Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние белково-пептидной фракции сыворотки крови на болевую чувствительность

1.0 С./5 СЛ

^РШСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРСУЬИШЕШОСТИ ■г- РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

МЕЛИК-ЕГАНОВ Георгий Рафазлевкч

ВЛИЯНИЕ БЕЖОЗО-ПЕПШНОЙ «АКЦИИ СЫВОРОТКИ КРОВИ НА БОЛЕВУЮ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ

14.00.25 - фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА - 1995

- г -

Работа выполнена в Научно-производственном центре "Гидробиос" МЗ МП РФ

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор В.В.Яснецов Официальные оппоненты: доктор ¡медицинских наук, профессор А.И.Майский доктор медицинских наук, профессор В.П.Фисенко

Ведущая организация: Московский медицинский стоматологический институт

Защита состоится " " 1995 г. в " " часов на

заседании специализированного совета К-084.14.05 по присуждению ученой степени кандидата наук в Российском государственном медицинском университете по адресу: 117869, Москва, ул. Островитянова 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан " " 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук,

доцент Т.Н.Клушина

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Важным направлением в науке о боли являются исследования роли белково-пептидных систем в механизмах боли и обезболивания, которые стали бурно развиваться с зередины 70-х годов, благодаря открытию опиоидных рецепторов и íx эндогенных лигандов - опиоидных пептидов ( Майский А.И. с зоавт, 1982-, Машковский М.Д., 1978, 1994; Игнатов Ю.Д., 1984, L989; Булаев В.М., Раевский К.С., 1982; Закусов В.В. с соавт., 1982; Харкевич Д.А., 1989; Утешев B.C., Коростелев С.А., 1990; ?снецов В.В., Пашков B.C., 1993 и мн. др.). Впоследствии было юказано участие и других семейств регуляторных пептидов (та-сикининов, нейротензинов, холецистокининов (ХЦК), гипоталами-юских либеринов и статинов, меланокортинов, бомбезинов, анги->тензинов и др.) в регуляции болевой чувствительности (Калюж-¡ыйЛ.В., 1984, 1990; Лиманский Ю.П., 1986, 1989; Братин Е.О., 1991; Vaught, 1988; Poole е.а., 1992 и мн. др.).

Наиболее детально в указанном аспекте исследована эндо-■енная опиоидная система, активные метаболиты которой образуется из трех белков предшественников: проопиомеланокортина, гроэнкефалина А и проэнкефалина В, содержащих 260-265 амино-жслотных остатков и имеюшда молекулярную массу около 30 кД [Ашмарин И.П., Каменская М.А., 1988; Olíate.а., 1989). Боль-инство исследованных эндогенных опиоидных субстанций обладают иалгетической активностью, вместе с тем вещества с гипералге-■ической активностью обнаружены среди различных групп регулярных пептидов. К ним прежде всего относятся пептиды, обладателе антиопиоидными свойствами: фрагмент бета-эндорфина (1-27) Suh H.H. е.a., 1988b), С-концевой трипептид последовательнос-и 7-9 окситоцина - Pro-Leu-Gly-NH2 (MIF-1) и Tyr-MIF-1 Kavaliers М., 1987), ХЦК-8 (Wlesenfeld-Hallln е.а., 1987) и р. Имеются также данные о наличии гипералгетической активнос-и у субстанции Р (Matsumara Н. е.а., 1985), миелопептидов Яновский О.Г. с соавт., 1989, 1990), ряда цитокинов (Захарова :.А., Петров Р.В., 1990; Ferreira S.H. е.а., 1988; Cunha е.а., 991) и др. Вместе о тем показано, что в условиях болевого оздействия в сыворотке крови происходит изменение содержания яда неизвестных веществ бедково-пептидной природы (Drysdale .С. е.а., 1986). Также имеются данные об облегчающем влиянии

неизвестных гуморальных факторов на устойчивые разряды псшимо-дальных нощщепторов (Ни гм-Отепг е.а., 1990).

Следовательно, наряду с хорошо изученными белково-пептидными системами с аналитической и гипералгетической активностью в крови млекопитающих присутствуют и другие вещества белково-пептидной природы, участвующие в регуляции боли. Таким образом, детальное изучение в указанном аспекте новых белко-во-пептидных фракций, выделенных из сыворотки крови млекопитающих, и их активных метаболитов позволит существенно расширить современные представления о белково-пептидных механизмах регуляции боли, что может явиться фундаментом нового подхода к эффективному лекарственному обезболиванию.

Цель х задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение характера и механизмов влияния белково-пептидных фракций сыворотки крови человека и млекопитающих на болевую чувствительность.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Выявить наиболее активные в отношении влияния на болевую чувствительность белково- пептидные фракции сыворотки крови различных видов животных и человека.

2. Исследовать влияние на болевую чувствительность отдельных компонентов наиболее активной фракции.

3. Оценить характер взаимодействия суммарных фракций и их наиболее активных компонентов с эндогенными и экзогенными опиатами и опиоидами.

4. Исследовать механизмы гипер- и аналгетического действия белково-пептидных фракций.

Научная новизна исследования состоит в том, что впервые получены данные о наличии гипералгетических свойств у белково-пептидных фракций сыворотки крови человека и животных, и выявлена наиболее активная - белково-пептидная фракция сыворотки крови гренладского тюленя (ФВ-Т). При этом обнаружено, что в ее составе присутствуют вещества как с гипер-, так и аналгетической активностью. Эффекты последних, как и суммарной фракции, зависят от активности ферментных систем, ингибирова-ше которых полностью устраняет или существенно ослабляет вли-

яние этих веществ на болевую чувствительность. Выявлено, что ФВ-Т обладает способностью предупреждать и устранять болеутоляюще действие морфина (производное фенантрена) и энкефалинов и, напротив, усиливает обезболивающий эффект промедола и фен-танила (производные пипередина). ФВ-Т и ее субфракции обладают выраженным центральным действием, что проявляется в изменениях амплитуды компонентов ноцицептивкых вызванных потенциалов в структурах ноци- и антиноцицептивной систем и связывания меченых лигандов со специфическими рецепторами головного мозга. В основе аналитической активностью субфракции ФБ-Т лежит ее способность взаимодействовать с мю-опиоиднми и бензодиазепино-выми рецепторами.

Практическая ценность работ. Настоящая работа относится к числу фундаментальных исследований. Результаты этого исследования могут лечь в основу новых фармакологических подходов к регуляции боли. Основное прикладное значение состоит в том, что исследованные белково-пептидные фракции в отличие от известных пептидов могут быть выделены из сыворотки крови различных млекопитающих в'промышленных " масштабах.

Апробация работы. Результаты работы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на I конференции Российской Ассоциации по изучению боли "Патофизиология и фармакология боли (экспериментальные и клинические аспекты)" (Москва, 1993 г.), Всеросийской конференции "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической фармакологии" (Смоленск, 1994 г.), на совместном заседании лаборатории 0-054 ИМЕН и отдела фармакологии НЩ "Гидробиос" (1994 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем работа. Диссертация написана на русском языке, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, трех глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и документирована 22 таблицами, 1 рисунком. Список литературы содержит 47 названий работ отечественных и 184 зарубежных авторов.

- 6 -

МАТЕРИАЛ! и методы ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проводили на .половозрелых животных - самцах: мышах линии США массой 10-15 г, крысах линии Вистар массой 200-250 г и кроликах породы Шиншилла массой 2.5-3.5 кг. Всего проведено 550 экспериментов.

Исследование болевсй чувствительности. Выло использовано 4 теста для определения болевой чувствительности у экспериментальных животных: тест "корчи" по методике (Okutoml Т. е. а. 1992), tall-flick тест (D'Amour, Smith 1941), тест "реакции вокализации" (РВ) (Evans W.O. 1961), тест реакции открывания пасти (РШ) (lovick Т. А. 1979).

Для определения нейрсфармакологических механизмов действия изучаемых веществ исследовали динамику параметров ноци-цептивных вызванных потенциалов в сенсомоторнойрной зоне коры и подкорковых структурах ноцицептивной и антиноцицептивной системы: парафасцнкулярном комплексе ядер таламуса (1Ш), центральном ядре миндалевидного комплекса (М), дорсомедиальном ядре гипоталамуса (ДМГ), центральном сером веществе (ЦСВ) и дорсальном ядре шва (ДОТ).

Применяемые вещества. Для получения фракций белков сыворотки крови крупного рогатого скота (ФВ-С) лиофихизовали стерильную сыворотку крови крупного рогатого скота, выпускаемую заводом медпрепаратов Киевского мясокомбината. Фракцию белков крови человека (ФБ-Ч) получали из сыворотки крови человека, предоставленную Центральной московской станцией переливания крови. Фракцию белков тюленя (ФВ-Т) выделяли иа сыворотки крови гренландского тюленя, заготовленную на месте забоя животных.

Препаративное хроматографическое разделения ФБ-Т проводили на анионообменной колонке DEAE Toyopearl 650М. Шло получено 5 субфракцийб (рис.1).

Электрофоретическое разделение изучаемых веществ выявило, что они являются не однородными по своей структуре. В первой субфракции присутствуют пять основных компонентов с молекулярными весами 81; 74; 60; 59 и 24 кДа, а так же до 13 минорных компонентов с низко- и высокомолекулярными весами. Субфракция- 2 состоит из четырех основных: 65; 60; 55 и 23 кДа и десяти минорных компонентов. Субфракция-3 характеризуется наличием

Рисунок 1 Кривая хроматографического разделения ФБ-Т на анионооСменной колонке (й-145 мм) БЕДЕ Тоуореаг1 650М (Япония) 1, 2.....5 - номера получаемых субфракций

в своем составе трех основных компонентов с молекулярными весами 76; 70 и 62 кДа и отсутствием минорных полос. Четвертая субфракция включает два основных 119 и 67 кДа и 15 минорных компонентов. Субфракция пять имеет основные полосы с молекулярным весом 72 и 39 кДа и 8 минорных полос.

Белково-пептидные фракции сыворотки крови непосредственно перед введением растворяли в физиологическом растворе и вводили животным п/к, в/б и в/в в следующем объеме: мыши - 0.2 мл, крысы - 0.5 мл и 10 мкд при в/ж введении, кролики - 2 мл и 40 мкл при в/ж введении. Дозы этих веществ соствляли для сист-нмного введения 0.4, 1, 2, 5 и 10 мг/кг, а для в/ж - 10 и 40 мкг.

Также в ходе экспериментов использовали введение сывороточного альбумина, получаемого из сыворотки крови крупного рогатого скота. Процесс растворения, дозы и объем введения сывороточного альбумина были аналогичны таковым при введении бел-ково-пептидных фракций.

Из фармакологических агентов были использованы антогонис-ты опиатов - налоксон в дозах 1 и 2 мг/кг при системном и 10 мкг при в/ж введении, налорфин в дозах 1 и 2 мг/кг при системном введении; наркотические анальгетики - морфин в дозах 2.5 и 5 мг/кг при системном и 40 мкг при в/ж введении, промедол в дозах 7 и 10 мг/кг при системном и 70 мкг при в/ж введении, фентанил в дозе 0.05 мг/кг при системном введении; эндогенные опиаты - лей-энкефалин и мег-энкефалин в дозах 50-200 мкг при в/ж введении; ингибитор протеаз - бацитрацин в дозе 5 мг/кг при системном введении,.

Исследование рецепторного связывания проводили на рецеп-торном аппарате синаптосом головного мозга крыс. Были использованы : ЗН- фдунитрозепам (85 Cl/nmol) в концентрации 2 нМ и ЗН-налоксона (61 Ci/nmol), ЗН-спиперон (88 Cl/nmol), ЗН-клони-дин (23.2 Cl/nmol) в концентрации 1 нМ. В случае определения неспецифического связывания вытесняющими агентами являлись: диазепам, морфин, пиренперон, клонидин в концентрации 10Е - 6 Ы. При оценки активности исследуемых веществ использовали концентрации от 0.1 до 1000 мкг/мл.

Статистическая обработка подученных данных включала использование параметрического критерия Стысщента и непараыетри-' ческих критериев Вилкоксона и Колмогорова-Смирнова. За досто-

- g -

верные принимались результаты с р не больше 0,05. Также в ряде экспериментов вычисляли коэффициент ранговой корреляции Спир-мана. Все расчеты проводили на компьтере IBM PC/AT - 286 о использованием пакета программ Statgraph v. 2.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При исследовании влияния суммарных белково-пептидных фракций сыворотки крови человека (ФБ-Ч), крупного рогатого скота (ФБ-С) и гренландского тюленя (ФБ-Т) на болевую чувствительность в диапазоне доз 1-10 мг/кг при в/б и п/к введении было выявлено, что все они в той или иной степени вызывают ги~ пералгезио. Так, например, в тесте "tall-flick" (табл.1) ФБ-Т дозозависимо снижала показатели латентного периода реакции отдергивания хвоста (Ж РОХ) через 60 и 90 мин после в/б введения. Менее активной по этому тесту являлась ФБ-С, вместе с тем в тесте "корчи" (табл.1) ФБ-С вызвала более выраженную гипе-раигезию.

ФБ-Ч (1-10 мг/кг, в/б) была неэффективна по тестам "корчи" и "tall-flick", однако в тесте "вокализации" (табл.1) она проявляла хотя и менее выраженную чем ФБ-С и ФБ-Т, но достоверную гипералгетическу» активность.

Выраженность гипералгетического действия наиболее активной белково-пептидной фракции в каждом конкретном тесте была сравнима с таковым эталонных препаратов - антагонистов наркотических анальгетиков - налоксона и налорфина (1-5 мг/кг, в/б).

Таким образом, все исследуемые белково-пептидные вещества обладают гипералгетической активностью, сравнимой с таковой эталонных препаратов налоксона и налорфина. Однако выраженность их эффекта в отличие от эталонных препаратов существенно варьирует в зависимости от применяемого теста.

Дифференцированное действие пептидов при болях разной природы продемонстрировано в различных исследованиях (Калюжный Л.В, 1988; Раевская О.С. с соавт., 1988; TiseoP.J., е.а., 1990; Calvlno В.. е.а., 1988; Morton C.R., е.а., 1989). Учитывая эти данные, можно объяснить подученные нами результаты о различном влиянии ФБ-Т и ФВ-С на боль термического и химического генеза. Однако обращает на себя внимание тот факт, что

Таблица 1

ВЛИЯНИЕ ИССЛЕДУЕМЫХ ВЕЩЕСТВ НА БОЛЕВУЮ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ

Препарат, Фон (контроль) Опыт

доза, путь

1 3

введения 2 1 2 3

ФБ-Т 2мг/кг 32+2.0 11.2+0.8 52+2.0 44+2.0 11.4+0.7 41+3.0

в/б (+25%)* (-21%)*

ФБ-Т 5мг/кг' 11+0.1 5.0+0.2 52+2.0 12+0.8 3.9+0.1 30+2.1

в/б (-22%)* (-32%)*

ФБ-С 2мг/кг 21+3.0 6.5+2.1 37+5.0 30+3.3 4.3+1.3 22+8.0

в/б (+32%)* (-3?%)* (-30%)*

ФБ-С 5мг/кг 35+5.0 4.6+0.8 53+5.0 32+4.0 4.2+0.7 47+11.0

в/б

ФБ-Ч 2мг/кг 15+3.0 4.6+1.3 52+5.0 20+3.0 4.7+1.9 43+1.6

в/б (-17%)*

ФБ-Ч 5мг/кг 35+5.0 4.8+1.9 52+5.0 30+3.0 4.9+2.1 42+1.8

в/б (-18%)

Субфракция-1 35+2.2 3.7+0.1 46+4.1 1.4+0.1

1 мг/кг в/б (+31%)* (-62%)*

Субфракция-2 35+2.2 4.3+0.2 27+3.5 7.2+0.1

1 мг/кг в/б (-23%)* (+63%)*

Бацитрацин

5 мг/кг в/б+

субфракция-1 35+2.2 3.7+0.1 35+4.1 3.8+0.2

1 м/кг в/б

Бацитрацин

5 мг/кг В/6+

субфракция-2 35+2.2 4.3+0.2 36+3.0 4.1+0.5

1 м/кг в/б

Субфракция-1 34+1.8 5.8+0.9 37+4.1 5.6+1.4

колл.

гидролизат

1 мг/кг в/б

Субфракция-1 43+5..0 6.4+1.3 40+3.8 6.5+1.9

трипсиновый

гидролизат

1 ыг/кг в/б

Субфракция-2 39+4.5 5.8+0.7 20+2.2 12.4+1.2

колл. (-19%)* (+113%)*

гидролизат

1 мг/кг В/О

Субфракция-2 40+2.5 6.2+0.9 31+3.1 7.8+0.3

трипсиновый (-23%)* (+25%)*

гидролизат

1 мг/кг В/б

Налоксон 64+3.0 11+1.2 47+2.0 133+7.0 8.0+1.0 36+2.0

1 мг/кг В/б (+107%) (-23%)* (-22%)*

Налорфин 18+2.0 6.0+1.3 53+3.8 19+3.0 4.1+0.5 50+3.0

1 мг/кг В/б (-32%)*

Примечание: 1 - тест "корчи" (число корчей)

2 - тест "tall-flick" (ЛП РОХ, с)

3 - тест "вокализация" (порог вокализации. В) * - изменения, достоверные к фону (контролю),

р < 0.05.

НЗ-Ч была или менее эффективна, чем ФБ-С и ФВ-Т (тест "вокали-}ации"), или совсем неэффективна (тесты "корчи" и 'tall-fИск"). Принципиальное отличие этой белково-пептидной фракции состоит в том, что она была выделена иа сыворотки крот здорового человека, причем забор крови не сопровождался зтоль выраженным эмоционально-болевым стрессом, как это наблюдалось в двух предыдущих случаях. Известно, что во время эмо~ даонально-болевого стресса в организме происходит мощный выб-юс гуморальных факторов различной природы, в частности Селко-ю-пептидных (Салиева Р.Ы. с соавт., 1988; Desiderio D.M. >.а., 1988; Spaziante R. е.а., 1990; Calvino В. е.а., 1991; Janccherl Р., е.а., 1985; Ley S.J., е.а., 1991; Ohno Н. е.а., L990). Большинство из этих веществ способны участвовать в регуляции болевой чувтвительности, а ряд из них обладает и гипе-эалгетической активностью. К ним прежде всего следует отнести 1Нтерлейкин-1-бета (Ferrelra е.а., 1988), интерлейкин-8 (Cunha 5.a., 1991), кальцитонин-ген-родственный пептид (Wolf е.а., L986), вазоактивный интестинальныи пептид (Welsefeld-Hallin, L987), вещество Р (Wolf, Welsefeld-Hallin, 1986; «.esefeld-Hallin е.а., 1990; Oncubo е.а., 1990; Eide, Hole, L991), соматостатин (Mbrton е.а., 1989; Oncubo е.а., 1990), 5радикинин (Guzman е.а., 1962; Llm е.а., 1964), фрагмент 44-68 харатиреоидного гормона (Welch, Dewey, 1990), холецистоки-юн-октапептид ( Welsefeld-Hallin, 1986; Wlesefeld-Hallln i. а., 1990), иммунопептвды (Федан В.А., Голов Б.Ю., 1989), ряд состномозговых факторов (Яновский О.Г. с соавт., 1989) и др.

Однако, в отличие от вышеперичисленных пептидных регуляторов боли, обладающих гипералгетической активностью, исследу-}мые вещества имеют большую молекулярную массу основных композитов и Солее длительный латентный период действия.

Ионообменное фракционирование ФБ-*Т позволило выделить 5 зубфракций. Исследование их активности при внутрижелудочковом зведении бодрствующим и наркотизированным крысам (10 мкг) в гесте РОТ выявило, что субфракция-1 обладает гипералгетическим действием, а субфракция-2 - авалгетическим. При этом сывороточный альбумин, введенный животным контрольной группы, не вызывал достоверных изменений болевого порога. Аналогичные дан-аде по влиянию на болевую чувствительность- были получены и при зистемном введении (0.4-1.0 мг/кг, в/б) изучаемых субфракций

- 12 - .

мышам в тесте "корчи" (табл.1).

В ФБ-Т, а также в субфракциях 1 и 2 содержатся высокомолекулярные компоненты белков с молекулярной массой более 22 кД. В связи с тем, что испытанные препараты при системном и центральном введении действуют довольно сходным образом, то имеется определенная вероятность их проникновения из крови в мозг, например, через ГЭБ с помощью специфических транспортных систем, или в обход ГЭБ через циркумвентрикулярные органы (Марьянович А.Т., Поляков Е.Л., 1991; Шашков B.C. с соавт., . 1994). Также не исключено, что гипералгетйческим и аналитическим действием обладают не сами белки, а их метаболиты -различного рода пептиды, обладающие значительно меньшей молекулярной массой.

Быстрое коллагеназное расщепление (инкубация 30 мин) субфракции-2 значительно усиливало ее болеутоляющее действие, а предварительное введение ингибитора протеаз, бацитрацина (5 мг/кг, в/б) полностью предупреждало развитие аналитической активности этой субфракции в тестах "tail-flick" и "корчи" (табл.1). Следовательно, болеутоляющее действие субфракции-2 определяется ее ферментативным расщеплением в организме.

Предварительное расщепление субфракции-1 колагеназой и трипсином с различным временем инкубации либо не приводило к усилению ее гипералгетической активности, либо в ряде случаев ее снижало (табл.1). Между тем, введение бацитрацина существенно ослабляло гипералгетическое действие этого препарата (табл.1).

Таким образом, в состав обеих субфракций как с аналитической, так и гипералгетичеекой активностью входят высокомолекулярные белки-прекурзоры, действие которых определяется ферментативным расщеплением в организме.

Известно, что ряд веществ опосредуют свое гипералгетическое влияние за счет блокады антиноцицептивных эффектов эндогенных опиоидов, а также обладают свойствами антагонистов экзогенных опиатов. Из синтетических препаратов к ним прежде всего относятся блокаторы опиоидных рецепторов: налорфин, на-локсон, MR-226 и др. (Игнатов Ю.Д., 1984).

Эндогенные вещества, обладающие антиопиоидной активностью, обнаружены среди различных групп.регуляторных пептидов: тиролиберин, брадикинин, холецистокинин-октапептид, фраг-

менты бета-зндорфина, океитоцина, динорфина, АКТГ и др. (Була-ев В.U., Закусов В.В., 1980; Закусов В.В. с соавт., 1983; Harmonds е.а., 1984; Nicolas, LI, 1985; Friedman е.а., 1981; Ehrensing е.а., 1984; Kastln е.а., 1985; LI, Han. 1989; O'Neil е.а., 1989; Tseng, Collins, 1992).

В свете изложенного, естественно возникает вопрос о механизме гипералгетического действия ФБ-Т и ее субфракции. По всей вероятности, в его основе лежит ослабление антиноцицеп-тивного эффекта эндогенных опиоидов (в частности, как показали проведенные эксперименты, мет- и лей-энкефалинов) и опиатов, в частности морфина (табл.2).

Влияние ФБ-Т в различных дозах (1-5 мг/кг) на морфиновую аналгезию исследовали при ее введении за 15-мин до применения морфина, одновременно с ним и спустя 15 мин после его введения. Достоверные различия в количестве корчей по сравнению с контрольной группой были выявлены при введении ФБ-Т в дозе 2 мг/кг, которая сама по себе не влияла на болевую чувствительность в данном тесте. При введении ФБ-Т за 15 мин до введения морфина наблюдалось достоверное ослабление аналгетического эффекта морфина: количество корчей у этих животных возрастало на 211% (р < 0.05), а различия с контрольной группой были недостоверны (табл. 2). Введение ФБ-Т одновременно с морфином или спустя 15 мин после него вызывало сходный, хотя и менее выраженный эффект: число корчей в обоих случаях увеличивалось на 189% (р < 0.05).

Исследование влияния ФБ-Т в разных дозах (1-10 мг/кг) на морфиновую аналгезию в тесте "tall-flick" выявило, что применение препарата в дозах 1 и 2 мг/кг через 30 мин после введения морфина достоверно не изменяет обезболивающее действие последнего. Введение ФБ-Т (5 мг/кг, в/б) в том же временном интервале приводило к заметному ослаблению аналгетического эффекта морфина: - ЛП РОХ возрастал только на 43% (р < 0.05) (табл. 2). Аналогично действовала ФБ-Т в дозе 10 мг/кг. Кроме того, обращает на себя внимание тот факт, что ФБ-Т в дозе 5 мг/кг при в/б введении за 30 кош до применения морфина в той же дозе полностью предупреждала развитие морфиновой аналгезии. Налоксон в дозе 2 мг/кг (в/б) полностью устранял болеутоляющий эффект морфина, а налорфин в той же дозе (в/б) существенно его ослаблял (на 62%, р< 0.05) (табл. 2).

Таблица 2

ВЛИЯНИЕ ИССЛЕДУЕМЫХ ВЕЩЕСТВ НА БОЛЕУТОЛЯЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ОПИАТОВ И опиоидов

Препарат, Фон (контроль) Опыт

ДОоа, ПУТЬ

введения 1 2 3 1 2 3

Морфин 5 34+3.0 5.0+0.5 45+2.4 9+2.0 13.0+1.5 >60

иг/кг в/б (-74%)* (+160%)* (+33%)*

ФБ-Т 5мг/кг 34+3.0 5.0+0.5 45+2.4 28+4.0 4.7+0.6 45+3.5

в/б + ** ** **

морфин 5

мг/кг в/б

Лей-энке- 5.6+0.4 9.7+0.8

фалин 100 (+73%)*

мкг в/ж

ФБ-Т 5мг/кг 5.6+0.4 5.7+0.9

в/б + **

Лей-энкеф.

100 мкг в/ж

Мет-энкеф. 5.8+0.3 13.7+0.7

100 мкг в/ж (+135%)*

ФБ-Т 5мг/кг 5.8+0.3 5.6+0.7

в/б + **

Мет-энкеф.

100 мкг в/ж

Бромедол 26+2.1 8.6+1.4 44+4.3 18+4.1 18.0+4.7 44+2.5

7 мг/кг в/б (-31%)* (+173%)*

ФБ-Т 5мг/кг 26+2.1 8.6+1.4 44+4.3 4 +1.4 32.0+7.1 58+2.1

в/б + (-55%) (+395%) (+32%)*

промедол ** ** **

7 мг/кг в/б

Фентанил в/б 36+2.1 4.3+0.1 45+1.1 17+1.0 9.2+1.0 54+1.6

0.05 мг/кг (-50%)* (+114%)* (+20%)*

ФБ-Т 5мг/кг 36+2.1 4.3+0.1 45+1.1 4 +1.0 15.5+3.2 59+1.0

в/б + (-59%) (+260%) (+31%)

фентанил в/б ** ** **

0.05 мг/кг

Примечание:.! - тест "корчи" (число корчей)

2 - тест "tall-flick" (ЛП РОХ, с)

3 - тест "вокализация" (порог вокализации, В) * - изменения, достоверные к фону (контролю),

р < 0.05.

**- изменения, достоверные к эффектам опиатов и опиоидов, р < 0.05.

У крыс в тесте "вокализации" морфин (5 мг/кг, п/к и в/б) через 30 мин после введения увеличивал порог вокализации на 15%, а через 60 и 90 мин - более чем на 20% (р < 0.05). Эффекты, обусловленные введением ФЕ-Г через 30 мин после применения морфина в дозах 1, 2, 5 и 10 мг/кг, достоверно не отличались друг От друга: во всех случаях наблюдалось полное восстановление фоновых показателей (табл. 2).

Введение лей-знкефаяина (в/ж, 50-200 мкг) вызывало дозо-зависимое снижение ЛП РОХ у бодрствующих крыс. Максимальный аналгетический эффект наблюдался на 10 мин, когда повышение ЛП РОХ при использовании дозы 200 мкг составляло 221% от "фона (р < 0.05). Предварительное введение ФБ-Т (в/б, за 30 мин, 1-5 мг/кг) приводило к снижений наблюдаемого эффекта. Наиболее эффективной дозой ФБ-Т являлась доза 5 мг/кг, при предварительном введении которой не наблюдалось достоверных изменений в значениях ЛП РОХ (табл.2).

Введение ыег-энкефалина (в/ж, 50-200 мкг) также вызывало дозозависимое снижение ЛП РОХ у крыс. Выраженный аналгетический эффект наблюдался при введении дозы 100 мкг, когда повышение ЛП РОХ составляло 236% от фона (р < 0.05) (табл.2). Увеличение дозы до 200 мкг незначительно сказывалось на выраженности аналгезии. Предварительное введение ФБ-Т (в/б, 1-5 мг/кг) приводило к полному предупреждению аналгетического действия мет-энкефалина, причем это наблюдалось независимо от дозы как вводимой фр&кции белков сыворотки крови, так и мет-энкефалина.

Представленные выше данные о сравнтельном влиянии ФБ-Т, налоксона и налорфина по влиянию на болевую чувствительность и выраженность морфиновой и энгеефалиновой аналгезии могут свидетельствовать о том, что в основе гипералгетического действия ФБ-Т лежит антиопиоидный механизм. В то же время нами било выявлено, что ФБ-Т способна усиливать аналгетический эффект про-медола и фентанила. Так, например, п/к ведение промедола мышам в дозе 10 мг/кг за 30 и 45 мин до введения уксусной кислоты вызывало достоверное снижение количества корчей соответственно на 27% и 31% (р < 0.05), что свидетельствует о развитии к этому времени выраженной аналгезии. ФБ-Т в дозе 2 мг/кг как за 15 мин до введения промедола, так и через 15 мин после его применения вызывала усиление аналгетического эффекта наркотического анальгетика: число корчей в обоих случаях снижалось на 78-79%

-16'' по сравнению с контролем (р < 0.05) (табл. 2).

Введение проыедола крысам в дозе 7 мг/кг (п/к) также приводило к развитии болеутоляющего эффекта в "tall-flick" тесте. Так, через 30 мин после введения промедола ЛИ РОХ у крыс достоверно (р < 0.05) повышался на 330%, через 60 мин увеличение ЛП РОХ составляло 307%, а через 90 мин - 1042. Введение ФБ-Т в дозе 5 мг/кг (в/б) за 30 мин до введения промедола или одновременно с ним не изменяло аналгетический эффект последнего на 30 и 60 мин, но достоверно усиливало его на 90 мин - ЛП РОХ возрастал на 385-400% по отношению к фону, или на 78-83% (р < 0.05) по сравнению с контрольными значениями (группа животных-, получавших только промедол) (табл. 2).

В тесте "вокализации" через 30 и 60 мин после введения промедола крысам в дозе 7 мг/кг (в/б) у них наблюдалось повышение порога PB на 30% (р < 0.05), а через 90 мин этот показатель возвращался к фоновым значениям. Предварительное (за 30 мин), одновременное с промедолом и через 30 мин после последнего введение ФБ-Г в дозе 5 мг/кг достоверно не изменяло порог вокализации на 30 и 60 мин. Вместе с тем на 90 мин при комбинированном введении ФБ-Т и промедола наблюдалась достоверное повышение болевого порога. При предварительном введении ФБ-Т повышение этого показателя по отношению к контролю (эффект самого промедола) составляло 32% (р < 0.05), при одновременном -34% (р < 0.05) и при введении спустя 30 мин - 45% (р < 0.05) (табл. 2).

Аналогичные данные были получены при исследовании влияния ФБ-Т на выраженность и длительность фентаниловой аналгезин (табл.2).

Следует отметить, что промедол и фентанил по своей химической структуре принадлежат к производным пиперидина в отличие от морфина, который является производным фенантрена. Однако, по имеющимся литературным данным, и морфин, и наркотические анальгетитики пиперёдиновой природы вызывают аналгеэию, благодаря одному механизму - взаимодействию с мю-опиоидными рецепторами (Игнатов Ю.Д., 1984).

Шесте с тем в ряде последних работ показано, что производные фенантренового ряда (морфин и кодеин) являются эндогенными компонентами спинномозговой жидкости и содержатся наряду с продуктами их биосинтеза в мозге млекопитающих (Cardinale

G.J. е.a., 1987; Kodalra H. е.a., 1989). Поскольку и знкефали-ны являются эндогенными веществами, то можно предположить, что эта особенность и лежит в основе противоположного действия ФБ-Т на аналитический эффект морфина и энкефалинов, с одной стороны, и производных пипередина с другой. Необходимо также подчеркнуть, что, как было выявлено, ФБ-Т содержит в своем составе субфракцию-2, обладающую обезболивающим действием. Следовательно, усиление аналгетического эффекта промедрла и фентанила, по всей вероятности, зависит от активности именно этого компонента ФБ-Т, в то время как ослабление болеутоляющего действия морфина и знкефалинов связано с активностью субфракции-1.

Радиолигандное исследование рецепторного. связывания показало, что ФБ-Т проявляет наибольшее сродство к альфа-2-адрено-рецепторам, мю-опиоидным и бензодйазепиновым рецепторам, вместе с тем ФБ-Т имеет низкое сродство к другим типам рецепторов головного мозга, в частности, у нее полностью отсутствует аффинитет к S-2 серотониновым рецепторам. Если считать, что предельно допустимая- концентрация изучаемых веществ в крови не превышает 100 мг/мл, то суммарная фракция белков сыворотки крови гренландского тюленя проявляет довольно высокое сродство ко всем трем вышеперечисленным типам рецепторов, так как ее константы ингибирования (К!) не превышают 119 мкг/мл. ФБ-С была менее активной чем ФБ-Т при ингибировании связывания лиган-дов с альфа-2-адренорецепторами, бензодиазепиновыми и мю-опи-оидными рецепторами; причем в последнем случае IC50 превышало 251 мкг/мл, а константа ингибирования была равна 125.9 мкг/мл. В то же время ФБ-С проявляла выраженное сродство к S-2 серотониновым рецепторам, которое полностью отсутствовало у ФБ-Т. ЕБ-Ч проявляла выраженный аффинитет к альфа-2-адренорецепто-рам, S-2 серотониновым и бензодиазепиновым рецепторам и не «мела сродства к мю-опиоидным.

Таким образом, общим для всех испытанных суммарных фрак-дий является то, что они обладают сродством к бензодиазепино-зым рецепторам. Этот факт позволяет объяснить полученные нами гходные результаты по влиянию указанных фракций на порог вока-шзации у крыс, поскольку данный тест отражает эмоциональный юмпонент боли и, следовательно, высокочувствителен к препаратам, обладающим транквилизирующими свойствами. 5 то же время

способность изучаемых препаратов ингибировать связывание других лигандов с соответствующими рецепторами существенно варьировала в зависимости от природы белковой фракции. Как указано выше, гипералгетическая активность ФБ-Т, ФБ-С и ФБ-Ч далеко не одинакова, однако полученные данные радиолигандного исследования не позволяют провести четкую корреляцию между способностью препаратов к рецепторному связыванию и их гипералгетичеекой активностью. Для решения этого вопроса было проведено исследование влияния субфракции ФБ-Т с гипер- и аналгетической активностью на связывание меченых лигандов со специфическими рецепторами синаптических мембран головного мозга крыс.

Было обнаружено, что субфракция-2, вызывающая аналгезию, обладает высоким сродством к мю-опиоидным и бензодиазепиновым рецепторам. По всей вероятности; эта способность и лежит в основе аналгетического действия указанной субфракции. Напротив, субфракция-1 с гипералгетичеекой активностью не проявляла сродства ни к одному из исследуемых типов рецепторов.

Если предположить, что антиопиоидное действие ФБ-Т обусловлено наличием в ее составе субфракции-1 с гипералгетичеекой активностью, то оно не может быть обусловлено взаимодействием с мю-опиоидными рецепторами, так как нами не было обнаружено аффинитета субфракции-1 к этому типу рецепторов. Для изученных пептидов, ослабляющих аналгетический эффект опиатов и опиои-дов, установлено несколько механизмов их антиопиоидного действия. Наряду с пептидами, связывающимися с опиоидными рецепторами (тиролиберин, фрагменты бета-эндорфина, АКТГ и др.), существуют и другие, с иными свойствами. Так, напримкр, в механизме действия холецистокинина показано участие собственных В-холецистокининовых рецепторов (Wlesenfeld-Hallln 2. е.а., 1990), а для фрагментов окситоцина - Mlf и Tyr-Mlf обнаружено участие дофаминовых рецепторов (Krowlckl Z.K., 1991 а, Ь). Ряд пептидов способен ослаблять опиатную аналгезию посредством снижения синтеза эндогенных опиоидов. К ним прежде всего необходимо отнести ваэопресин и окситоцин (Laczi F. е.а., 1987), кальцитонин-ген-родственный пептид (Nikolarakls К.Е. е.а., 1985), соматостатин (Weld М.М. е.а., 1987) и др. Б целом можно заключить, что механизмы антиопиоидного действия известных ре-гуляторных пептидов не ограничиваются их взаимодействием с опиоидными рецепторами.

- 19 -

Обобщая собственные и литературные данные, можно прийти к ыводу, что возможные механизмы антиопиоидного действия ФБ-Т и е субфракции, по-видимому, обусловлены или неисследованными ами типами рецепторов, или взаимодействием с другими нейрохи-ическими системами без вовлечения рецепторного звена.

Подтверждением того, что гипералгетический и антиопиоид-ый эффект ФБ-Т не связан с блокадой мо-опиоидных рецепторов югут служить данные по сравнительному действии налокеона и В-Т на биоэлектрическую активность различных структур ЦНС. [ами было обнаружено, что ФБ-Т в отличие от налокеона изменяет юмпонентный состав корковых и амигдалярных ДВП. При этом навидается преимущественный рост амплитуды длиннолатентных (пи-ювая латенция более 200 мс) комплексов. Следует отметить, что i настоящее время убедительно доказано, что коротколатентные кэрковые ответы носят пре- и моносинаптический характер и »бусловлены проведением болевой импульсации по A-бета волок-[ам, а длиннолатентные - имеют полисинаптический характер и >бусловлены проведением по А-дельта волокнам (Chudler E.H. s.a., 1986; .Dong.W.K. е.а., 1990). Появлению длиннолатентных >тветов соответствует выраженная эмоционально-аверсивная реак-щя на болевое раздражение (Иваницкий A.M., 1974; Иваницкий i.M., Матвеева Л.М., 1978; Chudler E.H. е.а., 1986). Следовательно, ФБ-Т в отличие от налокеона, вызывая гипералгезию, об-1егчает проведение по полисинаптическим путям. Эта особенность действия препарата сохраняется и на фоне предварительно введенного морфина. Вместе с тем ФБ-Т, подобно налоксону, устра-1яет рост амплитуды всех компонентов ответов в ЦСВ и ДЯШ, вызванный морфином.

Увеличение амплитуды компонентов ДВП в ЦСВ и ДЯШ на фоне действия наркотических анальгетиков можно рассматривать как их активацию. В пользу этого свидетельствуют данные о наличии «эрреляции между усилением импульсной активности и ростом ком-тоне нтов ноцицептивных ВП в структурах антиболевой системы гтвола мозга при развитии некоторых видов обезболивания (Рудаков А.Т., 1978; Игонькина С.И., Крыжановский Г.Н., 1979). Следовательно, морфиновая аналгезия сопровождается активацией стволовых антиноцицептивных структур - ЦСВ и ДЯШ, что хорошо согласуется с имеющимися литературными данными об участии системы нисходящего торможения в болеутолящем эффекте опиатов

(Игнатов Ю.Д., 1984; Duggan A.W., 1982; Jones S.L., Gebhart G.F., 1988).

Итак, антиопиовдное действие ФБ-Т сопровождается снижением активности структур головного мозга, относящихся к антино-цицептивной системе, в частности ЦСВ и ДЯШ, опосредующих нисходяще тормозные влияния морфина на дорсальные рога спинного мозга, а также повышением активности МК, М и сенсомоторной области коры - структур, участвующих в проведении, переработке и интеграции болевых возбуждений.

С другой стороны, при нейрофармакологическом исследовании способности ФБ-Т усиливать и пролонгировать обезболивающий эффект прмедола было выявлено, что при комбинированном введении этих препаратов отмечается практически полное подавление ДВП в сенсомоторной коре, ШК (сохраняется лишь первичный комплекс) и миндалине. Напротив, в ЦСВ наблюдайся резкий рост активности: увеличивалась амплитуда практически всех компонентов в среднем на 200% (р < 0.05). В ДЯШ не отмечалось достоверных изменений по сравнению с эффектом одного промедола.

Таким образом, сочетанное введение ФБ-Т и промедола значительно усиливает эффект последнего, причем наблюдается преимущественная активация ЦСВ, а не ДЯШ.

ВЫВОДЫ

1. В крови человека и млекопитающих присутствуют вещества белково-пептидной природы, способные изменять болевую чувствительность и отличающиеся по своим химическим и фармакологическим свойствам от известных ранее.

2. Белково-пептидная фракция сыворотки крови гренландского тюленя (ФБ-Т) в разных тестах (при боли различного генеза) проявляет наибольшую активность по сравнению с другими аналогичными фракциями.

3. В составе ФБ-Т содержатся две субфракции с противоположным влиянием на болевую чувствительность: с аналгетической и гипералгетической активностью, которые являются белками-пре-курзорами, а выраженность их действия зависит от активности ферментных систем организма.

4. ФБ-Т и ее две субфракции обладают выраженным центральным действием: они способны изменять амплитуду компонентов но-

хицепгивных вызванных потенциалов в структурах ноци- и антино-дицептивных систем и связывание меченых лигандов со специфическими рецепторами синаптических мембран головного мозга.

Б. В основе аналитической активности субфракции ФБ-Т легат ее способность взаимодействовать с мю-опиоидными и бензо-щазепиновыми рецепторами; в то же время другая субфракция ВБ-Т - с гипералгетической активностью - не проявляет сродства га к одному из исследованных типов рецепторов (альфа-2-адрено->ецепторы, мю-опиоидные, Б-г-серотониновые и бензодиазепиновые >ецепторы).

6. ФБ-Т обладает способностью предупреждать и устранять болеутоляющий эффект морфина (производное фенантрена) и знке-залинов, при этом по активности она близка к эталонным препа->атаы - налоксону и напорфину; в то же время ФБ-Т усиливает >безболивающее действие производных пиперидина - промедола и зентанила.

7. Предупреждение и устранение морфиновой аналгезии ФБ-Т юпровождается повышением биоэлектрической активности структур гацицептивной системы головного мозга и снижением.активности ируктур антиноцицбптивной системы: ЦСВ (центральное серое Бегство) и ДШ (дорсальное ядро шва).

8. Усиление ФБ-Т аналгетического эффекта промедола сопро-¡оядается снижением активности структур ноцицептивной системы [ активацией ЦСВ, но не ДОТ.

- 22 -

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Асланянц Ж.К., Батраков С.Г., Евстратов A.B., Яснецов В.В., Иванов М.П., Коробов Н.В., Мелик-Еганов Г.Р./ Влияние белков сыворотки крови тюленя на болеутоляющее действие .наркотических анльгетиков.// Бюлл.зксп.биол. и мед. .-1991. -62. -N 11. -С.503-505

2. Яснецов В.В., Мелик-Еганов Г.Р., Асланянц Ж.К., Батраков С.Г., Евстратов A.B., Иванов М.П., Коробов Н.В./ Влияние белков сыворотки крови тюленя на аналитическое действие наркотических анальгетиков.// Тез. докл. Всее. конф. с меад. уч. "Синтез фармакология и клинические аспекты новых обезболивающих средств".-Новгород. - 1991. -С.60-61

3. Мелик-Еганов K.P., Мелик-Еганов Г.Р., Громов А.Н./ К фопросу о нейрофизиологических механизмах конкурентной аналге-зии.// Успехи физ. наук. -1992. -23. -С.85-96

4. Батраков С.Г., Яснецов В.В., Евстратов A.B., Иванов М.П., Асланянц Ж.К., Мелик-Еганов Г.Р./ Гипер- и гипоалгети-ческие эффекты белков сыворотки крови человека и животных. // Известия Академии Наук РФ: серия биологическая. - 1993. - N 5. -С.714-731

5. Яснецов В.В., Мелик-Еганов Г.Р., Асланянц К.К., Батраков С.Г., Евстратов A.B., Русаков Д.Ю./ Роль отдельных белковых фракций сыворотки крови в регуляции болевой чувствительности.// Тез. докл. I конф. Российской Ассоциации по изучению боли. -М. -1993. С.164