Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Экспериментальное исследование кардиопротекторных эффектов новых синтетических аналогов энкефалинов

ФИЛИАЛ ФЕДЕРАЛЬНОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО БЮДЖЕТНОГО УЧРЕЖДЕНИЯ НАУКИ ИНСТИТУТА БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М. М.ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ПУЩИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЕСТЕСТВЕННО - НАУЧНЫЙ

ИНСТИТУТ»

ШАЙХУТДИНОВА ЭЛЬВИРА РАУИЛЬЕВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КАРДИОПРОТЕКТОРНЫХ ЭФФЕКТОВ НОВЫХ СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ ЭНКЕФАЛИНОВ 14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

04201361756

На правах рукописи

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Мурашев А.Н.

Томск - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список использованных сокращений..........................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................................................................6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие сведения о системе опиоидных пептидов..................................................................12

1.1.1. Краткий исторический очерк и современные представления

о структуре и функциях системы опиоидных пептидов....................................12

1.1.2. Основные компоненты системы опиодных пептидов..........................................13

1.1.2.1. Рецепторы опиоидных пептидов............................................................................13

1.1.2.2. Опиоидные пептиды..................................................................................................................16

1.1.2.2.1. Энкефалины............................................................................................................18

1.1.3. Физиологические и фармакологические эффекты

опиоидных пептидов..........................................................................................................................20

1.2. Опиоидные пептиды как звено адаптационной защиты сердца 22 1.2.1. Опиоидная система сердца............................................................................................................22

1.2.2. Феномен «ишемического прекондиционирования»..................23

1.2.2.1. Участие опиатных рецепторов в формировании феномена

адаптации к ишемии............................................................................................................25

1.2.2.2. Роль N0 в развитии ишемической адаптации..........................................26

1.2.3. Состояние опиоидной системы в условиях острой

ишемии миокарда........................................................................................................................27

1.2.4. Кардиопротекторные эффекты экзогенных опиоидных пептидов в

условиях миокардиальной ишемии............................................................................30

1.3. Некоторые аспекты проблем синтеза и практического применения синтетических аналогов энкефалинов. Перспективы их решения................................31

1.3.1. Возможные модификации в структуре энкефалинов..................................32

1.3.2. Перспективы поиска новых синтетических аналогов природных опиоидных пептидов..............................................................................................................34

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Предмет исследования..........................................................................................................................35

2.2. Объект исследования..................................................................................................................................36

2.3. Методы исследования................................................................................................................................36

2.3.1. Моделирование острого инфаркта миокарда............................................................36

2.3.2. Имплантация артериальных и венозных катетеров............................................38

2.3.3. Определение биохимических показателей крови..................................................38

2.3.4. Определение площади зоны риска, зоны инфаркта и

общей площади левого желудочка ..............................................................39

2.4. Дизайн исследования................................................................................................................................39

2.5. Статистическая обработка результатов....................................................................................42

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследование кардиопротекторной активности новых синтетических аналогов энкефалинов «ЕР91»- «ЕР95» на модели острого инфаркта миокарда

у крыс СБ при профилактическом введении......................................... 43

3.1.1. Исследование кардиопротекторной активности новых аналогов

энкефалинов при однократном профилактическом введении перед

острым инфарктом миокарда....................................................... 45

3.1.2. Изучение зависимости «доза-эффект» пептидов «ЕР91»

и «ЕР94»..................................................................................................................................................50

3.1.3. Исследование кардиопротекторной активности пептидов «ЕР91» и «ЕР94» при многократном профилактическом введении перед острым

инфарктом миокарда................................................................ 53

3.1.4.Заключение по исследованию кардиопротекторной активности

новых синтетических аналогов энкефалинов «ЕР91» - «ЕР95» при профилактическом введении...................................................... 56

3.2. Изучение терапевтических эффектов пептида «ЕР94» и «ЕР94»

3.2.1. Исследование кардиопротекторной активности пептидов «ЕР91»

и «ЕР94», введенных во время окклюзии ЛКА................................ 57

3.2.2. Исследование кардиопротекторной активности пептидов

«ЕР94» и «ЕР91», введенных в реперфузионном периоде.................. 59

3.2.3. Влияние увеличения продолжительности окклюзии ЛКА

на кардиопротекторный эффект пептида «ЕР94»........................... 61

3.2.4. Заключение по исследованию терапевтических эффектов пептидов «ЕР91» и «ЕР94»..................................................................... 63

3.3. Исследование механизмов кардиопротекторной активности «ЕР94»

3.3.1. Исследование участия опиоидных рецепторов в реализации кардиопротекторной активности пептида «ЕР94»............................ 64

3.3.2. Исследование участия N0 в реализации кардиопротекторной

активности пептида «ЕР94»......................................................... 69

3.3.3.Заключение по исследованию механизмов кардиопротекторной активности пептида «ЕР94»...................................................... 72

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................... 74

ВЫВОДЫ....................................................................................... 81

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................... 82

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АД - артериальное давление

АКТГ - адренокортикотропный гормон

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИПК - ишемическое прекондиционирование

ЛКА - левая коронарная артерия

оим - острый инфаркт миокарда

оп - опиоидные пептиды

ОР - опиоидные рецепторы

ФПК - фармакологическое прекондиционирование

цАМФ - циклический аденозин монофосфат

ЧСС - частота сердечных сокращений

ЦНС - центральная нервная система

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

МЕ - Ме^энкефалин

МЕАвЬ - МеЬэнкефалин-А^-01у-Ьеи

МЕАР - МеЬэнкефалин-А^-РИе

N0 - оксид азота

N08 - 1Ч0-синтаза

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Обнаружение в мозге высокоспецифичных рецепторов классических непептидных опиатов - морфина и др. позволило начать целенаправленный поиск их эндогенных лигандов. Первые работы по изучению опиоидных пептидов принадлежат А. Голдстайну, Дж. Хьюсу, X. Костерлицу, С. Снайдеру, JI. Терениусу (Hughes et al.,1975; Snyder,1980). В исследованиях Дж. Хьюса и X. Костерлица в 1975 году впервые из мозга свиньи были выделены и идентифицированы два морфиноподобных кислото-растворимых пентапептида -Туг-Gly-Gly-Phe-Leu и Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Met, впоследствии названных лей-и мет-энкефалинами соответственно (Hughes et al.,1975).

Начало интенсивного изучения опиоидных пептидов (ОП) было продиктовано поисками эффективных анальгетиков, лишенных побочного действия, присущего известным обезболивающим средствам (Erspamer et al., 1989). Так, опиат растительного происхождения морфин, наиболее часто используемый анальгетик для купирования болевых ощущений, имеет ряд серьезных побочных эффектов (угнетение дыхания, желудочно-кишечные дисфункции, привыкание), что приводит к ограничению его использования в клинической практике. Поиск новых терапевтических агентов, которые бы смогли заменить морфин, главным образом сосредоточен на развитии пептидных аналогов с высокой рецепторной селективностью к опиоидным рецепторам (Janecka et al., 2008). Развитие этой линии исследований привело к созданию энкефалиновых аналогов, которые были бы во много раз активнее морфина по своим анальгетическим свойствам при экзогенном введении.

Помимо участия энкефалинов в регуляции болевых рефлексов, основными известными эффектами в спектре биологической активности опиоидных пептидов можно считать их участие в деятельности сердечно-сосудистой и эндокринной систем, функций желудочно-кишечного тракта, поведения и психоэмоциональных процессов. При этом существенно то, что многие эффекты опиоидов проявляются в гораздо меньших дозах, чем анальгетические. Это свидетельствует о том, что регуляция боли не является доминирующей функцией опиоидной системы.

Имеющиеся на сегодняшний день публикации позволяют говорить о вовлечении опиоидных пептидов в механизмы развития стресса и формирования адаптации. При экстремальных воздействиях и острых патологических состояниях энкефалины проявляют антистрессорное действие, что подтверждается изменением их концентрации в крови (Лишманов и др., 1998, 1999). В ряде работ была показана важная роль ОП в реализации кардиопротекторных (Лишманов и др., 1986) и антиаритмических эффектов (Лишманов и др., 1989).

Согласно мнению многих авторов (Mild et al., 1998; Schultz et al., 1997; Chien et al., 1999; Лишманов и др., 2000; Gross, 2003) опиоидные пептиды являются одними из наиболее значимых эндогенных медиаторов так называемого феномена «ишемического прекондиционирования». Суть названного явления заключается в повышении адаптационной устойчивости сердца к действию длительной ишемии после нескольких предварительных сеансов кратковременной коронароокклюзии и реперфузии (Murry et al., 1986). При ишемическом прекондиционировании происходит синтез и высвобождение опиоидных пептидов, включая мет- и лей-энкефалины, и Jackson с соавт. (2001) показали, что 4 сеанса 10-минутной ишемии, чередующихся с 10-минутными сеансами реперфузии, в миокарде кошки привели к нарастанию высвобождения мет-энкефалина-Arg-Phe (МЕАР) во время ишемии и возвратом к исходным концентрациям опиоидов во время реперфузии. В поддержку данных результатов Paradis еще в 1992 году предположил, что повышение концентрации энкефалинов, подобно МЕАР, в ткани желудочков крысы во время нарушения кровоснабжения может быть компенсаторным механизмом, который помогает ограничить развитие инфарктной зоны. Подобное увеличение концентрации энкефалинов в ткани сердца не является следствием поступления этого пептида в миокард из кровотока, а вызвано усилением синтеза опиоида из высокомолекулярных предшественников. Эти данные позволяют предположить, что опиоидные пептиды могут играть важную роль в патогенезе миокарда и подобное увеличение их синтеза и секреции является реакцией организма на повреждающий фактор.

Некоторыми исследователями было показано, что экзогенное введение энкефалинов и синтетических опиоидных пептидов до окклюзии уменьшали миокардиальную ишемию (Kuzume et al, 2003; Song, 2005).

7

Многообразие кардиоваскулярных эффектов опиоидных пептидов позволяет рассматривать их в качестве модуляторов физиологических и патологических процессов в миокарде, открывая перспективы практического использования синтетических аналогов эндогенных энкефалинов.

Актуальность развития подобного направления исследований обусловлена, главным образом тем, что до настоящего времени не созданы достаточно эффективные и лишенные нежелательных побочных свойств лекарственные средства, позволяющие повысить устойчивость сердца к нарушениям, вызванным действием ишемии и реперфузии. Важным фактором, отягощающим течение острого инфаркта миокарда, является болевой синдром, который также является одним из медиаторов, активирующих симпатическую нервную систему после повреждения сердечной мышцы (Albutaihi, 2003). Таким образом, наличие кардиопротекторного действия таких пептидов повышает перспективность их применения в клинической практике, и подобная терапия будет являться более эффективной для снижения ишемического/реперфузионного повреждения.

Тем не менее, существует ряд сложностей и проблем, которые замедляют внедрение пептидных аналогов в биологическую и медицинскую практику. Одним из основных аргументов против прикладного использования ОП является то, что энкефалины не проникают через гематоэнцефалический барьер. На данный момент существуют работы, в которых авторам удалось синтезировать аналоги энкефалинов с повышенной гидрофобностью и, соответственно, с высокой проницаемостью гематоэнцефалического барьера (Gentilucci, 2004)

Следующая сложность возможного использования пептидных препаратов связана с их относительно быстрым распадом под влиянием эндопептидаз. Так, метаболический период полужизни мет-энкефалина в крови крыс при введении in vivo составляет составляет всего 3,9 минут (Lindstrom et al., 1978). По этой причине они не могут достигнуть ЦНС при использовании доз, достаточных для проявления анальгезии при периферическом введении. Стабильность таких пептидов может быть повышена различными структурными модификациями, что обеспечивает удлинение периода полураспада соединения и позволяет достигнуть органа-мишени.

Модификация структуры пептидов путем использования неприродных D-аминокислот, а также замены С-концевой аминокислоты ведет к увеличению их

стабильности (Piestrzeniewicz et al., 2006). И.В. Бобровой в 2008 году были предложены пять аналогов энкефалинов с линейной и разветвленной структурой пептидной цепи, имеющих общую тетрапептидную последовательность Tyr-A-Gly-Phe(p-N02)-NH2, где «А» является D-изомером основной аминокислоты (Bobrova I. Patent: Cardioprotective compounds, Int.Pub.No.: WO/2008/020802). Эти пептиды получили кодовые названия: «ЕР91», «ЕР92», «ЕР93», «ЕР94» и «ЕР95». В связи с этим представляет интерес изучения кардиопротекторной активности новых синтетических аналогов энкефалинов на лабораторных грызунах, а также оценке их потенциальных возможностей как кардиопротекторов при острой ишемии коронарных сосудов, что в настоящее время представляется актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью работы является исследование кардиопротекторных эффектов новых синтетических аналогов энкефалинов, имеющих тетрапептидную структуру.

Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать кардиопротекторную активность новых синтетических аналогов энкефалинов при профилактическом однократном и многократном введении на модели острого инфаркта миокарда у крыс CD.

2. Изучить терапевтические кардиопротекторные эффекты наиболее активных пептидов.

3. Оценить кардиопротекторный эффект пептида «ЕР94» при различной продолжительности окклюзии коронарной артерии.

4. Изучить механизмы кардиопротекторного эффекта «ЕР94» с помощью антагонистов опиоидных рецепторов.

5 . Оценить роль N0 в реализации кардиопротекторного действия «ЕР94».

Научная новизна работы. Впервые показано, что кардиопротекторная активность синтетических аналогов энкефалинов, имеющих тетрапептидную структуру зависит от длины боковой цепи второй аминокислоты. Выявлен пептид «ЕР94», обладающий кардиопротекторным эффектом, превосходящим морфин. Обнаружена дозозависимость изучаемого эффекта, наибольший

кардиопротекторный эффект пептида «ЕР94» проявляется в дозе 0,7 мкг/кг.

9

Показано, что с увеличением продолжительности тестовой ишемии отменяются превентивные свойства «ЕР94», однако, защитные эффекты сохраняются при многократных введениях пептида в период ишемии миокарда. Установлено, что «ЕР94» является неселективным агонистом опиоидных рецепторов, в реализации кардиопротекторного эффекта участвует эндогенный N0 клетки.

Практическая значимость работы. Настоящее исследование расширило существующее представление о роли энкефалинов в кардиопротекции при остром инфаркте миокарда. Полученные результаты указывают на эффективность синтетического аналога энкефалина «ЕР94», имеющего тетрапептидную структуру, как потенциального кардиопротектора при терапии острого инфаркта миокарда, а также свидетельствуют о перспективности дальнейшего его доклинического изучения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выявлены два высокоактивных пептида линейной структуры «ЕР91» и «ЕР94», имеющих общую последовательность Туг-А-С1у-РЬе(р-Ж)2)-]Ж2.

2. Кардиопротекторная активность новых аналогов энкефалинов зависит от длины боковой цепи второй аминокислоты.

3. Максимальный эффект кардиопротекции у экспериментальных животных достигается при однократном введении пептидов «ЕР91» и «ЕР94» до наступления острой ишемии миокарда, наблюдается дозозависимость изучаемого эффекта.

4. Пептид «ЕР94» способен эффективно снижать объем инфаркта при длительной ишемии миокарда.

5. Кардиопротекторное действие нового энкефалинового аналога «ЕР94»реализуется через активацию опиоидной системы, возможным механизмом протекции является эндогенная МО-система клетки.

Апробация результатов исследования. Основные результаты диссертационной работы были представлены на IV Всероссийской школе-ко�