Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Экспериментальное исследование кардиопротекторных эффектов новых синтетических аналогов энкефалинов

V

005ьло« —

ШАЙХУТДИНОВА Эльвира Рауильевна

На правах рукописи

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КАРДИОПРОТЕКТОРНЫХ ЭФФЕКТОВ НОВЫХ СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ ЭНКЕФАЛИНОВ

14.03.06- фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 СЕН аш

Томск-2013

005533156

Работа выполнена в Филиале Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук и Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пущинский Государственный естественно-научный институт»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Мурашев Аркадий Николаевич

Официальные оппоненты:

Алиев Олег Ибрагимович, доктор медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских паук, лаборатория фармакологии кровообращения, ведущий научный сотрудник

Ласукова Татьяна Викторовна, доктор биологических наук, Федеральное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Томский государственный педагогический университет», кафедра медико-биологических дисциплин, профессор кафедры

Ведущая организация: Государственное учебно-научное учреждение Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

диссертационного совета Д 001.031.01 при Федеральном Государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального Государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Защита состоится

в

часов на заседании

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Амосова Евдокия Наумовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что энкефалины играют важную роль не только в регуляции болевых рефлексов (Zhang Y. et al., 2012), но и могут выступать в качестве кардиопротекторов при ишемии коронарных сосудов (Маслов JI.H. и др., 2010, 2012; Dickson E.W. et al., 2006). Однако попытки создать кардиопротекторные лекарственные препараты на основе энкефалинов пока не увенчались успехом.

Существует ряд проблем, ограничивающих применение энкефалинов в клинической практике. Одна из них связана с быстрой деградацией эндогенных опиоидов под влиянием пептидаз крови и спинномозговой жидкости. Так, период полураспада мет-энкефалина в крови крыс составляет 3,9 минуты (Lindstrom L. et al., 1978). Использование синтетических аналогов энкефалинов, обладающих повышенной устойчивостью к протеолитическим ферментам, позволит решить данную проблему.

Модификация структуры пептидов путем использования неприродных D-аминокислот, а также замены С-концевой аминокислоты ведет к увеличению их стабильности. И.В.Бобровой в 2008 году были предложены пять аналогов энкефалинов с линейной и разветвлешюй структурой пептидной цепи, имеющих общую тетрапептидную последовательность Tyr-A-Gly-Phe(p-N02)-NH2, где «А» является D-изомером основной аминокислоты (Bobrova I. Patent: Cardioprotective compounds, Int.Pub.No.: WO/2008/020802). Эти пептиды получили кодовые названия: «ЕР91», «ЕР92», «ЕР93», «ЕР94» и «ЕР95». В связи с этим представляет интерес изучения кардиопротекторной активности новых синтетических аналогов энкефалинов на лабораторных грызунах, а также оценке их потенциальных возможностей как кардиопротекторов при острой ишемии коронарных сосудов, что в настоящее время представляется актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью работы является исследование кардиопротекторных эффектов новых синтетических аналогов энкефалинов, имеющих тетрапептидную структуру.

Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать кардиопротекторную активность новых синтетических аналогов энкефалинов при профилактическом однократном и многократном введении на модели острого инфаркта миокарда у крыс CD.

2. Изучить терапевтические кардиопротекторные эффекты наиболее активных пептидов.

3. Оценить кар дио протекторный эффект пептида «ЕР94» при различной продолжительности окклюзии коронарной артерии.

4. Изучить механизмы кардиопротекторного эффекта «ЕР94» с помощью антагонистов опиоидных рецепторов.

5 . Оценить роль NO в реализации кардиопротекторного действия «ЕР94».

Научная новизна работы. Впервые показано, что кардиопротекторная активность синтетических аналогов энкефалинов, имеющих тетрапептидную структуру зависит от длины боковой цепи второй аминокислоты. Выявлен пептид («ЕР94»), обладающий кардиопротекторным эффектом, превосходящим морфин. Обнаружена дозозависимость изучаемого эффекта, наибольший кардиопротекторный эффект пептида «ЕР94» проявляется в дозе 0,7 мкг/кг. Показано, что с увеличением продолжительности тестовой ишемии отменяются превентивные свойства «ЕР94», однако, защитные эффекты сохраняются при многократных введениях пептида в период ишемии миокарда. Установлено, что «ЕР94» является неселективным агонистом опиоидных рецепторов, в реализации кардиопротекторного эффекта участвует эндогенный N0 клетки.

Практическая значимость работы. Настоящее исследование расширило существующее представление о роли энкефалинов в кардиопротекции при остром инфаркте миокарда. Полученные результаты указывают на эффективность синтетического аналога энкефалина «ЕР94», имеющего тетрапептидную структуру, как потенциального кардиопротектора при терапии острого инфаркта миокарда, а также свидетельствуют о перспективности дальнейшего его доклинического изучения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выявлены два высокоактивных пептида линейной структуры «ЕР91» и «ЕР94», имеющих общую последовательность Туг-А-01у-РЬе(р-М02)-КН2.

2. Кардиопротекторная активность новых аналогов энкефалинов зависит от длины боковой цепи второй аминокислоты.

3. Максимальный эффект кардиопротекции у экспериментальных животных достигается при однократном введении пептидов «ЕР91» и «ЕР94» до наступления острой ишемии миокарда, наблюдается дозозависимость изучаемого эффекта.

4. Пептид «ЕР94» способен эффективно снижать объем инфаркта при длительной ишемии миокарда

5. Кардиопротекторное действие нового энкефалинового аналога «ЕР94»реализуется через активацию опиоидной системы, возможным механизмом протекции является эндогенная МО-система клетки.

Апробация результатов исследования. Основные результаты диссертационной работы были представлены на IV Всероссийской школе-конференции с международным участием по физиологии кровообращения (Москва, МГУ, 2008).; на Международной научной конференции по биооргапической химии, биотехнологии и бионаиотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущгаю, 2009), па 14-ой Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века», (Пущино,2010); на Ш Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010»

4

(Нижний Новгород, 2010), на Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине (Санкт-Петербург, 2010), на XXIII Международной зимней молодежной научной школе (Москва, ИБХ,2011), на научно-практической конференции «Биомедицина и биомоделирование» (Светлые горы, 2011), на V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск., 2011), на V Всероссийской школе-конференции с международным участием по физиологии кровообращения (Москва, МГУ, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано_печатных работ, из них J_

в журнале, рекомендованном ВАК.

Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на 101 странице машинописного текста, иллюстрированы 15 таблицами и 16 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения полученных данных, заключения, общих выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 222 источника, из них 172 работы иностранных авторов.

Материалы и методы исследования. В экспериментах были использованы крысы СО в возрасте 8-9 недель из питомника Филиала ИБХ РАН. Животные содержались в стандартных контролируемых условиях (температура 18-24°С, влажность 30-70%, 12 часовой период освещения, корм и вода - ас! ИЬНит). Эксперименты выполнялись в соответствии с требованиями Институтской Комиссии по контролю над содержанием и использованием лабораторных животных Филиала

Пять новых аналогов знкефалинов общей тетрапептидной последовательности Tyr-A-Gly-Phe(p-N02)-NH2, где «А» - ацетилированный D-изомер основной аминокислоты были получены с помощью твердофазного синтеза с использованием F-moc стратегии (Bobrova I., 2008). Пептиды «ЕР91», «F.P92», «ЕР94» являлись линейными, из них «ЕР94» являлся самым коротким, «ЕР92»-самым длинным линейным пептидом (табл.1). Пептиды «ЕР93» и «ЕР95» формально являются пенгапептидами, однако их следует рассматривать как разветвленные структурные аналоги тетрапептида, в котором боковая цепь основной аминокислоты во 2-ом положении (D-Orn) удлинена остатком Asn в «ЕР93» и Gly в «ЕР95» соответственно.

Исследование кардиопротекторной активности новых аналогов проводили в сравнении с морфином (лицензия на деятельность №21/000216 от 10.03.2004) — опиоидным агонистом, включенного в схему обязательной терапии в неотложной

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ИБХ РАН.

кардиологии у пациентов с ОИМ для купирования болевого синдрома (Сыркин A.C., 2003).

Таблица 1.

Последовательности и структура боковых цепей аминокислот во 2-ом положении новых синтетических аналогов энкефалинов

Пептид Последовательность Л Структура А

<(ЕР91» -D-Om(Ac)- о —Л-

«ЕР92» -D-Lys(Ac)- н

«ЕР93» -D-Orn-Ac-Asn-' ^Vv т о

«ЕР94» -D-Dab(Ac)- о н

«ЕР95» -D-Orn-Ac-GlyJ о W-y о

Анализ кардиопротекторной активности. Острый инфаркт миокарда моделировали путем окклюзии левой коронарной артерии (JIKA) с её последующей 2-часовой реперфузией на аутбредных самцах крыс CD под уретановым наркозом (1 г/кг массы тела, внутрибрюшинно). Окклюзия в экспериментах длилась 25 минут за исключением опытов по изучению кардиопротекторных эффектов пептида «ЕР94» при увеличении продолжительности ишемии, когда окклюзия JIKA составляла 40 минут.

Окклюзию JIKA проводили следующим образом: выполняли торакотомию в четвертом межреберье слева при искусственной вентиляции легких (частота дыхания 60-65 вдохов/выдохов в минуту, дыхательный объем 1 мл на 100 г массы тела) с помощью аппарата искусственного дыхания (UGO BASILE 7025, Италия). Далее вскрывали перикард, определяли локализацию общего ствола левой коронарной артерии, под который с помощью атравматической иглы подводили тонкую полиамидную нить (ETHILON 6-0). Концы нити помещали в полиэтиленовую трубку РЕ-10, таким образом, получали окклюдер для создания обратимой ишемии миокарда.

Также животным имплантировали венозный и артериальный катетеры. Полиэтиленовые катетеры вживляли в брюшную аорту через бедренную артерию -для регистрации артериального давления (АД) и частоты сердечных сокращений (ЧСС), и в бедренную вену - для введения веществ. Гемодинамические параметры

регистрировали с помощью электроманометра и обрабатывали с помощью оригинальной программы «HemoDynamics», которая позволяла рассчитывать среднее ЛД и ЧСС. Гемодинамические параметры измеряли в исходном состоянии, до момента наступления окклюзии, а также во время окклюзии JIKA и реперфузии. Дня контроля наличия ишемии миокарда у животных во время окклюзии осуществляли регистрацию ЭКГ в грудном отведении.

Пептиды растворяли в физиологическом растворе и вводили через венозный катетер. Объем внутривенных инъекций составлял 1 мл/кг веса животного.

Для определения MB-фракции креатинфосфокиназы и лактата в сыворотке животных, образцы крови в объеме 200-300 мкл забирали из бедренной артерии через полиэтиленовый катетер в исходном состоянии и по окончании реперфузии. Количественное определение биохимических показателей проводили спектрофотометрическими методами с использованием стандартных наборов реагентов на планшетном спектрофотометре «Spectra Count» (Packard, США).

В конце каждого эксперимента у животных подсчитывали общую площадь зоны риска, зоны инфаркта и левого желудочка с помощью методики «двойного окрашивания» 2 % метиленовым синим и 1 % трифеншггстразолием хлоридом (1I X) (Vivaldi М.Т. et al., 1985; Schwarz E.R, et al., 2000). Для выявления области миокарда, лишенной кровоснабжения (зоны риска) по окончании реперфузионного периода в бедренную вену вводили 2 мл 2% раствора метиленового синего, который окрашивает в синий цвет только кровоснабжаемую часть миокарда. Для определения некротизированных участков (зоны инфаркта), срезы левого желудочка сердца толщиной 2 мм окрашивали 1% ТТХ в течении 15 мин при температуре 37°С. ТТХ позволяет выявлять область инфаркта в зоне риска - живая ткань окрашивается в красный цвет, некротизировапные участки остаются неокрашенными. Срезы после окраски фиксировали в 10% формалине, сканировали с двух сторон и обрабатывали с помощью компьютерной планиметрии. Данные представляли в виде процентных соотношений общей площади зоны риска к общей площади левого желудочка сердца (ЗР/ЛЖ, %), а также площади зоны инфаркта к общей площади зоны риска (ЗИ/ЗР, %) (Valtchanova-Maîchouganska А., 2003; Zhang Y et all., 2004; Галагудза M.B., 2007). О наличие кардиопротекторных свойств у изучаемых соединений судили по способности уменьшать соотношение ЗИ/ЗР (Maslov L.N., 2012).

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программы «Microsoft Excel» для вычисления средних арифметических значепий и их стандартных ошибок и программы «Statistica for Windows 7.0». Для сравнения результатов внутри группы относительно исходного состояния применяли Мест Стьюдента для парных выборок или ANOVA-1 с последующим тестом Краскела-Уоллиса; оценку межгрупповых значений проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA-1 с применением теста Ньюмена-Кейлса, поправки Бонферрони либо Т-тестом. Различия между группами считали статистически достоверными при уровне значимости Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение кардиопротекторной активности новых синтетических аналогов энкефалмнов при профилактическом однократном и многократном введении на модели острого инфаркта миокарда у крыс CD

Исследование кардиопротекторной активности новых аналогов энкефалинов при однократном профилактическом введении перед острым инфарктом миокарда

Для выявления кардиопротекторных эффектов и исследования механизмов действия изучаемых соединений использовали модель острой окклюзии коронарной артерии у крыс CD. Литературные данные указывают на то, что опиоиды при введении до наступления ишемии могут снижать объем повреждения миокарда (Gross, 2003), поэтому изучаемые аналоги вводили однократно за пять мин до окклюзии ЛКА. Доза для введения была выбрана 1 мкг/кг. Крысы, получавшие морфин в дозе 300 мкг/кг (Gross E.R., 2004) составляли группу сравнения. Контролем служили животные, которым вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме за 5 мин до окклюзии.

Введение пептидов «ЕР91» и «ЕР94» за 5 мин до окклюзии ЛКА вызывало статистически значимое снижение зоны инфаркта (27,5±2,4% и 26,0±3,5%, соответственно) по сравнению с контрольной группой (42,9±2,7%). Морфин и пептиды «ЕР92», «ЕР93» и «ЕР95» не оказывали влияния на размер зоны инфаркта, процент отношения ЗИ к ЗР составлял 45,6±4,6; 43,6±3,4%; 43,1±3,5% и 48,2±4,9% соответственно (рис.1).

ЗИ/ЗР,%

60 -

Контроль морфин ЕР91 ЕР92 ЕРИ ЕР94 ЕР95

Рис.1. Влияние морфина и новых синтетических аналогов энкефалинов «ЕР91»-«ЕР95» на размер инфаркта миокарда у животных экспериментальных групп при однократном введении за 5 мин до окклюзии ЛКА

*-Р<0,05 относительно группы «контроль» по ANO VA-1 с последующим тестом Ньюмен-Кейлса

Значения гемодинамических параметров, регистрируемых в ходе эксперимента, представлены в таблице 2. В исходном состоянии среднее АД и ЧСС достоверно не отличались во всех экспериментальных группах. Внутривенная инъекция пептидов и морфина приводила к незначительному повышению АД у животных к моменту наступления ишемии, тогда как в контроле этот параметр не изменялся. Окклюзия ЛКА приводила к снижению давления у всех животных по сравнению с исходными показателями, ЧСС к моменту окончания окклюзии достоверно возросла в контрольной группе и группах, которым вводили пептиды «ЕР92» и «ЕР94». К концу реперфузионного периода в группах сохранялась гипотензия, за исключением группы, которым вводился пептид «ЕР94», тахикардия наблюдалась у всех экспериментальных животных.

Таблица 2.

Значения гемодинамических параметров у животных опытных групп

СрАД, мм.рт.ст ЧСС, уд/мии

ИСХОДНО перед окклю зией конец окхлю ЗИП конец репер фузии ИСХОДНО перед окклю зией конец окклю ЗИН конец репер фузии

контроль 84,3± 4,2 80,1± 3,8 64,5± 5,8* 48,0± 3,5* 291,8± 11,5 306,9± 8,9 364,9± 19,0* 401,5± 14,2*

морфии 83,8± 2,5 90,6± 6,1 56,5± 3,9* 56,3± 6,8* 319,9± 17,4 322,2± 11,4 338,6± 28,4 373,4± 15,9*

ЕР91 79,0± 2,5 85,0± 3,9 60,0± 2,4* 52,8± 6,8* 294,1± 16,8 292,0± 13,8 317,6± 13,0 368,6± 23,1*

ЕР92 77,3± 3,5 80,1± 6,0 58,6± 3,6* 53,3± 3,2* 296,Н 11,2 344Д± 17,4 415,3± 28,9* 441,5± 25,6*

ЕР93 83,5± 2,1 91,4± 3,8 69,б± 3,4* 60,1± 4,4* 326,1± 17,1 312,2± 10,9 379,3± 23,0 358,6± 12,5*

ЕР94 75,9± 5,3 88,3± 2,1 59,3± 4,1* 70,3± 3,5" 280,7± 6,3 304,5± 16,3 357,9± 14,2* 368,0± 10,0*

ЕР95 80,1± 4,4 85,5± 5,0 61,2± 3,3* 64,3± 5,9* 302,9 ±8,4 316,2± 9,8 344,4± 21,0 369,2± 11,5*

* - Р<0.05 относительно исходных значений по АЖ)УА-1 с последующим тестом Краскела-Уоллиса;

Ф - Р<0'.05 относительно группы «контроль» по критерию Краскела-Уоллиса с последующим тестом Манна Уитни

В условиях проведенного эксперимента была изучена зависимость между содержанием маркеров повреждения миокарда (КФК-МВ и лактата) в сыворотке крови и размером инфаркта миокарда у крыс контрольной и опытных групп. Определение КФК-МВ показало достоверное увеличение активности фермента к концу реперфузионного периода у животных всех групп (табл.3). Введение аналогов энкефалина или морфина не вызывало изменение содержания лактата в сыворотке крови опытных групп по окончании реперфузионного периода.

9

Таблица 3.

Содержание КФК-МВ и лактата в сыворотке крови экспериментальных животных до окклюзии ЛБА и к концу реперфузпи

Группа контроль морфин | EF91 ЕР92 ЕР93 ЕР94 «ЕР95»

Креатинкиназа MB (МЕ/л)

До окклюзии 9,8±2,0 10,8±2,9 13,б±1,7 9,0±2,4 12,5±2,1 13,7±2,1 12,1±2,9

К концу реперфузии 23,7±1,4* 22,б±1,9* 24,5±1,3* 21,9±1,5* 25,8±2,3* 22,8±1,8* 24,6±2,5*

Лактат (мМ/л)

До окклюзии 4,4±0,3 4,9±0,2 5,2±1,5 4,9±0,6 5,6±0,5 4,7±0Д 5,9±0,3

К концу реперфузии 5,3±0,9 5,2±0,5 7,7±0,4 5,8±0,3 6,8±0,7 6,2±0,5 7,4±0,9

*- Р<0.05 относительно исходного уровня согласно ^тесту Стьюдента для парных выборок;

Результаты экспериментов данной серии показали, что между изучаемыми биохимическими показателями и соотношением ЗИ/ЗР отсутствует корреляция. Морфин и все пептиды одинаково влияли на биохимические показатели, однако, только пептиды «ЕР91» и «ЕР94» статистически значимо уменьшали соотношение зоны инфаркта к зоне риска. Эти результаты вступают в противоречие с многочисленными данными литературы о достаточно тесной корреляции активности КФК-МВ и лактата и размером инфаркта (Gibbons R.J. et al., 2004; Кароог P. et al., 2011). В то же время имеются данные, что изоформа КФК-МВ не является кардиоспецифическим маркером и ее активность может повышаться при повреждении других тканей, в частности, скелетпой мышцы (Rajappa M.et all., 2005). В ходе моделирования инфаркта миокарда у животных происходит значительное повреждение скелетных мышц, что связано с обеспечением оперативного доступа (Галагудоа М.В., 2007). Возможно, именно этим объясняется отсутствие корреляции между размером инфаркта и сывороточной активностью КФК-МВ и лактата, обнаруженное в наших экспериментах.

В связи с этим в последующих сериях исследований биохимические параметры не изучались.

Также в дальнейших экспериментах не приводятся показатели гемодинамических параметров, так как не было выявлено каких-либо существенных изменений в величинах среднего АД и ЧСС у животных, получавших пептиды и морфин в сравнении с контрольной группой.

Изучение зависимости «доза-эффект» пептидов «ЕР91»и «ЕР94»

Для определения дозы, в которой пептиды «ЕР91» и «ЕР94» наиболее эффективно будут уменьшать размер зоны инфаркта, за 5 мин до окклюзии ЛКА однократно вводились исследуемые пептиды в дозах от 0,01 до 10 мкг/кг. Кривые зависимости соотношений ЗИ/ЗР от дозы вводимого соединения представлены на рис.2.

ЗИ/ЗР, % 10 О -10 -20 -30 -40 -50 -60

- ЕР91 [ЭДтах=2.7 мкг/кг] ЕР94 [ЭДтах=0.7 мкг/кг]

-2.0 -1.5

-1.0 -0.5 0.0 о(мкг/кг)

0.5 1.0

Рис.2. Кривые зависимости кардиопротекторного действия от дозы пептидов «ЕР91» и «ЕР94», введенных за 5 мин до окклюзии. По оси ординат - изменение (относительно контрольного значения, принятого за 100%) соотношения ЗИ/ЗР

Показано, что уменьшение размера зоны инфаркта у животных, которым вводили пептиды «ЕР91» и «ЕР94» являлось дозозависимым, предел эффективных доз составил 0,14-3,5 мкг/кг и 0,5-5 мкг/кг, соответственно. Для пептида «ЕР91» наибольшее кардионротекторное действие проявлялось в дозе 2,7 мкг/кг, у пептида «ЕР94» - в 0,7 мкг/кг.

Таким образом, проведенные эксперименты позволили выявить среди изучаемых синтетических аналогов энкефалинов два активных - «ЕР91» и «ЕР94», обладающих выраженным кардиопротекторным эффектом.

Если сравнивать структуру тетрапептидов и проявленный эффект, то наиболее активные пептиды («ЕР91» и «ЕР94») имеют самые короткие боковые цепи у П-аминокислоты. Возможно, что удлинение боковой цепи («ЕР92») или ее разветвление («ЕР93» и «ЕР95») приводит к уменьшению сродства к рецепторам и отсутствию исследуемого эффекта соответственно.

Исследование кардиопротекторной активности пептидов «ЕР91» и «ЕР94» при многократном профилактическом введении перед острым инфарктом миокарда

Далее нами была исследована кардиопротекторная активность пептидов «ЕР91» и «ЕР94» в сравнении с морфином до момента наступления ишемии миокарда при многократном введении. Для этого за 30 мин до окклюзии ЛКА крысы получали три 5-минутные инфузии морфина или пептидов, разделенных между собой 511

минутными перерывами. В группе «морфин» животные получали препарат в дозе 300 мг/кг (20 мкг/кг/мин) (Schultz J.E. et al, 1996), в группах «ЕР91» и «ЕР94» -пептиды в дозах 3 и 1 мкг/кг (0,2 мкг/кг/мин и 0,066 мкг/кг/мин) соответственно. Контролем служили животные, получавшие физиологический раствор в аналогичной схеме.

В результате было показано, что применение морфина и пептидов приводило к статистически достоверному снижению размера инфаркта до 33,3±2,7% ; 29,8±1,6% и 22,8 ±1,9% соответственно (Р <0,05 относительно контроля 43,3±3,1%) (рис.3).

ЗИ/ЗР, % 50 "

40 "

30 -

20 -

10 -

О -

Контроль морфин ЕР91 ЕР94

Рис. 3. Влияние морфина и новых синтетических аналогов энкефалинов «ЕР91» и «ЕР94 » на размер инфаркта миокарда экспериментальных животных при многократном введении до окклюзии JIKA

*-Р<0,05 относительно группы «контроль» по ANOVA-I с последующим тестом Ньюмен-Кейлса;

#-Р<0,05 относительно группы «морфин» по t-кригерию Стьюдента

Таким образом, полученные данные позволяют считать оптимальным для достижения максимального кардиопротекторного эффекта протокол, состоящий из однократного профилактического введения пептидов «ЕР91» и «ЕР94» (до наступления ишемии). Напротив, для ограничения размеров инфаркта морфином требуются многократные инфузионные введения. Кроме того, следует отметить, что защитный эффект морфина уступает аналогичному эффекту «ЕР 94», что свидетельствует о высокой кардиопротекторной активности изучаемого аналога.

Изучение терапевтических эффектов пептида «ЕР94» и «ЕР94»

Исследование кардиопротекторной активности пептидов «ЕР91» и «ЕРЦ4», введенных во время окклюзии JTKA

В следующей серии экспериментов были изучены терапевтические эффекты пептидов, которые вводили однократно в момент ишемии миокарда на окклюзии

ЛКА. Животные из группы сравнения получали морфин в дозе 300 мкг/кг, из групп «ЕР91» и «ЕР94» получали пептиды в дозах 3 и 1 мкг/кг соответственно.

Введение осуществляли через 5 мин после окклюзии ЛКА. Результаты данной серии экспериментов представлены на рис.4. Введение морфина и пептида «ЕР91» вызывало снижение зоны инфаркта по сравнению с контролем, однако, достоверные различия в размере инфаркта между группами отсутствовали. Введение пептида «ЕР94» было более эффективным и способствовало снижению размера инфаркта миокарда до 30,6±3,5% (Р <0,05 относительно контроля 42,9±2.7%).

ЗИ/ЗР, %

50

40

30 • 20 -10 0

Контроль морфин ЕР91 ЕР94

Рис. 4. Влияние ошюидных агонистов на размер инфаркта миокарда экспериментальных животных при их однократном введении на 5-ой мин окклюзии ЛКА

*-Р<0,05 относительно группы «контроль» по ANOVA с использованием поправки Бонферрони

Исследование кардиопротекторной активности пептидов «ЕР94» и «ЕР91», введенных в репеуфузионном периоде

В данной серии экспериментов были изучены кардиопротекторные эффекты пептидов «ЕР91» и «ЕР94» при их однократном введении во время реперфузии в О мин или через 5 мин после восстановления кровотока. Обнаружена тенденция к уменьшению объема поражения миокарда при введении пептидов на 0 мин реперфузии до 35,4±3,4% и 36,8±1,9% соответственно. Введение «ЕР91» и «ЕР94» на 5 мин реперфузии не влияло на размер инфаркта у животных опытных групп (43,8±5,1% и 42,6±1,7% относительно контроля 42,9±2,7) (рис.5).

Полученные результаты показали неэффективность применения энкефалиновых аналогов «ЕР91» и «ЕР94» в раннем реперфузионном периоде.

Однако существует ряд публикаций, который свидетельствует о том, что опиоидные агонисты могут предупреждать реперфузионную гибель кардиомиоцитов, когда ишемическое повреждение сердца уже произошло (Маслов Л.Н. и др., 2012). Так, в работе Gross Е. и соавт (2004) была показана эффективность морфина и BW373U86B, введенных непосредственно до наступления реперфузии. Обнаружено,

что опиоиды защищали миокард от дальнейших повреждений уменьшением образования свободных радикалов, накопление которых при вознобновлении кровотока приводило к интенсивному повреждению структур и ферментов миокарда (Jang Y. et al., 2008).

ЗИ/ЗР, % 60 50 40 -30 -20 -10 0

ЗИ/ЗР, % 60 -50 -40 -30 -20 10 0

В

Контроль 0 мин 5 мин

Контроль 0 мин 5 мин

Рис.5. Влияние пептидов «ЕР91» (А) и «ЕР94» (В) на размер инфаркта миокарда экспериментальных животных при их введении в репсрфузионном периоде (0 или 5 мин) в дозах 3 и 1 мкг/кг соответственно

Таким образом, опиоиды эффективно уменьшают размер инфаркта, когда вводятся до наступления реперфузии. Эти данные подтверждают, что только своевременное введение опиоидных агонистов может предотвращать последствия ишемического/реперфузионного повреждения.

По результатам выполненных экспериментов пептид «ЕР94» являлся наиболее активным соединением и был выбран нами для дальнейшего изучения.

Влияние увеличения продолжительности кардиопротекторную активность пептида «ЕР94»

окклюзии

ЛКА

Традиционно карднонротекгорный эффект в экспериментальных исследованиях оценивается при определенной стандартной продолжительности ишемии миокарда. В большинстве работ по моделированию острого инфаркта предлагается оптимальное время для окклюзии ЛКА - 25-30 мин (Riess L.M. et all., 2004; Галагудза М.В., 2007). В то же время большой практический интерес представляет исследование кардиопротекторной эффективности пептида в зависимости от длительности тестовой ишемии. С этой целью нами были выполнены эксперименты, в которых время окклюзии ЛКА было увеличено до 40 мин. Кардиопротекторные эффекты «ЕР94» оценивали при однократном введении за 5 мин до наступлении ишемии и при многократном введении пептида (каждые 5 мин) в

течении всей окклюзии. Доза пептида при профилактическом введении до окклюзии составляла 1 мкг/кг, при введении на окклюзии - 0,5 мкг/кг.

У животных контрольной группы при увеличении продолжительности ишемии миокарда с 25 мин до 40 мин наблюдалось достоверное увеличение зоны инфаркта с 42,9 ±2,7% до 55,2±2,5%. Пептид «ЕР94» проявлял кардиопротекторную активность как при 25-минутной окклюзии, так и при 40-минутной окклюзии ЛКА только в случае многократных введениях пептида в период острой ишемии миокарда. Применение пептида профилактически оказалось эффективным только в случае 25-минутной окклюзии ЛКА (табл. 4).

Таблица 4.

Кардиопротекгорпые эффекты пептида «ЕР94» при различной продолжительности окклюзии ЛКА

Группы Окклюзия 25 минут (ЗИ/ЗР,%) Окклюзия 40 минут (311/31",%)

Контроль 42,9 ±2,7 55,2±1,8*

«ЕР94»-введе11ие за 5 минут до окклюзии 26,0±3,5* 55,2±2,6

«ЕР94»-многократ11ые введения на окклюзии 28,3 ±0,7* 34,8±1,5*

* - Р<0,05 относительно соответствующей контрольной группы

# - Р<0,05 относительно группы « контроль» с 25- минутной окклюзией ЛКА

Таким образом, увеличение продолжительности ишемии миокарда до 40 мин приводило к полной нейтрализации кардиопротекторного эффекта пептида «ЕР94» введенного однократно в профилактических целях. Однако защитный эффект пептида сохранялся при многократных введения на протяжении всей окклюзии. Введепие пептида в период острой ишемии уменьшает зону поражения миокарда, способствуя увеличению времени для проведения адекватной реперфузионной терапии у пациентов с острым инфарктом миокарда. Полученные данные необходимо учитывать в дальнейших исследованиях пептида при оценке его эффективности и подбирать адекватную схему введения с учетом предполагаемой длительности окклюзии ЛКА.

Изучение механизмов действия кардиопротекторной активности пептида«ЕР94»

Исследование участия опиоидных реиепторов в реализации кардиопротекторной активности пептида «ЕР94»

В следующих экспериментах было изучено кардиопротекторпое действие энкефалинового аналога «ЕР94» на фоне блокады опиоидных рецепторов (ОР). В первой серии исследования животным перед окклюзией ЛКА за 10 мин до введения

пептида «ЕР94» в дозе 1 мкг/кг вводили неселективный антагонист палоксон (Nal) в дозе 3 мг/кг. Также оценивали влияние самого блокатора на размер инфаркта, который вводили за 10 мин до окклюзии JIKA.

Показано, что инъекция антагониста опиоидных рецепторов налоксона полностью устраняет протекторное влияние пептида «ЕР94» (ЗИ/ЗР 37,5±1,8% относительно контроля 42,9±2,7%) (рис.6). Введение антагониста без пептида не изменяло размер соотношения ЗИ к ЗР относительно контроля (38,5±2,1%). Таким образом, можно заключить, что действие энкефалинового аналога «ЕР94» может осуществляется через опиоидные рецепторы.

ЗИ/ЗР,%

Контроль ЕР94 NaI+EP94

Рис. 6. Влияние неселективного агониста опиоидных рецепторов налоксона (Nal) на кардиопротекторный эффект пептида «ЕР94»

*- Р<0,05 относительно группы «контроль» по ANOVA с использованием поправки Бонферрони

Далее оценивалась роль конкретных типов опиоидных рецепторов в формировании кардиопротекторного эффекта пептида «ЕР94». Для этого проводились эксперименты по селективному фармакологическому блокированию ¡i-, 6- и к- опиоидных рецепторов. Блокаторы вводили за 15 мин до введения пептида, за 5 мин до окклюзии JUCA вводили «ЕР94» (доза 1 мкг/кг). Также изучали влияние антагонистов на размер зоны инфаркта при введении их до окклюзии ЛКА без предварительного введения пептида. Растворы антагонистов готовили на физиологическом растворе и вводили в объеме 10 мл/кг веса животного однократной инъекцией. Дозы и время введения блокаторов были выбраны на основании данных литературы как оптимальные для оказания ингибирующего действия (Zhang J. et al., 2004; Zatta A. J. et al., 2008).

Показано, что введение налтриндола (NTD) - селективного 8-антагониста опиоидных рецепторов; СТОР - селективного р-антагониста опиоидных рецепторов и нор-биналторфимина (nor-BNI) - селективного k-антагониста за 15 минут до введения «ЕР94» перед окклюзией JIKA блокировали кардиопротекторпый эффект пептида (ЗИ/ЗР составила 45,1±3,1%; 37,0±3,9%; 37,4±2,4% соответственно; Р <0,05

16

относительно группы с введением пептида) (рис.7). При этом не было значимой разницы величин ЗИ/ЗР при введении блокаторов за 15 мин до окклюзии без предварительного введения «ЕР94» (для N10 ЗИ/ЗР составила 38,6±3,2%; для пог-ВМ-40,6±3,0%; для СТОР-34,3±2,3%).

Контроль ЕР94 N10 СТОР ВМ +ЕР94 + ЕР94 +ЕР94

Рис.7. Влияние 6-ОН антагониста налтриндола (N10), ц-ОЛ антагониста (СТОР) и кОК антагониста Нор-биналторфимина (BNI) на кардиопротекгорныи эффект пептида

* - Р<0,05 относительно группы « контроль» по AN0VA-1 с последующим Даннет-тестом

Известно, что опиоидные рецепторы, участвующие в регуляции сердечнососудистой системы, локализованы как в ЦТ 1С, так и на периферии (Goodman D. et al.,1980). На сарколемме кардиомиоцитов обнаружены 8- и k-опиоидные рецепторы, следовательно, есть основание предполагать, что эти типы рецепторов принимают участие в кардиопротекторном эффекте пептида. Поскольку вопрос о наличие кардиальпых р-рецепторов остается дискуссионным (Krumius S.A. et al., 1985; Wittert G. at al.,1996 ), и пептид способен проникать через гематоэнцефалический барьер, то его действие может быть опосредовано по меньшей мере через р-ОР, локализованные в ЦНС (Gross G. et al., 2012).

Таким образом, в наших экспериментах было показано, что для осуществления кардиопротекторного эффекта энкефалинового аналога «ЕР94» необходимо наличие интактных опиоидных рецепторов (6-, д- и к-), выключение какого-либо типа рецептора приводит к отмене действия пептида.

Исследование участия NO в реализации кардиопротекторной активности пептида

В следующей серии экспериментов изучали роль системы NO в реализации кардиопротекторной активности «ЕР94». Для этого на фоне предварительного введения (за 20 минут до окклюзии) неселективного ингибитора NO-синтаз (NOS) L-NAME в дозе 10 мг/кг за 5 минут до окклюзии ЛКА вводили исследуемый пептид «ЕР94» в дозе 1 мкг/кг. Также оценивали влияние самого ингибитора на размер зоны

ЗИ/ЗР,%

«ЕР94»

«ЕР94»

инфаркта. Ь-ЫАМЕ растворяли в физиологическом растворе и вводили в объеме 10 мл/кг веса животного однократной инъекцией.

Обнаружено, что на фоне блокады синтеза N0 с помощью Ь^АМЕ кардиопротекторный эффект «ЕР94» отменяется. Отношение ЗИУЗР составила 40,0±6,7% в группе «Е-ИАМЕ+ «ЕР94»» против контроля 42,9±2,7% (рис.8).

ЗИ/ЗР,%

т т

* Ш 'Ifffe- 1Я

ш

Контроль ЕР94 L-NAME + ЕР94

Рис.8. Влияние L-NAME на кардиопротекторный эффект «ЕР94»

*- Р<0,05 относительно группы «контроль» по ANOVA-1 с последующим тестом Ньюмен-Кейлса

Показано, что NO является медиатором, повышающим устойчивость кардиомиоцитов к ишемическому повреждению, участвует в реализации феномена ишемического прекондиционирования, тем самым обеспечивая повышение толерантности миокарда (Nakano Н. et all., 2007). NO активирует гуанилат-циклазу, увеличивая синтез цГМФ (Lowenstein С. J. et al., 1992). Есть данные о том, что опиаты могут усиливать продукцию N0 эндотелием (Stefano G. В. et al., 1998; 2002). В экспериментах на изолированном сердце было обнаружено, что кардиопротекторный эффект морфина не выявляется в условиях блокады NO-синтазы L-NAME (Jang У. et all., 2008).

Таким образом, предварительное введения неселективного ингибитора NO-синтаз L-NAME на фоне введение пептида полностью устраняло кардиопротекторное действие энкефалинового аналога. Это указывает на участие эндогенного NO в реализации кардиопротекторного действия « ЕР94».

выводы

1. Кардиопротекторная активность обнаружена у двух аналогов энкефалинов «ЕР91» и «ЕР94» как при однократном, так и при многократном профилактическом введении, тогда как морфин показал эффективность лишь при многократном применении до наступления острого инфаркта миокарда у крыс СО. Уменьшение размера инфаркта является дозозависимым, наибольший эффект пептидов «ЕР91» и «ЕР94» проявляется в дозах 2,7 и 0,7 мкг/кг соответствешю.

2. Терапевтический кардиопротекторный эффект пептида «ЕР94» проявляется только в случае его применения в период острой ишемии миокарда, использование пептида во время реперфузии оказывается неэффективным.

3. При увеличении продолжительности окктозии коронарной артерии с 25-и до 40 мин превентивный кардиопротекторный эффект «ЕР94» отменяется, однако при многократных инъекциях в период острой ишемии защитный эффект пептида сохраняется.

4. Кардиопротекторный эффект энкефалинового апалога «ЕР94» реализуется через опиоидную систему. Для осуществления протекции необходимо наличие интактности всех трех (р-, 5- и к-) типов опиоидпых рецепторов.

5. Блокада синтеза эндогенного N0 ингибирует кардиопротекторное действие пептида «ЕР94».

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Положительные экспериментальные результаты при введении новых синтетических аналогов энкефалинов тетрапептидной структуры на модели острого инфаркта миокарда у крыс СБ являются основанием для дальнейших доклинических исследований данного класса соединений. Поскольку наибольшей активностью обладали пептиды с короткой боковой цепью второй аминокислоты, целесообразно изучать аналоги с модификацией второй аминокислоты пептида. Необходимо исследовать влияние таких фармакологических агентов на насосную функцию миокарда и электрическую стабильность сердца, а также оценить безвредность и установить возможные побочные эффекты.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шайхутдинова Э.Р. Влияние анестетиков на размер инфаркта миокарда при ишемическом и фармакологическом прекондиционирования у крыс CD // Четвертая Всероссийская школа-конференция по физиологии кровообращения: тезисы докладов. Москва, 2008,- С.103-104.

2. Хохлова О.Н., Шайхутдинова Э.Р., Мурашев А.Н., Крапф Г. Новые опиоидные пептидные агонисты с анальгетической и кардиопротективной активностью // Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова; сборник тезисов. Москва-Пущино, 2009.-С.387.

3. Шайхутдинова Э.Р., Хохлова О.Н., Берчатова A.A., Мурашев А.Н. Защитные эффекты морфина при остром инфаркте миокарда у крыс CD // 14-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века»: сборник тезисов. Пущино, 2010,- С.192.

4. Шайхутдинова Э.Р., Мурашев А.Н. Влияние анестетиков на выраженность инфаркг-лимитирующего эффекта // Третий Всероссийский конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010»: сборник тезисов. Нижний Новгород, 2010,- С.158.

5. Шайхутдинова Э.Р., Хохлова О.Н., Мурашев А.Н. Защитный эффект фармакологического прекондионирования морфином на модели острого инфаркта миокарда у крыс CD // Международная научно-практическая конференция «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине»: сборник трудов. Санкт-Петербург, 2010 Г.-С.372-379.

6. Шайхутдинова Э.Р., Слащева Г.А., Хохлова О.Н., Берчатова A.A., Мурашев А.Н. Синтез и биологическая активность новых синтетических аналогов зпкефалинов // ХХШ Международная зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии»: сборник тезисов. Москва, 2011 Г.-С.61

7. Шайхутдинова Э.Р. Кардиопротективное действие морфина на модели острого инфаркта миокарда у крыс CD // Третий Всероссийский конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2011»: сборник тезисов. Воронеж, 2001.- С.80

8. Мурашев А.Н., Шайхутдинова Э.Р., Боброва И.А., Хохлова О.Н., Слащева ГЛ., Берчатова A.A., Крапф Г., Биссессар Э. Кардиопротективные эффекты синтетических аналогов энкефалинов // V Российский симпозиум «Белки и пептиды»: сборник тезисов. Петрозаводск, 2011.-С. 101

9. Мурашев А.Н., Шайхутдинова Э.Р., .Хохлова О.Н. Опиоидная система и устойчивость сердца к ишемическим повреждениям // Пятая Всероссийская школа-конференция по физиологии кровообращения: тезисы докладов. Москва, 2012.-С.111-112.

10. Шайхутдинова Э.Р., Боброва И.В., Хохлова О.Н., Слащева Г.А., Мурашев А.Н. Фармакологические подходы к повышению устойчивости миокарда на модели острого инфаркта у крыс СБ // Биомедицина.- 2012.- №1.-С. 102-106.

11. Шайхутдинова Э.Р., О.Н. Хохлова О.Н., Мурашев А.Н. Использование экспериментальной модели острого инфаркта миокарда для изучения кардиопротективных свойств препаратов // Вестник ВолГМУ: приложение (Материалы IV Всероссийского научно-практического семинара молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств») - Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2012. —С.180-182.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АД — артериальное давление

ИПК - ишемическое прекондиционирование

КФК-МВ - MB изоформа креатинфосфокиназы

JIKA — левая коронарная артерия

ОИМ — острый инфаркт миокарда

ОП - опиоидные пептиды

ОР - опиоидные рецепторы

ЧСС — частота сердечных сокращений

ФПК — фармакологическое прекондиционирование

NO - оксид азота

NOS - NO-синтаза

Подписано в печать:

31.07.2013

Заказ № 8639 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru