Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Поиск новых средств фармакологической регуляции болевой чувствительности среди фрагментов атипичных опиоидных пептидов

На правах рукописи

ГУЗЕВАТЫХ Людмила Сергеевна

Поиск новых средств фармакологической регуляции болевой чувствительности среди фрагментов атипичных опиоидных пептидов

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2009

1 8 ФЕВ 2010

003491942

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова РАМН (НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН)

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Воронина Татьяна Александровна

академик РАН,

доктор химических наук, профессор Мясоедов Николай Федорович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Коваленко Лариса Петровна

член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор Решетняк Виталий Кузьмич член-корр. РАН, доктор химических наук, профессор Цетлин Виктор Ионович

Ведущая организация:

Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова

Защита диссертации состоится 2010 года, в............часов на

заседании диссертационного совета Д.001.024.01 при НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Ученой части НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН.

Автореферат разослан...................................года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор мед. наук

Е.А. Вальдман.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Поиск новых высокоэффективных анальгетиков является актуальной проблемой современной фармакологии, поскольку применяемые в клинической практике обезболивающие препараты не удовлетворяют требованиям эффективности и безопасности (M.JI. Кукушкин, В.К. Решетняк, 1999; С.С.Павленко, 1999; Г.Н. Крыжановский, 1999; В.В. Чурюканов, М.В. Чурюканов, 2002; M.JI. Кукушкин, Н.К. Хитров, 2004; Trescot et al., 2008; Осипова, 2009). Так, наркотические анальгетики характеризуются сильным обезболивающим действием, что обеспечивает возможность их использования при травмах и заболеваниях, сопровождающихся выраженным болевым синдромом (злокачественные новообразования, инфаркт миокарда и другие). Однако, наряду с анальгетическим эффектом, они оказывают влияние на центральную нервную систему человека, проявляющееся в развитии эйфории, а при их повторном применении возникает привыкание, наблюдаются синдромы психической и физической зависимости. Кроме того, увеличение дозы препарата сопровождается риском угнетения дыхательного центра (Э.Э. Звартау и др, 2007; Wintle, 2008).

Ненаркотические анальгетики не оказывают влияния на дыхательный центр, не вызывают эйфории и явлений физической и психической зависимости. Однако их анальгегическая активность проявляется, главным образом, при невралгических, мышечных, суставных болях, головной и зубной боли, а при сильной боли, связанной с травмами, полостными оперативными вмешательствами, злокачественными новообразованиями и т.п., они практически не эффективны; некоторые ненаркотические анальгетики характеризуются хорошими жаропонижающим и противовоспалительным эффектами. Нежелательным побочным действием этих препаратов является негативное влияние на желудочно-кишечный тракт, систему кроветворения, выводящую систему (E.JI. Насонов, 1999; А.Ю. Беспалов, Э.Э. Звартау, 2000; В.С.Шухов, 2001; Ю.Б. Белоусов, А.Н.Грацианская, 2008; Krenzischek et al., 2008).

В настоящее время общепризнанна ведущая роль эндогенных пептидов в регулировании различных систем организма (И.П. Ашмарин и др., 1988). В нашей стране успешно развивается направление создания лекарственных средств на основе регуляторных пептидов. Внедрены в клиническую практику ноотроп и нейропротектор семакс (ИМГ РАН (Н.Ф. Мясоедов, И.П. Ашмарин, А.А. Каменский, В.Н. Незавибатько и др., 1982)), ноотроп ноопепт (НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН (С.Б. Середенин, Т.А. Воронина, Т.А. Гудашева, Р.У. Островская и др., 1995), противоязвенный препарат даларгин (ИЭК РКНПК МЗ РФ (М.И. Титов, Ж.Д. Беспалова и др., 1983)), иммуномодулятор тимоген (ИБХ им.

академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова (В.И. Дейгин, В.Х. Хавинсон и др., 1989)).

Существует несколько стратегий поиска веществ пептидной структуры с заданной фармакологической активностью. В НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН успешно применяется подход конструирования новых пептидных лекарственных средств как трехмерных топологических аналогов известных непептидных лекарственных соединений (Т.А. Гудашева, 1985-2008). Также часто используют множественное выравнивание аминокислотных последовательностей белковых структур, которое позволяет определить общность происхождения, функцию отдельных аминокислотных остатков, консервативность определенных участков и совпадение пространственных структур (multiple alignments) (Minkiewicz et al., 2008). Другой подход связан с поиском закономерностей в последовательностях аминокислот, способствующих эффективно и специфично взаимодействовать с рецепторами (Bakalkin et al., 1992).

В нашем исследовании был выбран подход, связанный с поиском минимальной аминокислотной последовательности, отвечающей за проявление анальгетического эффекта, среди эндогенных опиоидных пептидов (ОП), и разработка на ее основе новых соединений.

Атипичные ОП образуются из разных предшественников, и не содержат консервативной последовательности Tyr[Phe]-Gly-Gly-Phe-Met[Leu], ответственной за связывание с опиоидными рецепторами (OP) (Corbett et al., 2006). Особый интерес представляют эндоморфины (Tyr-Pro-TrptPhcj-Phe-NHi), дерморфины (Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2), и пептиды группы Туг-МИФ-1 (Tyr-Pro-Leu[Trp]-Gly-NH2), которые преимущественно связываются с ц-ОР (Broccardo et al., 1981; Zadina et al., 1996; Tseng et al., 2000). Попыток выявить общую последовательность среди атипичных ОП ранее не проводилось. Эндоморфины синтезируются в мозге млекопитающих, в том числе человека, и проявляют активность при центральном введении (Sakurada et al., 2008). Высокая анальгетическая активность этих пептидов сопровождается побочными эффектами, характерными для морфина (Czapla et al., 2000; Soignier et al., 2004; Chen et al., 2003). Дерморфины проявляют анальгетическое действие при центральном и периферическом введении (Broccardo et al., 1981; Negri et al., 2000), при этом не влияют на частоту дыхания даже в кататонических дозах (Paakkari et al., 1990), вызывают более медленное развитие толерантности по анальгетическому действию и менее выраженный синдром отмены по сравнению с морфином (Broccardo et al., 1985; Negri et al., 1995; Riba et al., 2002). Туг-МИФ-1 оказывает антиопиоидное действие, уменьшая анальгетическую активность и препятствуя развитию толерантности при использовании морфина (Erchegyi et al., 1993; Pan, Kastin, 2007), при этом в более высоких дозах обладает собственным

анальгетическим действием (2ашйгоуа е! а]., 2003). Таким образом, поиск новых потенциальных анальгетиков на основе общей структуры атипичных ОП представляется достаточно перспективным, поскольку пептиды должны обладать менее выраженными побочными эффектами, характерными для классических опиоидов.

Целью настоящего исследования явился поиск новых средств фармакологической регуляции болевой чувствительности на основе функционально-значимой минимальной аминокислотной последовательности атипичных опиоидных пептидов.

В соответствии с поставленной целью в работе решались следующие задачи:

1. Выявить наиболее часто встречающийся минимальный аминокислотный фрагмент в первичных последовательностях 60 атипичных ОП и исследовать его (Туг-Рго) анальгетический эффект, психотропную активность, механизм действия и побочное действие при системном введении.

2. Исследовать влияние модификации остатка пролина в молекуле Туг-Рго-содержащего атипичного ОП дерморфина (ДМ) на проявления анальгетической, психотропной активности и побочных эффектов.

3. Исследовать структурно-функциональные взаимоотношения в ряду удлиненных и модифицированных по остатку пролина аналогов Туг-Рго на проявление анальгетической и опиоидной активности, и отобрать наиболее перспективные для дальнейшего углубленного изучения соединения.

4. Определить спектр анальгетической активности, эффективность и продолжительность действия при разных путях введения и исследовать нейропсихотропную активность отобранных соединений.

5. Изучить механизм действия отобранных соединений.

6. Изучить побочные эффекты отобранных соединений, в том числе влияние на дыхание, оценить синдром отмены, развитие толерантности и терапевтическую широту.

7. Изучить распределение по органам и тканям отобранных соединений.

8. Провести сравнительные исследования отобранных соединений с эталонными препаратами.

Научная новизна. Выявлена последовательность Туг-Рго, встречающаяся у большинства (63%) атипичных ОП и продемонстрировано, что именно она является минимально необходимой для проявления анальгетической активности. Впервые показано, что дипептид Туг-Рго в дозах 0.1 - 10.0 мг/кг при системном введении проявляет анальгетическую активность в тестах соматической и висцеральной боли при активации ноцицепторов химическим, термическим и механическим стимулами, а также обладает противовоспалительным действием. Анальгетическое действие

дипептида реализуется через налоксон-чувствительные механизмы; Туг-Рго имеет низкое сродство к периферическим 5-ОР, и не взаимодействует с периферическими ц-ОР. Туг-Рго в дозах 1 - 800 мг/кг не влияет на частоту дыхания и не вызывает гибели мышей в течение последующих 24 часов. Установлено, что фармакологическая активность атипичных ОП не зависит от положения последовательности Туг-Рго в молекуле и модификация С- и //-конца последовательности -Туг-Рго- природными аминокислотами сохраняет анальгетическую активность полученных пептидов, что открывает возможности конструирования новых пептидов, стойких к протеолизу и обладающих анальгетическим действием.

Показано, что стереохимическая модификация или дегидрирование остатка пролина в молекуле атипичного ОП ДМ (Туг-Р-А1а-РЬе-01у-Туг-Рго-5ег-ЫН?) не изменяет анальгетическую активность при химическом и механическом раздражении и уменьшает противовоспалительное действие. Наряду с этим, дегидрирование остатка пролина в молекуле ДМ приводит к ослаблению противовоспалительного и анальгетического действия при механическом раздражении ноцицепторов, но вызывает появление анксиолитической и потерю противосудорожной активности.

При изучении 22 оригинальных пептидов выявлена новая группа соединений, обладающих анальгетическим действием, общей формулы А-Туг-Рго(Д-Рго, ДРго, Д-ДРго, Нур)-В-Х, где А, В - природные аминокислоты, а X - метальная или амидная группировка. Установлено, что анальгетическая активность этих пептидов не зависит от взаимодействия с периферическими ц- и 8-ОР подвздошной кишки морской свинки (ПКМС) и семявыносящего протока мыши (СПМ), что предполагает низкий риск развития лекарственной зависимости. Среди пептидов этой группы отобраны Туг-Рго-[ДЦ-5ег-МН2 и Туг-О-Рго-Бег-ИНг, которые обладают наиболее высокой анальгетической активностью. Установлено, что в смеси стереоизомеров Туг-Рго-[Д£]-5ег-№12 (1:1), получаемой в результате амидирования Туг-Рго-£-8ег-ОМе, анальгетической активностью обладает только Д-стереоизомер (Туг-Рго-0-8ег-ЫН2).

Впервые показано, что Туг-Рго-[Д£]-8ег-МН2 и ТугчО-Рго-Зег-ЫН2 в дозах 0.1 -10.0 мг/кг при системном введении проявляют анальгетическое действие в тестах по оценке болевой чувствительности, основанных на активации ноцицепторов термическими, химическими или механическим стимулами. Туг-Рго-[Д£]-8ег-ЫН2 активен на модели нейропатической боли; Тут-Д-Рго-Бег-ЖЬ оказывает прямое действие на первичные афференты ноцицептивного флексорного рефлекса. Анальгетическое действие Туг-Рго-[Д/,]-Зег-МН2 уменьшается при холодной (4°С) и жаркой (31-32°С) температуре окружающей среды.

Показано участие опиоидергической системы в анальгетическом действии Туг-Рго-[Д£]-5ег-КН2 и Туг-Д-Рго-Бег-ЖЬ: анальгетическая активность ослабляется неселективным антагонистом центральных ОР налоксоном и периферических ОР -

налоксоном метиодидом. Установлено, что Tyr-Pro-[AZ,]-Ser-NH2 и Tyr-Z)-Pro-Ser-NН2 взаимодействуют с «высокоаффинными» центрами связывания (1.5-3 нМ) ДМ и не взаимодействуют с «низкоафинными» (> 5 нМ). Tyr-Pro-[D,L]-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NHj, в отличие от ДМ и морфина, проявляют слабое сродство (1С50 3.3x10"5 моль и 4.5х10"5 моль, соответственно) к периферическим р-ОР ПКМС и не обладают сродством (1С50 б.бхЮ"4 моль и б.ЗхЮ^моль, соответственно) к периферическим 8-ОР СПМ.

Установлено, что Tyr-[3H]Pro-[AZ,]-Ser-NH2 и Tyr-Z)-[3H]Pro-Ser-NH2 наиболее интенсивно распределяются в сильно васкуляризированных органах выделения (печень, почки) и меньше - в слабоваскуляризированных (мозг, легкие, сердце). Оба соединения выводятся из организма (t]/2ci из крови = 53.6 и 57.8 мин, MRT из крови = 43.2 и 46.1 мин, соответственно), а их протеолиз осуществляется ферментами крови, сердца, легких и мозга. В качестве основного меченного метаболита обнаруживаются пролин и £>-пролин, соответственно.

Научно-практическое значение. Выявлена новая группа оригинальных веществ регуляции болевой чувствительности общей формулы А-Туг-Ргоф-Рго, ДРго, В-ДРго, Нур)-В-Х, где А, В - природные аминокислоты, а X - метильная или амидная группа, с отличным от классических ОП механизмом действия (зарегистрирован патент РФ №2286169 (приоритет от 18.04.2005), подана заявка на международный патент WO 2008/020778 А1 (от 21.02.2008)). Преимущества наиболее активных соединений этой группы перед морфином заключаются в отсутствии угнетающего влияния на дыхательный центр, более медленном развитии толерантности по анальгетическому действию и достоверно меньшей выраженностью синдрома отмены, в связи с чем, новые соединения имеют большую, чем морфин, безопасность и терапевтическую широту. При сравнении с диклофенаком пептиды активны в меньших дозах и обладают более широким спектром анальгетических эффектов. Отобранные пептиды Tyr-Pro-[D,£]-Ser-NH2 и Tyr-/?-Pro-Ser-NH2, сочетающие анальгетическую активность и безопасность применения, можно рассматривать в качестве базисных соединений для создания потенциального анальгетика пептидной природы.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Международной конференции "Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности" (Минск, 1999), Международной научной конференции «Новые лекарственные средства: синтез, технология, фармакология, клиника» (Минск, 2001), Всероссийском симпозиуме «Механизмы терморегуляции и биоэнергетики: взаимодействие функциональных систем» (Иваново, 2002), III Съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), 10- German-Russian Peptide Symposium (Turingia, 2003), 8- ECNP Regional Meeting (Moscow, 2005), I съезде

физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005), IV международной научной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006), 15th World Congress of Pharmacology (Beijing, 2006), II международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2006), XVIII симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе, 2006), Российских научно-практических конференциях с международным участием «Актуальные вопросы острой и хронической боли» (Самара, 2005) и «Хронические болевые синдромы» (Новосибирск, 2007), II и III съездах фармакологов России (Москва, 2003; Санкт-Петербург, 2007), I, II, III и IV Российских симпозиумах по химии и биологии пептидов (Москва, 2003; Санкт-Петербург, 2005; Пущино, 2007; Казань, 2009).

Объем и структура диссертации. Представленная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего 687 отечественных и зарубежных источников, приложения. Диссертация изложена на 297 страницах машинописного текста, содержит 54 таблицы и 74 рисунка.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 44 печатные работы, среди них 16 в рекомендованных ВАК журналах.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Эксперименты проводили на самцах нелинейных белых крыс массой 180-250 г, самцах нелинейных белых мышей и мышей линии СВА и С57/Ы6 массой 20-25 г, самцах морских свинок массой 500 г, самцах кроликов массой 3-4 кг, полученных из Центрального питомника лабораторных животных «Столбовая» Московской области. Животных содержали на постоянном доступе к корму и воде. Содержание и уход за животными, проведение экспериментов и эвтаназия осуществлялись в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных (86/609 EEC). Всего было проведено 1965 экспериментов.

В работе использовано 26 пептидов, из которых 22 оригинальных, в том числе меченные тритием Tyr-[3,4-3H Pro]-[D/]Ser-NH2 и Tyr-D-[3,4-3H Pro]-Ser-NH2, синтезированные в Институте молекулярной генетики РАН (под руководством академика РАН Н.Ф. Мясоедова), и реактивы фирмы «Sigma»: налоксон, налоксон метиодид, налтрексон, налоксон бензоилгидразон, налтриндол, АМ-251, 3-метоксиналтрексон, конканавалин А.

Пептиды вводили внутрибрюшинно (в/б), внутримышечно (в/м), внутривенно (в/в), внутрь (р.о.), интраназально (и/н) в виде водного раствора, в диапазоне доз 0.0110.0 мг/кг веса животного (объем вводимого раствора составлял 1 мл/кг массы крыс и 10 мл/кг массы мышей, при и/н введении вводили 20 мкл на крысу). Блокаторы вводили подкожно. Контрольные животные получали эквивалентный объем

6

дистиллированной воды. Животных использовали однократно. Каждая экспериментальная группа состояла из 8-15 животных.

Исследования проводили в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ», (ред. - Р.У. Хабриев, 2005), где дано подробное описание используемых в работе методов. Анальгетическая активность изучалась в тестах: отдергивания хвоста при действии горячей воды (54°С) и луча света (установка 602000-TF-AD-MR-01 фирмы TSE-system, Германия) (D'Amor et al., 1941), горячей пластины (52°С) (Woolfe, Macdonald, 1944), уксусных корчей при действии 0.6% раствора уксусной кислоты (Chernov et al., 1967), формалиновых болей при действии 5% раствора формалина (Bannon et al., 1998), механической боли (Haffner, ¡929), на моделях нейрогенного (M.JI. Кукушкин и др., 1993) и центрального (M.JI. Кукушкин и др., 1999) болевого синдрома, флексорного рефлекса (M.J1. Кукушкин и др., 2003). Противовоспалительное действие изучали в тесте псевдоаллергической реакции, вызванной конканавалином А (Б.И. Любимов, Л.П. Коваленко и др., 2005).

Нейропсихотропное действие пептидов оценивали в тестах: открытое поле, приподнятый крестообразный лабиринт (Lister, 1987), конфликтная ситуация (Vogel et al., 1983), неизбегаемое плавание (Porsolt, 1979), поведенческое отчаяние в тесте вращающихся колес (Nomura et al., 1982), судорог, вызванных коразолом (Swinyard, 1969) и максимальным электрошоком (White, 1992). Влияние на суммарную биологическую активность мозга оценивали по ЭЭГ крыс (Т.А. Воронина, Л.Н. Неробкова, 2000). Электроды вживляли по координатам атласа Буреша (1991) в миндалину, гипоталамус, гиппокамп, сенсомоторную кору, ретикулярную формацию ствола мозга. Влияние на систему терморегуляции оценивали по ректальной температуре и температуре кожи хвоста животного (являющегося специфическим органом теплообмена у крыс), помещенного в холодную (4-6°С), термонейтральную (27-28°С) и жаркую среду (31-32°С) (Hart, 1971, Т.Г. Емельянова и др., 2008).

Для оценки побочных эффектов и терапевтической широты соединения измеряли частоту дыхания в минуту бодрствующих мышей и наркотизированных хлоралгидратом кроликов. ЛД50 рассчитывали по показателю гибели мышей через 24 часа после введения (Е.В. Арзамасцев и др., 2005). Развитие толерантности исследовали с использованием тестов отдергивания хвоста, уксусных корчей, открытого поля, вращающихся колес и конфликтной ситуации через 7, 14 и 28 дней после введения пептидов. Интенсивность синдрома отмены изучали по специфическим признакам при провокации налоксоном в дозе 10 мг/кг массы тела (Fernandes et al., 1977) и без провокации налоксоном после прекращения 28 дневного введения пептидов в тестах отдергивания хвоста и открытого поля.

JVs Семейство к-во структура Предшественник1 рецепторы' И 1 5 | к Примечание' Ссылки

Типичные опноидные пептиды

1 [Leu']-энкефалины 3 YGGFL ПЭ, ПД + +++ - нет Martinez et al., 1992

2 неоэндорфины 2 YGGFLRKYP ПД + +++ е-ОР Oka, Ncgishi, 1982 Houghten ct al., 1983

3 Динорфины 8 YGGFLRR ПД +/++ + +++ ORL, Pasternak ct al., 1999

4 [Met ]-энкефалины 17 YGGFM ПЭ. ПОМК ++ +++ - С-ОР Zagon et al., 1991

5 Р-Эндорфины 42 YGGFMK ПОМК +++ +++ - Е-ОР Nock ct al., 1993 Narita et al., 1998

6 Ксендорфины 2 YGGFIRKPDK ПКС А и В - - + [J'SlGTPyS Pattee et al., 2003

7 Орфанин-FQ /ноцисептины 3 Y[F]GGF ПОН - - + ORL, Mollcreau ct al., 1994

Атипичные опиондные пептиды

8 Эндоморфины 2 YPW[F]F- nh2 не обнаружен +++ + + нет Goldberg et al., 1998 Monory ct al.. 2000

9 Tyr-MIF-1 3 YPL[K,W]G -NHa данных нет +/- - - модулятор, М;>Ц|, U/CB Tyr-M1F-1; нпсх. per. рец. морфина Zadina, Kastin, 1985

10 Дерморфины 9 YaFG[W]YP ПДЛ В/С, ПДМ +++ + -/+ е-ОР Montecucclii et al., 1981 Giagnoni etal., 1984

11 Дельторфины 5 Ym[i,aJFH LMD-HHi ПДЛ В/С, ПДМ + +++ -/+ нет Erspamer et al., 1989

12 Р-казоморфины 8 YPF Р-Казеин + + - ц/св Tyr-MIF-1 Zadina, Kastin, 1985 Zadina etal., 1990

13 а-казоморфины 3 YLGYL с^!-казеин - + +++ kj; к:; 5; к* -ОР; ССР Kampa et al., 1996

14 Лакторфины 2 YG[L]LF -nh2 а-/р-ЛА 7 ? 7 нет Mullally et al., 1996

15 ctsi-казоморфины YVPFP а5,-к;исин - - +++ Kj; к2; KJ-OP Kampa, etal., 1996

16 неоказоморфин 1 YFVEPF р-Казеин ? 7 7 нет Jinsmaa, Yoshikawa, 1999

17 Геморфины 10 LWYFWT р-цепь гемоглобина ++ + + модулятор EPS3; ц/св Туг-MIF-l; АТ«Рц; ингнб.ДПП Ш Zadina etal., 1990 Mocllcr et al., 1998 Lammcrich ct al., 2003 Lee et al., 2004

18 глютеновые экзорфины А 2 GYYP Глютен пшеницы - + - модулятор Fukudome et al., 1992

19 глютеновые экзорфины В 2 YGGW Глютен пшеницы - + - модулятор Fukudome et al., 1992

20 глютеновые экзорфины С 1 YPISL Глютен пшеницы - + - модулятор Fukudome et al., 1993

21 Глиадорфины 1 YPQPQPF Глиадин пшеницы о ? 7 нет Glamsta et al., 1991

22 Рубисколины 2 YPLDL Рубиско шпината - -н- - нет Yoshikawa et al., 2003

23 Сойморфины 3 YPFW конглицин сои + - - нет Ohinata et al., 2007

24 Цитохрофины 2 YPFT цитохром В + + + ц/св Tyr-MIF-1 Zadina etal., 1990

25 Серорфины 1 YGFQNA БСА ? 7 7 нет Clare. Swaisgood, 2000

26 киоторфины/ неокиоторфины 2 YR БСА - - - выделение Met-энкефалина Takagi etal., 1982

' ПЭ - проэнкефалин; ПД - продинорфин; ПОМК - проогшомеланокоргин; ПДЛ - продельторфин; ПКС -предшественник ксендорфина; ПОН - препроорфанин-РО /ноцисептин; ПДМ - продерморфин; БСА - бычий сывороточный альбумин; ЛА - лактальбумин; ДПП - дипептилпептидаза; ц'св - центры связывания; 2 +++ - сильное связывание, ++ - среднее связывание; + - слабое связывание; - отсутствие связывания; 5 ССР - рецепторы соматостатина; АТРц - рецепторы антиотензина; БР - рецепторы бомбезина;

Связывание с периферическими ОР оценивали с использованием препаратов изолированных органов ПКМС (ц-ОР) и СПМ (5-ОР) (Broccardo et al., 1981). Связывание с центральными рецепторами оценивали по вытеснению [3Н]-ДМ из мест его специфического связывания с мембранной фракцией головного мозга крыс (H.A. Беляев и др., 1990). Для изучения динамики распределения и накопления пептида в тканях и органах крыс использовали меченные тритием пептиды (В.П. Шевченко и др., 2006). Изучали влияние соединений на содержание и оборот моноаминов и аминокислот в мозге крыс при использовании ВЭЖХ/ЭД и ВЭЖХ/ФД соответственно (B.C. Кудрин и др., 2005, П.М. Клодт и др., 2005).

Статистическую обработку данных проводили при использовании стандартных пакетов статистических программ Statistica 6.0, Microsoft Excel 2003 с приложением Attestat 10.6.1, STATGRAF (Stat. & Graph. Coip., USA), Pharm/PCS (ver. 4), Primer of Biostatictics (ver. 4.03). При сравнении характеристик массивов использовались параметрический t-Student тест, непараметрический Вилкоксона-Мэнна-Уитни и альтернативный метод Фишера (F-test). ЛД50, ТД50 и ЭД5() рассчитывали по методу Litchfield, Wilcoxon (1949).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. Выявление функционально значимого фрагмента в аминокислотных последовательностях атипичных опиоидных пептидов, изучение его анальгетической и другой физиологической активности

Проведенный нами анализ литературных источников показал, что в настоящее время насчитывается более 140 ОП природного происхождения. По происхождению, структурным особенностям, спектру физиологической активности и специфичности к известным опиоидным рецепторам ОП были разделены в нашей работе на 26 семейств (табл. 1). Согласно классификации Teschemacher (1993) представители ОП образуют два подкласса: типичные и атипичные ОП. Типичные ОП образуются из предшественников проопиомеланокортина, проэнкефалина, продинорфина и проорфанина-РСУноцицептина (Corbett et al., 2006). Посттрансляционные изменения предшественников приводят к образованию активных пептидов, имеющих общую N-концевую последовательность Tyr[Phe]-Gly-Gly-Phe-Met[Leu], ответственную за связывание с опиоидными и орфановыми ORLi-рецепторами (Raynor et al., 1994). Типичные ОП характеризуются высоким сродством к ОР и выраженной анальгетической активностью. Атипичные ОП более разнородны по происхождению и специфичности к известным ОР. Анальгетическая активность некоторых атипичных ОП сопровождается низким сродством к ОР, что указывает на существование иных отличных от классических опиоидных механизмов снижения болевой чувствительности. Исходя из вышеизложенного, поиск минимальной структуры,

необходимой для проявления анальгетической активности, был осуществлен в подклассе атипичных ОП.

Анализ наиболее часто встречающегося аминокислотного фрагмента в этом подклассе выявил, что мини-консенсусом, объединяющим большую часть (63%) рассматриваемой группы является дипептидный фрагмент -Туг-Рго- (рис. 1).

Рисунок 1. Распространённость дипептидных фрагментов у атипичных ОП.

■1 -VT -I -1 -1 -1 -1 -1 -VI -1 -1 "I -1 -V -I в

ADEFGH I KLMNPQRSTVW Y *

А - Ala, D - Asp, Е - Glu, F - Phe, G - Gly, H - His, I - He, К - Lys, L - Leu, M - Met, N - Asn, P - Pro, Q - Gin, R - Arg, S - Ser, T - Thr, V - Val, W - Trp, Y - Tyr

Выявленная нами уникальная распространенность дипептидного фрагмента Туг-Рго среди представителей атипичных ОП указывает на его участие в формировании фармакофора, а дипептид Туг-Рго сам по себе может обладать функциональной активностью, в том числе анальгетическим действием.

В связи с этим в настоящем исследовании был изучен широкий спектр анальгетических эффектов дипептида Туг-Рго при его системном введении. Установлено, что дипептид Туг-Рго в дозах 0.1 - 10.0 мг/кг (в/б) обладает дозо-зависимым анальгетическим действием в тесте отдергивания хвоста (тест соматической боли) (рис. 2), по уровню ЭД50 (1.2 (2.0-Ю.7) мг/кг) дипептид активнее ДМ в 4.25 раз, не уступает морфину, диклофенак в данном тесте не эффективен (табл.2). В тесте формалиновых болей Туг-Рго в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг вызывает дозо-зависимое уменьшение болевых реакций в I и II фазе, подобно наркотическим анальгетикам, тогда как НПВС, габапентин и антагонисты NMDA рецепторов активны только во II фазе (Le Bars et al., 2001). Дипептид в дозе 0.1 мг/кг (но не 1.0 и 10.0 мг/кг) подавляет реакцию воспачения, вызванную конканавалином А, а в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг уменьшает число корчей, вызванных уксусной кислотой (тест

10

висцеральной боли). По уровню ЭД50 (0.5 (8.3-Ю.03) мг/кг) в тесте уксусных корчей Туг-Рго на два порядка менее активен, чем ДМ, уступает морфину, но активнее диклофенака (табл. 2). Туг-Рго в дозе 10.0 мг/кг проявляет анальгетическое действие в тесте механического зажима основания хвоста (тест соматической боли) (табл. 4).

Таблица 2. Анальгетическая активность Туг-Рго, Туг-Рго-содержащих пептидов и

известных анальгетиков в тестах отдергивания хвоста и уксусных корчей.

Пептид Отде ргивание хвоста (изменение чувствительности, сек) Уксусные корчи

20 мин 40 мин 60 мин 90 мин 120 мин ЭДзо мг/кг %от контроля ЭД50 мг/кг

контроль 0.5±0.1 0.5±0.1 0.3±0.1 0.2±0.1 -0.1 ±0.1 100

Туг-Рго (в/6) 0.01 мг/кг 2.0±0.5 0.9±0.2 0.9±0.2 0.8±0.1 0±0.5 1.2(2 + 0.7) мг/кг 3.8 мкмоль/кт 0.5 (8.3 + 0.03) мг/кг 1.6 мкмоль/кг

0.1 мг/кг 3.5±0.6* 2.6±0.5* 0.7±0.2 0.4±0.1 0.1 ±0.1 82.3

1 мг/кг 3.4±0.8* 5.5±0.9 * 4.7±0.7* 3.9±0.6* 0.8±0.2 54*

10 мг/кг 4.8±1.4* 6.0±1.6* 5.9±1.6* 5.3±1.3* 4.3±1.4* 5.7*

Туг-Рго-[D,L]Ser-NH, (в/б) 0.01 мг/кг 1.0±0.2 1.3±0.3 1.2±0.2 1.0±0.3 0.9±0.2 1.3 (26 + 0.06) мг/кг 3.1 мкмоль/кг 73.5 0.06(0.1 +0.04) мг/кг 0.14 мкмоль/кг

0.1 мг/кг 5.0±0.7* 4.6±0.6* 2.3±0.3» 1.8±0.4 0.8±0.1 46.2*

1 мг/кг 4.2+0.6» S.0±0.S * 4.8±0.7» 3.6±0.6* 1.3±0.3 12.7*

10 мг/кг 6.4±1.0* 4.7±0.7 * 4.1±0.5* 3.8±0.6* 1.9±0.3 7.3*

Туг-Д-Рго-Scr-NH, (в/б) 0.01 мг/кг 2.0±0.3 1 -9±0.3 1.3±0.3 1.5±0.2 0.5+0.1 2.9(7.8+ 1.1) мг/кг 6.9 мкмоль/кг 90.9 0.2(0.4 + 0.18) мг/кг 0.47 мкмоль/кг

0.1 мг/кг 3.3±0.5* 3.5±0.6* 2.9±0.5* 1.6±0.5 1.1+0.3 65.2

1 мг/кг 5.7±0.2* 4.2+0.1 • 3.|±0.1» 2.1 ±0.1* 1.1+0.1 26.8*

10 мг/кг 6.3±].1* 4.9±0.8 » 3.9±0.8* 3.3±0.6* 2.0+0.6 7.3*

ДМ (в/б) 0.01 мг/кг 0±0.2 0.4±0.2 0.3±0.2 0±0.1 0±0.1 5.1(7.3 + 3.6) мг/кг 5.9 мкмоль/кг 47* 0.008 (0.1 + 0.0005) мг/кг 0.009 мкмоль/кг

0.1 мг/кг 0±0.1 0.5±0.1 0.3±0.1 0±0.1 -0.1 ±0.1 21.7*

1 мг/кг 3.5±0.4* 1.9±0.2 1.6±0.2 0.3±0.1 0.1 ±0.1 20.4*

10 мг/кг 2.9±0.3* 3.9±0.3 « 8.2±1.0* 5.1±0.3* 4.2±0.6* 0.3*

[DPro'WM (в/б) 0.01 мг/кг 2.7±0.6* 2.6±0.6* 1.6±0.3 0.6+0.2 0.1±0.1 1.1(6.7 + 0.2) мг/кг 1.3мкмоль/кг 70.4 0.06 (0.1 + 0.03) мг/кг 0.07 мкмоль/кг

0.1 мг/кг 2.3+0.3* 4.7±0.5* 3.7±0.3* 1.8±0.3 1±0.2 39.5*

1 мг/кг 5.8±0.9* 7.6±0.8* 5.4±0.5* 4.0+0.6* 0.2±0.1 27.6*

10 мг/кг 11±1.2* 12.4±1.6* 12.8±1.4* 6.7±0.7* 4.5±0.3* 9.5*

Морфин (в/6) 0.1 мг/кг - - - - - 2.8 (24 + 0.3) мг/кг 9.8мкмоль/кг 80.5 1.1 (6.7 + 0.2) мг/кг 1.3 мкмоль/кг

0.5 мг/кг - - - - 27.9*

1 мг/кг 1.4±0.4 0.7±0.2 0.9±0.2 0.6±0.1 0±0.1 6.6*

3 мг/кг 6.8±1.6* 9.6±2.3* 6.6±1.6* 3.5±0.6* 3.3±0.5* 0.5*

5 мг/кг 11.1 ±2.0' 12.2±2.0 * 12.3±2.0* 12.3±1.9* 12±2.0* 0.2*

Диклофенак (в/б) 10 мг/кг 0.7±0.1 0.9±0.2 1.2±0.2 0.9+0.2 0.7±0.1 >50 мг/кг 65.3 13 (89 + 2) мг/кг 43.9 мкмоль/кт

25 мг/кг 1.0+0.2 1.3±0.3 0.8±0.2 0.7±0.2 0.6±0.2 54.9*

50 мг/кг 0.7+0.2 1.3±0.2 0.6±0.2 0.610.2 0.4±0.1 13.5*

Введение (в/б) отдельных аминокислот Туг или Pro или их эквимолярной смеси не вызывает анальгезии в тесте отдергивания хвоста, следовательно, обезболивающим эффектом обладает именно дипептид (рис. 2).

Метилирование (Туг-Рго-оМе) или амидирование (Tyr-Pro-NH2) С-концевого пролина дипептида Туг-Рго снижает длительность анальгетического действия в тесте отдергивания хвоста и увеличивает величину анальгетического эффекта дипептида е тесте уксусных корчей (табл. 6). Сгереохимическая модификация остатка пролина в молекуле Туг-Рго не изменяет анальгетическую активность в тесте отдергивания хвоста и увеличивает в тесте уксусные корчи (табл. 6). Полученные данные позволяют предполагать разные механизмы проявления обезболивающего действия пептида в тестах соматической и висцеральной боли.

Рисунок 2. Влияние на болевую чувствительность пролина, тирозина, их смеси и Туг-Рго, в тесте отдергивания хвоста крыс.

— 4— контроль ■ Туг-Рго 0.1 мгЛг ■ 4 Туг-Рго 1 мг/кг -■» Туг-Рго Юм г/к г

• "А--- Туг 1 мгЛ<г •••■•••Рго1 мгЛсг Туг+Рго

Отличия от контроля достоверны (*) при р<0.05 по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (1Мс5().

Рисунок 3. Влияние блокаторов опиоидных рецепторов на анальгетическую активность Туг-Рго в тесте отдергивания хвоста.

* 90 120

Время после инъекции (мин)

— контроль • налоксон

А Туг-Рго —о— Туг-Рго+налоксон

налоксон метиодид ♦ ' - Туг-Рго+налоксон метиодид

Отличия достоверны при р<0.05 от контрольной группы (*) и от группы, которой вводили Туг-Рго (#) по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (и-(е50. Все соединения вводили в дозе 1 мг/кг в/б.

Анализ механизма анальгетического действия Туг-Рго с использованием фармакологических анализаторов показал, что выраженность эффекта снижается под действием антагонистов центральных и периферических опиоидных рецепторов налоксона и налоксона метиодида в тестах отдергивания хвоста и уксусных корчей (рис. 3, табл. 3), что свидетельствует о вовлечённости периферической

12

опиоидергической системы в анальгетический эффект Туг-Рго в тестах соматической и висцеральной боли.

Таблица 3. Влияние блокаторов опиоидных рецепторов на анальгетическую

активность Туг-Рго в тесте уксусных корчей.

Пептид (в/б)+блокатор (п/к) % от контроля Рецепторы |

опиоидные орфановые каннабинондаьЕ

И 1 Й1 1 6 | к | МбрГ ORL, СВ,

контроль 100%

Туг-Рго 1 мг/кг 55% 1

Туг-Рго 1 мг/кг + Налоксон 1 мг/кг 95% # центра 1ьные и периферичесгие

Туг-Рго 1 мг/кг + Налоксон метиодид I мг/кг 107% #

Туг-Рго 1 мг/кг + Налтрексон 1 и 10 мг/кг 40.4%* 38.4% * центральные и периферические

Туг-Рго 1 мг/кг + 3-метоксиналтрексон 5 мг/кг 38.4% *

Tyr-Pro J мг/кг + Налоксоназин 10 . мг/кг 31.8%*

Туг-Рго 1 мг/кг + Наптриндол 5 мг/кг 11.5% *#

Туг-Рго 1 мг/кг + Налоксона бензоил- | гидразон 1 мг/кг 9.5% *# I .Г агонист П|

Туг-Рго 1 мг/кг + АМ-251 5 мг/кг 1 48.1% *# ■ п

% относительно группы активного контроля, получившего уксусную кислоту. Отличия достоверны при р<0.05 от контрольной группы (*) и от группы, которой вводили Туг-Рго (#) по критерию Вилкоксона-Мэниа-Уигни (Шее!).

М6|ЗГ - рецепторы морфин-6-(3-глюкуронида

ЕШ - блокирует; 1 I - не влияет; Е£Ш - потенцирует.

Установлено, что анальгетический эффект Туг-Рго в тесте уксусных корчей не реализуется через рецепторы, связывающие морфин-6-(3-глюкуронид, каннабиноидные СВгрецепторы и ДгОР, так как какая-либо реакция на введение специфических антагонистов этих рецепторов (3-метоксиналтрексона, АМ-251 или налоксоназина, соответственно) отсутствовала. В то же время анальгезия, вызванная дипептидом, усиливается при блокаде 5-ОР налтриндолом, а также под действием бензоилгидразона налоксона, который стимулирует к-)- и подавляет ОЯЬг и |д-ОР (табл. 3).

Туг-Рго проявляет слабое сродство к периферическим 5-ОР (Ю50 9.1x10"5 моль) и не обладает сродством к периферическим д-ОР (1С50 7.6Х10"4 моль) на препаратах изолированных органов СПМ и ПКМС, соответственно (табл. 4), в отличие от ДМ и морфина, которые оказывают эффект в наномолярной области концентраций. Стереохимическая модификация остатка пролина в молекуле Туг-Рго приводит к потере способности связываться с периферическими §-ОР (табл. 6).

Таблица 4. Влияние модификаций по пролину на анальгетическую, нейропсихотропную активность и дополнительные эффекты

ДМ, его фрагментов И аналогов (в таблице указаны дозы в мг/кг при внутрибр кэши ином введении, вызывающие достоверные отличия от контрольной группы).

Тесты / вещество ДМ ГДРго^ДМ [ОРго"]ДМ Туг-Рго-[0,г.]5ег-М1: Туг-О-Рго-Эст-МЬ Туг-Рго

Отдергивание хвоста 1-10 мг/кг 1-10 мг/кг 0.01-10 мг/кг 0.1-10 мг/кг 0.1-10 мг/кг 0.1-10 мг/кг

4> 5 Горячая пластина 1 мг/кг 1-10 мг/кг 1-10 мг/кг 1-10 мг/кг 1-10 мг/кг не влияет

и <и 3 Й и л § Механическое раздражение 1-10 мг/кг 10 мг/кг 1-10 мг/кг 1-10 мг/кг 1-10 мг/кг 10 мг/кг

Формалиновый тест 1,11 фаза 1-10 мг/кг 1,11 фаза 1-10 мг/кг 1,11 фаза 1-10 мг/кг 1,11 фаза 1-10 мг/кг 1,11 фаза 1-10 мг/кг 1,11 фаза 1-10 мг/кг

< Уксусные корчи 0.01-10 мг/кг 1-10 мг/кг 0.1-10 мг/кг 0.1-10 мг/кг 1-10 мг/кг 1-10 мг/кг

Реакция на конканавалинА 0.1- 10 мг/кг 10 мг/кг 1 мг/кг не влияет 1-10 мг/кг 0.1 мг/кг

и § Горизонтальная двигательная активность седативное 1-10 мг/кг седативное 10 мг/кг седативное 10 мг/кг не влияет не влияет не влияет

г» о н 5 Вертикальная двигательная активность седативное 0.1-10 мг/кг седативное 1-10 мг/кг седативное 10 мг/кг не влияет не влияет не влияет

Ориент.-исслед. реакция седативное 10 мг/кг седативное 10 мг/кг не влияет не влияет не влияет не влияет

Приподнятый крестообразный лабиринт не влияет анксиолитическое 10 мг/кг не влияет анксиолитическое 1-10 мг/кг анксиолитическое 10 мг/кг анксиолитическое 1-10 мг/кг

Неизбегаемое плавание не влияет не влияет не влияет 1-10 мг/кг не влияет не влияет

Максимальный электрошок 0.1-10 мг/кг не влияет 10 мг/кг 1-10 мг/кг не влияет 10 мг/кг

Коразоловые судороги не влияет не влияет 1 мг/кг не влияет не влияет не влияет

Частота дыхания снижает снижает снижает не влияет не влияет не влияет

мышей (ТД50) > 600 мг/кг > 600 мг/кг 322 (466-1-221) мг/кг до 800 мг/кг До 800 мг/кг до 800 мг/кг

Гибель мышей через 24 часа (ЛДм) не вызывает > 800 мг/кг не вызывает > 800 мг/кг 568(618+522) мг/кг не вызывает > 800 мг/кг не вызывает > 800 мг/кг не вызывает > 800 мг/кг

В контрольной группе беспородных мышей частота дыхания соответствует 210.5±4.5 движений в минуту. Дипептид Туг-Рго в дозах 1, 10, 100, 500 и 800 мг/кг (в/б) не влияет на частоту дыхания и не приводит к гибели мышей через 24 часа после введения. Синдром отмены Туг-Рго при провокации налоксоном достоверно меньше выражен, по сравнению с отменой морфина. Дипептид в дозах 1-10 мг/кг (в/б) не изменяет температуру тела и кожи хвоста крыс при холодной (4-6°С), комфортной (27-28°С) и жаркой (31-32°С) температуре окружающей среды. В этих же дозах (в/б) Туг-Рго оказывает анксиолитическое действие в тесте ПКЛ и противосудорожное (только 10 мг/кг) в тесте МЭШ, но не в тесте коразоловых судорог, не изменяет двигательную активность и ориентировочно-исследовательскую реакцию в тесте открытое поле, не обладает антидепрессантной активностью в тесте неизбегаемого плавания (табл. 4).

II. Влияние модификаций остатка пролина в молекуле дерморфина на проявление анальгетической активности и сопутствующих эффектов

Атипичный ОП дерморфин (ДМ) - Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2 в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг (в/б) проявляет дозо-зависимую анальгетическую активность в тестах соматической боли при действии термических (тест отдергивания хвоста и горячей пластины) и механических стимулов (тест механического зажима основания хвоста) и в тесте тонической боли, вызванной формалином. Пептид оказывает анальгетическое действие в дозах 0.1 - 10.0 мг/кг (в/б) в тесте висцеральной боли, вызванной уксусной кислотой и противовоспалительное действие при стимуляции конканавалином А (табл. 2, 4, 6).

Замена остатка пролина в шестом положении в молекуле ДМ на D-стереоизомер или его дегидрирование (ДРго6) увеличивает латентный период болевой реакции и удлиняет анальгетическое действие в тесте отдергивания хвоста при в/б введении (табл. 2, 4, 6). Замещение остатка пролина на D-APro6 приводит к исчезновению эффекта. Уровень активности [£>-Рго6]-ДМ и [ДРго6]-ДМ в дозе 1.0 мг/кг (в/б) выше активности морфина в той же дозе, а в дозе 10.0 мг/кг [D-Pro6]-ДМ сопоставим с морфином в дозе 5.0 мг/кг (табл. 2). В тесте горячей пластины замена остатка пролина на D-Pro6, ДРго6 или D-ДРго6 уменьшает выраженность анальгетического эффекта. Стереохимическая модификация остатка пролина в молекуле ДМ не изменяет анальгетическую реакцию в тесте механического зажима основания хвоста крыс. Дегидрирование остатка пролина в молекуле ДМ приводит к увеличению эффективных доз (табл. 4). Замена остатка пролина на D-Pro в молекуле ДМ не изменяет диапазон действующих доз в тесте уксусных корчей и формалиновых болей (табл. 2, 4, 6). Дегидрирование остатка пролина в молекуле ДМ приводит к смещению диапазона действующих доз в сторону его увеличения в тесте уксусных корчей. Стереохимическая модификация или дегидрирование остатка

пролина в молекуле ДМ вызывает уменьшение противовоспалительного действия при стимуляции конканавалином А (табл. 4).

ДМ в дозах 1-500 мг/кг (в/б) снижает частоту дыхания (ТД50 = 574 (1042+317) мг/кг) и не вызывает гибели мышей. Дегидрирование остатка пролина не приводит к изменению доз, влияющих на дыхание, не изменяет токсичность и в дозах 1-800 мг/кг (в/б) пептид не вызывает гибель мышей. Стереохимическая модификация остатка пролина в молекуле ДМ снижает уровень доз, угнетающих дыхание (ТД50 = 322 (466+221) мг/кг) и повышает токсичность (ЛД50 = 568 (618+522) мг/кг) (табл. 5).

Таблица 5. Терапевтический индекс пептидов при внутрибрюшинном введении.

ТД5о дых/ЭД5о аналг корчи ЛД50 /ЭД50 аналг корчи

дм 68 375 >100 000

[ОРго'ЩМ 5 366 9 467

Туг-Рго-[Д£]8ег-Ш2 > 13 333 > 13 333

Туг-О-Рго-Зег-Шг >4 000 >4 000

ДМ (0.1 - 10.0 мг/кг, в/б) вызывает у мышей дозо-зависимое седативное действие в тесте открытое поле, не влияет на время пребывания крыс в открытых рукавах ПКЛ и не изменяет время иммобилизации мышей в тесте неизбегаемого плавания (табл. 4). В дозах 0.1 - 10.0 мг/кг (в/б) пептид проявляет противосудорожное действие в тесте МЭШ, но не в тесте коразоловых судорог. Стереохимическая модификация остатка пролина в молекуле ДМ приводит к увеличению уровня доз, оказывающих седативное действие в тесте открытое поле и противосудорожное действие в тесте МЭШ, и появлению противосудорожного действия в тесте коразоловых судорог (табл. 4). Дегидрирование остатка пролина в молекуле ДМ вызывает появление анксиолитического и исчезновение противосудорожного действия.

ДМ (0.5 мг/кг, в/б) изменяет температуру тела в зависимости от температуры окружающей среды. В холодной среде (4-6°С) и термонейтральной (27-28°С) вызывает гипотермию, а в жаркой (31-32°С) - гипертермию. При замене остатка Ь-пролина в молекуле ДМ на Д-стереоизомер или его дегидрировании гипотермическое действие в холодной среде сохраняется. В термонейтральной среде при действии ДМ наблюдается двухфазная сосудистая реакция. Дегидрирование остатка пролина приводит к исчезновению сосудосуживающего компонента действия, а стереохимическая модификация по пролину вызывает потерю гипотермического действия и сосудистой реакции. В условиях жаркой среды дегидрирование остатка пролина в молекуле ДМ приводит к инверсии температурной реакции на гипотермическую и появлению сосудосуживающего действия. Замена остатка I-пролина в молекуле ДМ на £>-стереоизомер вызывает появление сосудосуживающего действия.

При субхроническом 7-дневном введении [£>-Рго6]-ДМ (10 мг/кг, в/б) развивается толерантность по анальгетическому действию в тесте уксусных корчей и по седативному действию в тесте открытое поле. Перекрестная толерантность к морфину не проявляется. При провокации налоксоном синдрома отмены у морфин-зависимых животных регистрировались прыжки (у 94%) и изменение веса (на 23%). У [Д-Рго6]ДМ-зависимых животных наблюдалось достоверно меньшее по сравнению с морфином число прыжков (у 18 %). Вес пептид-зависимых животных не изменялся после введения пептида и провокации налоксоном. Следовательно, [0-Рго6]-ДМ-зависимые животные легче переносят синдром отмены.

ДМ с высокой аффинностью связывается с периферическими ¡х- и 8-ОР ПКМС и СПМ (2.6х10"8 моль и 9.0х10"8 моль, соответственно) (табл. 6). Стереохимическая модификация по остатку пролина в молекуле ДМ не изменяет сродства к периферическим |1- и 8-ОР ПКМС и СПМ (табл. 6).

Рисунок 4. Профиль активностей ДМ (А) и [£>-Рго6]-ДМ (Б).

А Б

мех аналгезия мех аналгезия

Примечание: Указаны дозы, вызывающие достоверные эффекты: 1 - доза 10 мг/кг, 2 - доза 1 мг/кг, 3 - доза 0.1 мг/кг. Изменение температуры тела в дозе 0.5 мг/кг: 1 - в холодной; 2 - в термонейтральной; 3 - в жаркой средах. Дозы, угнетающие дыхание и вызывающие гибель: 3 - 300 мг/кг, 2 - 500 мг/кг. 1 - 800 мг/кг. Синдром отмены (при провокации налоксоном прыжков): I - 30% животных, 2 - 60%, 3 - 100%.

Таким образом, Туг-Рго-содержащий пептид ДМ обладает анальгетическим, седативным, противосудорожным и терморегуляторным действием. Стереохимическая модификация остатка пролина в молекуле ДМ усиливает анальгетическое действие в тесте отдергивания хвоста и уменьшает противовоспалительное и противосудорожное действие (рис. 4). При субхроническом 7-дневном введении [£>-Рго6]-ДМ по анальгетическому и седативному действию развивается толерантность. При провокации налоксоном симптомы синдрома отмены [£>-Рго6]-ДМ менее выражены по сравнению с морфином. Дегидрирование остатка пролина в молекуле ДМ сдвигает диапазон действующих доз в сторону увеличения в тестах механического раздражения основания хвоста и уксусных корчей.

III. Исследование влияния удлинения дипептидной последовательности Tyr-Pro(Z>-Pro, ДРго, Hyp) на проявление анальгетической и опиоидной активности

Анализ зависимости структуры-активности в ряду атипичных ОП выявил свободу позиционирования пары -Туг-Рго- в последовательностях пептидов. Действительно, функциональная опиоидная активность пептидов принципиальным образом не зависит от положения фрагмента Туг-Рго в пептидной цепи и сохраняется при его перемещении как в jV-конец молекулы (эндоморфины, геморфины), так и внутрь цепи (глютеновые экзорфины А, геморфины, дерморфины), так и в С-конец (глютеновый экзорфин А, геморфин-(1-5)). С другой стороны, при рассмотрении серии гомологов геморфина выявлено, что аминокислотные остатки слева от тирозина и справа от пролина не имеют критического значения для проявления функциональной активности и могут быть удалены. На основании проведенного анализа было высказано предположение о том, что удлинение дипептида Туг-Рго природными аминокислотами может приводить к новым пептидам, сохраняющим анальгетическую активность.

1. Влияние С-концевого удлинения последовательности Tyr-Pro(Z)-Pro, ДРго, Hyp) на проявление анальгетической активности и сродство к опиоидным рецепторам

Изученные пептиды Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH2, Tyr-Pro-Ser-oMe, Tyr-D-Pro-Ser-NH2, Tyr-D-Pro-Ser-oMe, Tyr-APro-Ser-NH2, Tyr-[AZ.]APro-Ser-oMe, Tyr-Pro-Lys-NH2, Tyr-Pro-Ala-NH2 обладают анальгетическим действием в тестах отдергивания хвоста и уксусных корчей, a Tyr-Hyp-Ser-NH2, Tyr-Hyp-Ser-oMe - только в тесте уксусных корчей. Удлинение последовательности Туг-Рго положительно заряженным Lys увеличивает сродство к 5-ОР, нейтрально заряженным Ala - к р-ОР, а полярным Ser -незначительно увеличивает к |х- и уменьшает к б-ОР, при этом усиливается анальгетическая активность в тесте уксусных корчей (табл. 6).

При удлинении дипептида Туг-Рго последовательностью Gly-Pro анальгетический эффект сохраняется, хотя сродство к ¡> и S-OP практически не изменяется. При удлинении Tyr-£>-Pro-Ser последовательностью Pro-Gly-Pro значимо не изменяется сродство к р- и 6-ОР, но сокращается продолжительность обезболивающего действия в тесте отдергивания хвоста (табл. 6).

Амидирование, но не метилирование, С-концевых аминокислотных остатков увеличивает анальгетическую активность, однако выявленная закономерность не связана с увеличением сродства к р- и 5-ОР. В тестах соматической и висцеральной боли наибольшей активностью обладают трипептиды Tyr-Pro-[D,¿]Ser-NH2, Tyr-D-Pro-Ser-NH2, Tyr-Pro-Lys-NHj (табл. 6).

Таблица 6. Сравнительная анальгетическая (1 мг/кг, в/б) и опиоидная активность

пептидов общей формулы А-Б-Туг-Ргоф-Рго, ДРго, £>-ДРго, Нур)-В-Х и аналогов ДМ.

Пептид Отдергивание хвоста корчи ПКМС (и-ОР) СПМ (5-ОР)

20 мин 40 мин 60 мин 90 мин 120 мин % моль МОЛЬ

контроль 0.5±0.4 0.6±0Л 0.410.4 0.2Ю.4 010.4 100

дипептиды

Тут-Рто 3.4±0.8 » 5.510.9 • 4.710.7 • 3.910.6 • 0.810.2 54* 7.6x10-* (9.1 -6.3x10") 9.1x10"' (11 -7.7x10')

Тут-Рго-оМе Тут-Рго-№12 3.610.8» 3.011.0* 5.711.2» 5.811.5» 4.710.8 * 5.011.2* 2.910.8 * 4.010.8 * 1.410.3 0.810.2 23.8» 29.4» 8.4x10" (10-7.5x10"") 2.6х10"7 (3.0-2.3х10'7) 3.7x10'' (4.2-3.2x10"') 1.2x10"' (1.4-1.1x10"')

Туг-Д-Рго 3.811.0» 4.510.9 • 5.211.1 * 4.1+1.0* 1.210.5 31.7» 3.4x10"' (4.2-2.8x10") 8.8x10" (9.8-8.0x10")

трипептиды

Туг-Рго-Бсг-оМе 3.2±0.5 » 2.810.3 * 3.010.5 • 1.510.3 0.910.2 28.8» 6.1x10° (6.8 - 5.5x10-5) 4.0x10"* (4.4-3.7x10")

Тут-Рго-[ДХ]5сг-Ш, 4.210.6» 5.010.8 * 4.810.7 * 3.610.6» 1.310.3 12.7» З.ЗхЮ"5 (4.0-2.8x10') 6.5x10" (7.2 - 5.9x10")

Туг-Нур-Бег-оМе -1.910.2 -1.410.3 2.010.2 0.910.3 0.310.1 14.3* 5.9x10-' (6.9-4.8x10"') >10">

Туг-Нур-Зсг-М12 2.410.3 • 1.710.3 1.010.2 0.710.1 0.2Ю.1 10.9* 7.7x10"' (8.9-6.7x10"') 3.2x10"' (3.5-2.9x10')

Туг-ДРго-Бег-оМе 4.110.7» 3.710.6 » 0.210.4 0.1 ±0.4 0.1 ±0.4 19.2* 4.8x10"' (4.2-3.4Х105) 2.4x10"' (4.1 - 1.4x10"')

Туг-£>-Рго-5сг-МН2 5.710.2 • 4.210.1 » 3.110.1 • 2.110.1 * 1.110.1 26.8* 4.0x10"' (4.4-3.6x10"') 5.3x10" (6.0-4.8x10")

Туг-[ДуДРго-5ег-оМс 1.810.4 2.9+0.4 » 2.910.4 * 1.410.2 0.610.1 14.3* 1.4x10"' (2.3-0.4x10"') 2.9x10"' (3.4-2.5x10"')

Туг-ДРго-5ег-ЫН; Туг-Рго-1.у5-МН2 1.810.3 3.410.5 • 2.910.4 • 3.110.4» 6.111.0* 8.011.1 * 3.2+0.5 * 1.510.3 1.2+0.2 -0.210.1 5.2* 14.0* 5.2x10"' (8.1-3.4x10*) 7.3x10"' (8.5-6.2x10"*) 8.7x10"' (9.7-7.8x10"') 3.7x10"' (4.1 -3.3x10"')

Туг-Рго- А1а-1МН; 4.710.6 » 4.310.7 » 2.610.4 * 2.310.4 • 1.010.2 19.7» 2.6x10"" (3.1 -2.2x10") 4.4x10" (5.4-3.4x10")

тетрапегтгиды

Туг-Рго-О1у-Рго 3.610.5» 2.710.4 » 2.910.3 * 1.210.3 0.310.1 12.2» 4.6x10"* (5.6 - 3.8x10'4) 2.6x10" (3.7-1.5x10")

А1а-Туг-Д-Рго-5ег-Ш2 1.710.2 5.010.8 » 3.210.4 * 1.810.3 0.210.1 2.1 » 2.4x10"* (3.4 - 1.4x10"*) 1.7x10"' (2.0-1.5x10"')

ОА1а-Тут-Д-Рго-5сг-Ш2 1.910.3 3.610.5 » 4.0М.6 » 3.110.3» 0.610.2 6.0» 2.8x10"' (3.2-2.4x10"') >10"'

О1и-Туг-0-Рго-5ег-Ш2 Ми-Туг-Д-Рго-Бсг- ын, 3,010.5 » 0.8+0.2 6.111.2* 1.610.3 6.511.2* 0.510.2 4.3+0.9 * 0.110.1 0.910.2 -0.110.1 13.0» 7.3» 1.5x10"1 (2.0 - 1.1х10'3) >10"' 3.3x10"' (4.3-2.3x10"') 2.1x10" (2.3-1.9x10")

Ме|-Туг-Рго-А1а-Ш2 М«-Тут-ДРто-А1а- 1.310.3 1.310.3 0.510.2 1.810.3 1.310.3 1.810.3 1.310.3 1.310.3 0.510.2 0.210.1 88.6 54.3» 9.4x10"' (14 - 8.0x10"') 6.0x10"' 2.0x10"' (2.4-1.8x10"') 1.1x10"

ш, (7.2 - 5.0x10"') (21-9.1x10")

гептапегттиды

Туг-Д-Рго-Бег-Рго- 10.311.4 1.810.3 1.110.1 0.510.1 -0.110.1 9.9» 1.5x10"' 1.7x10"'

С1у-Рго * (1.7-1.3x10"') (2.0-1.5x10"')

гексапептнды

Тут-Д-А1а-РЬе-С1у-Туг-Рго-Бег-ИНг 3.5+0.4» 1.910.2 1.610.2 0.310.1 0.1+0.1 20.4» 2.6x10" (3.1-2.2x10"*) 9.0x10" (11.1 -7.3x10")

Туг-Д-А1а-РЬе-С1у-Туг-ДРго-5ег-КН2 7.610.9» 7.310.7* 4.710.5* 1.610.2 0.410.1 27.6» 4.5x10"' (5.1 -4.0x10"*) 8.4x10"" (9.4-7.5x10*)

Туг-Д-А1а-Р1ю-С1у-Тут-ОРго-Бсг-Шг Туг-Д-А1а-РЬе-С11у-Туг-ОДРго-5ег-КН2 5.8+0.9* 1.510.3 7.610.8* 1.510.3 5.410.5* 0.110.1 4.010.6* 0.110.1 0.210.1 010.1 18.1* 15.1» 3.0x10"" (3.5 - 2.6x10 ") данных нет 8.7x10"" (9.8 - 7.6x10") данных нет

Отличия от контроля достоверны (*) при р<0.05 по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (Шее!). ПКМС - подвздошная кишка морской свинки (СР1), СПМ - семявыносящий проток мыши (МУО)

2. Влияние Л'-концевого удлинения последовательности Tyr-Pro(J5-Pro, ЛРго)-Х на проявление анальгетической активности и сродство к опиоидным рецепторам

Филогенетический анализ мутаций аминокислотных остатков в белковых последовательностях позволило выделить основные группы взаимозаменяемых аминокислот: ароматические (Phe, Туг, Тгр), положительно заряженные (Lys, Arg, His), отрицательно заряженные (Glu, Asp), и остатки разной природы (неполярные с длинным радикалом (Val, Leu, Ile), слабополярные (Met, Cys), с коротким радикалом, (Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gin, Pro)) (Shulz, Schirmer, 1982). Были синтезированы аналоги содержащие представителей основных групп, кроме положительно заряженных, поскольку положительный заряд лигандов ОР увеличивает избирательность по отношению к ц-ОР (Shiller et al., 1989), что повышает риск развития нежелательных побочных эффектов.

Добавление Ala (аминокислотного остатка с малой боковой цепью) с ЛГ-конца трипептида Tyr-.D-Pro-Ser-NH2 увеличивает сродство к 8-ОР, без изменения анальгетической активности; добавление D-Ala - не влияет на анальгетическую активность и сродство к рецепторам, а добавление Glu (отрицательно заряженного) -повышает анальгетическую активность, увеличивает сродство к S-OP и уменьшает к (I-OP. Добавление //-концевого Met к трипептиду Tyr-D-Pro-Ser-NH2 уменьшает сродство к ц- и снижает анальгетическую активность в тесте соматической боли, а к трипептиду Tyr-Pro-Ala-NHî увеличивает сродство к ц- и 5-ОР, но при этом полностью исчезает анальгетическая активность. Среди изученных тетрапептидов наибольшей анальгетической активностью обладали Ala-Tyr-D-Pro-Ser-NHj и Glu-Tyr-D-Pro-Ser-NH2 (табл. 6). Met-Tyr-Pro-Ala-NH2 обладает высоким сродством кц-и 5-ОР, но не оказывает анальгетического действия. Дегидрирование остатка пролина в молекуле Met-Tyr-Pro-Ala-NH2 приводит к уменьшению сродства к б-ОР и появлению слабой активности в тесте уксусных корчей, но не отдергивания хвоста.

Таким образом, в результате проведенных исследований не было установлено взаимосвязи между уровнем анальгетической активности пептидов общей формулы A-Tyr-Pro(D-Pro, ДРго, D-ДРго, Нур)-В-Х и их связыванием с периферическими р- и 5-ОР. Можно полагать, что в группе Тут-Рго-содержаших пептидов механизм анальгетического действия не связан со взаимодействием с периферическими ц- и 5-ОР. Оптимальным соотношением уровней анальгетической активности и связыванием с периферическими ц- и 5-ОР обладают Tyr-Pro-[A£]Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2, что позволило отобрать эти пептиды для дальнейших исследований в качестве потенциальных анальгетиков.

IV. Изучение фармакологической активности Туг-Рго-[Д1,]8ег-1ЧН2 и Туг-Л-Рго-8ег-1ЧН2

С-концевой фрагмент атипичного ОП ДМ трипептид Туг-Рго-Бег-КН? сам не взаимодействует с ц-ОР, но обеспечивает стабильность взаимодействия с ними ДМ (Saqan й а1., 1989). Туг-Рго-Эег-КНг может образовываться при гидролизе ДМ (Оаг1ак е1 а1., 1988). Ранее было показано, что при внутрижелудочковом введении трипептид не обладает анальгетической активностью (Вгоссагйо е1 а1., 1981). Влияние стереохимической модификации остатков пролина и серина на проявление активности амида трипептида не исследовалось.

1. Изучение анальгетической активности Туг-Рго-[/,,/)]8ег-1ЧН2 и Туг-О-Рго-вег-ГШг

Туг-Рго-[Д£]5ег-МН2 и Туг-£>-Рго-5ег-МН2 проявляют анальгетическую активность в дозах 0.1 - 10.0 мг/кг (в/б) в широком диапазоне тестов определения болевой чувствительности. В тесте отдергивания хвоста анальгетическая активность Туг-Рго-[Д1]5ег-МН2 и Туг-0-Рго-5ег-МН2 в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг (в/б) сохраняется на протяжении 90 минут, а в дозе 0.1 мг/кг - 60 минут (табл.2). По уровню ЭД50 Туг-Рго-[£>,/,]8ег-]МН2 и Туг-В-Рго-Бег-ЫНо сопоставимы с ДМ. По глубине анальгетического действия пептиды уступают морфину в дозе 5.0 мг/кг. Диклофенак в дозах 10, 25 и 50 мг/кг в данном тесте не обладает обезболивающим действием. Туг-Рго-[Д£]8ег-КН2 и Туг-й-Рго-Эег-МНг в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг показывают сходную анальгетическую активность в тесте отдергивания хвоста при в/б и в/м введении на протяжении 90 мин и при р.о. введении на протяжении 60 мин (рис. 5). При и/н введении в дозах 0.001 и 0.01 мг/кг пептиды проявляют анальгетическую активность через 20 мин после введения (рис. 5). А

Рисунок 5. Влияние Туг-Рго-[Д^]Зег-ЫН2 (А) и Туг-0-Рго-5ег-1ЧН2 (Б) при различных способах введения на болевую чувствительность в тесте отдергивания

V ипгтя

Б

"I1" ко отрога * 4' • • хнутр! (1 от/кг)

-'♦—— 1НуТри6рЮ111ГСКН04 (1 мтЛт) - *

-О -кктраюзалъко*(0,001 га/яг)

■ — хнутрго.штле чко е (I иг/ит)

Отличия от контроля достоверны (*) при р<0.05 по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (и-1еБ1).

В тесте горячей пластины Туг-Рго-[Д£]8ег-МН2 и Туг-Д-Рго-8ег-№Ь обладают аналитическим действием в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг (в/б). Уровень активности этих трипептидов в дозе 1.0 мг/кг (в/б) сопоставим с активностью ДМ. Эффект сохраняется на протяжении 60 минут. Туг-Рго-[Д,.Ц8ег-МН2 и Туг-Д-Рго-8ег-ЫН2 в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг подобно ДМ снижают болевую чувствительность в тесте механического раздражения хвоста крысы (табл. 3). Как и морфиноподобные соединения Туг-Рго-[Д1]8ег-1ЧН2 и Туг-Д-Рго-8ег-ЫН2 (1.0 и 10.0 мг/кг, в/б) устраняют болевые симптомы I и II фазы в тесте тонической боли, вызванной формалином (рис. 6).

Рисунок 6. Влияние Туг-Рго-[Д1]8ег-Ш, (А) и Туг-Д-Рго-8ег-Ш2 (Б) на болевую чувствительность в формалиновом тесте.

А

1фзза

фаза

|фзм

|ф35.Ч

□контроль НО,1 мг/кг ЕНмгАсг □ 10 мг/кг |

Отличия от контроля достоверны (*) при р<0.05 по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (и-МЯ). Рисунок 7. Аналъгетическая активность ДМ и Туг-Рго-[Д,1]8ег-МН2 в тесте нейрогенного болевого синдрома

120 И 00

! 80

I

; 60

»

)

| 40

»

I 20

Г

о

ОТМЕНА ПРЛПАГАТОП

Г"""* /'

/ f /

/ ^-♦-' ^ 1 - ' 1 1

1 1 )

и_—1 --А—г—»—1—*—г—*—1—г—*--—*...... 1.......: 1 4 '■ 1 |......X—г -Л.........—-,-,-,-

10 11 13 15 16 18 день

-ч—ко Н1 роль

ДМ

В тесте уксусных корчей Туг-Рго-[Д£]8ег-ЫН2 (0.1 - 10.0 мг/кг, в/б) и Туг-£>-Рго-8ег->Ш2 (1.0 - 10.0 мг/кг, в/б) достоверно уменьшают число корчей, вызванных уксусной кислотой. По уровню Е05о пептиды активнее диклофенака, но уступают ДМ (табл.2). Туг-О-Рго-Зег-КНЬ (0.1 - 10.0 мг/кг, в/б) обладает выраженным противовоспалительным действием в тесте индуцированного конканавалином А воспаления, а Туг-Рго-[Д£]8ег-№12 не проявляет активность в изученных дозах. Туг-Рго-[ДХ]8ег-ЫН2 в дозе 1.0 мг/кг (в/б) препятствует развитию нейрогенного болевого синдрома (рис. 7) и не влияет на развитие центрального болевого синдрома. ДМ, напротив, усиливает болевую чувствительность в тесте нейрогенного болевого синдрома.

2. Влияние стереохимических модификаций остатка серина в молекуле Туг-Рго-|0,£]8ег-МН2 на уровень анальгетическую активность

В результате амидирования Туг-Рго-1-8ег-оМе получается смесь стереоизомеров Туг-Рго-Х-8ег-МН2 и Туг-Рго-£)-8ег-МН2 в соотношении 1:1. Изучение анальгетической активности отдельных стереоизомеров в тесте уксусных корчей показало, что анальгетическим действием при внутрибрюшинном введении обладает только Туг-Рго-./9-8ег-№-12 (рис. 8). Это соответствует полученным ранее данным Вгоссаг<1о и коллег (1981) об отсутствии анальгетического действия у Туг-Рго-£-8ег-МН2 при его внутрижелудочковом введении в тесте горячей пластины.

Рисунок 8. Влияние Ь- и £>-стереоизомеров по серину на проявление анальгетической активности Туг-Рго-[Д/,]8ег->Щ2 в тесте уксусных корчей.

Отличия от контроля достоверны (*) при р<0.05 по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (и^еэ!).

3. Изучение нежелательных эффектов Туг-Рго-[£Д>)8ег-]\Н2 и Туг-Х>-Рго-вег-РШг, характерных для опиоидов

Частота дыхания в контрольных группах животных соответствует 211±4 и

209.5±5.7 движений в минуту. Туг-Рго-[П,1]8ег-ЫН2 и Туг-А-Рго-Зег-ИНг не изменяют

частоту дыхания ненаркотизированных беспородных мышей в дозах 1, 10, 100, 500 и

800 мг/кт (в/б, однократно). В группе наркотизированных кроликов частота дыхания

23

до введения пептида соответствует 30±2.4 движения в минуту. После введения Туг-Рго-[Д1]8ег-МН2 в дозе 10 мг/кг (в/в, однократно) частота дыхания значимо не изменяется.

Рисунок 9. Влияние хронического введения Туг-Рго-[Д1]8ег-МН2 (А) и Туг-Д Рго-Зег-ИНг (Б) на болевую чувствительность в тесте отдергивания хвоста.

Отличия от контроля достоверны (*) при р<0.05 по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (Ч.Мс^).

Хроническое 14 и 28-дневное введение Туг-Рго-[Д£,]8ег-МН2 и Туг-Д-Рго-Бег-Ш2 в дозе 1.0 мг/кг (в/б) не приводит к развитию толерантности по анальгетическому эффекту в тесте отдергивания хвоста (рис. 9). 7-дневное введение трипептидов в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг (в/б) не вызывает развитие толерантности по анальгетическому эффекту в тесте уксусных корчей. На протяжении 28 дней введения пептидов в дозе 1.0 мг/кг и после их отмены не наблюдаются симптомы синдрома отмены, сохраняются параметры активности в открытом поле и анальгетическая активность в тесте отдергивания хвоста.

Рисунок 10. Симптомы синдрома отмены Туг-Рго-[Д.£]8ег-1ч[Н2 и Туг-О-Рго-Эег-МН2, провоцированного налоксоном.

□ морфин DTyr.Pro-lL.DlSet.HH2 о Туг.рРг» Зег.ИН2

Отличия от контроля достоверны (*) при р<0.05 по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (ичея^.

При провокации налоксоном синдрома отмены после введения Tyr-Pro-[A,I]Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NHi в дозах 3x50, 3x75 и 3x100 мг/кг в течение 5 дней прыжки и птоз наблюдаются у меньшего числа животных по сравнению с поведением морфин-зависимых животных (рис.10).

При однократном введении Tyr-Pro-[A£]Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 показывают высокий терапевтический индекс (табл. 5). Пептиды не вызывают гибели животных в дозах до 800 мг/кг (в/б). В дозе 100 мг/кг (в/б) Tyr-Pro-[A£]Ser-NH2 и Tyr-A-Pro-Ser-NH2 не влияют на двигательную активность, ориентировочно-исследовательскую реакцию и не вызывают миорелаксации, нарушения координации движений, нарушений ушного и корнеального рефлексов, судорог, тремора, птоза, прыжков, встряхиваний, стука зубами, синдрома Штрауба, чесания, чихания и бокового положения.

4. Изучение нейротропной активности Туг-Pro-[I),/. | S er- N Н2 и Туг-/>-Рго-Ser-NH2

Tyr-Pro-[A,L]Ser-NH2 и Tyr-A-Pro-Ser-NH2 в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг (в/б) не изменяют показателей двигательной активности в открытом поле. Tyr-Pro-[AL]Ser-NH2 в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг проявляет дозо-зависимое анксиолитическое действие в тесте ПКЛ и в дозе 10.0 мг/кг - в тесте конфликтной ситуации. Антидепрессантная активность Tyr-Pro-[Ai.]Ser-NH2 проявляется в тесте неизбегаемого плавания в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг и в тесте вращающихся колёс по Nomura в дозе 0.1 мг/кг. Пептид в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг оказывает противосудорожное действие в тесте МЭШ и не влияет на судорожную готовность в тесте коразоловых судорог. Tyr-A-Pro-Ser-NH2 вызывает анксиолитическое действие в дозе 10.0 мг/кг только в тесте ПКЛ (рис. 11) и не проявляет противосудорожную и антидепрессантную активность.

Рисунок 11. Профиль активности Tyr-Pro-[AX]Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2. Tyr-Pro-[A,L]Ser-NH2 Tyr-A-Pro-Ser-NH2

Примечание: Указаны дозы, вызывающие достоверные эффекты: 1 - доза 10 мг/кг. 2 - доза 1 мг/кг, 3 -доза 0.1 мг/кг. Дозы, угнетающие дыхание и вызывающие гибель: 1 - 300 мг/кг, 2 - 500 мг/кг, 3 - 800 мг/кг. Синдром отмены (при провокации налоксоном прыжков): 1 - 30% животных. 2 - 60%, 3 - 100%.

Изменение температуры окружающей среды приводит к изменению болевой реакции контрольной группы в тесте уксусных корчей (рис. 12). Максимальное число корчей наблюдается в термонейтральной среде. ДМ в дозе 1.0 мг/кг (в/б) уменьшает число корчей во всех температурных режимах. Туг-Рго-[Д.£,]Зег-МН2 обладает анапьгетическим действием только в термонейтральной среде. Наблюдаемые свойства не зависят от терморегуляторных эффектов пептидов. Туг-Рго-[Д1]8ег-МН2 в условиях холодной и термонейтральной среды не влияет на температуру тела, а в жаркой среде вызывает гипертермию, по динамике сходную с эффектом ДМ. Туг-Рго-[Д1]5ег-1МН2 только в термонейтральной среде вызывает сужение сосудов.

Рисунок 12. Болевая чувствительность в тесте уксусных корчей при разной температуре окружающей среды зависимость контрольных величин (А); влияние ДМ и Туг-Рго-[Д1]Зег-1ЧН2 (Б).

140

120 -„ 100 "

| 80-| 60 "

40 " 20 " 0

|Ь

rfl

0-6 13-14 21-22 26-27 31-33 теиперэтура скружагацей среды, оС

120 100

£ 80 5 60

CL

S 40 20 " 0

- О-бС а 2Б-27С о 31-33C

4i

Ii

дм

Туг-Рго-[D,l]Ser-MH2

Отличия от контроля в тестируемом температурном режиме достоверны (*) при р<0.05 по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (Шей).

5. Изучение фармакокинетических параметров Tyr-Pro-[AZ,]Ser-NH2 и Туг-ö-Pro-Ser-NH2

Анализ параметров кинетики - Tyr-[3H]Pro-[D,L]Ser-NH2 и Tyr-£>-[3H]Pro-Ser-NH2 показал, что пептиды определяются в крови, печени и почках на протяжении 120 минут, а в мозге, сердце и легких - 40 минут. Время достижения максимальной концентрации (Tmax) Tyr-[3H]Pro-[D,Z,]Ser-NH2 и Tyr-ß-[3H]Pro-Ser-NH2 составило 5 мин, а ее величина 0.71 и 0.67 % на мл/г, соответственно для пептидов. Пептиды с одинаковой скоростью выводятся из организма. Значения периода полувыведения (t|/2cl) и MRT из крови для Tyr-[3H]Pro-[D,L]Ser-NH2 - 53.8 мин и 43.2 мин, а для Туг--D-[3H]Pro-Ser-NH2 - 57.8 мин и 46.1 мин, соответственно.

В распределении Tyr-[3H]Pro-|7?,L]Ser-NH2 по органам прослеживается значительная гетерогенность. Анализ абсолютных величин тканевой доступности (Ft) исследуемых веществ (табл.7, рис. 13) показал, что пептиды наиболее интенсивно распределяются в хорошо васкуляризированных органах (почки, печень), и наименее

- в менее васкуляризированных органах (легкие, сердце, мозг). Тут-[3Н]Рго-[Д1]8ег-1ЧН2 и Туг-/)-[3Н]Рго-Зег-НН2 обладают малой интенсивностью проникновения в мозг, величина тканевой доступности - 0.11 и 0.04 соответственно. В качестве основного метаболита в тканях определяется [3Н]Рто или Д[3Н]Рго. Других возможных метаболитов Туг-[3Н]Рго/£»-[3Н]Рто или [3Н]Рго/£>-[3Н]Рго-8ег-МН2 обнаружено не было. Туг-[3Н]Рго-[0,Х]8ег-КН2 чувствителен к действию пептидаз и хорошо метаболизируется ферментами крови, сердца, легких, мозга, печени, мозга и незначительно ферментами почек.

Таблица 7. Основные фармакокинетические параметры Туг-[3Н]Рго-[Д£]8ег-1ЧН2 (А) и Туг-£>-[3Н]Рго-8ег-ЫН2 (Б) после его внутримышечного введения животным в дозе 1 мг/кг.

Биоматериалы АиС Тше| МЯТ Тщах Стах Р,

Мин*%/мл/г Мин*%/мл/г Мин Мин % на мл/г АиСткани/ АиСкрови

А Б А Б А Б А Б А Б А Б

Кровь 28.3 28.6 53.8 57.8 43.2 46.1 5.0 5.0 0.71 0.67 - -

Почки 201.2 371.1 19.2 19.0 55.6 57.3 20.0 20.0 4.05 6.16 5.70 9.19

Печень 52.6 193.8 18.2 76.9 56.1 87.6 20.0 80.0 1.06 1.57 1.49 2.34

Мозг 1.8 1.3 38.6 6.3 36.6 45.1 5.0 20.0 0.08 0.03 0.11 0.04

Сердце 9.5 12.8 50.7 67.0 37.3 39.2 5.0 5.0 0.33 0.32 0.46 0.48

Легкие 9.7 20.2 14.1 14.3 45.0 40.7 20.0 20.0 0.25 0.49 0.35 0.73

Рисунок 13. Тканевая доступность Туг-[3Н]Рго-[Д/.]8ег-1ЧН2 и Туг-£>-[3Н]Рго-8ег-ЫН2 после внутримышечного введения животным в дозе 1 мг/кг.

почки печень легкие сердце мозг

V. Изучение механизма действия Туг-Рго-[Д£]8ег-]УН2 и Туг-ДРго-Бег^Н,

В механизме анальгетического действия Туг-Рго-[Д£]8ег-МН2 и Туг-ДРго-Эег-ЫНг участвует опиоидергическая система. Это подтверждается способностью

напоксона, наптрексона и налоксона метиодида ослаблять эффекты пептидов в тестах отдергивания хвоста и уксусных корчей (табл. 8, рис. 14).

Рисунок 14. Влияние блокаторов опиоидных рецепторов на анальгетическую активность Туг-Рго-[Д£]8ег-МН2 и Туг-£>-Рго-8ег-ЫН2 в тесте отдергивания хвоста.

— контрояь —о— к«1<адт 1 '..и-; п —Tyt.Dftfr3e.NK2 -■»- T5rt.Fto.tP.Lper.NH2

— Tyt.DPto.SB.HH2 + налгжсонЗ 1Я>'гг —й— Т^-Ргй.[0.1]Зй1.НН2 + далоксон ! мг/кг

■ ■ Tyt-EiPro.3er.NH2 + м*псе:сон!.!ет 1 Mr.tr А Туг-Рго-[0Д.]^е1-НН2 + ¡етгоксон мет1 ыг/кг

— налоксая мет I г.згЛх

Отличия от контроля достоверны (*) при р<0.05 по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (1.1-1ен1).

Таблица 8. Влияние блокаторов опиоидных рецепторов на анальгетическую активность Туг-Рго-[Д£]8ег-МН2 и Туг-£)-Рго-8ег-ЫН2 в тесте уксусных корчей.

% от контроля Рецепторы

Пептид (в/б)+блокатор (п/к) Туг-Рго-[ДЦБег Туг-О-Рго-Эег- ЫН, опиоидные орфановые каннабиноизные

М М| 5 К М6|ЗГ окь. СВ,

13.2% 26.9%

Налоксон 1 мг/кг 87.7%# 83.1 %# шнгральиыс и периферические

Налоксон метиодид 1 мг/кг 110%# 103% # 1 '1; I, „чески. -л * ■

Налтрексон 1 мг/кг 94.3%* # 88.3%* # '1 ! >,Жр

3-метоксиналтрексон 5 мг/кг 21.8% * 25.5% *

Налоксоназин 10 мг/кг 9.7% * 13.2% *

Налтриндол 5 мг/кг 1.7% *# 11.4% *#

Налоксона бензоил-гидразон I мг/кг 36.7% * 31.2%* агонист

АМ-251 5 мг/кг 19.2%* 24.6% *

% относительно группы активного контроля, получившего уксусную кислоту. Отличия достоверны при р<0.05 от контрольной группы (*) и от группы, которой вводили пептид (#) то критерию Вшткоксона-Мэнна-Уитни (Шезг). Ь2зЗ- блокирует; □ - не влияет; И® - потенцирует; М60Г - рецепторы морфин-6-р-глюкуронида.

28

Анальгетический эффект Tyr-Pro-[D,Z,]Ser-NH2 и Tyr-Z)-Pro-Ser-NH2 (в/б) в тесте уксусных корчей не блокируется (п/к) 3-метоксиналтрексоном (антагонист рецепторов морфин-б-Р-глюкуронида), АМ-251 (антагонист каннабиноидных СВ,-рецепторов), налоксоназином (антагонист ЦгОР) или бензоилгидразоном налоксона (агонист ki-OP и антагонист ORL,- и ц-ОР) и усиливается при блокаде 5-ОР налтриндолом (табл. 8).

В исследованиях in vitro показано, что Tyr-Pro-[AL]Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 не взаимодействуют с периферическими 5-ОР препарата СПМ (1С50 6.5x10"4 моль и 5.3x10"4 моль, соответственно) и проявляют слабое сродство к периферическим ц-ОР препарата ПКМС (1С50 З.ЗхЮ"5 моль и 4.0х10"5 моль, соответственно) (табл. 6).

Показано, что [3Н]-ДМ имеет два участка насыщения в мембранной фракции головного мозга крысы, соответствующие 1.5-3 нМ и >5 нМ (КД[ = 0.26 ± 0.07 нМ и концентрация рецепторов Bmaxi = 24 ± 0.66 фмоль/мг белка, КД2=1.7 ± 0.01 нМ и концентрация рецепторов Втах2 = 53 ± 4.4 фмоль/мг белка (рис. 15). Tyr-Pro-[D,i]Ser-NH2 и Tyr-Z?-Pro-Ser-NH2 вытесняют [3Н]-ДМ только из «высокоаффинных» мест связывания, в первую очередь оккупируемых [3Н]-ДМ при использовании его в концентрации 0.5 нМ. (1С5о немеченого ДМ - составила 0.5 нМ, 1С50 для Туг-Рго-[D,Z,]Ser-NH2 - 8±2 мкМ, 1С50 для Tyr-Z)-Pro-Ser-NH2 - 5±1 мкМ) и не влияют на связывание [3Н]-ДМ с «низкоаффинными» местами связывания (рис. 15), чувствительными к немеченому ДМ и агонисту ОР DAGO (1С50 составила 5 и 4.8 нМ, соответственно).

Рисунок 15. Зависимость специфического связывания от концентраций [3Н]-ДМ в присутствии 5 мкМ ДМ (контроль), Tyr-Pro-[D,£]Ser-NH2, Tyr-D-Pro-Ser-NH2. (А), в координатах Скетчарда (Б).

0p05

0,0045

* орм

S

S 0,0035

£ ороз

t 0,0025

2 0pG2

i

f 0,0315

:

!*: О opoi

0,0005

А

-контроль • Туг- D Pro- Ser- N Н2

(*Н]ДМ, нМ

0,03052

o.oaoti

O.OD0) Q.03009

o.oaoc«

0.03D07 ; О.ООВ06

оимою mm

0.00003 ОДИХ» 0,00001 о

- Туг- Pro- [D, L ] Ser- N H2

Исследование ноцицептивного флексорного рефлекса показало, что Туг-Д-Рго-Ser-NHi (1.0 мг/кг, в/б) вызывает достоверное повышение порога возникновения раннего и позднего ответа, а также снижает количество спайков в раннем и позднем ответе, что характеризует подавление частоты импульсации в ноцицептивных А5- и С-волокнах. Сходным действием обладает морфин (Kimura et al., 2004), а ДМ снижает частоту импульсации только в С-волокнах (Sullivan, Dickenson, 1988).

Анализ электрофизиологических механизмов действия показал, что Туг-Рго-[D,L]Ser-NH2 (1 мг/кг, в/б) имеет отличный от морфина и ДМ профиль изменений биоэлектрической активности. В миндалине, гипоталамусе, ретикулярной формации ствола мозга и сенсомоторной коре через 10 минут после введения Tyr-Pro-[Ai]Ser-NH2 в дозе 1 мг/кг повышает Р, и р2 активность, а ДМ в той же дозе оказывает сноподобное действие, увеличивая активность в 5-диапазоне и уменьшая в 9Ь 02, р, и диапазонах. Морфин в дозе 5 мг/кг повышает 5-активность в перечисленных структурах. Общим в действии Tyr-Pro-[Z),L]Ser-NH2, ДМ и морфина является повышение Pi активности в сенсомоторной коре через 10 минут после введения и снижение р2 активности в гиппокампе через 20 минут после введения.

Рисунок 16. Влияние ДМ, Tyr-Pro-[AI]Ser-NH2 и морфина на содержание аминокислот в стриатуме крыс.

Asp 6lu Gly ГАМК

Отличия от контроля достоверны (*) при р<0.05 по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (1Мс81).

Туг-Рго-[Д.Ц8ег->Ш2, ДМ и морфин также различаются по влиянию на содержание и оборот моноаминов и аминокислот в мозге крыс. Туг-Рго-[Д1]8ег-МН2 в дозе 1 мг/кг (в/б) не влияет на содержание и оборот моноаминов, снижает содержание ГАМК в спинном мозге, повышает содержание глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и глицина в спинном мозге и стриатуме (рис. 16), и только глицина в гиппокампе. Морфин в дозе 5 мг/кг повышает количество глутаминовой кислоты в стриатуме и снижает содержание глицина в гиппокампе. ДМ в дозе 1 мг/кг повышает содержание ГАМК в стволе, глицина в стволе и стриатуме, а в спинном мозге снижает количество глицина. Общим в действии Туг-Рго-[Д1]Зег-ЫН2 и ДМ

является увеличение содержания глицина в стриатуме, а сходство между Туг-Рго-[D,Z,]Ser-NH2 и морфином проявляется в повышении глутаминовой кислоты в стриатуме. На содержание глицина в гиппокампе морфин и Tyr-Pro-[ß,i]Ser-NH2 оказывают разнонаправленное действие: трипептид - повышает, а морфин - снижает. На содержание глицина в спинном мозге ДМ и Tyr-Pro-[A£]Ser-NH2 также оказывают разнонаправленное действие.

Таким образом, аналитическая активность Tyr-Pro-[ö,L]Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 снижается налоксоном и не проникающим через ГЭБ налоксона метиодидом; пептид проявляет слабое сродство к периферическим р-ОР и не взаимодействует с периферическими 5-ОР на препаратах изолированных органов ПКМС и СПМ. При блокаде 6-ОР анальгетическая активность усиливается. Анальгетическое действие Tyr-Pro-[D,L]Scr-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 в тесте уксусных корчей не реализуется через pi, морфин-6-Р-глюкуронидные, каннабиноидные СВЬ и орфановые ORLr рецепторы. Электроэнцефалографические и нейрохимические исследования также выявили существенные различия в эффектах Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH2, ДМ и морфина и указывают на участие иного, отличного от классического опиоидного механизма действия, в реализации эффектов Tyr-Pro-[D,£]Ser-NH2 и Tyr-£>-Pro-Ser-NH2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ первичных последовательностей атипичных ОП, используемый в настоящей работе, позволил выявить наиболее часто встречающуюся пептидную последовательность - дипептид Туг-Рго у 63% пептидов. Эта последовательность Туг-Рго принимает участие в образовании ß-поворота, необходимого для взаимодействия с центрами связывания (Haslach et al., 2008; Doi et ah, 2002). Так ДМ (Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2), благодаря присутствию в молекуле Ö-Ala2 и ¿-Pro6 в растворе может образовывать два N- и С-концевых ß-поворота (Renugopalakrishnan, Rapaka, 1988), что соответствует двум центрам связывания ДМ. Это послужило основанием для предположения о том, что модификация Pro в молекуле Туг-Рго-содержащих пептидов может привести к изменению их биологической активности. Действительно, в нашем исследовании установлено, что замена пролина в молекуле ДМ на D-стереоизомер или его дегидрирование приводит к усилению и пролонгированию анальгетической активности в тесте соматической боли при термическом раздражении ноцицепторов, но не влияет на анальгетические эффекты при механическом и химическим раздражении соматических и висцеральных рецепторов, а также ослабляет седативное действие. Однако, несмотря на различия в эффектах, стереохимическая модификация по пролину в молекуле ДМ не изменяет сродства к р-и 5-ОР на препаратах изолированных органов.

Полученные результаты подтвердили значимость последовательности Туг-Рго для проявления эффектов пептидов и побудили к детальному изучению собственной активности дипептида. Дипептид Туг-Рго впервые был синтезирован и описан в работе, посвященной количественной оценке горького вкуса пептидов этой группы, как один из фрагментов р-казеина (Shinoda et al., 1986). В этом же году было установлено, что Тут-Pro является одним из продуктов ферментативной деградации in vitro опиоидного пептида ДМ (Scalia et al., 1986). В плазме человека и крысы Туг-Рго может образовываться при деградации пептида Tyr-MIF-1 (Kastin et al., 1994), эндоморфина-l (Tomboly et al., 2002; Barsun et al., 2007) и эндоморфина-2 (Sakurada et al., 2003). В гидролизе принимают участие дипептилпептидазы III и IV (Chen et al., 2004). Tyr-Pro также был обнаружен в ферментативном гидролизате казеинов молока (FitzGerald, Meisel, 2000; Zhu et al., 2007). Туг-Рго может также образовываться при гидролизе дипептилпептидазой IV нейропептида Y (NPY), в результате чего образуется фрагмент NPY3.36, с уменьшенной аффинностью к Y, рецепторам (Gerald et al., 1996). Установлено, что дипептид обладает антигипертензивным действием в дозах 0.1 - 10.0 мг/кг у спонтанногипертензивных крыс (Yamamoto et al., 1994), и этот эффект может быть обусловлен подавлением действия ангиотензин-превращающего фермента (Zhu et al., 2007). В исследованиях R6nai и коллег (2006) показано выраженное анальгетическое действие дипептида (100 нмоль на крысу, т.е. примерно 0.16 мг/кг) при внутрижелудочковом введении в тесте отдергивания хвоста.

Анальгетическая активность Туг-Рго при системном введении ранее не изучалась. В нашем исследовании было установлено, что Туг-Рго в дозах 0.1 - 10.0 мг/кг обладает дозо-зависимой анальгетической активностью в тестах тонической и фазической болей, вызванных термическим, механическим и химическим раздражением соматических и висцеральных рецепторов, которая снижается неселективными блокаторами центральных и периферических ОР налоксоном и налоксона метиодидом, соответственно. В тестах in vitro Tyr-Pro обладает слабым сродством к периферическим 5-ОР и не взаимодействует с периферическими ц-ОР. В исследованиях Ronai и коллег (2006) также не удалось обнаружить у Туг-Рго опиоидной активности в тестах in vitro. Кроме того, этой же группой исследователей было показано, что в экстракте мозга крыс через 30 мин после внж введения [3Н]Туг-Рго радиоактивность обнаруживается в тетра- и трипептидах, родственных эндоморфину-2, причём основным метаболитом является дезамидированный эндоморфин-2. Однако, анальгетическое действие эндоморфина-2 чувствительно к действию антагонистов ОР налоксоназину и 3-метоксиналтрексону, что указывает на участие щ-опиатных и морфин-6-/?-глюкуронидных рецепторов (Mizoguchi et al., 2006; Sakurada et al., 2002). В наших исследованиях установлено, что анальгетическое действие Туг-Рго не блокируется антагонистом ргОР налоксоназином и антагонистом

морфин-6-Р-глукуронидных рецепторов 3-метоксиналтрексоном, следовательно, анальгетическое действие при периферическом введении Туг-Pro не опосредовано эндоморфином-2.

Выполненный нами анализ первичной структуры атипичных ОП показал, что опиоидная активность не зависит от положения пары -Туг-Рго- в последовательностях этой выборки и сохраняется, как при его перемещении в N-конец молекулы (эндоморфины, геморфины), так и внутрь цепи (глютеновые экзорфины А, геморфины, дерморфины), и в С-концевое положение (глютеновый экзорфин А, геморфин-(1-5)). Это указывает на возможность сохранения анальгетической активности при модификации -Туг-Pro- с С- и //-концов природными аминокислотами.

На основании полученных результатов были синтезированы и изучены соединения общей формулы A-Tyr-Pro(D-Pro, ДРго, D-ДРго, Нур)-В-Х, где А, В -природные аминокислоты, а X - метильная или амидная группа. Среди протестированных 22 оригинальных синтетических пептидов наиболее эффективными оказались Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Scr-NIb. Анализ литературных источников показал, что свойства пептидов Tyr-Pro-Z)-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 ранее не изучались, а трипептид Tyr-Pro-L-Ser-NH2 был изучен только при внутримозговом введении в тесте горячей пластины, где продемонстрировал отсутствие анальгетической активности (Broccardo et al., 1981). В- наших исследованиях было установлено, что в изучаемой нами смеси стереоизомеров Туг-Pro-[AI]Ser-NH2 (1:1) анальгетической активностью при в/б введении обладает именно Tyr-Pro-D-Ser-NH2, а не Tyr-Pro-Z-Ser-NH2 Установлено, что Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH2 и Tyr-ö-Pro-Ser-NHo в дозах 0.1-10.0 мг/кг проявляют активность в широком наборе тестов оценки болевой чувствительности и на моделях воспалительной боли. Tyr-£>-Pro-Ser-NH2 подавляет частоту импульсации в А5- и С-волокнах ноцицепторов. Туг- Pro-[D, ¿] S er-NH2 оказывает обезболивающее действие на модели нейропатической боли, но не при моделировании центрального болевого синдрома. Анальгетическое действие пептида зависит от температуры окружающей среды (в холодной и жаркой среде ослабляется). Анальгетический эффект Tyr-Pro-[ö,I]Ser-NH2 и Tyr-ß-Pro-Ser-NH2 (в/б) блокируется неселективными антагонистами центральных и периферических ОР, однако пептиды проявляют слабое сродство к периферическим р- и не связываются с 6-ОР на препаратах изолированных органов ПКМС и СПМ, но взаимодействуют с «высокоаффинными» местами связывания ДМ в головном мозге крыс.

Таким образом, выявлен новый класс пептидных соединений, обладающих анальгетической активностью. Отобранные для дальнейших исследований пептиды Tyr-Pro-[Z>,L]Ser-NH2 и Tyr-£)-Pro-Ser-NH2 проявляют анальгетическую активность и

обладают рядом преимуществ по сравнению с морфином: 1) имеют большую терапевтическую широту и не оказывают влияния на частоту дыхания при превышении терапевтической дозы в 500 раз; 2) у пептидов не отмечено развития толерантности по анальгетическому действию при их хроническом введении; 3) у пептидов не выявляется проявлений синдрома отмены после прекращения их длительного введения (28 дней) и наблюдается достоверно менее выраженные проявления острой физической зависимости при провокации напоксоном. По сравнению с диклофенаком пептиды активны в более широком диапазоне тестов и в меньших дозах.

ВЫВОДЫ

1. При анализе биоинформационными методами первичной последовательности 60 представителей атипичных опиоидных пептидов выявлена аминокислотная последовательность -Туг-Рго- у 63% веществ. Показано, что наличие опиоидной активности пептидов не зависит от положения -Туг-Рго- в их молекулах.

2. Туг-Рго в дозах 0.1 - 10.0 мг/кг (в/б) проявляет анальгетическую активность в тестах фазической и тонической боли при раздражении соматических и висцеральных ноцицепторов химическими, термическими и механическими стимулами. Анальгетическая активность Туг-Рго чувствительна к действию центральных и периферических антагонистов опиоидных рецепторов налоксона и налоксона метиодида, однако пептид проявляет слабое сродство к 8-опиоидными рецепторам семявыносящего протока мыши и не взаимодействует с ц-опиоидным рецепторам подвздошной кишки морской свинки.

3. Стереохимическая модификация остатка пролина в молекуле Туг-Рго-содержащего пептида дерморфина не влияет на сродство к периферическим ц- и 5-опиоидным рецепторам. Замена ¿-пролина на О-стереоизомер не изменяет анальгетическую активность дерморфина при механическом и химическом раздражении ноцицепторов, но ослабляет противовоспалительное действие. Дегидрирование пролина в молекуле дерморфина повышает сродство к опиоидным рецепторам, ослабляет противовоспалительное и анальгетическое действие при механическом раздражении ноцицепторов и приводит к появлению анксиолитической и потере противосудорожной активности.

4. Изучение зависимости между строением и анальгетической активностью в ряду новых 22 синтетических пептидов, содержащих -Туг-Рго-, выявило, что наибольшей активностью обладают трипептиды Туг-Рго-[Д Ь] Бег-ИНг (1:1) и Туг-Б-Рго-Бег-МНг, которые в дозах 0.1 - 10 мг/кг проявляют анальгетическое действие в тестах фазической и тонической боли при раздражении соматических и висцеральных ноцицепторов химическими, термическими и механическими стимулами, и в тестах воспалительной боли. Анальгетическая активность трипептидов сохраняется в

34

течение 90 минут и наблюдается при различных способах введения (внутрибрюшинном, внутримышечном, внутрь и интраназальном). В смеси стереоизомеров Tyr-Pro-[D,L]Scr-NH2 анальгетической активностью обладает D-стереоизомер, а ¿-стереоизомер - не активен.

5. При исследовании механизма действия Tyr-Pro-[D,£]Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NHj обнаружено, что анальгетическая активность пептидов чувствительна к действию центральных и периферических антагонистов опиоидных рецепторов (напоксона, налтрексона и налоксона метиодида), однако пептиды проявляют слабое сродство к ц-опиоидным рецепторам подвздошной кишки морской свинки и не взаимодействует с 5-опиоидными рецепторами семявыносящего протока мыши. Оба пептида связываются с «высокоаффинными» центрами связывания дерморфина мембранной фракции гомогената мозга крысы. Tyr-Pro-[Ai]Ser-NH2 увеличивает содержание в стриатуме и спинном мозге возбуждающих глутаминовой и аспарагиновой аминокислот и тормозной аминокислоты глицина, и в гиппокампе -глицина.

6. Животные, получавшие Tyr-Pro-[A,Z]Ser-NH2- и Tyr-D-Pro-Ser-NHj в высоких возрастающих дозах, проявляют достоверно меньшие по интенсивности симптомы синдрома отмены, провоцируемого налоксоном, по сравнению с морфином и [А-Ргоб]-дерморфином. Хроническое (28 дней) введение Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH2 и Tyr-A-Pro-Ser-NH2 не приводит к развитию толерантности по анальгетическому эффекту, а прекращение 28-дневного введения пептидов не вызывает проявлений синдрома отмены.

7. Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 наиболее интенсивно распределяются в сильно васкуляризированных органах (печень, почки) и меньше - в слабоваскуляризированных (мозг, легкие, сердце). Соединения выводятся из организма (ti,2ci из крови = 53.8 и 57.8 мин, MRT из крови = 43.2 и 46.1 мин соответственно). Протеолиз Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Scr-NH2 осуществляется ферментами крови, сердца, легких и мозга. В качестве основного меченного метаболита обнаруживается пролин и А-пролин, соответственно.

8. Tyr-Pro-[A,i]Ser-NH2 и Tyr-A-Pro-Scr-NII2 в сравнении с морфином обладают большей терапевтической широтой, достоверно менее выраженными проявлениями синдрома отмены и толерантности, не влияют на дыхательный центр (в дозах до 800 мг/кг), а в сравнении с диклофенаком - активны в меньших дозах и имеют более широкий спектр анальгетической активности. Отобранные пептиды, сочетающие анальгетическую активность и безопасность применения, можно рассматривать в качестве базисных соединений для создания потенциального анальгетика пептидной природы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ АВТОРА

1. Гузеватых, Л.С. Влияние дерморфина, его фрагментов и аналогов на систему терморегуляции [Текст] / Л.С. Гузеватых, Т.Г. Емельянова, А.Б. Усенко, H.H. Горячева, JI.A. Андреева, Л.Ю. Алфеева, Н.Ф. Мясоедов // Международная конференция "Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности", 1999, Беларусь, Минск. - Минск, 2001. - С. 126.

2. Гузеватых, Л.С. Изучение анальгетической активности аналогов эндогенного пептида дерморфина [Текст] / Л.С. Гузеватых, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, А.Б. Усенко, Т.Г. Емельянова, Т.А. Воронина, Н.Ф. Мясоедов // Международная научная конференция «Новые лекарственные средства: синтез, технология, фармакология, клиника». Минск, 14-16 ноября 2001. - Минск, 2001. - С.58.

3. Емельянова, Т.Г. Влияние аналогов дерморфина на терморегуляцию крыс в различных температурных режимах [Текст] / Т.Г. Емельянова, А.Б. Усенко, А.П. Бонарцев, A.A. Каменский, Л.С. Гузеватых, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, Н.Ф. Мясоедов // Известия АН, серия биологическая. - 2002. - Т.З. - С. 348-354.

4. Гузеватых, Л.С. Влияние структурных изменений Pro6 в молекуле дерморфина на анальгетическую активность [Текст] / Л.С. Гузеватых, Т.Г. Емельянова, А.Б. Усенко, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, Т.А. Воронина, Н.Ф. Мясоедов // Известия АН, серия биологическая. - 2002. - Т. 4. - С. 472-476.

5. Емельянова, Т.Г. Структурно-конформационные особенности дерморфинов и их роль в регуляции температурного гомеостаза [Текст] / Т.Г. Емельянова, Л.С. Гузеватых, А.Б. Усенко, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, Н.Ф. Мясоедов // Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Механизмы терморегуляции и биоэнергетики: взаимодействие функциональных систем»; Иваново, 1-5 октября 2002. - Иваново, 2002. -С. 22.

6. Емельянова, Т.Г. Дерморфины - природные опиоидные пептиды. Связь структуры с функцией [Текст] / Т.Г. Емельянова, Л.С. Гузеватых, А.Б. Усенко, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, Н.Ф. Мясоедов // Тезисы научных докладов III Съезда биохимического общества; Санкт-Петербург, 2002. - С.-Пб., 2002. - С. 538.

7. Emel'yanova, T.G. In vitro and in vivo opioid activity of [D-Pro6]dermorphin, novel analogue to dermorphin [Текст] / T.G. Emel'yanova, A.B. Usenko, M.G. Uranova, A.A. Kamensky, L.S. Guzcvatykh, L.A. Andreeva, L.A. Alfeeva, N.F. Myasoedov, E. Gianini, G. Improta, M. Broccardo // Peptides. - 2003. - V.24, №3. - P. 419-428.

8. Гузеватых, Л.С. Анальгетическая активность аналогов дерморфина со стереохимическими модификациями пролина в шестом положении [Текст] / Л.С. Гузеватых, Т.А. Воронина, Т.Г. Емельянова, Л.А. Андреева, Н.Ф. Мясоедов // Материалы II съезда Российского научного общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии»; Москва, 2003, ч. 2. - М., 2003. - С. 228.

9. Emel'yanova, T.G. Structure-activity relationships of Dermorphines [Текст] / T.G. Emel'yanova, A.B. Usenko, L.S. Guzevatykh, L.A. Andreeva, L.Y. Alfeeva,

N.F. Myasoedov // Tenth German-Russian Peptide Symposium, Turingia, Germany, 2-5 October 2003. - Germany, Turingia, 2003. - P. 23.

10. Емельянова, Т.Г. Структурно-функциональные исследования дерморфинов [Текст] / Т.Г. Емельянова, А.Б. Усенко, Л.С. Гузеватых, Л.Ю. Алфеева, Л.А. Андреева; Н.Ф. Мясоедов // Тезисы докладов Российского симпозиума по химии и биологии пептидов; Москва, 17 ноября 2003. - М., 2003. - С. 10.

11. Валуйских, Д.В. Роль шестой аминокислоты молекулы дерморфина в проявлении анальгетической активности пептида [Текст] / Д.В. Валуйских, Л.С. Гузеватых, Л.Ю. Алфеева, Л.А. Андреева, Т.Г. Емельянова, Т.А. Воронина, Н.Ф. Мясоедов // Тезисы стендовых сообщений Российского симпозиума по химии и биологии пептидов; Москва, 17 ноября 2003. - М., 2003. - С. 66.

12. Емельянова, Т.Г. «Терморегуляторная активность фрагментов дерморфина» [Текст] / Т.Г. Емельянова, H.H. Горячева, Л.С. Гузеватых, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, Н.Ф. Мясоедов // Известия АН, серия биологическая. - 2004. - Т.5. - С. 570-576.

13. Емельянова, Т.Г. «Изучение терморегуляторной активности фрагмента природного предшественника дерморфина - Arg-дерморфина и его аналогов» [Текст] / Т.Г. Емельянова, H.H. Горячева, Л.С. Гузеватых, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, Н.Ф. Мясоедов // Известия АН, серия биологическая. - 2005. - Т. 1. - С. 47-54.

14. Гузеватых, Л.С. «Анальгетическая активность дерморфина и его пролиновых аналогов» [Текст] / Л.С. Гузеватых, Д.В. Валуйских, Т.А. Воронина, Т.Г. Емельянова, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, С.Б. Середенин, Н.Ф. Мясоедов // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2005. -Т.68, №2. - С.8-10.

15. Гузеватых, Л.С. «Сравнительное изучение физической зависимости пролинового аналога дерморфина и морфина» [Текст] / Л.С. Гузеватых, Д.В. Валуйских, Т.А. Воронина, Т.Г. Емельянова, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, Н.Ф. Мясоедов // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2005. - Т.68, №3. - С. 16-19.

16. Guzevatykh, L.S. «The biological activity of the novel fragment of the natural precursor for the dermorphin - Arg-dermorphin and its analogues» [Текст] / L.S. Guzevatykh // Proceeding of 8th ECNP Regional Meeting, Moscow - Russia, April 14-16, 2005. - Eur. Neuropsychopharmacology. - 2005. - V.15 (Suppl. 2). - S268.

17. Гузеватых, Л.С. «Анальгетическая активность дерморфина и его аналогов» [Текст] / Л.С. Гузеватых, Т.А. Воронина, Т.Г. Емельянова, Л.А. Андреева, Н.Ф. Мясоедов // Тезисы докладов II Российского симпозиума по химии и биологии пептидов, Санкт-Петербург, 25-27 мая 2005. - С.-Пб., 2005. - С.39.

18. Емельянова, Т.Г «Влияние стереохимической модификации Pro6 в молекуле дерморфина на изменение сосудодвигательной активности« [Текст] / Т.Г. Емельянова, Л.С. Гузеватых, Л.Ю. Алфеева, Л.А. Андреева, Н.Ф. Мясоедов, Т.А. Воронина // Тезисы докладов И Российского симпозиума по химии и биологии пептидов, Санкт-Петербург, 25-27 мая 2005. - С.-Пб., 2005. - С.56.

19. Гузеватых, Л.С. «Анальгетическая активность пролиновых аналогов дерморфина» [Текст] / Л.С. Гузеватых, Т.А. Воронина, Т.Г. Емельянова, Л.А. Андреева, Н.Ф. Мясоедов

// Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы острой и хронической боли» Самара, 28-30 июня 2005 // Патогенез. - 2005. - Т. 1. - С.7-8.

20. Гузеватых, Л.С. «Физиологическая активность новых аналогов дерморфина» [Текст] / J1.C. Гузеватых, Т.Г. Емельянова, J1.A. Андреева, Т.А. Воронина, Н.Ф. Мясоедов // Материалы I съезда физиологов СНГ, Сочи, Дагомыс, 19-23 сентября 2005. - М., 2005. -С.59.

21. Алфеева, Л.Ю. Семейство пептидов, обладающее анальгетической активностью» [Текст] /Л.Ю. Алфеева, JI.A. Андреева, Т.А. Воронина, Л.С. Гузеватых, Т.Г. Емельянова, Н.Ф. Мясоедов, С.Б. Середенин / Патент РФ №2286169, приоритет от 18.04.2005 // Бюллетень "Изобретения. Полезные модели"от 27.10.2006. - 2006. - №30. - С. 227.

22. Гузеватых, Л.С. «Фармакологическая активность аналогов дерморфина» [Текст] / Л.С. Гузеватых, Т.Г. Емельянова, Л.А. Андреева, Т.А. Воронина, Н.Ф. Мясоедов // Материалы IV международной научной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Москва, Россия, 13-16 марта 2006. - М., 2006. - С.47.

23. Voronma, T. «Substances with analgesic activity among dermorphine analogues» [Текст] / T. Voronina, L. Guzevatykh, L. Andreeva, T. Emelyanova, S. Seredenin, N. Myasoedov // 15lh World Congress of Pharmacology, Beijing, China, July 2-7, 2006 - Beijing, China, 2006. -P.45.

24. Гузеватых, Л.С. «Анальгетическая и нейротропная активность новых аналогов дерморфина» [Текст] / Л.С. Гузеватых, Т.А. Воронина, Т.Г. Емельянова, Л.А. Андреева, Н.Ф. Мясоедов // Второй международный междисциплинарный Конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», Судак, Крым, Украина, июнь 10-21, 2006. - Судак, 2006. -С. 38.

25. Гузеватых, Л.С. «Новые аналоги дерморфина и их анальгетическая и нейротропная активность» [Текст] / Л.С. Гузеватых, Т.А. Воронина, Т.Г. Емельянова, Л.А. Андреева, Н.Ф. Мясоедов // Материалы XVIII симпозиума «Современная химическая физика» Туапсе, Россия, 22 сентября - 3 октября 2006. - М., 2006. - С.86.

26. Громовых, П.С. «Синтез меченных тритием фрагментов дерморфина и исследование кинетики распределения радиоактивности в органах крысы при их внутримышечной инъекции» [Текст] / П.С. Громовых, Л.С. Гузеватых, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева,

B.П. Шевченко, К.В. Шевченко, И.Ю. Нагаев, Н.Ф. Мясоедов, Т.А. Воронина // Радиохимия. - 2007. - Т.49, №1. - С. 93-96.

27. Гузеватых, Л.С. «Сравнительный анализ анальгетической активности дерморфина, [D-Рго6]-дерморфина и их С-концевых трипептидов» [Текст] / Л.С. Гузеватых, Т.А. Воронина, Т.Г. Емельянова, Л.А. Андреева, П.С. Громовых, Н.Ф. Мясоедов,

C.Б. Середенин // Известие РАН, серия биологическая. - 2007. - №5. - С. 577-582.

28. Громовых, П.С. «Синтез, фармакокинетика и метаболизм С-концевого трипептида дерморфина и его диастереомера» [Текст] / П.С. Громовых, Л.С. Гузеватых, К.В. Шевченко, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, В.П. Шевченко, И.Ю. Нагаев, Т.А. Воронина, Н.Ф. Мясоедов // Биоорганическая химия. - 2007. - Т.ЗЗ, №6. - С. 581-587.

38

29. Емельянова Т.Г. «Влияние N-концевых трипептидов бомбезина, литорина и их аналога на температуру тела и возможные реакции» [Текст] / Т.Г. Емельянова, И.В. Сосновская, H.H. Горячева, Л.С. Гузеватых, Т.А. Воронина, Е.Б. Евстегнеева, В.П. Голубович // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 144, № 8. - С. 174-176.

30. Емельянова, Т.Г. «Связь структуры дерморфинов с их терморегуляторной активностью» [Текст] / Т.Г. Емельянова, Л.С. Гузеватых, Л.А.Андреева, Л.Ю. Алфеева, Н.Ф. Мясоедов // Известие РАН, серия биологическая. - 2007. - №6. - С. 711-719.

31. Емельянова, Т.Г. «Зависимость анальгетической активности дерморфина, метэнкефалина и динорфина А от температуры окружающей среды» [Текст] / Т.Г. Емельянова, А.Б. Колотилова, Л.С. Гузеватых, Н.Ф. Мясоедов // Доклады Академии наук. - 2007. -Т.417, № 5. - С. 704-706.

32. Гузеватых, Л.С. «Анальгетическая активность дипептида Тут-Pro» [Текст] / Л.С. Гузеватых, Т.А. Воронина, Т.Г. Емельянова, Л.А. Андреева, Н.Ф. Мясоедов // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Хронические болевые синдромы»; Новосибирск, 23-25 мая 2007. - Новосибирск, 2007. -С.51.

33. Громовых, П.С. «Использование меченого тритием Tyr-[3,4-3H]Pro-Ser-NH2 для изучения их рецепторного связывания с мембранной фракцией головного мозга крыс» [Текст] / П.С. Громовых, О.Ю. Соколов, Н.В. Кост, A.A. Зозуля, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, Л.С. Гузеватых, К.В. Шевченко, И.Ю. Нагаев, В.П. Шевченко // III Российский симпозиум «Белки и пептиды». Тезисы стендовых сообщений; Пущино, 16—21 сентября 2007 - Пущино, 2007. - С. 67.

34. Гузеватых, Л.С. «Короткие Туг-Рго-содержащие пептиды - новый класс пептидов, обладающих анальгетической активностью» [Текст] / Л.С. Гузеватых, Т.А. Воронина, Т.Г. Емельянова, Л.А. Андреева, Н.Ф. Мясоедов // Ш Российский симпозиум "Белки и пептиды"; Пущино, 16-21 сентября 2007. - Пущино, 2007. - С. 48.

35. Сосновская, И.В. «Влияние пролиновых аналогов дерморфина на двигательную активность и ориентировочно-исследовательскую реакцию» [Текст] / И.В. Сосновская, Л.С. Гузеватых, Т.А. Воронина, Т.Г. Емельянова, Л.А. Андреева, Н.Ф. Мясоедов // III Российский симпозиум "Белки и пептиды"; Пущино, 16-21 сентября 2007. - Пущино, 2007. - С. 92.

36. Гузеватых, Л.С. «Аналоги дерморфина - новый класс анальгетических средств» [Текст] / Л.С. Гузеватых, Т.А. Воронина, Л.А. Андреева, Т.Г. Емельянова, Н.Ф. Мясоедов, С.Б. Середенин // Материалы III Съезда фармакологов России. «Фармакология практическому здравоохранению». Санкт-Петербург, 23-27 сентября 2007 г. // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т. 7 (спец. выпуск); ч. 1. - С. 1670.

37. Калинина, Т.С. «Сравнительное изучение дифференцировочных стимульных свойств анксиолитиков и нейролептиков» [Текст] / Т.С. Калинина, Т.А. Воронина, Л.С. Гузеватых, Е.В. Петрянина // Материалы III Съезда фармакологов России. «Фармакология практическому здравоохранению». Санкт-Петербург, 23-27 сентября 2007 г. // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т. 7 (спец. выпуск); ч. 1.-С. 1715.

38. Каримова, О.Б. «Исследование влияния природного опиоидного пептида дерморфина и его С-концевого фрагмента на содержание нейротрансмиттерных аминокислот в структурах мозга крыс Wistar» [Текст] / О.Б. Каримова, П.М. Клодт, В.Б. Наркевич, Л.С. Гузеватых, B.C. Кудрин, А.И. Майский, Т.А. Воронина // Материалы III Съезда фармакологов России. «Фармакология практическому здравоохранению». Санкт-Петербург, 23-27 сентября 2007 г. // Психофармакология и биологическая наркология. -2007. - Т. 7 (спец. выпуск); ч. 1. - С. 1719.

39. Сосновская, И.В. «Роль пролина в молекуле дерморфина в проявлении анальгетической активности пептида» [Текст] / И.В. Сосновская, Л.С. Гузеватых, Т.А. Воронина, Л.А. Андреева, Т.Г. Емельянова, Н.Ф. Мясоедов, С.Б. Середенин // Материалы III Съезда фармакологов России. «Фармакология практическому здравоохранению». Санкт-Петербург, 23-27 сентября 2007 г. // Психофармакология и биологическая наркология. -2007. - Т. 7 (спец. выпуск); ч. 2. - С. 1961.

40. Гузеватых, Л.С. «Анальгетическая активность дипептида TYR-PRO» [Текст] / Л.С. Гузеватых, Т.А. Воронина, Т.Г. Емельянова, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, С.Б. Середенин, Н.Ф. Мясоедов // Известие РАН, серия биологическая. - 2008. - №1. -С. 1-7.

41. Громовых, П.С. «Использование меченного тритием дерморфина для исследования взаимодействия С-концевого аналога дерморфина Tyr-Pro-Ser-NH2 и его стереоизомера Tyr-D-Pro-Ser-NHi с опиоидными рецепторами» [Текст] / П.С. Громовых, О.Ю. Соколов, Н.В. Кост, A.A. Зозуля, Л.С. Гузеватых, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, К.В. Шевченко, В.П.Шевченко, И.Ю. Нагаев, Мясоедов Н. Ф.. // Доклады Академии наук. - 2008. -Т. 419,№2.-С. 276-278.

42. Гузеватых, Л.С. «Выявление функционально значимого дипептидного фрагмента в аминокислотных последовательностях атипичных опиоидных пептидов» [Текст] / Л.С. Гузеватых // Биоорганическая химия. - 2008. - Т.34, № 5. - С. 591-609.

43. Сосновская, И.В. «Влияние дерморфина и его пролиновых аналогов на двигательную активность, ориентировочно-исследовательскую реакцию, уровень тревожности и устойчивости к депрессии» [Текст] / И.В. Сосновская, Л.С. Гузеватых, Т.А. Воронина, Т.Г. Емельянова, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, С.Б. Середенин, Н.Ф. Мясоедов // IV Международный Междисциплинарный Конгресс "Нейронаука для медицины и психологии", 10-20 июня Судак, Крым, Украина, 2008 г. - М:000 «МАКС Пресс», 2008. -С. 283.

44. Гузеватых, Л.С. «Поиск новых анальгетиков на основе общей последовательности атипичных опиоидных пептидов» [Текст] / Л.С. Гузеватых, Т.А. Воронина, Т.Г. Емельянова, Л.А. Андреева, Н.Ф. Мясоедов // Материалы IV Российского симпозиума «Белки и пептиды», Казань, 23-27 июня 2009. - Казань: Издательство «ФизтехПресс» КазНЦ РАН, 2009. - С. 20.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

А1а- аланин в/б - внутрибрюшинное введение

Arg- ■ аргинин в/в - внутривенное введение

Asn- -аспарагин внж - внутрижелудочковое введение

Asp - - аспарагиновая кислота и/н - интраназальное введение

Gin - ■ глутамин п/к - подкожное введение

Glu- ■ глутаминовая кислота р.о. - введение внутрь

Gly- • глицин

His- гистидин 5-НТ - серотонин

Hyp- - гидроксипролин 5-ОИУК - 5-оксииндолуксусная кислота

Ile-i изолейцин ГАМК - у-аминомаслянная кислота

Leu- ■ лейцин ГВК - гомованилиновая кислота

Lys - ■лизин ДА - дофамин

Met- - метионин ДОФУК - 3,4-диоксифенилуксусная кислота

Phe- • фенилаланин НА - норадреналин

Pro- пролин

Ser- серин DAGO - Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-Gly-ol-энкефалин

Tau - ■таурин НПВС - нестероидные противовоспалительные средства

Thr- треонин

Trp- триптофан ГЭБ - гематоэнцефалический барьер

Tyr- тирозин ДвА - двигательная активность

Val- валин МЭ111 - тест максимального электрошока

APro - дегидропролин ОИР - ориентировочно-исследовательская реакция

OMe - метиловый эфир ПКЛ - приподнятый крестообразный лабиринт

nh2- -амид ПКМС - подвздошная кишка морской свинки

СПМ - семявыносящий проток мыши

ДМ- -дерморфин ЭЭГ - электроэнцефалограмма

ОП- опиоидные пептиды

OP- опиоидные рецепторы

1С50 - доза, вызывающая 50% связывание

ЭД50 - доза, вызывающая 50% эффект

ТД50 - доза, вызывающая угнетение дыхания на 50%

ЛД50 - доза, вызывающая гибель у 50% животных

Втах - концентрация мест связывания КД - константа диссоциации

AUCo-t (нг/млхмин) - площадь под фармакокинетической кривой (площадь под

кривой концентрация лекарственного вещества - время);

MRT (мин) - среднее время пребывания вещества в организме;

T]/2ei (мин) - период, за который выводится половина введенной и всосавшейся дозы

вещества

Tmax - время, необходимое для достижения пиковых концентраций

СШах_ пиковая концентрация (максимальная концентрация препарата в плазме);

Ft - тканевая доступность, рассчитывается по формуле: Ft = AUCt 0., / AUCp о-» где

AUCt о., - AUC в IKaH1I, AUCp o-i- AUC , крови

Заказ № 102-а/12/09 Подписано в печать 26.11.2009 Тираж 150 экз. Усл. п.л. 2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

выводы

1. При анализе биоинформационными методами первичной структуры 60 представителей атипичных опиоидных пептидов выявлена аминокислотная последовательность -Туг-Рго- у 63% веществ. Показано, что наличие опиоидной активности пептидов не зависит от положения -Туг-Рго- в их молекулах.

2. Туг-Рго в дозах 0.1 - 10.0 мг/кг (в/б) проявляет анальгетическую активность в тестах фазической и тонической боли при раздражении соматических и висцеральных ноцицепторов химическими, термическими и механическими стимулами. Анальгетическая активность Туг-Рго чувствительна к действию центральных и периферических антагонистов опиоидных рецепторов налоксона и налоксона метиодида, однако пептид проявляет слабое сродство к 8-опиоидными рецепторам семявыносящего протока мыши и не взаимодействует с р-опиоидными рецепторами подвздошной кишки морской свинки.

3. Стереохимическая модификация остатка пролина в молекуле Туг-Рго-содержащего пептида дерморфина не влияет на сродство к периферическим р- и 5-опиоидным рецепторам. Замена ¿-пролина на А-стереоизомер не изменяет анальгетическую активность дерморфина при механическом и химическом раздражении ноцицепторов, но ослабляет противовоспалительное действие. Дегидрирование пролина в молекуле дерморфина повышает сродство к опиоидным рецепторам, ослабляет противовоспалительное и анальгетическое действие при механическом раздражении ноцицепторов и приводит к появлению анксиолитической и потере противосудорожной активности.

4. Изучение зависимости между строением и анальгетической активностью в ряду новых 22 синтетических пептидов, содержащих -Туг-Рго-, выявило, что наибольшей активностью обладают трипептиды Туг-Рго -[/),£] 8 с г- N Н 2 (1:1) и Туг-Г)-Рго-8ег-1ЧН2, которые в дозах 0.1-10 мг/кг проявляют анальгетическое действие в тестах фазической и тонической боли при раздражении соматических и висцеральных ноцицепторов химическими, термическими и механическими стимулами, и в тестах воспалительной боли. Анальгетическая активность трипептидов сохраняется в течение 90 минут и наблюдается при различных способах введения (внутрибрюшинном, внутримышечном, внутрь и интраназальном). В смеси стереоизомеров Туг-Рго-[Д /,|8ег-Ы1 [2 анальгетической активностью обладает А-стереоизомер, а Х-стереоизомер - не активен.

5. При исследовании механизма действия Туг-Рго-[ДХ]8ег-МН2 и Туг- 1)-Рго-8ег-]ЧГН2 обнаружено, что анальгетическая активность пептидов чувствительна к действию центральных и периферических антагонистов опиоидных рецепторов (налоксона, налтрексона и налоксона метиодида), однако пептиды проявляют слабое сродство к р-опиоидным рецепторам подвздошной кишки морской свинки и не взаимодействует с 8-опиоидными рецепторами семявыносящего протока мыши. Оба пептида связываются с «высокоаффинными» центрами связывания дерморфина мембранной фракции гомогената мозга крысы. Tyr-Pro-[AZ,]Ser-NH2 увеличивает содержание в стриатуме и спинном мозге возбуждающих глутаминовой и аспарагиновой аминокислот и тормозной аминокислоты глицина, и в гиппокампе - глицина.

6. Животные, получавшие 'I'yr-Pro-[ ДI. jSer-N1Ь и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 в высоких возрастающих дозах, проявляют достоверно меньшие по интенсивности симптомы синдрома отмены, провоцируемого налоксоном, по сравнению с морфином и [А-Рго6]-дерморфином. Хроническое (28 дней) введение Tyr-Pro-[AL]Ser-NH2 и Tyr-APro-Ser-NH2 не приводит к развитию толерантности по анальгетическому эффекту, а прекращение 28-дневного введения пептидов не вызывает проявлений синдрома отмены.

7. Tyr-Pro-[AL]Ser-NH2 и Tyr-A-Pro-Ser-NH2 наиболее интенсивно распределяются в сильно васкуляризированных органах (печень, почки) и меньше - в слабоваскуляризированных (мозг, легкие, сердце). Соединения выводятся из организма (t]/2ei из крови = 53.8 и 57.8 мин, MRT из крови = 43.2 и 46.1 мин соответственно). Протеолиз Туг-Pro-[/),Z]Scr-NTb и Tyr-D-Pro-Ser-NPb осуществляется ферментами крови, сердца, легких и мозга. В качестве основного меченного метаболита обнаруживается пролин и А-пролин, соответственно.

8. Tyr-Pro-[AL]Ser-NH2 и Tyr-A-Pro-Ser-NH2 в сравнении с морфином обладают большей терапевтической широтой, достоверно менее выраженными проявлениями синдрома отмены и толерантности, не влияют на дыхательный центр (в дозах до 800 мг/кг), а в сравнении с диклофенаком - активны в меньших дозах и имеют более широкий спектр анальгетической активности. Отобранные пептиды, сочетающие анальгетическую активность и безопасность применения, можно рассматривать в качестве базисных соединений для создания потенциального анальгетика пептидной природы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ аминокислотных последовательностей атипичных ОП, используемый в настоящей работе, позволил выявить наиболее часто встречающуюся дипептидную последовательность - дипептид Туг-Рго у 63% пептидов. Эта последовательность Туг-Рго принимает участие в образовании ß-поворота, необходимого для взаимодействия с центрами связывания (Haslach et al., 2008; Doi et al., 2002). Так ДМ (Tyr-£>-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser

2 6

NH2), благодаря присутствию в молекуле D-Ala и Z-Pro , в растворе может образовывать два N- и С-концевых ß-поворота (Renugopalakrishnan, Rapaka, 1988), что соответствует двум центрам связывания ДМ. Это послужило основанием для предположения о том, что модификация Pro в молекуле Туг-Рго-содержащих пептидов может привести к изменению их биологической активности. Действительно, в нашем исследовании установлено, что замена остатка пролина в молекуле ДМ на D-стереоизомер или его дегидрирование приводит к усилению и пролонгированию анальгетической активности в тесте соматической боли при термическом раздражении ноцицепторов, но не влияет на анальгетические эффекты при механическом и химическим раздражении соматических и висцеральных рецепторов, а также ослабляет седативное действие. Однако, несмотря на различия в эффектах, стереохимическая модификация по пролину в молекуле ДМ не изменяет сродства к р- и 5-ОР на препаратах изолированных органов.

Полученные результаты подтвердили значимость последовательности Туг-Рго для проявления эффектов пептидов и побудили к детальному изучению собственной активности дипептида. Дипептид Туг-Рго впервые был синтезирован и описан в работе, посвященной количественной оценке горького вкуса пептидов, как один из фрагментов ß-казеина (Shinoda et al., 1986). В этом же году было установлено, что Туг-Рго является одним из продуктов ферментативной деградации in vitro опиоидного пептида ДМ (Scalia et al., 1986). В плазме человека и крысы Туг-Рго может образовываться при деградации пептида Tyr-MIF-1 (Kastin et al., 1994), эндоморфина-l (Tomboly et al., 2002; Barsun et al., 2007) и эндоморфина-2 (Sakurada et al., 2003). В гидролизе принимают участие дипептилпептидазы III и IV (Chen et al., 2004). Tyr-Pro также был обнаружен в ферментативном гидролизате казеинов молока (FitzGerald, Meisel, 2000; Zhu et al., 2007). Tyr-Pro может также образовываться при гидролизе дипептилпептидазой IV нейропептида Y (NPY), в результате чего образуется фрагмент NPY3.36, с уменьшенной аффинностью к Yi рецепторам (Gerald et al., 1996). Установлено, что дипептид обладает антигипертензивным действием в дозах 0.1 - 10.0 мг/кг у спонтанногипертензивных крыс (Yamamoto et al., 1994), и этот эффект может быть обусловлен подавлением действия ангиотензин-превращающего фермента (Zhu et al., 2007).

В исследованиях Rônai и коллег (2006) показано выраженное анальгетическое действие дипептида (100 нмоль на крысу, т.е. примерно 0.16 мг/кг) при внж введении в тесте отдергивания хвоста.

Анальгетическая активность Туг-Рго при системном введении ранее не изучалась. В нашем исследовании было установлено, что Туг-Рго в дозах 0.1 - 10.0 мг/кг обладает дозо-зависимой анальгетической активностью в тестах тонической и фазической болей, вызванных термическим, механическим и химическим раздражением соматических и висцеральных рецепторов, которая снижается неселективными блокаторами центральных и периферических ОР налоксоном и налоксона метиодидом, соответственно. В тестах in vitro Tyr-Pro обладает слабым сродством к периферическим 5-ОР и не взаимодействует с периферическими р-ОР. В исследованиях Rônai и коллег (2006) также не удалось обнаружить у Туг-Рго опиоидной активности в тестах in vitro. Кроме того, этой же группой исследователей было показано, что в экстракте мозга крыс через 30 мин после внж введения [3Н] Туг-Рго радиоактивность обнаруживается в тетра- и трипептидах, родственных эндоморфину-2, причём основным метаболитом является дезамидированный эндоморфин-2. Однако, анальгетическое действие эндоморфина-2 чувствительно к действию антагонистов ОР налоксоназину и 3-метоксиналтрексону, что указывает на участие pi-опиатных и морфин-6-/?-глюкуронидных рецепторов (Sakurada et al., 2002; Mizoguchi et al., 2006). В наших исследованиях установлено, что анальгетическое действие Туг-Рго не блокируется антагонистом pi-OP налоксоназином и антагонистом морфин-6-(3-глукуронидных рецепторов 3-метоксиналтрексоном, следовательно, анальгетическое действие при периферическом введении Туг-Рго не опосредовано эндоморфином-2.

Выполненный нами анализ первичной структуры атипичных ОП показал, что опиоидная активность не зависит от положения пары -Туг-Рго- в последовательностях этой выборки и сохраняется, как при его перемещении в JV-конец молекулы (эндоморфины, геморфины), так и внутрь цепи (глютеновые экзорфины А, геморфины, дерморфины), и в С-концевое положение (глютеновый экзорфин А, геморфин-(1-5)). Это указывает на возможность сохранения анальгетической активности при модификации -Туг-Рго- с С- и N-концов природными аминокислотами.

На основании полученных результатов были синтезированы и изучены соединения общей формулы A-Tyr-Pro(D-Pro, APro, Z)-APro, Нур)-В-Х, где А, В - природные аминокислоты, а X - метильная или амидная группа. Среди протестированных 22 оригинальных синтетических пептидов наиболее эффективными оказались Tyr-Pro-[AZJSer-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2. Анализ литературных источников показал, что свойства пептидов

Tyr-Pro-D-Ser-NKb и Tyr-APro-Ser-NH2 ранее не изучались, а трипептид Tyr-Pro-L-Ser-NH2 был изучен только при внутримозговом введении в тесте горячей пластины, где продемонстрировал отсутствие анальгетической активности (Broccardo et al., 1981). В наших исследованиях было установлено, что в изучаемой нами смеси стереоизомеров Туг-Рго-[AL]Ser-NH2 (1:1) анальгетической активностью при в/б введении обладает именно Туг-Рго-ASer-Ni Ь. а не Tyr-Pro-Z,-Ser-NH2. Установлено, что Т у г-1 'го- [ /), L ] S е г- N Н 2 и Tyr-APro-Ser-NH2 в дозах 0.1-10.0 мг/кг проявляют активность в широком наборе тестов оценки болевой чувствительности и на моделях воспалительной боли. Tyr-APro-Ser-NH2 подавляет частоту импульсации в А5- и С-волокнах ноцицепторов. Tyr-Pro-[A^]Ser-NH2 оказывает обезболивающее действие на модели нейропатической боли, но не при моделировании центрального болевого синдрома. Анальгетическое действие пептида зависит от температуры окружающей среды (в холодной и жаркой среде ослабляется). Анальгетический эффект Tyr-Pro-[A,L]Ser-NH2 и Tyr-APro-Ser-NH2 (в/б) блокируется неселективными антагонистами центральных и периферических ОР, однако пептиды проявляют слабое сродство к периферическим р- и не связываются с 8-ОР на препаратах изолированных органов ПКМС и СПМ, но взаимодействуют с «высокоаффинными» местами связывания ДМ в головном мозге крыс.

Таким образом, выявлен новый класс пептидных соединений, обладающих анальгетической активностью. Отобранные для дальнейших исследований пептиды Туг-Рго-[ALjSer-Nlb и Tyr-APro-Ser-NH2 проявляют анальгетическую активность и обладают рядом преимуществ по сравнению с морфином: 1) имеют большую терапевтическую широту и не оказывают влияния на частоту дыхания при превышении терапевтической дозы в 500 раз; 2) у пептидов не отмечено развития толерантности по анальгетическому действию при их хроническом введении; 3) у пептидов не выявляется проявлений синдрома отмены после прекращения их длительного введения (28 дней) и наблюдается достоверно менее выраженные проявления острой физической зависимости при провокации налоксоном. По сравнению с диклофенаком пептиды активны в более широком диапазоне тестов и в меньших дозах.