию, обладает пиридинкарбоновая кислота, которая! угнетает активность тромбоксансинтетазы и снижает уровень тромбогенного фактора — ТхА2, не влияя на синтез простациклина [132^ 133, 134].

Однако, необходимо отметить, что выраженный эффект достигался применением достаточно высоких доз этого лекарства, способного вызвать нежелательные эффекты [30]'.

В тоже время имеются публикации, которые свидетельствуют, что по силе и продолжительности антиагрегационного эффекта, пиридин-3-карбоновую кислоту превосходили ее дериваты [21, 22].

Все выше изложенное, послужило основанием для проведения наших экспериментов, связанных с поиском новых, перспективных противотромботических лекарственных препаратов из выше указанного класса соединений, а так же изучению некоторых аспектов механизма их действия.

Таким образом, успешное решение создания высокоэффективного и малотоксичного антиагреганта среди производных пиридин-3-карбоновой кислоты, позволит предложить для клинической практики медикаментозное средство, предназначенное для борьбы с тромбозами и различными сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Данная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» по проблеме «Лекарственная регуляция гемостаза», № Госрегистрации 01200100390.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель исследования < — скрининг новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты для последующего отбора и создания перспективного противотромботического лекарственного препарата.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Для достижения намеченной цели были поставлены задачи:1

1. Изучить влияние 13 новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты (в сравнении с эталонной субстанцией) на агрегацию тромбоцитов, индуцируемую аденозиндифосфорной кислотой в условиях in vitro.

2. Определить наиболее активное соединение, подавляющее агрегацию тромбоцитов, в условиях in'vivo.

3. Исследовать- влияние перспективного антиагреганта на о I уровень свободного кальция [Са ]i в цитоплазме лимфоцитов доноров.

4. Оценить возможность регуляции данным соединением активности нейтрофилов доноров и больных, страдающих сердечно-сосудистой патологией.

5. Определить острую токсичность (LD5o) наиболее активного антиагрегационного соединения - деривата пиридин-3-карбоновой кислоты.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЙ

Впервые проведен скрининг антиагрегационной активности 1 13 новых дериватов пиридин-3-карбонвой кислоты. Отобрано вещество, способное угнетать активность тромбоцитов, как в условиях in vitro, так и при пероральном введении.

Наиболее выраженным эффектом при данном пути введения обладает гидрохлорид диэтилового эфира 1ЧГ-(5-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты с условным шифром ИФК-366.

Доказано, что это вещество подавляет обмен ионов Са в лимфоцитах здорового человека, за счет снижения выхода этих ионов из внутриклеточных депо, угнетает транспорт данного катиона через кальциевые каналы плазматических мембран клеток, по-видимому, через ингибирование активности

Са -АТФ

-азы.

Установлено, что ИФК-366 не только в образцах крови доноров, но и у больных, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями-(острый инфаркт миокарда, гипертоническая болезнь II ст.), подавляет образование нейтрофилами человека супероксид анион радикалов, не уступая по выявленному антиоксидантному эффекту индапамиду.

Результаты исследований, изложенные в диссертации, существенную теоретическую значимость: они могут быть использованы при поиске новых противотромботических средств среди новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты.

Еще одним доказательством, подтверждающим необходимость внедрения потенциального антиагреганта в клиническую практику, является его низкая острая токсичность, позволяющая отнести данное вещество к IV классу токсичности.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ Полученные данные позволили выявить среди новых дериватов пиридин-3-карбоновой кислоты вещества с антиагрегационными свойствами. измерения уровня концентрации внутриклеточного кальция и метод изучения острой токсичности.

Апробация диссертации

Основные положения диссертации были обсуждены на совместном заседании кафедр фармакологии и клинической фармакологии Московского Государственного медико-стоматологического университета (протокол № 7 от 04.05.2007г. 2007г.)

Публикации

Результаты исследований по теме диссертации изложены в 7 печатных научных работах, в том числе 1 работа в журнале, рекомендованном ВАК Минобразования РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 103 страницах машинописного текста и состоит из введения, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения и выводов, содержит 21 рисунок, 7 таблиц. Список используемой литературы включает 59 отечественных и 106 зарубежных источников.

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Поиск потенциальных антиагрегационных средств среди вновь синтезированных дериватов пиридин-3-карбоновой кислоты"

ВЫВОДЫ

1. При скрининге антиагрегационной активности 13 новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты у 3 ее производных (ИФК-321, ИФК-472 и ИФК-366) выявлено ослабление АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в условиях in vitro.

2. При пероральном введении кроликам, лишь гидрохлорид диэтилового эфира №(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты (вещество ИФК-366) ингибировал агрегацию тромбоцитов.

3. Гидрохлорид диэтилового эфира 1чГ-(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты угнетает транспорт Са2+ через кальциевые каналы плазматических мембран лимфоцитов доноров и снижало [Ca2+]i в данных форменных элементах крови.

4. Гидрохлорид диэтилового эфира №(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты подавляет образование активных форм кислорода в образцах цельной крови доноров и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями (инфаркт миокарда, гипертоническая болезнь Пет.), не уступая индопамиду.

5. Потенциальный антиагрегант - гидрохлорид диэтилового эфира >1-(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты относится к группе малотоксичных соединений (LD50 - 3334 мг/кг).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Результаты исследований позволили дать рекомендации химикам для продолжения синтеза химических соединений среди производных пиридин-3-карбоновой кислоты с заданной биологической активностью в целях дальнейшего поиска перспективных противотромботических лекарственных препаратов.

Полученные результаты являются основной частью пакета документов для получения в МЗ РФ и CP разрешения на клинические исследования гидрохлорида диэтилового эфира Ы-(5-Ь-гидроксипиридин-3-карбоноил)-Ь-глутаминовой кислоты (ИФК — 366) для последующего внедрения его в медицинскую практику, как эффективного антиагрегационного средства.

 
 

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2008 года, Григорьев, Георгий Константинович

1. Аналог АСТН4.10 вызывает дыхательный взрыв, связанный с фагоцитами крови человека / Асташкин Е.И., Петров Е.А., Глезер М.Г. и др. // Вопр. биол. и фармац. химии, М., 2001, №3, -с.25-29.

2. Антиишемический эффект нового производного оксиникотиновой кислоты\\ Рясина Т.В., Коршунова Т.С., Полянский Н.Б. и др. \\"Фармакология и токсикология." 1994, №3, с.49-51

3. Баркаган З.С. «Плюсы и минусы профилактического иfлечебного применения аспирина при коронарной болезни- сосудов» в кн: «Прогресс и проблемыв лечении заболеваний сердца и сосудов»// Мастериалы юбилейной, конференции С.-Пб. Университета, С.-П6.Д997, с.7-8

4. Баркаган З.С. «Современная антитромботическая профилактика и терапия» в кн: «Фармакотерапия заболеваний сердечнососудистой системы. Лекция для. практикующих врачей»// VIII национальный конгресс «Человек и лекарство», М., 2002, с. 142-153

5. Баркаган З.С., Мамот А.П. Основы диагностики нарушений гемостаза // Москва-Обнинск, 2000.-е. 153.

6. Галеева Р.И., Халдеева В.А., Гаврилов М.Ю. "Синтез и фармакологическая, активность амидов 2-алкокси-6,7-дигидро-5-пиридин-3-карболовых кислот" \\ Химико фармацевтический журнал, 1996, №9, с. 19-21

7. Гемостазрегулирующая роль никотиновой кислоты и ее аналогов\ Ахундов Р.А.,ТретьякВ.М.,Халилова Э.М. и др. \\ Фармакология и токсикология" 1993, №4, с.267-269

8. Гепарин-аспирин-никотиновый комплекс и его лечебный эффект у больных с ишемической болезнью сердца \ Панченко В.М., Сороколетов С.М., Лапина Л.А., Пасторова В.Е. \\ в сб. 2-й Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", 1994, с.214

9. Граник В.Г. «Метаболизм экзогенных соединений. Ленкарственные средства и другие ксенобиотики»// Москва, «Вузовская книга», 2006, 526 с.

10. Граник В.Г. «Метаболизм эндогенных соединений»// Москва, «Вузовская книга», 2006, 522 с.

11. Граник В.Г. Лекарства. Фармакологический, биохимический и химический аспекты //М., 2001.-c.410 .

12. Граник В:Г. Основы медицинской химии // М:, 2001.-c.385. <

13. Граник В;Г., Жунгиету Г. Основные принципы конструирования лекарств // К., 2000.-c.350.

14. Дегтярев А.Н. Автореферат диссертации на соискание степени к.м.н. Антиагрегантные свойства и механизм действия новых производных бензимидазола на реологические показатели крови // Волгоград, 2001.

15. Дейл М.М., Формен Дж. К. Руководство по имму но фармакологии // М., 1998.- с.332.

16. Елькова К.В. "Кардио- и гепатопротекторное действие некоторых производных оксиникотиновой кислоты и пространственно затрудненных фенолов". \ автореф. канд. диссерт.,М.,1996,с.З-19

17. Катцунг Б. Базисная и клиническая фармакология // М.,1998., т. I.-C.596

18. Клещев A.JL, Демидов М.Я., Седов К.Р. Биохимические аспекты действия натрия нитропруссида // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1994. т. 51. №2.-с.21-25

19. Конищева T.JL, Макаров С.А. "Влияние никотинамидных коферментов и витамина В6 на агрегацию тромбоцитов человека." \\ Вестник ЛГУ серия З(биология), 1991, №1, с.60-63

20. Лекарственная терапия воспалительного процесса \ СигидинЯ.А. , Шварц Г.Я., Арзамасцев А.П. и др. \\ М., Медицина, 1988, с.55

21. Машковский М.Д. Информация о лекарственных средствах для специалистов здравоохранения, выпуск 2, лекарственные средства действующие на сердечно-сосудистую систему // М., 1997.-c.380.

22. Машковский М.Д. Лекарственные средства — справочник // X., 2001.- с.506.

23. Маянский Д.Н. Хроническое воспаление // М., 1991. -с. 1030.

24. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К., Реутов В.П. Биохимия // М., 2000. т. 65. вып. 4.-С.485.

25. Моисеев С.В. «Перспективы антитромбоцитарной терапии»// Ж. «Клиническая фармакология и терапия», М., 2003, №4, с. 1822

26. Муляр А.Г. Лекарственная регуляция агрегации тромбоцитов // диссертация на соискание степени доктора медицинских наук, Москва, 1995, с.220

27. Накопия Х.Р. «Исследование антиагрегационной активности накоторых производных 3-пиридинкарбоной и этановой кислот»// Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, Купавна, 2002, 23с.

28. Нейрофизиологический анализ действия нооглютила в сравнении с известными ноотропными средствами \ Крапивин С.В., Воронина Т.А., Богданов Н.Н. и др. \\ Химико-фармацевтический журнал, 1994, №2, с.4-8

29. Новые производные бензимидазола как потенциальные антиагрегационные средства / А.А. Спасов, А.Г. Муляр, М.Т. Гасанов и др. // «Лекарства - человеку» - материалы научно-практической конференции, Харьков, 2002, t.XVII, с.60-63.

30. Органов Р.Г. Профилактика сердечно-сосудистых заболеваний во врачебной практике // Труды первого международного научного форума «Кардиология 99», М., 1999.-c.33-39.

31. Панченко Е.П «Антитромботическая терапия при инфаркте миокарда»// Русский медицинский журнал, 1999, т.7, №15, с. 1-9

32. Перспективы поиска активаторов К+-АДФ-чувствительных каналов среди производных оксиникотиновой кислоты \ Сернов Л.Н., Митрохин П.И., Кесарев О.Г. и др. \\ в сб. 3-й Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", 1996, с.49

33. Поиск и создание перспективных антикоагулянтов, антиагрегантов и местных гемостатиков / Муляр А.Г., Крылов Ю.Ф., Мутин И.Н. и др. // «Лекарства человеку», М., 1998., -с.6

34. Применение антитромбоцитарных препаратов. Рекомендации Европейского общества кардиологов// Ж. «Клиническая фармакология и терапия», М., 2004, №3, с.32-39

35. Прпетромботическое состояние. Тромбоз и его профилактика/ В.П. Балу да, М.В. Балуда, А.П. Гольдберг и др.// Москва, 1997, 297 с.

36. Пыж М.В., Герасименко Т.И., Грацианский Н.А. "Гиполипидемическая активность и переносимость новой отечественной лекарственной формы никотиновой кислоты" \\ в сб. 2-й Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", 1995, с.298-299

37. Рак и тромбоз / Балуда В.П., Балуда Н.В., Лепшуков И.К. и др. //Государственный реестр лекарственных средств' М., 2000: т. 2 с.749.

38. Рак и тромбоз/ В.П. Балуда, М.В. Балуда, И.К. Тлепшуков и др. //Москва-Обнинск, 2000, 146 с.

39. РЛС-энциклопедия 14 выпуск под. ред. Вышковского Г.Л./ М., 2007.-С.1504.

40. Руказенков Ю.Э. Экспериментальные исследования действия, производных имидазола на агрегацию тромбоцитов и биосинтез тромбоксана А2 // дисс.: кан. мед. наук , М., 1986. -с. 172.

41. Салазникова О.А Влияние гипогликемических средств на гемостаз и реологию крови. Автореферат диссертации на соискание степени к.м.н. // Волглград., 2001

42. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы // М-В.,1999.-с. 637.

43. Середенин С.Б., Воротина Т.А. "Современное состояние и перспективы лекарственного лечения психических заболеваний" \\ Экспериментальная и клиническая фармакология ,1992, №1, с.4-10

44. Сернов Л.Н., Тацура В.В. Элементы экспериментальной фармакологии // М., 2000.-c.351.

45. Синтез и фармакологическая активность производных миоинозита с никотиновой и у-аминомасляной кислотами \ Грачева И.Н., Орехова Е.М., Копелевич В.М. и др.\\ Химико-фармацевтический журнал, 1996, №7, с.27-30

46. Спасов А.А. Автореферат диссертации на соискание степени к.м.н. Имидазо (1,2-а)бензимидазолы новый класс кардиотропных средств // М., 1983

47. Сравнительное изучение действия семака на Са -ответы нейтрофилов человека и клеток HL-60 / Асташкин Е.И., Беспалова Ю.Б., Смирнов О.Н. и др. // Вопр. биол. и фармац. химии., М., 2000, №4, -с.50-54.

48. Третьяк В.М. "Экспериментальное исследование действия производных никотиновой кислоты на агрегационную способность тромбоцитов и антиагрегационные свойства сосудистой стенки." \\ Автореферат кандидатской диссертации, М., 1983

49. Шевченко Ю.Л. Большая Российская нциклопедия лекарственных средств // М., 2001 .,2 т.-с. 1157.

50. Шиффман Ф.Д. Патофизиология крови //С-П.,2000.-с.448.

51. A new model of dual interacting ligand binding sites on integrin ссцьРз / Hu D. D., White C. A., Panzer-Knodle S., et al.// J. Biol. Chem. 1999. 274: 4633-4639.

52. A revised model of platelet aggregation / Kulkarni S., Dopheide S. M., Yap C. L., et al.// J. Clin. Invest. 2000. 105: 783-791.

53. A thrombin receptor function for platelet glycoprotein Ib-IX unmasked by cleavage of glycoprotein V / Ramakrishnan V., DeGuzman F., Bao M., et al.// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001. 98: 1823-1828.

54. Accelerated atherogenesis in prostacyclin receptor deficient mice / Egan K., Austin S., Smyth E., et al.// Circulation. 2000. 102:176.

55. Activated platelets mediate inflammatory signaling by regulated interleukin 1(3 synthesis / Lindemann S., Tolley N. D., Dixon D. A., et al.// J. Cell Biol. 2001. 154: 485-490:

56. Activation of the murine EP3 receptor for PGE2 inhibits cAMP production and promotes platelet aggregation / Fabre J.-E., Nguyen M., Athirakul K., et al.// J. Clin. Invest. 2001. 107: 603-610.

57. Activity of adenosine diphosphates and triphosphates on a P2YT -type receptor in brain capillary endothelial cells / Simon J., Yigne P., Eklund K. M., et al.// Br. J. Pharmacol. 2001. 132: 173-182.

58. ADP induces partial platelet aggregation without shape change and potentiates collagen-induced aggregation in the absence of Gaq / Ohlmann P., Eckly A., Freund M., et al.// Blood. 2000. 96: 2134-2139.

59. ADP is not an agonist at P2Xi receptors: evidence for separate receptors stimulated by ATP and ADP on human platelets / Mahaut-Smith M. P., Ennion S. J., Rolf M. G., etal.//Br. J. Pharmacol. 2000. 131: 108-114.

60. Advances in prostaglandin, thromboxane and leukotrien research/ Samuelson B. et al.// Raven Press, 1983, V.12, p. 280

61. Agonists of the P2YAc-receptor activate MAP kinase by a ras-independent pathway in rat C6 glioma / Grobben В., Claes P., Van Kolen K., et al.//J. Neurochem. 2001. 78: 1325-1338'.

62. Amelioration of bleomycin-induced lung fibrosis in hamsters by dietary supplementation with taurine and niacin: biochemical mechanisms \ Guni S.N., Blaisdell R., Rucker R.B. et al. \\ Environ-Health-Perspect 1994 Dec, 102 Suplio: 137-47

63. Antiplatelet agents in tissue factor-induced blood coagulation / Butenas S., Gawthern К. Mi, van't Veer C., et al.// Blood. 2001. 97: 2314-2322 .

64. Antiplatelet agents in tissue factor-induced blood coagulation / Butenas S., Cawthern К. M., van't Veer C., et al.// Blood. 2001. 97: 2314-2322 .

65. Antiplatelet effects of 2-methyl-3-(l,4,5,6-tetrahydronicotinoyl)pyrazolol,5-a.pyridine in relation to its disposition in rats, rabbits and dogs \ Ohmuro S., Sasahara Т., Taga F. et al \\ Arzneim.-Forsch\drug ), №1 (1992) , p.43-47

66. Arachidonic acid in platelet microparticles up-regulates cyclooxygenase-2-dependent prostaglandin formation via a protein kinase С

67. Mitogen-activated Protein Kinase-dependent Pathway / Barry O. P., Kazanietz M. G., Pratico D., et al.// J. Biol. Chem. 1999. 274: 7545-7556.

68. Armstrong, P. W. Unsticking platelets: the role of glycoprotein Ilb/IIIa receptor blockade // Can. Med. Assoc. 1999. 161: 1423-1424.

69. Assembly of a fibronectin matrix by adherent platelets stimulated by lysophosphatidic acid and other agonists / Olorundare О. E., Peyruchaud O., Albrecht R. M., et al.// Blood. 2001. 98: 117-124.

70. Awtry E., Loszalzo G. "Aspirin. Circulation"// 2000, 103, p. 1206-1218

71. Bhatt D., Topol E "Current role of platelet glycjprotein Ilb/IIIa in acute coronary syndromes"// JAMA, 2000, V.284, p. 1549-1558

72. Bhatt D., Topol E "Scientific and therapeutic advances in antiplatelet therapy"//Nature Reviews, 2003, V.2, p. 15-28

73. Blood coagulation at the site of microvascular injury: effects of low-dose aspirin / Undas A., Brummel K., Musial J., et al.// Blood. 2001. 98: 2423-2431.

74. Born G.V.R. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal // Nature, 1962, 1962 (4832), pp. 927-929.

75. Born G.V.R., Cross M. J. Aggregation of blood platelets // J. Physiol., 1963, 168 (l),pp. 178-195.

76. Breyer M. D., Breyer R. M. G-protein-coupled prostanoid receptors and the kidney // Annu. Rev. Physiol. 2001. 63: 579-605.

77. Breyer R. M. Prostaglandin EPi receptor subtype selectivity takes shape // Mol. Pharmacol. 2001. 59: 1357-1359.

78. Brock Т., McNish R., Peters-Golden M. Arachidonic acid is preferentially metabolized by cyclooxygenase-2 to prostacyclin and prostaglandin E2 // J. Biol. Chem. 1999. 274:11660-11666.

79. Burnstock G., Williams M. P2 purinergic receptors: modulation of cell function and therapeutic potential // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2000. 295: 862-869.

80. Cattaneo M., Gachet C. ADP receptors and clinical bleeding disorders//Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1999. 19:2281-2285.

81. Changes in dimensions and mechanical properties of bone in chicks fed high levels of niacin. \ Johnson N.E., Qin X.L., Gans L.D. et al. \\ Food-Chem-Toxicol., 1995 Apr.; 33(4), p.265-271

82. Cochen M. "Antihyperlipedemic properties of B-pyridylcarbinol. A review of preclinical studies." \\ Lafe Sciences, Vol.37 p.p. 1949-1961

83. Comparative effects of the dihydropyrine-type calcium-agonists (-)-S-Bay К 8644, (+/-)-Bay-W 5035 and (+/-)-Bay-T 5006 on human platelet aggregability.\Rump AF, Boiler R., Berkels R. Et al. \\ Gen-Pharmacol. 1994 May; 25(3): 447-50

84. Cyclooxygenase-2 expression is induced during human megakaryopoiesis and characterizes newly formed platelets / Rocca В., Secchiero P., Ciabattoni G., et al.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. 99: 76347639.

85. Defective platelet aggregation and increased resistance to thrombosis in purinergic P2Yi receptor-null mice / Ьёоп С., Hechler В., Freund M, et al.//J. Clin. Invest. 1999.104:1731-173.

86. Discrete role for cytosolic phospholipase Aia in platelets: studies using single and double mutant mice of cytosolic and group IIA secretory phospholipase A2 / Wong D. A., Kita Y., Uozumi N., et al.// J. Exp. Med. 2002. 196:349-357.

87. Distinct roles of von Willebrand factor and fibrinogen in thrombus growth in arterioles / Ni H., et al.// Thromb. Haemost. Suppl. 1999. p. 411.

88. Dobrydneva Y., Blackmore P. "2-Aminoethoxydiphenyl borate directly inhibits store-operated calcium entry channels in human platelets"// J. Mol. Pharmacology, 2001, Sep., 60(3): 541-552

89. Drug facts and comparisons// Ed. 59, 2005, 172p.

90. Effect of nicotinic acid and lovastatin in renal transplant patients: a prospective, randomized, open-labeled crossover trail \ Lai S.M., Hewett J.E., Petrovski G.F. et al. \\ Am-J-Kidney-Dis. 1995 Apr, 25(4) 616-622

91. Effect of nicotinic acid on exogenous myocardiac glucose utilization \ Stone C.K., Holden J.E., Stanley W. Et al. \\ J-Nucl-Med. 1995 Jun; 36(6): 996-1002

92. Effects of nicotinamide and niacin on bleomycin-induced acute injury and subsequent fibrosis in hamster lungsA Nagai A., Matsumiya H., Yasui S. Et al. \\ Exp-Lung-Res. 1994 Jul-Aug; 20(4): 263-81

93. Effects of specific inhibition of cyclooxygenase-2 on sodium balance, hemodynamics, and vasoactive eicosanoids / Catella-Lawson F.,

94. McAdam В., Morrison В: W., et al.// J. Pharmacol. Exp. Ther. 1999. 289: 735741.

95. Enhancement of miocardial fluorine-18., fluorodeoxyglucose uptake by a nicotinic acid derivative\ Knuuti MJ, Yki-Jarvinen H, Voipio-Pulkki LM et al. \\ J-Nucl-Med. 1994 Jun; 35(6): p.989-998.

96. Fibrin-dependent platelet procoagulant activity requires GPIbvreceptors and von Willebrand factor / Beguin S., Kumar R., Keularts I., et al.// Blood. 1999. 93: 564-570.

97. French D. L., Seligsohn U. Platelet glycoprotein Ilb/IIIa receptors and glanzmann's thrombasthenia // Arterioscler. Thromb; 2000. 20: 607-610.

98. Harvey A.R., Champb A.R; "Pharmacology" // Lippicot's illustrated revies, 2nd edition, 1997, 447p.

99. Himber J., Burcklen L., Steiner B. Effects, of GP Ilb/IIIa receptor antagonists on the activated clotting time of heparinized blood / Blood. 2000. 95:2189-2190.

100. Increased adhesion and aggregation of platelets lacking cyclic guanosine 3',5'-monophosphate kinase T / Massberg S., Sausbier M;, Klatt P., et al.//J. Exp. Med. 1999. 189: 1255-1264.

101. Internalization of the TXA2 receptor alpha and beta isoforms. Role of the differentially spliced cooh terminus in agonist-promoted receptor internalization / Parent J.-L., Eabrecque P., Orsini M. J., et al.// J. Biol. Chem. 1999.274:8941-8948.

102. Involvement of glycoprotein VI in .platelet thrombus formation on both collagen and von Willebrand factor surfaces under flow conditions / Goto S., Tamura N., Handa S., et al.// Circulation. 2002. 106: 266-272.

103. Ishikawa Т. " Nicotinic acid and derivatives for therapy of .hyperlipoproteinemia" \\ Nippon-Rinsho. 1994 Dec: 52(12): 3292-7

104. Jung S.M., Moroi M. Signal-transducing mechanisms involved in activation of the platelet collagen'receptor integrin a2Bi // J. Biol. Chem. 2000.275:8016-8026 V ^

105. Kennedy J; W., Stadius M. L. Combined thrombolytic and*' platelet glycoprotein Ilb/IIIa inhibitor therapy for acute myocardial infarction : will pharmacological therapy ever equal primary angioplasty? // Circulation. 1999. 99:2714-2716.

106. Kiseleva N.G. "Induracin, prolonged-action nicotinic acid, in the treatment of atherogenic dyslipoproteinemia " \\ Klin-Med-Mosk. 1994; 72(3): 20-4

107. Localized reduction of atherosclerosis in von Willebrand*factor-deficient mice / Methia N., Andre P., Denis С. V., et al.// Blood. 2001. 98: 14241428.

108. Markovitz J. H., Tolbert L., Winders S. E. Increased serotonin receptor density and platelet GPIIb/IIIa activation among smokers // Arterioscler. Thromb. 1999. 19: 762-766.

109. Mpl ligand increases P2Yj receptor gene expression in megakaryocytes with no concomitant change in platelet response to ADP / Hechler В., Toselli P., Ravanat €., et al.// Mol. Pharmacol. 2001. 60: 11121120.

110. Nagarava Y., Orimo H. "The anti-platelet effect of niceritrol in patients with arteriosclerosis and the relationship of the lipid-lowering effect to the anti-platelet effect" \ Thromb-Res. 1985 Nov (15); 40 (4), p.543-553

111. Narumiya S., Fitzgerald G. A. Genetic and pharmacological analysis of prostanoid receptor function // J. Clin. Invest. 2001. 108: 25-30.

112. Niacin attenuates acute iung injury by lipopolysaccharide in the hamster \ Nagai A., Yasui S., Ozawa Y. Et al \\ Eur-Respir-J. 1994 Jun; 7(6): 1125-30

113. Paul B.Z., Jin J., Kunapuli S.P. Molecular mechanism of thromboxane A2-induced platelet aggregation. Essential role for Р2ТЛС and 2A receptors // J. Biol. Chem. 1999.274:29108-29114.

114. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen / Ni H:, Denis С. V., Subbarao S., et al.//J. Clin. Invest. 2000. 106: 385-392.

115. Principles of Pharmacology: The pathophysiologic basis of drug therapy/ Golan E.D. et al.// Lippincott Williams and Wilkins, 2004, 348p.

116. Protective effects of KC-764 on short-term forebrain ischemia in gerbilsYYasumoto Y., Arai H:, Kusumoto M. Et al \\ No-To-Shinkei. 1994 Nov, 46(11): 1045-9 . . ' '■;;>. ' ■

117. Role of intracellular signaling events in ADP-induced platelet aggregation./ Daniel J.L., Dangelmaier C., Jin J., et al.// Thromb. Haemost. 1999:82:1322-1326. .

118. Ross R. Atherosclerosis: an inflammatory disease // N. Engl. J. Med. 1999. 340:115-126.

119. Scarborough R. M., Kleiman N. S., Phillips D. R. Platelet glycoprotein Ilb/IIIa antagonists : what are the relevant issues concerning their pharmacology and clinical use? // Circulation. 1999. 100: 437-444.

120. Shibata K. "Conversion ratio of tryptophan to niacin in rats fed with a nicotinic acid-free, tryptophan-limiting diet" \\ Biosci-Biotechnol-Biochem. 1995 Apr; 59(4): 715-6

121. Shlansky-Goldberg R. Platelet aggregation inhibitors for use in< peripheral vascular interventions: what can we learn from the experience in the coronary arteries? // J. Vase. Interv. Radiol. 2002. 13: 229-246.

122. B3-integrin-deficient mice are a model for glanzmann thrombasthenia showing placental defects and reduced survival / Hodivala-Dilke K.M. et al.// J. Clin. Invest. 1999. 103:229-238.

123. Stein E.A. "Drug and alternative therapies for hyperlipidemia" \\ Atherosclerosis. 1994 Aug; 108 suppl: s. 105-116

124. Strechen S.B., Kresiun V.I. "Mechanisms of hepatoprotective action of new nicotinic acid derivatives in experimental CCL4-induced liver injury" \\ Buill-Eksp-Biol-Med. 1992 Jul; 114(7): 58-61

125. Victoria C.R. "Jejunal electrogenic transport of glucose in rats with niacin deficiency" \VArq-Gastroenteroh 1994 Jan-Mar; 31(1): 18-23

126. Vogt W. "Role of phospholipase A2 in prostaglandin formation in: advances in prostaglandin and thromboxane research!' \\ Galli: C. Et al \\ . N.Y. 1978, V.3, p. 89-95

127. Walldins G., Wahlberg G. "Effect; of nicotin. acid and it's derivaties on lipid metabolism fhd other metabolic factors related to atherosclerosis" Л Adv-Exp-Med-Biol., 1985; 183, p.281-293

128. Weber A., I Iohlfeld Т., Schror K. cAMP is an important messenger for ADP-induced platelet aggregation // Platelets. 1999. 10:238-241.

129. Woulfe D., Yang J., Brass L. ADP and platelets: the end of the beginning// J. Clin. Invest. 2001. 107: 1503-1505.

130. Zhao Z.Z., Huang M.T. "A study if vitamin inhibition on the mutagenicity of the antineoplastic drugs" \\ Chung-Hua-Yu-Fang-I-Hsueh-Tsa-Chih. 1992 Sep; 26(5): 291-3