Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние дисульфида кофермента А на систему гемостаза

Р Г Б ил

1 п

1ЯГТ

МИНИСТЕРСТВО_ЗДРДВОХРДНЕНИЯ

И НЕПИ11ИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ.

МОСКОВСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи.

Е.А.Филина УДК: 616 - 005.2 : 615.355

"Влияние дисульфида кофермента А на систему гемостаза"

специальность - 14.00.25. фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских, наук

МОСКВА 1995

Работа выполнена на кафедре фармакологии Московского . медицинского стоматологического института

Научный руководитель: кандидат медицинских наук.

доцент.Муляр А.Г.

•, . .с !

Научный консультант: доктор биологических наук!

профессор Асташкин Е.И.

Официальные оппоненты: член-корр. РАМН.профессор В. К.Лепахин

член-корр. РАМН.профессор Б.И.Любимов

Ведущая организация: Гематологический научный центр--- РАМН.

Защита состоится "_"_!_1995года в_часов

на заседании диссертационного совета при Московском ордена медицинском стоматологическом институте (Москва, 103473. ул.Долгоруковская. 4).

С диссертацией можно'ознакомиться в библиотеке по адресу: г.Москва.ул.Вутетича, д. 10' А.' Автореферат разослан " " а - 1995г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

Л. Л.КИРИЧЕНКО

- г -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ.

Лечение и профилактика тромбозов представляет собой одну из наиболее важных задач современной медицины.

Успешное решение данной проблемы позволит достаточно эффективно бороться с такими распространенными заболеваниями как тромбоэмболия, инфаркт миокарда, тромбофлебиты, инсульты и т.д.

В качестве противотромботических средств.в настоящее время применяются антиагрегационные препараты: ацетилсалициловая кислота.дипиридомол. трентал. Их небольшое количество, а также наличие слабой эффективности и ряда побочных эффектов вынуждает исследователей продолжить поиск новых лекарств с аналогичным типом действия.

Коэнзим ацетилирования (КоА) занимает ключевые позиции в обмене веществ организма.Он участвует в образовании и окислении жирных кислот.стероидов, фосфолипидов и других реакциях.

Благодаря многообразию свойств.КоА и его гомологи, используются за рубежом при лечении лучевой болезни;опухолей, хронических артритов, заболеваний сердечно-сосудистой системы, вирусного гепатита и т.д. Отдельные публикации свидетельствуют о возможности Ко А подавлять основную функцию тромбоцитов.

Все выше изложенное свидетельствует о целесообразности «учения антиагрегационных эффектов,вновь синтезированных . ю оригинальной технологии, стабильного отечественного ди-

сульфида КоА и его интермедиаторов (кетопантотената и пан-тотената кальция) с целью создания эффективных противотром-ботических средств.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель исследования - изучить влияния дисульфида КоА,D-панто-тената и кетопантотената кальция на функциональное состояние тромбоцитов и плазменный гемостаз. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

- Исследовать действие дисульфида КоА, кетопантотета и D-пантотената кальция на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов in vitro,in vivo в широком диапазоне доз и концентраций.

- Исследовать влияние дисульфида КоА, кетопантотената и D-пантотената кальция на коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов в тех же концентрациях и дозах.

- Изучить действие наиболее активного фармакологического вещества на свертываемость крови и тромбопластиновое время по Квику.

- Изучить влияние потенциального антиагрегавдонного средства на базальный уровень свободного кальция в форменных элементах крови доноров.

- Определить острую токсичность наиболее перспективного соединения.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Впервые изучена антиагрегационная активность вновь синтезированных веществ: дисульфида КоА, кетопантотената и D-пантотената кальция на различных моделях гиперагрегации. Показано.что наиболее выраженной антиагрегационной спо-

собностью в условиях In vitro и In vivo обладает отечественный дисульфид КоА.

Установлено,что КоА дисульфид непосредственно не влияет на уровень свободного кальция в цитозоле форменных элементов крови.

Выявлено,что дисульфид КоА относится к не токсичным соединениям (LD50 - 3334мг/кг).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Учитывая ограниченное количество препаратов, обладающих выраженным антиагрегационным действие, нами были проведены фармакологические исследования гомологов пантотеновой кислоты дисульфида КоА. кетопантотената и D-пантотената кальция с целью создания эффективного лекарственного средства с противотромбо-тическим действием, подавляющего способность тромбоцитов к агрегации.

Результаты исследований, представленные в диссертации,позволили выявить высокую антиагрегационную активность,антикоагу-лянтный эффект и низкую токсичность отечественного коэнзима А, свидетельствующие о целесообразности дальнейшего его изучения по параметрам безвредности с перспективой выхода на клинические испытания в качестве нового противотромботического лекарственного препарата.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ И ПУБЛИКАЦИИ.

Результаты диссертационной работы были обсуждены на совместном заседании кафедры фармакологии ММСИ им.Н.А.Семашко и лабораторным отделом фармакологии НПО "Витамины"1995г.,на конференциях:"Современные аспекты создания, исследования и апробации лекарственных средств"г.Харьков. 1994г.; "Научная работа на кафедре как основа творческого роста преподавателя"Волгог-рад 1993г.; "50 лет Российской Академии Медицинских Наук" Москва,1994г,"Человек и лекарство" Москва.1995г.

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работы.

- 5 -

ОБЬЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Работа изложена на машинописного текста, состоит

из введения,Обзора литературы.материалов и методов исследования, 3 глав: собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, содержащего ^.отечественных и .^.зарубежных источников.

Диссертация иллюстрирована ^.рисунками и „^.таблицами. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ.

- Установлена выраженная антиагрегационная активность дисульфида КоА.

- Исследовано действие дисульфида КоА на свертывание крови и тромбопластиновое время.

- Изучено влияние дисульфида КоА на уровень свободного кальция в лимфоцитах.

- Определена острая токсичность отечественного дисульфида КоА.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Эксперименты по изучению влияния Ко А и его предшественников (кетопантотената кальция и Д-пантотената кальция) на гемостаз были проведены на 160 кроликах породы "Шиншилла" обоего пола массой 2,5-3,5кг.

1. Определение агрегации тромбоцитов по Born (1962) с графической регистрацией изменений оптической плотности плазмы "богатой" тромбоцитами проводилось на аппарате "Chrono-log".Принцип работы агрегометра заключается в графической регистрации изменений оптической плотности плазмы обогащенной тромбоцитами до и после добавления к ней Определенного количества агрегирующих агентов (коллаген, АДФ).

2.Для исследования свертываемости цельной крови использовали регистрацию тромбоэластограмм на тромбоэластографах Heilige и Тромб-2. При аналчзе тромбоэластограмм учитывали следующие показатели: 1/Время реакции "R" /появление в крови тромбопластина и образование тромбина/ - отрезок от начала прямой линии до момента, когда ширина тромбоэластограммы достигает 1 мм.; 2/Время образования сгустка "К" / образование фибрина/ фиксировали до места, где ширина тромбоэластограммы составляет 10 ми.:

З/Максимальная эластичность сгустка "ME". 3.Определение тромбопластинового времени по Quck, основано на измерении времени свертывания цитратной и оксалатной крови при смешивании ее с тромбопластином и раствором хлористого кальция.Этим тестом определяется суммарная активность II.YII,IX, X факторов - активность тромбопластинового комплекса.

4.Концентрации свободных ионов кальция [Ca**11 в цитоплазме лимфоцитов определяли с помощью флуоресцентного индуктора ионов кальция - фура 2АИ. Проникновение фуры 2АМ в клетки и степень гидролиза до кислоты контролировали по увеличению интенсивности флуоресценции эфира.Измерение флуоресценции проводили на спектрофлуориметре Hitachi F-4000 (Япония).

5. Острую токсичность определяли

при внутрибрюшнном введении исследуемого вещества интакт-ным мышам массой 20+2г.Результаты учитывали спустя сутки. Расчет средней смертельной дозы ( LDJ0 ) проводили по методу Lltchfleld.Wllcoxon / 1949 /.

6.Статистическую обработку полученных результатов проводили по Стьюденту.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

В рамках.поиска и создания эффективных антиагрегацион-ных лекарственных средств в настоящей работе мы изучали отечественный дисульфид КоА. и отдельные его вероятные предшественники - кетопантотенат кальция и D-пантотенат кальция.

В первом разделе работы исследовалось влияние данных соединений на агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ и коллагеном,в условиях in vitro.

При инкубации дисульфида КоА в концентрации 10"5М с плазмой обогащенной тромбоцитами наблюдалось отсутствие эффекта на АДФ-индуцированную агрегацию. Снижение концентрации дисульфида КоА до 10"6М вызывало подавление агрегации на 25% по сравнению с контролем .Аналогичная картина наблюдалась при использовании дисульфида КоА в концентрации , i0"7М. Дальнейшее уменьшение концентрации до 10"еМ, 10"9М приводило к исчезновению антиагрегационного эффекта.Табл.1.

■ В опытах с коллаген-индуцированной агрегацией ингибиру-ющие действие дисульфида КоА было более значительным, чем в предыдущей серии экспериментов.Как оказалось, данное соединение в концентрации 10*7 М снижал агрегацию на 50% от" исходного, а в 10"®М на 65Í5.Более низкие концентрации КоА дисульфида (10"9 М) не оказывали существенного . эффекта. Табл. 2. , ...

В опытах in vitro с кетопантотенатом кальция в концентрациях Ю"5М, 10"6М на модели АДФ-индуцированной arpera-

Таблица l.

Влияние КоА дисульфида на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов кроликов в условиях In vltro(M±m)

Изменение оптической плотности плазмы в %

контроль АДФ 10"5 м М=60.8 М=±1.28 59.6 ±2.41 50.4 ±1.31 53.4 ±1.75 54.6 ±1.48

концентр. 10"9 М 10"8 М ю-7 М ю-6 М 10"5 М

КоА дисульфид + АДФ s 10"5М М= 60.2 М=±1.51 56.8 ±1.81 37.8* ±1.58 39.8* ±2. 89 53.0 ±1.32

Тримечание: *-р<0.05 по сравнению с контролем. Таблица 2.

5лияние КоА дисульфида коллаген-индуцированную агрегацию

тромбоцитов кроликов в условиях m vitro (М±ш).

Изменение оптической плотности плазмы в 55

контроль 10"5 М 10"6 М 10"7 Н 10"8 М 10"9 М

М-25.5 24.3 24 11,2* 8.33* 23

М-±1. 08 ±2.15 ±0.77 ±2.18 ±1.8 ±1.0

[римечание: *-р<0.05 по сравнений с контролем.

ции происходило возрастание оптической плотности плазмы, обогащенной тромбоцитами, превышавшее контрольные значения приблизительно на 12% характеризующее состояние гиперагрегации, 10" 8М на столько же понижал.

При использовании коллаген-индуцированной агрегации ке-топантотенат кальция в концентрации 10"7М снижал оптическую плотность плазмы, богатой тромбоцитами на 20%.

D-пантотенат кальция не влиял на агрегационную способность тромбоцитов,моделируемую с помощью АДФ и коллагена.

Таким образом, наши исследования показали, что выраженное антиагрегационное действие на моделях АДФ и коллаген-индуцированной агрегации присуще лишь одному дисульфиду КоА. Агрегация тромбоцитов в опытах с кетопантотенатом кальция на АДФ-индуцированной агргегации изменялась двухфазно;в высоких концентрациях (10"5М,10"6М) повышалась, а при снижении концентрации до 10"7М угнеталась.При создании гиперагрегации с помощью коллагена кетопантотенат кальция снижал функцию тромбоцитов в 2.5 раза слабее, чем дисульфид КоА.Ц-пантотенат кальция не влиял на функциональное состояние тромбоцитов In vitro.Рис.1:

В следующем разделе работы мы изучили антиагрегационную способность наших соединений в условиях живого организма.В качестве модельных состояний также применялась агрегация вызываемая АДФ и коллагеном.При исследовании АДФ-индуцированной агрегации дисульфид КоА в дозе 40 мкг/кг повышал способность тромбоцитов к склеиванию на 21% через 1 час после введения. Однако, в дозе 80 мкг/кг через 30 минут от начала опыта.происходило подавление агрегации на 50%. а через 60 минут - на 3535. Табл.3.

и.' 1 V, Ч^ГЛ.

х1слп-1 и I ипи! сл. 1 ипип 1 и 1 & 1 а па

АДФ-индуцированную агрегацию в условиях

т У^го

140 120 100 80 60 40 20 0

%

Ж

II?

а?

V!

¿С? £1

10

10 6М 10 7М 10 "^м

СИЗ контроль ЕЗ КоА ' 1 Д-пантотенат ЕЗ кетопантоетнат

Рис.1.

Таблица 3.

Влияние внутривенного введения дисульфида КоА на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов кроликов (М±т).

Изменение оптической плотности плазмы в %

ДОЗЫ контроль 15' зо' 60'

ОПЫТ ОПЫТ опыт

40 МКГ/КГ 55.0 ±1.7 46. 75 ±8. 99 58.25 ±3.94 63.63* ±1.74

80 МКГ/КГ 49.75 ±5.78 41.75 ±5.58 24.88* ±5.71 32.5* ±5.63

160 мкг/кг 56.88 ±4.56 58.13 ±3.62 23.50* ±5.73 53.2 ±0.37

Примечание: *-р<0.05 по сравнению с' контролем.

Таблица 4.

Влияние внутривенного введения дисульфида КоА в дозе 80 мкг/кг на коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов кроликов (М±т).

Изменение оптической плотности плазмы в 55

контроль 15мин. ЗОмин. 60МИН.

М-25.5 14.67» 13.3« 19.3*

М-11.08 ±2.3 ±1.5 ±1.3

Примечание:*-р<0.05 по сравнению с контролем.

- 12 -

Увеличение дозы дисульфида КоА в 2 раза сопровождалось подавлением агрегационного процесса на 59% в первые 30 минут опыта.Действие изучаемого вещества прекращалось в последующие 30 минут исследования.

Таким образом.наибольший антиагрегационный эффект дисульфида КоА проявлялся в дозе 160 мкг/кг.хотя и был менее длительным чем в дозе 80 мкг/кг. Рис. 2.

По способности дисульфида КоА ингибировать агрегацию, вызываемую коллагеном, оптимальной оказалась доза 80 мкг/кг. Антиагрегационный эффект дисульфида КоА уже через 15 минут после введения составлял 42%. усиливался в последующие 15 минут (48%) и ослабевал к концу опыта (к 60-ой минуте),однако до конца не исчезал (25%).Табл.4.

Кетопантотенат кальция и D-пантотената кальция на показатели агрегационной способности тромбоцитов в условиях 1п vivo не оказывали существенного влияния, как в опытах с АДФ, так и с коллагеном.

При сопоставлении антикоагулянтной активности дисульфида КоА,кетопантотената и D-пантотената кальция по тестам тромбозластограммы было установлено, что только дисульфид КоА в дозе 160 мкг/кг увеличивал время "R" (образование протромбиназы и тромбина) на 30%Рис. 3.Другие показатели тромбоэластогаммы не изменялись.

При сравнении действия дисульфида КоА, кетопантотената кальция и D-пантотената кальция на тромбопластиновое время по Квику эффект отсутствовал.

Согласно многочисленным исследованиям ионы кальция являются универсальным фактором, влияющим на функцию клеток

Влияние дисульфида КоА при в/в введении на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов кролика.

160 мг/кг

Рис.2.

80 мг/кг 40 мг/кг

Влияние внутривенного введения КоА дисульфида в дозе 160мкг/кгкроликам

на показатели ТЭГ.

400 -

350

контроль 15 минут 30 минут 60 минут

шя "R" ESO "К" Ш-i "Ма"

* _ статистически достоверные Рис. 3. изменения

(Д. Брей 1994). В частности,в тромбоцитах [Са+2 И вызыв&ог активацию фосфолипазы А2,изменение формы и реакцию высвобождения. (К.Роберте 1994).Регуляция концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме тромбоцитов [Са +2]1 играет важную роль в агрегации данных форменных элементов крови.В связи с этим.в последнее время возрос интерес к поиску препаратов угнетающих трансмембранный ток кальция, и так же вызывающих перераспределение ионов кальция,путем понижения, последних, в цитоплазме.

В соответствии с выше изложенным, мы сочли целесообразным изучить способность дисульфида КоА, как перспективного антиагреганта, влиять на перераспределение [Са+2]1 лимфоцитов. Выбор в наших экспериментах данных форменных элементов крови обусловлен их высокой стабильностью, мало зависящей от центрифугирования.изменения температуры. рН-среды и т. д.

При инкубировании лимфоцитов добровольцев, с арахидоно-вой кислотой (АА),которая является стандартным индуктором перераспределения кальция отмечается последовательный рост свободных ионов кальция .Предварительное введение дисульфида КоА в среду с лимфоцитами контрольной группы людей вызывали однотипную картину и позволяло данным форменным элементам крови достаточно чутко и одинаково реагировать на воздействие АА в течении всего эксперимента.

Таким образом.результаты этой серии опытов позволили сделать вывод.что дисульфид КоА не влияет на способность лимфоцитов регулировать [Са +2]1.В дальнейшем, предполагается изучить способность КоА дисульфида модулировать кальциевый ответ на другие индукторы агрегации, а также в лимфоцитах больных с различной сердечно-сосудистой патологией.

- 16 -

Острая токсичность дисульфида КоА при внутрибрюшинном введении составляет 3334 мл/кг, что позволяет отнести данное вещество к практически не токсичным соединениям.

В заключении следует подчеркнуть, что наши исследования показали достаточно высокую антиагрегационную активность и низкую острую токсичность отечественного дисульфида КоА.

Мы полагаем,что после углубленного изучения по параметрам безвредности данное фармакологическое вещество может быть ■ рекомендовано для последующих клинических испытаний в качестве перспективного антиагрегационного лекарственного средства.

ВЫВОДЫ:

1.В экспериментах на кроликах установлена высокая антиагре-гационная активность отечественного дисульфида КоА.

2.КоА угнетал склеивание кровяных пластинок вызванное АДФ и коллагеном в условиях In vitro и In vivo.

3.Кетопантоетнат кальция при добавлении в плазму, обогащенную тромбоцитами на АДФ-индуцированную агрегацию действовал двухфазно:в концентрации 10"5М, 10"6М он ее повышал. а в концентрации 10~7М - снижал.Коллаген индуцированная агрегация угнеталась.В условиях живого организма функциональное состояние тромбоцитов под влиянием кето-пантоетната не менялось.

4.Функция тромбоцитов в опытах с D-пантотенатом кальция не изменялась как в пробирке так и при внутривенном введении.

5. Дисульфид КоА угнетал 1 фазу свертывания крови (образование протромбиназы и тромбина);кетопантотенат кальция и Э-пантотенат кальция на плазменный гемостаз не влияли.

6.Дисульфид КоА,кетопантоетнат и Б-пантотенат кальция не изменяли протромбиновое время по Квику.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1."Влияние кофермента ацетилирования КоА и его предшественников на агрегацию тромбоцитов". В соав. А.Г.Муляр.Тезисы докладов научной сессии,посвященной 50-летию Российской Академии Медицинских наук.Москва, 1994г.,стр. 62.

2. "Исследование антиагрегационной активности КоА и некоторых пантотенатов".В соав.А.Г.Муляр.Сборник статей научной конференции"Современные аспекты создания, исследования и апробации лекарственных средств"г.Харьков,1995г.;стр.17.

3."Влияние некоторых гомологов и производных пантотеновой кислоты на ацетилирующую функцию организма и показатели клеточного гемостаза".В соав.Лобанова Е.Г..Любимов И.Б.,Муляр А.Г.Волгоград .07,1993г.,стр.44.Тезисы докладов Всероссийской конференции "Научная работа на кафедре-как основа творческого роста преподавателя".