Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Участие лигандов опиоидных рецепторов в регуляции клеточного деления в эпителиальных тканях организма

п ь ид

I о ОНТ Ш

На правахр кописи

610 - 0У 8.15: 615,217.2: 615. 36

Р.АДИВОЗ Михаил Иванович

УЧАСТИЕ ЛИГАНДОВ ОПИОИДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В РЕГУЛЯЦИЙ КЛЕТОЧНОГО ДЕЛЕНИЯ В ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ТКАНЯХ ОРГАНИЗМА

14.00.23 - гиы ология, цитология, эмбриология

Ав тореферат Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Владивосток - 199^ г.

Работа выполнена в ЦНИИ Дальневосточного государственного медицинского университета.

Научный консультант:

д.м.н., профессор С.С.Тимошин

Официальные оппоненты:

д.м.н., профессор С.Г.Мамонтов д.м.н., профессор О.И.Кириллов д.м.н., профессор Б.Я.Рыжавский

Ведущая организация:

Институт морфологии человека РАМН г.Москва

Защита состоится «2Ь> 1999 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д.084.2//.01 при Владивостокском государственном медицинском университете по адресу: 690600, г.Владивосток, пр. Острякова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета. (690600, г.Владивосток, пр. Острякова, 2).

Автореферат разослан « 2(» 999 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических наук Г.М.Холоденко

г . о

Актуальность проблемы. Традиционные представления о участии интегративных - нейро-эндокрипной, иммунном систем организма п регуляции процессов клеточного деления в настоящее время существенно пересматриваются благодаря всестороннему изучению роли регуляторпых пептидов в различных биологических процессах организма. Эндогенные оннондные пептиды представляют наиболее обширное семейство из класса регуляторпых пептидов. На базе опиоидов в последние годы создаются фармакологические препараты с широким спектром биологических эффектов, которые все более успешно используются в терапии различных по своему патогенезу заболеваний - п кардиологии, гастроэнтерологии, дерматологии офтальмологии и клинике нервных болезней. Исследования, посвященные изучению влияния опиоидов па процессы клеточного деления в организме единичны и носят противоречивый характер. Они выполнены в основном с использованием опиоидов семейства - энкефалнпов преимущественно па культурах клеток I. Zagon (1987), а при исследованиях in vivo па костном мозге Е.Г.Гольдберг (1987), и некоторых пидач эпителия С.С.Тимошип (1997). '.Эпителии наиболее широко представлены в организме, защищают его внутреннюю среду от воздействия разнообразных агрессивных факторов. Изменения процессов клеточного деления эпителия под их влиянием могут приобретать стойкий характер, приводя к развитию болезней пролиферации, коррекция и традиционая терапия которых часто неэффективна Изучение влияния агоиистов субпопуляций ониондных рецепторов па процессы' ■ клеточного деления эпителия должно существенно расширить представления о механизмах регуляции тканевого гомсостаза этих тканей организма в физиологических условиях и при патологических процессах.

Целью работы является выявление закономерностей влияния представителей-основных огшоидных семейств: энкефалнпов, эндорфнпов, дпнорфипа и дерморфииов на процессы клеточного деления различных видов эпителия белых крыс в физиологических условиях и при воздействии различной природы стрессов.

3 а :д а ч и и с следования:

Л, Оценить влияние синтетических аналогов: эпдорфппа. дпнорфипа и терморфина, агоиистов: [i-, 6- и к- опиоидпых рецепторов, на процессы клеточного аелепия эпителиальных тканей белых крыс в физиологических условиях при энутрибрюшинном введении.

2. Осуществить сравнительную оценку влияние аналогов эпкефалнпа и 1срморфина на процессы пролиферации эпителиальных тканей при ппуфибрюпишпом t интраназальном введении .

3. Оценить влияние Ц- и 8-агопистов при ннутрибрюпшипом введении на 1роцессы клеточного деления эпителиев при воздействии стрсссорных фак торов.

4. Изучить некоторые механизмы влияния аналогов эпкефалина. эпдорфипа, шнорфина и дерморфииа на процессы клеточного делении и эпителиальных тканях >елых крыс.

I! а у ч н а я н о в и з и а :

1. Впервые установлено, что агонисты 6- опиоидных рецепторов вызывают стимуляцию пролиферативных процессов в экто- и энтодермальных эпителиях роговицы, языка, фупдапьного отдела желудка белых крыс.

2. Впервые установлено, что агонисты ц- опиоидных рецепторов стимулируют процессы клеточного деления в эпителиях энтодермальных и угнетают -в эпителиях эктодермалыюго происхождения.

3. Впервые показано, что в эктодермальном эпителии роговицы смешанные ц /8 агонисты семейства энкефалина и дерморфина воспроизводят влияние на процессы клеточного деления и при интраназальпом введении.

4. Впервые показано цитоиротектионое влияние даларгина и дерморфина, в экто- и энтодермальных эпителиях организма при воздействии общего 7-облучения.

5. На основании собственных исследований и сведений литературы установлена взаимосвязь между сродством опиоидных пептидов к ц- и 5- рецепторам и характером реакции процессов клеточного деления в эпителиальных тканях.

О с н о аные положения ди с сертаци и, выносимые на з а иI и ш у :

1. Агонисты 5- опиоидных рецепторов стимулируют процессы клеточного деления в экто - и энтодермальных эпителиях.

2. Агонисты (Л- опиоидных рецепторов стимулирую процессы пролиферации в энтодермальных, и угнетают в эктодермальных эпителиях.

3. Характер реакции пролиферативных процессов на введение опиоидных пептидов зависит гистогенеза эпителия и от преобладающего сродства к конкретными субпопуляциями опиоидных рецепторов.

4. Аналоги энкефалина и дерморфина оказывают гистопротективное влияния в эпителиальных тканях при воздействии общего 7- облучения и частично общей гипертермии.

Апробация работы и внедрение результатов. Основные положения диссертации представлены на У-Всесоюзном съезде патофизиологов СССР (Кишинев, ¡989), на I! и Ш Съездах физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск,1995.1097), на региональной научной конфреншш «Проблемы фармакологии и фармации на Дальнем Востоке» (Хабаровск, 1997), на межрегиональной научно-практической конференции «Физическая культура, спорт и здоровье населения Дальнего Востока» (Хабаровск, 1997), на международном конгрессе «Человек в мире спорта» (Москва, 1998).

Публикации результатов работы. Основные положения работы отражены в 10 статьях и тезисах и 17 тезисах докладов.

С т р V к «IV р а и объем работы. Диссертация состоит из введения .обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, 12 выводов, лршюжения.содержащего перечень сокращений, таблицы, рисунки, микрофотографии и библиографический указатель .Объем диссертации составляет 272 страницы машинописного текста. Иллюстративный материал представлен 18 рисунками. 16 микрофотографиями, 21 таблицей. Библиографический указатель включает 755 источников из них 433 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1.1. Характеристика используемым опиоидных пепшнОои

1. Из семейства э н к е ф а л и « о в были изитм:

а) селективный агонист ц-опиоидных рецепторов ДАГО - с аминокислотной

последовательностью:

Туг - D-Ala- Gly - Phe - ОН,

б) селективный агонист 5-опоидных рецепторов ДАДЛ - с аминокислотном

последо вател ы юстыо:

D-Ala - Gly - Phe - D-Ley,

в) высокоселективный агонист 5-ониоидных рецепторон ДЛСЛ1ГГ - с аминокислотной

последовательностью:

Туг - D-Ser - Gly - Phe - Ley - Tic ,

г) преимущественный агонист 5-опиоидных рецепторов даларпш со структурной

формулой: Туг - D-Ala - Gly - Ley - Arg .

2. Из семейства э н д о р ф и н о п в опытах использовались:

а) агонист с одинаково выраженной р- и 5-опиоидной селективностью - [З-ждорфин со

структурной формулой:

Туг - Gly - Gly - Phe - Met - Tre - Ser - Glu - Lys - Lys - .Ser -- Gly - Tre - Pro - Ley - Val - Tre - Ley - Plio - Lys - Asp - Ala -- Ile - Val - Lys - Asn - Ala - Gys - Lys - Gly - Gly - COOlt;

б) агонист к-опиоидных рецепторов у-эндорфин с аминокислотной последовательностью:

Туг - Gly - Gly - Phe - Met - Tre - Ser - Glu - Lys -- Lys - Ser - Gly - Tre - Pro - Ley - Val - Ti c.

3. Из опиоидных пептидов семейства д е р м о р ф и и о в i¡ опытах использовались группа лигандов, получивших в лаборатории синтеза неитплои ВКПЦ РАМН условное обозначение «А»:

а) селективный агонист ц-опиоидных рецепторов природный дерморфпп

«А-1», имеющий аминокислотную последовательность:

Туг - Ala - Phe - Gly - Туг - Pro - Ser - NI Ь ;

б) смешанный (i/8-агонист опиоидных рецепторов пептид - «се.иини» с

аминокислотной последопательпстыо:

Н- Arg - Туг - D-Ala - Phe - Gly - ОН;

в) высокоселективный агонист ц- опиоидных ренет орон пептид «А-43» со структурной формулой:

H-Arg - Туг - D-Arg - Phe - D-Ala - NH2.

4. Из семейства д и пор ф и н а было избран преимущественный агонисг к-опиоидных рецепторов дипорфин-1-13 с последовательностью аминокислот:

Туг - Gly - G!y - Phe - Ley - Arg - Arg - lie -- Arg - Pro - Lys - Ley - Lys - ОН.

Вещества, использованные в экспериментах, изготовлены в лаборатории синтеза пептидов РАМН (г. Москва) и любезно предоставлены нам проф. М.И. Титовым, проф. Ж.Д. Беспаловой и канд. мед. наук Е.П. Яровой, за что мы приносим им благодарность и выражаем искреннюю признательность.

1.2. Характеристика объектов исследования

Обьектами исследования служили различные типы покровного эпителия белых крыс. Эпителии относятся к непрерывно обновляющимся клеточным популяциям которые отличаются высокой пролиферативной активностью и устойчивым балансом процессов образования и естественной гибели клеток (С. Leblond, 1964). Многообразные межклеточные контакты, являющиеся универсальными интегратишшми механизмами (В.П. Михайлов, Г.С. Кагинас,1984), обеспечивают формирование из эпителиоцитов структурно и метаболически единого барьерно-тканевого покрова (A.A. Заварзии, 1976), который обуславливает защиту подэгжтелнальпых тканей от внешиич воздействий (А.Г. Маленков, Г.А. Чуич, 1979). Объектами исследования были избраны эпителиальные ткани роговицы, языка, желудка и 12-перстной кишки. Многослойный плоский неороговевающий передний эпителий роговицы имеет эктодермальное происхождение и отражает наиболее общие закономерности процессов клеточного деления (JI.Д. Лиознер, 1966). Эффективная трофика роговицы при отсутствии ее прямого кровоснабжения осуществляется за счет диффузии необходимых метаболитов (К.А. Захваткина, 1972) и аксоиального транспорта через нервные окончания (Н.Г. Слюсарь, A.A. Кудрин, 1975). Характерная для физиологических процессов в организме суточная периодичность (С.И. Степанова, 1986) проявляется в клеточной пролиферации эпителия роговицы одновершинной кривой с максимальным количеством митозов в 8-12 ч и минимальным количеством на 18-22-часово.м сроке (В.II. Доброхотов, А.Г. Курдюмова, 1961).

Пролиферативпый пул представлен слоем базальпых клеток (Л.Д. Лиознер, 1966), продолжительность их митотического цикла достигает 72 ч: Gi-период составляет около 60 ч, S-период - 7,5-8,5 ч, Gi-период - 4 ч, а сам митоз продолжается 45-60 мин. (О.И. Епифанова, 1972; С.С. Тимошин, 1982). Второй тканевой системой был избран многослойный плоский частично ороговевающий эпителий языка, который имеет эктодермальный гистогенез (А. Хэм, Д. Кармак, 1983). В пищеварительного тракта организма, испытывая многообразные механические нагрузки, он подвергается интенсивному обновлению (Л.Д. Лиознер, 1966). Продолжительность клеточного цикла базальных клеток достигает 24 ч. Суточная периодичность митозов в эпителии языка имеет одновершинный характер (Г.С. Мамонтов, 1977), с максимальным числом митозов в 22-6 ч и минимальным - и 18-22 ч. Полное обновление эпителия происходит за 3.8 сут.

Третьей тканевой тестовой системы был взят покровный эпителий слизистой оболочки фундальной части желудка.

Суточная периодичность митозов в эпителии желудка имеет двухвершинный характер с максимальным числом митозов в 10 и 19 ч и обновляется каждые 3 еут. за счет пролиферации клеток перешейка желудочных желез (В.М. Успенский. 1986).

Эпителий 12-перстной кишки энтодермалыюго гистогенеза обеспечивает выполнение диаметрально противоположных функций - переваривания и всасывания. Суточная периодичность митозов эпителия топкой кишки имеет одновершинный характер с максимальным количеством митозов в 22 ч и наименьшим - в 6-10 ч (Д.10. Цибульский, E.H. Орлова, 1975). Обновление клеток на отрезке «дно крипты -вершина ворсинки» происходит за 3 сут. (Л. Хэм, Д. Кармак, 1983). Изучаемые эпителии имеют различную степень функциональной специализации и барьерной функции (Л.Л. Заварзин; 1975).

1.3. Методика проведения экспериментов

Опыты проводили на нелинейных белых крысах-самцах массой 160-220 г. Экспериментальные группы включали 8-10 животных. Крыс содержали при 18-22°С в естественном световом режиме и свободном доступе к поде и пиши, приучая к рукам экспериментатора . В работе использовано 1237 животных.

Регуляторные пептиды использовали в дозах 10 и 100 мкг/кг (П.Г. Смапш и соавт, 1983). Пептиды вводили внутрибрюиппшо - (в/о). Контрольные животные группы получали эквиобъемное количество изотопического раствора хлорида натрия (0,1 мл/100 г массы). Интраиазально - (и/п) пептиды вводили в оба носовых хода микродозатором. Контрольные крысы получали эквиобъемное количество изотонического раствора хлорида натрия (0,05 мл/100 г массы) л каждый носовой ход.

Для исследования ИМЯ в роговице на нее аинлицировали 0,2 мБк 3Н-тимидина с интервалом 20 мин. за 1 ч до эвтаназии крыс. Для определения ИМЯ в остальных изучаемых эпитслиях животным также за 1 ч до эвтаназии внутрибрюшинно вводили 31Г-тимидин в дозе 100 мкКи/IOO г массы тела.

Эвтаназию осуществляли методом декапитации предварительно оглушенных животных. Возможные изменения скорости митоза под влиянием пептидов оценивалили в опытах с колхицином. Колхицин вводили крысам в дозе 0.2 мг/100 г за 2 часа до эвтаназии. Учитывая отсутствие прямого кровоснабжения роговицы, па нее дополнительно апплицировали 0,2 мл. 0,01 % раствора колхицина.

1.4. Экспериментальные модели стрессорпых аоздайстаий

Для оценки характера влияния опиоидиых пептидов па процессов клеточного деления при воздействии стрессоров (С.С. Тимошин, 1982) использовали две моделях экстремальных воздействий.

1. Пятикратное 2-часовое общее перегреваппе при 43°С. Общая гипертермия рассматривается как тяжелый, слабо компенсируемый окислительный стресс способный индуцировать в тканях 3-кратное увеличение уровня аберрантных митозов (М.И. Радивоз, С.С. Тимошин, 1988).

2. Пятикратное общее g-облучепие в суммарной дозе 5 Гр. которое обуславливает блокаду процессов клеточного деления и вызывает повышение в тканях содержания аберрантных митозов (Е. Weller et а!., 1996). Характерной особенностью воздействия этих экстремальных факторов на организм является активация в тканях процессов ПОЛ (В.Л. Барабой и соавт., 1992) и резкое увеличение содержания

аберрантных митозов (С .С. Тимошин, 1983; М.И. Радивоз и соавт., 1997). Экстремальные воздействия осуществляли следующим образом:

1. Перегревание крыс осуществляли ежеденевно с 10 до 12 ч в водяном термошкафе ВДШ-3 с емкостью камеры 0,3 м3 при 43°С и периодическом вентилировании. Для исключения ожога лапок животных дно термоизолировали. Относительную влажность воздуха в камере контролировали психрометром Августа и поддерживали в интервале 60-65% за счет поддува теплого воздуха. Термометрию тела животных осушествляли через каждые 20 минут ректальным датчиком электротермометра ТПЭМ-1 на глубине 2 см. от анального отверстия. Через 30 мин. после помещения в термостат температура тела у крыс возрастала до 41,0±0,5°С и сохранялась в л ом интервале на протяжении последующих 90 минут их перегревания. Избранный режим гипертермии соответствует тяжелым тепловым воздействиям (В.Д Линденбратен, 1967). о чем свидетельствует гибель 10-15% животных в первые 24 ч после их перегревания Пептид вводили в/б перед перегреванием. Контрольные крысы получали эквиобъемное количество изотонического раствора хлорида натрия. Экспериментальное воздействие повторяли однократно или пять дней подряд по 2 ч. Эвтаназию осуществляли через 4, 12 и 24 ч после заключительного воздействия.

2. Общее ?-облучение животных осушествляли по трое в контейнерах на установке «АГАТ-С», оснащенной источником излучения Со60, при мощности излучения 0,75 Гр/мин. Облучение проводили один раз в сутки дозой 1 Гр, ежедневно в течение 5 дней. Контрольных крыс помещали в контейнеры, но не облучению. Облучения проводились в 10-12 часов дня. Пептиды экспериментальным животным вводили в/б перед облучением. Контрольные получали эквиобъемное количество изотопического раствора хлорида натрия.

1.5. Приготовление гистологических препаратов а их исследование

После эвтаназии у животных выделяли оба глазных яблока, язык, фрагменты фуидального отдела желудка и 12-перстной кишки, которые фиксировали в течении 1 ч в охлажденной смеси 96% этанола и ледяной уксусной кислоты (3:1). Правую роговицу, фрагменты языка, фуидального отдела желудка и 12-перстной кишки после фиксации проводили по батарее спиртов восходящей крепости и заливали в парафин. Серийные срезы толщиной 6-7 мкм готовили на санном микротоме МС-2. Окраску депа рафинированных срезов производили гематоксилином Лилли-Майера и эозином.

Митотичеекий индекс - (МИ) отношение числа делящихся клеток к общему их количеству в эпителии роговицы и языка у животных выражали в промилле (%с) после просмотра 10-15 тыс. клеток. Митозы считали по фазам. Митотичеекий колхициновый индекс (МИК) определяли аналогично и выражали в промилле (%о). Оценку содержания патологических митозов (ПМ), адекватно отражающих тяжесть стрессорных повреждений пролиферирующих тканей (С.С. Тимошин, 1982), осуществляли в тотальных препаратах роговицы.

Фигуры аберрантных митозов определяли согласно классификации И.А. Алова. (1972). Уровень ПМ выражали в процентах от общего числа делящихся клеток.

1.6. Метод гисторадиоаапюграфин

Радиоавтографов готовили на серийных срезах исследуемых органон и тканей ia стекле, депарафинировали и покрывали фотоэмульсией ПИХИМФОТО. 'Змульсию ipn 40°С разводили дистиллированной водой в соотношении 1:1 и паноснлп па ipenараты (О.И. Епифанова, 1969). Готовые препараты экснопиропали 4 нед. при -4°С. Радиоавтографы обрабатывали проявителем Д-19, фиксировали н 33% растворе ипосульфита натрия, промывали и окрашивали гематокиелипом Лидлп-Майера. 1ндекс меченых ядер (ИМЯ) - отношение числа меченых 111-тммилшюм ядер к >бщему их количеству - выражали в процентах. Меченными считали ядра, содержащих ге менее 5 треков. Средним числом зерен серебра над 100 мечеными ядрами выражали штенсивность метки - ИМ. Определение ИМЯ в эпителии рогошты. языка, ¡ундапьного отдела желудка и 12-перстной кишки осуществляли после просмотра 2.5,0 тысяч клеток. Подсчет меченных 3Н-тимидином ядер осущест вляли к геперанншых опах изучаемых эпителиев при увеличении объектив -ЮОх, окуляр -12,5х на шкроскопе «Jonomed».

/. 7. Методика определения 11АМФ в эпителиальных тканях

Анализ механизмов влияния пептидов - представителей основных опиоидных' смсйств на процессы клеточного деления в эпителиальных тканях осуществлял», 'существляли по изменению содержания цАМФ. Концентрацию дАМФ н шпгелиях оговицы и фуцдального отдела желудка определяли радиоиммуниым методом с абором BIOTRAK. фирмы «AMERC1IAM». Фрагменты эпителиальных тканей сследуемых органов после забора замораживали. Образцы гомогенизировали в 6% рнхлоруксусной кислоте в разведении 1:10 при +2-+6°С. Полученные гомогепаты ;ентрифугировали. Супернатат промывали дистиллированной водой « смеси с иэтиловым эфиром. Эфирную фазу подвергали лиофшн.пой сушке, а после азведения буферным раствором полученные образцы исследовали па ц- счетчике Гамма-800».

Этот фрагмент работы был проделан нами совместно с сотрудниками иохимического отдела ЦНИЛ ДВГМУ ст. науч. сотр. к.м.п. Н.Ь. Мурзипон и ст. науч. отр. к.м.н. Г.Г. Обуховой .

Все количественные показатели, приведенные н работе, обработаны меюдом ариационной статистики с определением критерия значимости по Стыодепту (II.Ф. окитскнй, 1961). Различия между сравниваемыми показателями считали остоверными при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Создание технологии синтеза опиоидных пептидов с заданными гонистическими свойствами расширило возможности изучения их армакологических эффектов и целенаправленное использование в условиях атологии (O.A. Гомазков, 1996). Модулирующий характер влияния отюндных ептидов на функции нервной, иммунной и эндокринной систем свидетельствует о зжной роли опиоидэргических механизмов в реализации интеграции ориишзма на ровне его физиологических систем органон и тканей (И.П. Ашмарпп. М.Ф. Обухова, 394). Процессы пролиферации на всех этапах онтогенеза являются основными

биологическим механизмом поддержания тканевого гомеостаза организма физиологических условиях и при разнообразных патологических процессах (Л.Д Лиознер, 1966).

1. Пентапептид ДАДЛ синтезирован на основе природного лей-энкефалин; имеет структуру: Туг - 0-А1а - 01у - Реп - ГМху.

ДАДЛ обладает в 6 раз более выраженной с1-, чем ш-опиоидно! селективностью (О.Н. Чичснков и соавт, 1988). Наличие у ДАДЛ аналгетически: свойств свидетельствует о возможности реализации пептидом стресслимигирующи: эффектов. Это подтверждает способность ДАДЛ, аналогично метэнкефалину ослаблять у животных проявление посстрессорной гипокинезии (А. Ка(оЬ м а!., 1990) В то же время, введение ДАДЛ воспроизводит характерную для опиоидов триад} симптомов: гипотонию, брадикардию и апноэ.

Открытие у энкефалинов способности угнетать желудочную секрецик способствовало эффективному использованию их синтетических аналогов в терапш язвенной болезни желудка и эрозивных нарушений в различных эпителиальны) тканях. Стимуляция ДАДЛ заживления индуцированных цистиамином дуоденальны> язв является косвенным свидетельством вовлеченности пептидов в регулящне процессов регенерации эпителиальных тканей (В.Г. Смагин и соавт., 1983). Отмен: упомянутого эффекта налоксоном подтверждает участие в его реализации опиодних рецепторов.

ДАДЛ вводили экспериментальным животным однократно в/б в дозах 10 и ЮС мкг/кг а Ю часов утра. Клеточное деление изучали в эпителии роговицы, языка и желудка белых крыс через 4, 12 и 24 ч после введения препарата. Результаты свидетсльсгвуют. что ДАДЛ в обеих дозах оказывал стимулирующее влияние па процессы клеточного деления в эпителии роговицы, (табл.1). При введении препарата в дозе 10 мкг/кг отмечается увеличение ИМЯ в эпителии роговицы через 12 и 24 ч после воздействия возрастало по отношению к контролю в 1,7 и 1,3, а ИМ не изменялась. МИ через 4 ч оставался стабильным, а через 12 ч после воздействия увеличивался в 1,5 раза. При увеличении дозы вводимого животным пептида до 100 мкг/кг в эпителии роговицы происходила активация процессов клеточного деления. При этой наряду с увеличением ИМЯ через 4 и 24 ч в 1,4 и 1,6 раза наблюдалось возрастание ИМ, свидетельствующее об увеличении скорости синтеза ДНК!. Показатель МИК через 24 часа после воздействия пептида в дозе 100 мкг/кг не изменялся. В эпителии языка ДАДЛ в дозах 10 и 100 мкг/кг также вызывал стимуляцию процессов клеточного деления в течение 24 ч после введения. Через 4 ч после воздействия пептида в дозе 10 мкг/кг ИМЯ в эпителии языка увеличивался в 2,4, через 12 ч - в 1,7. Показатель ИМ через 4 и 12 ч оставался стабильным. О стимуляции клеточного деления свидетельствует увеличение в 1,8 раза на 12-часовом сроке показателя ИМ.

Увеличение дозы пептида до 100 мкг/кг вызвало дальнейшую активацию процессов клеточного деления (табл.2). При этом проявляется наряду с увеличением ИМЯ через 4 и 24 часа в 2.2 и 2,8 раза наблюдалось увеличение в 1,7 и 1,9 раза по сравнению с интактиым контролем ИМ (Р<0,05). Увеличение в 2,5 раза величины МИК на 24-часовом сроке свидетельствует об увеличении числа делящихся клеток.

Гпатца I

Влияние однократного парентерального введения эпкефялнна ДЛДЛ и дозе 10

мкг/кг на процессы пролиферации в эпителии роговицы к пилка белых _крыс_

Сроки наблюдения Группы животных Показатели пролиферации

МИ, %о имя,% ИМ

Эпителий роговицы

4 ч после воздействия Интактный контроль 15,0+1,0 9,6+0,4 18,4+1.4

Подопытные ДАДЛ 15,1+2.2 1 !.5±().2': IX. 2+1.5

12 чпосле воздействия Интактный контроль 20,1 + 1,8 13,0+1.5 23.1 ±2.0

Подопытные ДАДЛ 30.5+2,4* 22.Х+2.1 * 24.4±3.0

24 ч после воздействия Интактный контроль 15,0±|,0 У.6+0.4 18.4+1,4

Подопытные ДАДЛ 11.2+0,2* 12,7+0,7* 13.2+1.1

Эпителий языка

4 ч после воздействия Ингактнын контроль - 6,7+0.2 25.6+1.2

Подопытные ДАДЛ - 16.5±1,4* 26,5+1,5

12 ч после воздействия Интактный контроль 9,2+0,7 10,1 ±0,5 26.4+2,8

Подопытные ДАДЛ 17,3±1,6* 17,4+2.1* 25.5+2,7

24 ч после воздействия Интактный контроль - 6,7±0,2 25.6±! .2

Подопытные ДАДЛ - 9.6+0.2* 26.4+1,0

Примечание. *- отличие от интактного контроля достоверно (1'<0.05).

Таочина 2

Влияние однократного парентерального введения энкефалнма ДЛДЛ в лозе 100 _мкг/кг на процессы пролиферации в эиителнях белых крыс_

Сроки наблюдения Группы животных Показазели пролиферации

ИМЯ, % ИМ

Эпителий роговицы

4 ч после воздействия Интактный контроль 9,5+0,3 18,(1 + 1,2

Подопытные ДАДЛ 13,5+1,2* 26.4 + 2.5*

24 ч после воздействия Интактный контроль 9,5+0,3 1 Х.0± 1.2

Подопытные ДАДЛ 15,6±1,7* 29.4+2.1 •

Эпвтелий языка

4 ч после воздействия Иптактный контроль б,7±0,2 25,4±1,|

Подопытные ДАДЛ 14,9+1,6* 44,7±3,5*

24 ч лосле воздействия Иптактный контроль 6,7+0,2 25,4+1,1

Подопытные ДАДЛ 18,8+1,4* 48,0+3,3*

Эпителий фундального отдела желудка

4 ч после воздействия Иптактный контроль 3,8+0,2 13,5+1,4

Подопытные ДАДЛ 5,7+0,5* 11,8+1,9

24 ч после воздействия Иптактный контроль 3,8±0,2 13,5+1,4

Подопытные ДАДЛ 5,2+0,1* 9,7±1,1

Примечание. * отличие от иитактного контроля достоверно (р<0,()5).

Введение ДАДЛ в дозе 10 мкг/кг вызывало в эпителии фундального отдел; желудка увеличение ИМЯ в 1,2 раза, достоверное по отношению к контролю, толькс через 4 часа после воздействия пептида. Показатель ИМ на обоих сроках не изменяло (табл.3).

Таким образом ДАДЛ в дозе 10 мкг/кг вызывал кратковременную активацик процессов синтеза ДНК на 4-часовом сроке.

Увеличение дозы пептида до 100 мкг/кг усиливало его влияние и на процессь клеточного деления в эпителии желудка. Через 4 и 24 ч после введения ДАДЛ в доз< 100 мкг/кг ИМЯ достоверно увеличивался по отношению к контролю соответственно i 1,5 и 1,3 раза. ИМ на этих сроках исследования не изменялась. Почти 3-крагно( увеличение показателя МИК через 24 ч является следствием активации npoueccoi синтеза ДНК па предыдущих сроках исследования.

2. ДАСЛЕТ является специфическим агонистом d-опиоидных рецепторов Пептид состоит из шести аминокислот, расположенных в последовательности: Туг - D Ser - Gly - Plie - Ley - Tre.

Этот гексапепгид взаимодействует с б-опиоидными рецепторами в 600 ра активнее, чем с р-опиоидпымп рецепторами, и оценивается как селективный 6-агонис (М. Chesselet et al., 1981).

ДАСЛЕТ вводили животным однократно в/б в дозе 10 мкг/кг в 10 часов утра Клеточное деление изучали через 4 и 24 ч после введения препарата. Для исключепт изменения скорости митоза проводили также опыты с колхицином.

Полученные данные (табл. 4) свидетельствуют, что ДАСЛЕТ вызыва. активацию синтеза ДНК в эпителии роговицы на всех сроках исследования. Через 4 i 24 ч после воздействия ДАСЛЕТ величина ИМЯ в эпителии роговицы была в 1,3 и 1,: раза выше показателя иитактного контроля.Величина ИМ на обоих сроках опыт; оставалась стабильной.

Опыты с колхицином выявили угнетение митотической активности в эпители: роговицы под влиянием ДАСЛЕТ на обоих сроках наблюдения. Воздействи селективного агониста ô-рецепторов вызывало в эпителии роговицы белых кры стимуляцию процессов синтеза ДНК за счет увеличения количества ДН1

синтезирующих клеток. Достоверное снижение величины МИК ни обоих сроках исследования, по-видимому, обусловлено уменьшением количества, вступающих в митоз клеток. Эти изменения свидетельствуют, что ДЛСЛЕТ может оказывал. влияние на ключевые фазы, регламентирующие цикла в О | - Я и Ст-М иерподач события митотического цикла. Важным доказательством участия 5-опмопдпмх рецепторов в активацию клеточной пролиферации являются результаты наших совместных опытов с Т.Д. Паньковой (1988) по изучению влияния аналога деи-энксфалнпа - .м.тлрпша па процессы клеточного деления в эпителиальных тканях .

'Гчилица 3

Влияние однократного парентерального введения экксфа.иша ДЛДЛ илии 10 мкг/кг на процессы пролиферации в эпителии фундалыюго отдела лелудкл белых

крыс__

Сроки наблюдения Группы животных 11оказа1с;ш нро.тпфераннн

ИМЯ. % ИМ

4 ч после воздействия Интактный контроль 3,8+0,2

Подопытные ДАДЛ 4.4±0.09-' lft.S±l,7

24 ч после воздействия Интактный контроль 3,S±0,2 13.5 +1.4

Подопытные ДАДЛ 3.5+0,1

Примечание. * отличие от иитактпого контроля достоверно (р-0.05).

ï'tiô uiua 4

Влияние однократного парентерального введения энк-ефалнна ДЛСЛЕТ н дозе 10 _мкг/кг на процессы пролиферации в эпителии роговицы белых крыс_

Группы животных Показатели нролн(]>ерашш

МИК, %» ИМЯ, % ИМ

4 часа после воздействия

Интактный контроль 5,9+0.3 6,1+0.3 16.7±().(1

Подопытная 2,8+0,2* 7,5+0,3* 17.2+О.Х

2 4 часа после в о з д е П с г в м я

Интактный контроль 5,9±0,3 6.1+0,3 16.7±о.()

Подопытная 4,1+0,1* 9,5±0,S* IS.2+O.S

Примечание: * отличиеинтактного контроля достоверно (р<0.05).

3. Даларгин состоит из шести аминокислот в последовательности: Туг - D-Ala - Gly - Plie - Ley - Arg и обладает сильными дельта и более слабыми 5-ониопдпымп свойствами. Да.таргпп характеризует устойчивость к действию эндопептидаз. Период полураспада пептида

достигает 10 мин. (C.B. Зайцев и соавт., 1996). Влияние даларгина на процессы пролиферации экто- и энтодермальных эпителиев изучали в сериях экспериментов с однократным (1 серия опытов) и повторным в течение 5 сут. (II серия опытов) воздействием препарата. В первой серии экспериментов пептид вводили однократно в/б в дозе 10 мкг/кг; процессы клеточного деления изучали в эпителии роговицы через 4 и 24 ч после воздействия. Во второй серии дозу пептида увеличили до 100 мкг/кг; процессы пролиферации изучали в эпителиях языка, пищевода, фундального отдела желудка и 12-перстной кишки через 24 ч после заключительного воздействия. Показателей МИ, МИК, ИМЯ и ИМ приведены в табл.5, 6. Эти исследования нашли отражение в той части работы Т.Д. Паньковой (1992), которую мы выполняли совместно. По данным радиоавтографии, показатели ИМЯ и ИМ в эпителии роговицы белых крыс через 4 и 24 ч после однократного воздействия даларгина были, соответственно, в 2,7 и 2,0 раза выше уровня контроля. На 24-часовом сроке опыта отмечалось только 2-кратное увеличение ИМ. МИ через 4 и 24 ч в 1,7 и 1,6 раза превосходил показатели интактного контроля. Эти изменения свидетельствуют, что стимуляция клеточного деления даларгином обусловлена активацией синтеза ДНК и увеличением числа, вступающих в митоз клеток.

Важной стороной оценки митогенного влияния даларгина стало изучение влияния пептида на синтез ДНК в эпителиях различных отделов гастроинтестипалыюго тракта. Пептид вводили животным однократно в/б в дозе 100 мкг/кг. Клеточного деления изучали через 24 ч после воздействия в эпителии языка, пищевода, фундального отдела желудка и 12-перстной кишки. Введение даларгина вызывает в эпителиях пищеварительного тракта стимуляцию синтеза ДНК. В эпителии языка, пищевода, фундального отдела желудка и 12-перстной кишки ИМЯ через 24 ч после воздействия возрастало в 1,7, 1,6 и 1,5 раза в сравнении с интактным контролем, а в дуоденальном эпителии ИМЯ возрастал почти в 2,2 раза. Величины ИМ ьо всех эпителиях под влиянием даларгина не изменялась.

Учитывая сведения о снижении чувствительности опиоидных рецепторов при продолжительном введении в организм их агонистов (В. Yoburn et al., 1993) мы проведили оценку митогенного влияния даларгина при его 5-кратном воздействии. Даларгин вводили крысам в/б в дозе 100 мкг/кг ежедневно на протяжении 5 сут. Процессы клеточного деления изучали через 24 ч после заключительного воздействия пептида в эпителии языка, пищевода, фундального отдела желудка и 12-перстной кишки. Через 24 ч после заключительного введения даларгина ИМЯ в эпителиях языка,

пищевода, фундального отдела желудка и 12-перстной кишки увеличивался, соответственно, в 1,6, 1,7 и 2,3 раза в сравнении с контролем. Показатель ИМ в эпителиях не изменялся.

4. Тетрапептид ДАГО создан на основе лей-энкефачина и имеет структуру: Туг - D-Ala - Gly - Phe - ОН.

Он обладает в 80 раз более выраженными Ц-, чем S-опиоидными свойствами (О.П. Чиченков и соат., 1988), и обладает сильной аналгетнческой активностью (М.Г. Пшеничникова. 1987). Этот налоксонзависимый эффект ДАГО вызывает даже в небольших дозах (А. Герц, М. Миллан, 1989).

Тчйлици 5

Влияние однократного парентерального введения смешанного 5/ц-агониста даларгина в дозе 10 мкг/кг на процессы пролиферации в эпителии роговины {¡слых крыс

Группы животных Показатели пролиферации

МИК, %» ИМЯ. % ИМ

4 часа после воздействия

Интактный контроль 7,9+0,6 3,1 ±0.1 Н.4+0,4

Подопытная 14,3±1,3* 9,3+0.6* 9,7+0.5

24 часа после воздействия

Интактный контроль 5,6+0.5 3.1 ±0,1 8.4±0.4

Подопытная 14,9+1,2* 6,5+0.3* 10.1 ±0.9

Примечание: * отличие интактного контроля достоверно (р<0.()5).

Тсшлп/а 6

Влияние парентерального введения аналога лси-эикефплпна даларпнт и дозе 100 м кг/кг на процессы пролиферации в эпителиальных тканях белых крыс через 24 ___ч после воздействия _

Режим эксперимента Группы животных Показатели пролиферации

ИМЯ, % ИМ

Эпителий я з ы к а

Однократное введение 5-кратное введение Контроль 3,9+0,3 1 2.9±0,6

Опыт 6.7+0.2* 14.(Ы),Х

Контроль 3.9+0,3 1 2.9+0.6

Опыт 8.Н+0.2* 14.5+0.9

Эпителии инщек ода

Однократное введение Контроль 3,4+0,2 1 К.(>+().5

Опыт 5,6+0,2' 20.К±1.2

5-кратное введение Контроль 6.8±0,5 29.5+1.5

Опит 11,6±0,6* 2Х.1)+|.(Н

Эпителий ф у н д а л ь н о г о отдела ж с л V д к а

Однократное введение Контроль 1,4±0,2 27.2±1.7

Опыт 2.1 ±0.2* 26.К+1.1

5-кратное введение Контроль 4,2+0.6 20.3+1.1

Опыт 9,8+1,1* 22.1+1.2

Эпителий 12 -п е р с т но н к и ш к п

Однократное введение Контроль 10.5+0,9 32,4+1,3

Опыт 23,2+0,9* 33,9±1,4

5-крагное введение Контроль 12,5±1,2 25,4±1,5

Опыт 25,4+1,2* 27,2+1,8

Примечание. * - отличие от контроля статистически достоверно (Р<0,05).

Па физиологические системы организма ДАГО оказывает влияние, характерное многим агониетам ц-опиоидных рецепторов, вызывая снижение частоты сердцебиения, дыхания и угнетение ноцицсптивных процессов (А.А. Зайцев и соавт., 1993). Как многие |>агонисты: морфии и дерморфин, ДАГО стимулирует базальную секрецию желудка (Ь. 1Шогге е1 а!., 1993).

ДАГО вводили животным в/б в 10 часов утра в дозе 10 и 100 мкг/кг однократно. Клеточного деления изучали через 4, 12 и 24 ч после введения пептида. Изменения скорости митоза оценивали в опытах с колхицином.

Полученные данные свидетельствуют, что в/б введение ц-агониста ДАГО оказывает на процессы клеточного деления в изучаемых эпителиях дифференцированное влияние (табл.7-9). В эпителии роговицы ДАГО индуцировал угнетение процессов клеточного деления в дозе 10 мкг/кг на всех сроках наблюдения. Спустя 4. 12 и 24 ч после введения пептида показатель ИМЯ в эпителии роговицы в сравнении с контролем достоверно уменьшался, соответственно, в 1,8, 1,6 и 1,4 раза. ИМ не изменялась. Уменьшение количества ДНК-синтезирующих клеток после введения пептида сопровождалось снижением МИ на этих сроках исследования соответственно в 1,8, 1.6, 2,3 раза. МИК в эпителии роговицы через 4 и 24 часа после введения пептида в дозе 10 мкг/кг был в 2,4 и 1,7 раза ниже величины контроля.

Ингибирующее влияние пептида в дозе 100 мкг/кг на процессы синтеза ДНК в эпителии роговицы в сравнении дозой 10 мкг/кг ослабевало. Через 4 ч после введения пептида ИМЯ в эпителии роговицы снижался в 1,4 раза, а к 24 ч он совпадал с величиной контроля (табл. 9). Показатель ИМ при введении ДАГО в дозе 100 мкг/кг как и при дозе 10 мкг/кг не изменялся. Ослабление угнетения синтеза ДНК в эпителии роговицы при повышении доз ДАГО может свидетельствовать об «ускользании эффекта», что может быть обусловлено перекресным реагированием пептида с другими субпопуляциями опиоидны.ч рецепторов. В эпителии языка ДАГО в отличие от эпителия роговицы вызывает активацию процессов синтеза ДНК. Через 4, 12 и 24 ч после введения животным ДАГО в дозе 10 мкг/кг ИМЯ в эпителии языка равномерно повышался в 1,6, 1,7 и 1,5 раза по сравнению с показателями интактных крыс. ИМ на этих сроках не измененялась. МИ через 12 ч после воздействия пептида был в 1,5 раза выше показателя контроля. Возможно, это связано с изменением времени митоза, на что указывает увеличение в 1,5 раза на 4 часовом сроке показателя МИК.

При увеличении дозы ДАГО до 100 мкг/кг характер влияния пептида на процессы клеточного деления не изменился. Через 4 и 24 часа после введения пептида ИМЯ в эпителии языка увеличивался соответственно в 1,9 и 1,5 раза в сравнении с контролем. ИМ на обоих сроках наблюдения повышался в 1,7 и 2,0 раза в сравнении с контролем, чего не наблюдалось под влиянием пептида в меньшей дозе. Это свидетельствует, что повышение дозы ДАГО способствует усилению его митогенного влиянияза счет

увеличения числа клеток, вступающих в й-период п скорости сптеза ЛПК. Противоположный характер влияния ДАГО па процессы клеточного деления в эпителии роговицы и языка может быть обусловлен неодинаковом представленностью в обоих эпитслиях субпопуляций |4- и 5- опиопдных рецепторов, различной их биодоступностью и принадлежностью этих эктодермальпых эпителием к разным физиологическим системам организма.

Тштща 7

Влияние однократного парентерального введения энкефллпна ДАГО н лозе 10

Сроки наблюдения Группы животных Показа юли иро.тпферавип

МИ, %ч ИМЯ. % ИМ

Эпителий роговицы

4 ч после воздействия Интактный контроль Подопытпые ДАГО 15,3±0.У 8.1 ±0.9-* 9.7±0,4 5.2±0,4* 18.4±1.4 15.3±1.0

12 ч после воздействия Интактный контроль Подопытные ДАГО 20,1 ±1,8 13,4±|.2* 13,0+1.5 8.0+0,5* 23,1+2,0 1У,1±2,2

24 ч после воздействия Интактный контроль Подопытные ДАГО 15,3+0,9 6.4+0,7* 9.7+0,5 6.7±0.2" 18,4+1.4 2<>.0±|.К

Эпителий языка

4 ч после воздействия Интактный контроль - 6.7±0.4 25.Г.±1,2

Подопытные ДАГО 9,2+0.7 10.1 ±0.5! 26.4+2.8

12 ч после воздействия Интактный контроль - 6,7±0.4 25.6±1.2

Подопытные ДАГО - ш.ади* 26Л>±1.1

24 ч после воздействия Интактный контроль 14,3+1.2* 17,9±0.К 28.3 + 1,0

Подопытные ДАГО - 10,4 ±0.3* 24.5±1.5

Примечание. *- отличие от интактного контроля достоверно (1><0,05).

Таблица 8

Влияние однократного парентерального введения эикефялина ДАГО в дозе 10 мкг/кг на процессы пролиферации в эпителии фундального отдела желудка и 12_ перстной кишки белых крыс__

Срок» наблюдения Группы животных Показатели пролиферации

ИМЯ, % ИМ

Эпителий фундального отдела желудка

4 ч после воздействия Интактный контроль 3,8+0,2 13.5+1,4

Подопытные ДАГО 4,9+0,2* 15,9±3,1

24 ч после воздействия Интактный контроль 3,8±0,2 13,5+1,4

Подопытные ДАГО 3,9+0,3 10,5+1,4

Эпителий 12-перстной кишки

4 ч после воздействия Интактный контроль 14,0+1,1 10,2+1,4

Подопытпые ДАГО 16,2+1,3 9,4±0,4

24 ч после воздействия Интактный контроль 14,0+1,1 10,2+1,4

Подопытные ДАГО 33,8+3,4* 30,9±4,2*

Примечание. *- отличие от интактного контроля достоверно (Р<0,05).

Таблица 9

Влияние однократного парентерального введения энкефалина ДАГО в дозе 100 _мкг/кг на процессы пролиферации в эпителиях белых крыс_

Сроки наблюдения Группы животных Показатели пролиферации

ИМЯ, % ИМ

Эпителий роговицы

4 ч после воздействия Интактный контроль 9,5+0,3 18,0±1,2

Подопыгные ДАГО 6,4±0,3* 14,4±1,8

24 ч после воздействия Интактный контроль 9,5±0,3 18,0± 1,2

Подопытные ДАГО 9,0+0,3 17,6+1.6

Э п н т е л и й языка

4 ч после воздействия Интактный контроль 6,7±0,2 25,4+1,1

Подопытные ДАГО 12,8±0,8* 45,1 ±2,6*

24 ч после воздействия Иптактпый контроль 6,2±0,3 25.4+1, S

Подопытные ДАГО 13,2±0,3* 51.1+3,2-'

Эпителий фундального отдела желудка

4 ч после воздействия Иптактпый контроль 4.1 ±0,1 lí). 1+0.5

Подопытные ДАГО 5,7±0,2* 1 7.N+0.7

24 ч после воздействия Иптактпый контроль 4,1 ±0,1 1 (i.l ±0.5

Подопытные ДАГО У.2+0.У* 1 7.5±0.3

Эпителий 1 2 - п е р с т и о ¡i кишки

4 чпосле воздействия Иптакт пый контроль 14,0±1.| 10.2 + 1.4

Подопытные ДАГО 2 5,У ±3.2* 34.К+4.5*

24 ч после воздействия Интактный контроль 14,0+1,1 10.2+1.4

Подопытные ДАГО 9.7+1,0* 15.8+1.Г-

Примечание. *- отличие от иптактного контроля достоверно (Р<0.05).

D эпителии фундального отдела желудка ДАГО н дозе 10 мкг.'кг ituiunu увеличение ИМЯ в 1,3 раза только через 4 ч после его введения. Через 2-4 ч показа гель ИМЯ не отличался от контроля. ИМ на обоих сроках не изменялась. I кжмшеппе дозы пептида до 100 мкг/кг ДАГО вызывало усилению стимулирующего эффекта. 11МЯ увеличивался через 4 и 24 ч в 1,4 и 2,2 раза. ИМ в течение 24 ч не претерпевала изменений. 2,2 и 1,7-кратное повышение МИК через 4 и 24 ч спидетельепле!. что стимуляция клеточного деления опосредуется ДАГО кроме активации синтеза ДИК н изменением скорости митоза.

Это подтверждает правильность нашего предположения о формировании стереотипного иролиферативпого ответа на воздействие агопиета р/й-оппопдпых рецепторов ДАГО в разных по гистогенезу эпителиях. объединенных в единой функциональной системы пищеварения. Влияние ДАГО на процессы синтеза ДНК в эпителиях описаны нами впервые (М.И. Радивоз и соавг.. 1994).

Аналоги энкефалина, селективные преимущественно к 5-оннонлпмм рецепторам (ДАДЛ, ДАСЛЕТ, даларгин), вызывают стимуляцию процессов клеточного деления, а смешанный агонист p/5-опиопдиых рецептором - ДАГО, наоборот, индуцировал угнетение пролиферации. Эти результаты объясняют отчасти причину противоречивости данных о влиянии опнопдов на процессы пролиферации в тканях.

5. Дерморфины, пептиды, составляющие четвертое семейство онпоилных пептидов, были выделены из экстрактов кожи южноамериканской лягушки Phyllomedusa sauvagei P. Motecucchi в 19<SI г. Выделенный пошил имел аминокислотную последовательность:

Туг - D-Ala - Pen - Gly - Туг - Pro - Ser - NH:.

В настоящее время это семейство включает пять природных нешндпых изоформ. Наличие D-аминокислоты и необычайно высокий р-аффишпет способе шуст-смысловому обособлению дерморфина среди всех уже известных семена в оппоплпых

пептидов (D. Duehsne et al., 1993), но не отменяет его характерных опиоидных биологических свойств.

дерморфин, пептид (А-1):

Туг - D - Ala - Phe - Gly - Туг - Pro - Ser - NH2. аналог дерморфина (A-43):

D-Arg - Туг - D-Arg - Phe - D-Ala - NH2. По данным ETI. Яровой, эти аналоги имеют следующее соотношение ц -агонистической активности:

дерморфин - пептид - (А-1) - селективный агонист, аналог дерморфина (А-43) - высокоселективный р-агонист.

Дерморфин и его синтетический аналог пептид А-43 вводили подопытным животным однократно в/б в дозе 10 мкг/кг в 10 часов утра. Клеточное деление изучали в эпителии роговицы, языка, фундалыюго отдела желудка и 12-перстной кишки через 4 и 24 ч после воздействия пептидов.

В эпителии роговицы белых крыс селективный р-агоннст дерморфин, по данным ралиоавтографии, вызывал угнетение процессов синтеза ДНК на обоих сроках наблюдения. Через 4 и 24 ч показатель ИМЯ в эпителии роговицы был, соответственно, в 1,6 и 1,8 раза ниже показателей контроля. ИМ на всех сроках не изменялась. Повышение МИ на 4-часовом сроке в 1,5 раза, в сравнении с контролем, возможно обусловлено растяжкой митоза во времени. Почти 1,4-кратное уменьшение МИ на 24-часоаом сроке наблюдения в эпителии роговицы является следствием угнетения синтеза ДНК па предыдущем сроке опыта (табл .10).

В эпителии языка высокоселективный (i- агонист дерморфин, по данным радиоавтографии с 3Н-тимидином, вызывал через 4 ч после воздействия почти 2,4-кратное увеличение ИМЯ без изменения величины ИМ. Спустя 24 ч показатели ИМЯ и ИМ в эпителии языка были почти в 1,5 раза ниже уровня контроля. Через 4 ч МИ в 2,4 раза превосходил величину показателя интактных крыс, а спустя 24 ч достоверно уступал ей в 1,3 раза.

В эпителии фундалыюго отдела желудка воздействие природного дерморфина вызывало, по данным радиоавтографического анализа, отсроченную стимуляцию синтеза ДНК. На 4-часовом сроке наблюдения показатели ИМЯ и ИМ у подопытных крыс не измененялся. Спустя 24 ч после введения животным дерморфина величина ИМЯ в 1,6 раза превосходила уровень интактного контроля, а показатель ИМ не изменялся.

Данные радиоавтографии свидетельствуют, что дерморфин вызывал активацию синтеза ДПК в дуоденальном эпителии па протяжении 24 ч после воздействия. Через 4 ч в эпителии 12-перстной кишки отмечалось только 2,5-кратное увеличение ИМ. На 24-часовом сроке наблюдения 1,3-кратное повышение ИМЯ (Р<0,05), и увеличение в 1,4 раза ИМ. Это, свидетельствует ,что селективный ц-агопист - дерморфин вызывает в энтодермальных эпителиях стимуляцию процессов синтеза ДНК.

Гиплици 10

Блиянне однократного парентерального введения дерморфппа н его аналога пептида А-43 в дозе 10 мкг/кг на процессы пролиферации в эпителиальных __тканях белых крыс_

Сроки наблюдения Группы животных 1 [оказател 111 фол пферш а 111

МИ,%> ИМЯ, % ПМ

Эпителий роговицы

Интактный контроль 12,1±!,() 10.0+0.3 1.3.2+0.5

4 ч после воздействия Подопытные А-1 17.8+0,9 6,1 +0.3- 10.0+0,4*

Подопытные А-43 4,5+0,3 16,2+0.7* 7.6±0.5*

24 ч после воздействия Подопытные А-1 8.2+0,4 5.7+0,2~ 12.4+0,6

Подопытные А-43 7,1+0,7 9.0+0.6 9,1+0.7 1

Э и и т с л и и я з и к а

Интактный контроль 6.1+0.5 6.6±0.4 28,8+1.Х

4 ч после воздействия Подопытпые А-1 14.6+0.9* 7,0+0,6 29.4+0,9

Подопытные А-43 6,7+0,4 4.6±0.2- 16.5+1,5"

24 ч после воздействия Подопытные А-1 4,7+0,2* 4.4+0,2 8 19,4±2.К*

Подопытные А-43 3,7+0,2* 4.3+0,3'" 22 2±2 8*

Эпителий фундального отдела желудка

Интактный контроль - 5.4+0.3 2 1,5±1.6

4 ч после воздействия Подопытные А-1 - 6,1 ¿0,5 17,0+1.1

Подопытные А-43 - 12,3+1.2- 23.5 + 1.8

24 ч после воздействия Подопытные А-1 - И.7+0.5 ' 20.1±1.8

Подопытные А-43 • 16.4+1.2 ; 24.7+1.6

Эпителий 1 2 - п с р с т п о й к н ш к п

Интактный контроль - 20.8+1.5 10.2+0.7

4 ч после воздействия Подопытные А-1 - 16,4+0.7® 25.9+4.8'-

Подопытные А-43 - 10.9±0.9* 9.5±0.8

24 ч после воздействия Подопытные А-1 - 26.8±1,5* 15,1±1,3*

Подопытные А-43 - 30.6+2.4''- 8.8+0.9

Примечание. * отличие от иптактпого контроля достоверно (р<().()5).

Детализацию влияния агонистов р.- рецепторов на процессы клеточной пролиферации в эпителиальных тканях осуществляли в опытах с аналогом дерморфина - высокоселективным р-агонистом - А-43 (Е.П. Ярова, 1987). В эпителии роговицы пептид А-43 вызывал кратковременное угнетение процессов синтеза ДНК. Через 4 ч после введения животным А-43 ИМЯ был в 1,3 раза ниже величины контроля. ИМ оставалась стабильной. На 24-часовом сроке наблюдения изменений ИМЯ и ИМ у подопытных крыс не наблюдалось. Увеличение МИ на 4-часовом сроке опыта в 1,2 раза (Р<0.05) на фоне угнетения синтеза ДНК может быть обусловлено увеличением времени митоза. Через 24 ч после воздействия А-43 МИ в эпителии роговицы не изменялся.

В эпителии языка высокоселективный ц-агонист А-43 ингибировал процессы клеточного деления на протяжении 24 ч после воздействия . Через 4 и 24 ч после его введения ИМЯ был в 1.4 и 1,5 раза меньше соответствующих показателей контроля. ИМ через 4 ч была в 1,7 раза ниже ее величины у интактных крыс. Показатель МИ на 4-часовом сроке опыта не изменялся, а через 24 ч был в 1,6 раза меньше уровня контроля. Ингибирование синтеза ДНК в эпителии языка под влиянием аналога дерморфина А-43 носило более выраженный характер, чем в эпителии роговицы.

В эпителии фундального отдела желудка белых крыс дерморфин А-43 вызывал активацию процессов синтеза ДНК. Показатель ИМЯ через 4 и 24 ч после воздействия пептида был увеличен, соответственно, в 2,2 и 2 раза в сравнении с контролем. Величина ИМ на обоих сроках опыта не измененялась. Интенсивность активации р-агонистами синтеза ДНК в эпителии фундального отдела желудка возрастает с увеличением ц-селективности пептидов и уменьшением их 5-активпости в ряду:

«дерморфин; ДАГО; пептид А-43».

На процессы синтеза ДНК в дуоденальном эпителии высокоселективный р-пептид А-43 оказывал дифференцированное влияние. Через 4 ч после воздействия пептид А-43 вызывал 1,9-кратное уменьшение ИМЯ в сравнении с контролем, которое на 24-часовом сроке сменялось его почти 1,4-кратной стимуляцией (Р<0,05). ИМ на обоих сроках опыта не изменялась.

Результаты опытов с (з-агонистами свидетельствуют, что характер влияния на процессы клеточного деления в эпителиев имеет определенную зависимость от их гистогенеза. В эктодермальном эпителии роговицы оба дерморфина и ДАГО индуцировали угнетение синтеза ДНК, а в энтодермальных эпителиях, напротив, вызывали его стимуляцию. Двойственное влияние р-агонистов на процессы клеточного деления в экто- и энтодермальных эпителиях, возможно, обусловлены различным соотношением в них субпопуляций опиоидных рецепторов, особенностями метаболизма опиоидов или разной степенью их вовлеченности в функцию гастроинтестенальной системы организма. Для оценки правильности предположения о двойственном характере влияния р-агонистов на процессы клеточного деления в экто-и энтодермальном эпителии было решено исследовать характер влияния естественног о опиоида с равновыраженными ц- и 5-агонистическими свойствами р-эндорфина и его природного фрагмента - 'у-эпдорфипа.

6. Семейство эндорфинов имеет своим общим предшественником молекулу проопиомеланокортина (ПОМК) и существует несколько обособленно от семейства энкефалинов. Эндорфины обнаружены в задней и промежуточной долях гипофиза, куда они поступают по аксонам из нейросекреторных клеток медио-базилярной

области гипоталамуса (Li Zhou et al., 1995). Пептиды семейства эндорфинов образуются за счет ограниченного протеолиза их общего предшественника ß-эидорфина. ß-эндорфин представляет 61-91- аминокислот- ный фрагмент еще более общей 1-91-аминокислотной молекулы его предшественника - ß-линотропнна.

Изменение длины пептидных молекул эпдорфиноп изменяет их оипопдную активность, ß-эндорфин одинаково активно связывается с р- и 5-онпонлнымн рецепторами, однако, ß-эндорфип вызывает лишь незначительную активацию аденилатциклазы, что характеризует его как слабый S-агонпст (W. Klee. M Niicnbcrg, 1976). У беременных женщин перед родами наблюдается почти 10-крат пое \ не.шченне ß-эндорфина. как проявление эндогенного обезболивания (R. Oolaiul et al.. 1981) так-как ß-эндорфин обладает выраженной, продолжительной ниадгетичеокой акпншосгио.

Эндорфины отличает от эикефалипов обособленность их ôho.toi нческого предшественника, места синтеза, величина и аминокислотный coeian неншдпых молекул, а также спектр агонистичсских свойств и характер влияния па организм. Наличие у них сходных с энкефалинами опиоидных свойств подтнерждае! участие эндорфинов в модуляции физиологических функций организма и регуляции тканевого гомеостаза. Сведения о влиянии эндорфинов на процессы клеточного деления единичны. О способности эндорфинов стимулировать клеточное деление г. эннгелни языка через 24 ч после его введения свидетельствуют данные С.С. Тимошина и Т.Ф. Ждановой (1988). Отсутствие в этик исследованиях данных о динамике процесса затрудняет окончательные выводы о природе наблюдаемого митогеппого эффекта. Стимуляция эндорфином заживления язв 12-перстпой кишки (В.Г. С.магпп п соавт.. 1983) свидетельствует об активации этим пептидом процессов пролиферации. В то же время, данные S. Bartolome et al. (1990) об угнетении эндорфином рост а мол а и печени у 6-дневных крысят, по-видимому, не могут быть экстраполировано на lupoc.iMX животных. Опыты Т.В. Яценко (1998) свидетельствуют, что характер нлияиня нейропептидов на пролиферативные процессы меняется к разные стадии онтогенеза организма.

Исследование влияния эпдорфииа на процессы клеточного деления осуществляли с дозами 10 и 100 мкг/кг. Пептид вводили животным однокранш в/б в 10 часов утра. Процессы пролиферации изучали через 12 н 24 ч после воздействия (табл. 11). По техническим причинам (апликацшо 411-тп-мпдпна осущссныялн на роговицу) процессы клеточного деления в этой серии опытов изучали ю.-н.ко в эпителии роговицы.

Однократное в/б введение ß-эндорфипа в дозе К) мкт/кг вызывало к нште.тнп роговицы угнетение процессов синтеза ДНК па протяжении 24 ч ноете введения пептида. Через 12 и 24 ч после введения ß-эпдорфнпа ИМЯ в эшпелпп рокпшцы увеличивался соответственно в 1,4 и 2,0 раза в отношению к контролю (1'"0.05). И напротив, ИМ па обоих сроках было почти в 1,5 раза выше or показателей ннгакгного контроля. Возрастание МИ через 12 и 24 ч в 3,3 и 3,0 раза может быть обу словлено увеличением времени митоза .

Влияния ß-эндорфина на процессы пролиферации в дозе 100 мкг/кг изучали через 24 ч после в/б введения пептида в эпителиях: роговине, языке, фчн.ча.тмю.м отделе желудка и 12-перстиой кишки (табл. 12).

Увеличение дозы ß-зндорфина в 10 раз не изменяло стимулирующего влиянии пептида в эктодермальном эпителии роговицы. Через 24 ч после воздействия ИМИ в эпителии роговицы был почти в 1,4 раза выше уровня иптактпых животных, а ИМ превосходила

величину контроля почти в 2,5 раза. Стимуляции синтеза ДНК соответствовало и адекватное увеличение МИ в роговице в 2,3 раза. Это повышение МИ может быть обусловлено, помимо активации синтеза ДНК, также и стимуляцией самого митоза.

Таблица 11

Влияние однократного парентерального введения Р- и у-эндорфина в дозе 10 мкг/кг на процессы пролиферации в эпителии роговицы белых крыс

Сроки наблюдения Группы животных Показатели пролиферации

МИ, %„ ИМЯ, % ИМ

12 ч после воздействия Интактный контроль 3,6+0,2 2,9+0,2 17,8±0,5

Подопытная у-эндорфин 5,1+0,2* 1,8±0,1 * 9,7+0,4

Подопытная р -эндорфин 12,2+0,6* 3,5±0,3 11,8±0,3*

24 ч после воздействия Интактный контроль 3,6±0,2 2,9+0,2 17,8±0,5

■ Подопытная у -эндорфин 6,6+0,4** 1,3+0,2* 10,7±0,3*

Подопытная Р -эндорфин 10,8+0,3* 6,0+0,4* 12,0+0.4*

Примечание: * отличие от интактного контроля достоверно (р<0,05).

Таблица 12

Влияние однократного парентерального введения ¡3- к у-зндорфинов в дозе 100 мкг/кг на процессы клеточного деления вэпителиях белых крыс через 24 ч после блокады опиоидных рецепторов налоксоном

Группы животных Показатели пролиферации

МИ,%о ИМЯ, % ИМ

Роговица

Интактный контроль 3,5±0,2 3,8+0,1 16,5±0,4

Подопытная (у-эндорфин) 3,5+0,4 2,4+0,1* 18,5+1,9

Подопытная (налоксом + у-эндорфин) 2,5±0,3* 4,2+0,1 17,2+0,4

Подопытная (налоксом) 4,9+0,5* 5,3+0,1* 19,8±0,8*

П о до 11 ытн ая (Р -э н дорф| ш) 8,2±0,7* 5,2+0,1* 37,7±2,1*

Язык

Интактный контроль 14,8+0,2 9,1 ±0,4 31,3±1.1

Подопытная (у-эндорфин) 7,4+0,6* 6,0+0,3* 11,4+0,6*

Подопытная (налоксон+у-эндорфин) 12,6±0,9* 7,9+0,2* 19,8+0,9*

Подопытная (палоксон) 21,2+0,3* ■ 9,3±0,4 30.8+1.2

Подопытная (В-эндорфин) 14,1 + 1,1 8,9+0,4 33,6+1.0

Желудок

Интактный контроль - 6,5±0,1 18,8+0,7

Подопытная (у-эндорфин) - 5,0+0,1* 16,8+0,9

Подопытная (налоксон+у-эндорфин) - 9,4+0,4* 20,2+0,4

Подопьппая (валоксон) - 6,4+0,2 16.4±0.5

Подопытная (Р-эвдорфнн) - 8,5±0,2* 17,2+1,0

12-перстная кишка

Интактный контроль - 10,2±1,1 ¡4,2+1.2

Подопытная (у-эндорфин) - 2,1+0,5* 10,3+0,9

Подопытная (налоксон+у-эндорфин) - 2,6+0,4* 10,0±1,0*

Подопытная (иалоксон) - 9,2+1,8 12,3+1,1

Подопытная (Р-эндорфин) - 14,5+1,6* 12,0+1,0

Примечание. * отличие от интактного контроля достоверно (р<0.05).

В эпителии языка через 24 ч после введения р-эпдорфппа в дозе 100 мкг/кг показатели ИМЯ и ИМ не претерпевали изменений. Отсутствие влияния пептида па процессы пролиферации, возможно, обусловлено особенностями метаболизма (3-эндорфина в ткани языка или иным, чем в других тканях, соотношением субпопуляций опиоидных рецепторов.

В эпителии фундального отдела желудка через 24 ч после воздействия пептидов ИМЯ был почти в 1,3 раза выше уровня контроля. Величина ИМ не измененялась. Характерно, что смешанный 8/(1 агонист даларгип в аналогичной дозе вызывал в наших опытах более интенсивную активацию синтеза ДНК в эпителии фундального отдела желудка. Возможно, это обусловлено преобладанием у даларгмпа 5-агонистических свойств (Т.Д. Паиькова, 1992), в то время как сродство р-эпдорфнпа к pi- и 8-рецепторам практически одинаково (L. Tseng et al., 1976).

В эпителии 12-перстной кишки Р-эпдорфип как и в эпителии фундального отдела желудка, вызывал стимуляцию процессов клеточного деления. Об этом свидетельствует 1,4-кратное увеличение ИМЯ в дуоденальном эпителии через 24 ч после введения пептида в дозе 100 мкг/кг. Величина ИМ достоверно не изменялись.

Эти данные свидетельствуют об участии р-эпдорфипа в регуляции пролиферативных процессоп в эптодермальном эпителии гаетро-нптеетнпалыюго тракта организма. Косвенным подтверждением этого предположения являются сведения В.А. Виноградова, В.М. Полонского (1983) о аптиульнеротспиом эффекте Р-эцдорфина на модели дуоденальных цистиамииовых язв белых крыс.

Дальнейшее изучение влияния пептидов семейства эпдорфипа было осуществлено в опытах с коротким фрагментом молекулы Р-эпдорфппа - у-эндорфином.

у-эндорфин состоит из 17 аминокислотных остатков молекулы ß-эндорфина, которые располагаются в последовательности:

Туг - Gly - Gly - Phe - Met - Try - Ser - Glu - Lys -Ser - Glu - Tre - Pro - Ley - Val - Tre - Ley.

По данным Y. Jacquet, N. Marks (1976), у-эндорфин имеет слабые анапьгетические свойства, что обусловлено его низкой д-опиоидной активностью (N. Ling. R. Gaillemin, 1976) и коротким периодом полураспада в биологических средах организма (F. Bloom cl al., 1976).

Влияние у-эндорфина на процессы клеточного деления изучали в дозах 10 и 100 мкг/кг. Пептид вводили в/б в 10 часов утра. Процессы клеточного деления изучали через 12 и 24 ч после воздействия. По техническим причинам (апликацию 3Н-тимидина осуществляли на роговицу) процессы клеточного деления в серии опытов с дозой пептида 10 мкг/кг изучали только в эпителии роговицы. Через 12 и 24 ч после введения ß-эндорфина в дозе 10 мкг/кг ИМЯ в эпителии роговицы был снижен, соответственно, в 1,5 и 2,1 раза по отношению к контролю. Величина ИМ была на этих сроках опыта снижена в 1,8 и 1,6 раза (Р<0,05). Это свидетельствует о угнетении синтеза ДНК под влиянием у-эндорфина в эпителии роговицы на обоих сроках наблюдения. Показатель МИ в эпителии роговицы через 12 и 24 ч был, напротив, увеличен по отношению к контролю, соответственно, в 1,4 и 1,8 раза.

Введение у-эндорфина в дозе 100 мкг/кг также вызывало в эпителии роговицы угнетение процессов клеточного деления (табл. 12). Через 12 ч после инъекции пептида в дозе 100 мкг/кг ИМЯ в эпителии роговицы снижался в сравнении с контролем в 2.1 раза, а ИМ - уменьшалась в 1,28 раза. Через 24 ч после введения у-эндорфина ИМЯ в эпителии роговицы был снижен в сравнении с контролем почти в 2 раза, а величина ИМ не отличалась от его уровня. МИ при этом не изменялся. Стабильность МИ через 24 ч на фоне депрессии синтеза ДНК вероятно обусловлена сохранением низкой скорости митоза.

В эпителии языка у-эндорфин в дозе 100 мкг/кг вызывал изменение процессов клеточного деления сходные с его эффектом в эпителии роговицы. Через 12 часов после введения пептида в дозе 100 мкг/кг показатели ИМЯ и ИМ в эпителии языка били снижены почти в 1,9 раза в сравнении с контролем. Величина МИ у подопытных животных на 12 часовом сроке была снижена в сравнении с контролем в 1,3 раза (Р<0.05). Спустя 24 часа после введения пептида ИМЯ и ИМ в эпителии языка уменьшались по отношению к контролю, соответственно, в 1,5 раза и 2,7 раза. МИ снижался почти в 2 раза.

В эпителии фундалыюго отдела желудка через 12 ч после введения у-эндорфина процессы синтеза ДНК не изменялись (табл. 13). На 24-часовом сроке ИМЯ был в 1,3 раза ниже показателя контроля, а величина ИМ оставалась стабильной.

Гш'ишц! 13

Изменение процессов клеточного деления вэпитслнях белых к-рыс черсм 12 часов после однократного парентерального введении у-эидорфина п дозе 100 мкг/кг

Группы животных Показатели пррлпферишш

МИ, 96« ИМЯ. % ИМ

Эпителий роговицы

Интактный контроль Подопытная (у-эндорфин) 3,6±0,2 4,9±0,4* 3.8±<>,1 1,8+0,1* К..5±0.4 1 2.8+0.5»

Эпителии я з |.| к а

Интактный контроль Подопытная (у-эндорфин) )4,8±0,2 11,6±0,5* 9,1+0,4 4.8+0.3* 3 1,3±2,1 16.4±0.<)<

Эпителий фундальпого отдела желудка

Интактный контроль Подопытная (у-эндорфин) 6,5±0,1 7,4±(),2 18,8+0,7 18,5±0,4

Эпителий 12-перстиой кишки

Интактный контроль Подопытная (у-эндорфин) 10,2+1,1 3,7±0,9> 14.2+1.2 12.5+0,7

Примечание. * отличие интакгного контроля достоверно (р<0.05).

В эпителии 12-перстной кишки через 12 ч после введения у-эпдорфнпа м дозе 100 мкг/кг ИМЯ был снижен в сравнении с контролем почти в 2.7 раза, а величина ИМ при этом не изменялась (табл. 13). На 24-часовом срокеопыта ИМЯ п ИМ в дуоденальном эпителии подопытных крыс не отличались от соот ие1 ствуюпшх показателей контроля .

Таким образом, у-эндорфин в эпителии роговицы, язык;1, фундальпого отдела желудка и 12-перстной кишки вызывает однонаправленное угнетение процессов синтеза ДНК. Оценку роли опиоидных рецепгорони реализации пнгпбпрующего влияния у-эндорфина на процессы пролиферации в эшггелнях экто- и энтодерма.п.пот происхождения осуществляли в опытах с налоксоном.

Налоксон в животным вводили в/б в дозе 200 мкг/кг за 40 мин. до нш.екцпп у-эндорфина в дозе 100 мкг/кг. Процессы клеточного деления изучали через 21 ч после экспериментального воздействия в эпителиях роговины, языка, фундальпого отдела желудка и 12-перстной кишки. Предварительная блокада опиоидных рецепторов налоксоном отменяла ингибирование ИМЯ в эпителии роговицы иод влиянием у-эпдорфина. Почти 2-кратное снижение в эпителии роговицы па фойе введения налоксона МИ косвенно свидетельствует, что блокада опнондпых рецепторов отменяет угнетение скорости митоза под влиянием у-эндорфина (табл. 12 ). И эпителии языка блокада опиоидных рецепторов налоксоном ослабляла в 1.3 раза (1'<0.05) депрессию ИМЯ под влиянием у-эпдорфипа и н 1,7 раза уменьшала мпетенпе показателя ИМ. В эпителии фундальпого отдела желудка блокада опиоидных рецепторов налоксоном устраняла депрессию ИМЯ под влиянием у-эндорфина и

вызывала его стимуляцию (табл. 12 ). Величина ИМ не изменялась. В дуоденальном эпителии блокада рецепторов налоксона несколько нивелировало ингибирование ИМЯ под влиянием у-эндорфина (табл. 12). Угнетение у-эндорфином ИМ в дуоденальном эпителии налоксон не отменял. Это косвенно свидетельствует, что угнетение у-эндорфином процессов пролиферации в наших опытах, по-видимому, обусловлено преобладанием у пептида к-агонистической активности.

7. Опноидные агонисты динорфина являются представителями пепидного семейства продшюрфина или проэнкефалина В, синтез которого регулируется в организме животных отдельным геном (V. Hollt, 1983). Обособленное семейственное представительство динорфина подтверждает присутствие в организме его специализированных к-опиоидных рецепторов (S. Paterson et al., 1983). Они были выделены при изучении синтетических аналогов морфина W. Martin et al., (1976). Рецепторы обнаружены у всех лабораторных животных, хотя их локализация в одноименных органах может и не совпадать (T. Ока et al., 1980).

Воспроизведение к-рецепторами морфиновой анальгезии без устранения ее характерной абстиненции свидетельствует о существенном отличии этих рецепторов от типичных |х- опиоидных рецепторов (W. Martin et al., 1976).

Динорфин вводили жинотным однократно в/б в дозах 10 и 100 мкг/кг в 10 часов утра. Клеточное деление изучали в эпителии роговицы, языка, желудка и 12-перстной кишки спустя 12 и 24 ч после экспериментального воздействия. Полученные данные свидетельствуют, что введение динорфина в дозах 10 и 100 мкг/кг на процессы синтеза ДНК в эпителии роговицы белых крыс оказывало ингибирующее влияние (табл. 14, 15). Спустя 12 и 24 ч после воздействия динорфина в дозе 10 мкг/кг ИМЯ в эпителии роговицы снижался соответственно в I, и 1,4 раза достоверно по отношению к контролю. Этому угнетению синтеза ДНК соответствовало однонаправленное снижение в 1,8 и 1,4 раза и показателя ИМ. Изменения митотической активности под влиянием динорфина в эпителии роговицы были разнонаправленными. Через 12 ч МИ был снижен в 1,3 раза в -сравнении с контролем. Возрастание в эпителии роговицы МИ через 24 ч после воздействия динорфина, возможно, было обусловлено замедлением темпов самого митоза.

Таблица 14

Влияние однократного парентерального введении динорфина в дозах 10 п 100 мкг/кг на процессы пролиферации в эпителии роговицы белых крыс

Сроки наблюдения Группы животных Показатели пролиферации

МИ, %о ИМЯ, % ИМ

Эпителий роговицы (10 м г/кг)

12 ч после воздействия Интактный контроль 3,4±0,1 5,3±0,1 19,8±0,7

Подопытная динорфин 3,7±0,2 2,5±0,1* 12,0+0,5*

24 ч после воздействия Интактный контроль 3,4±0,1 5,3±0,| 19,8+0,7

Подопытная динорфин 9,2+0,3* 2,9+0,1* 18,1 ±0,9

Эпителий роговицы (100 мкг/кг)

12 ч после воздействия Интактный контроль 3,4±0,1 2,9+0,1 17,8+0,5

Подопытная динорфин 2,б±0,2* 2,4+0,09* 9,7±0,4*

24 ч после воздействия Иитактный контроль 3,4+0,1 2,9±0,1 17,8+0,5

Подопытная динорфин 6,0±0,3* 2,0±0,2* 12,0±0,4*

Примечание: * отличие от интактного контроля достоверно (р<0,05).

Таблица 15

Влияние однократного парентерального введения динорфина в дозе 100 мкг/кг на процессы пролиферации вэпителиях белых крыс

Сроки наблюдения Группы животных Показатели пролиферации

МИ,%о ИМЯ, % ИМ

Эпителий языка

12 ч после воздействия Иитактный контроль 15,9±0,9 7,4+0,3 31,3+1,1

Подопытная динорфин 10,2+1,4* 5,5±0,2* 21,4+1,0*

24 ч после воздействия Иитактный контроль 15,9+0,9 7,4+0,3 31,3+1,1

Подопытная динорфин 19,4+1,2* 4,6+0,1* 19,3±1,0*

Эпителий желудка

12 ч после воздействия Иитактный контроль - 6,4+0,1 18,8+0,6

Подопытная динорфин - 3,6+0,2* 17,8+1,2

24 ч после воздействия Иитактный контроль - 6,4±0,1 18,8+0,6

Подопытная динорфин - 3,1+0,09* 19,0±1,7

Эпителий 12-перстной кишки

12 ч после воздействия Интактный контроль - 10,8±1,2 22,4±1,3

Подопытная динорфин - 4,9±0,7* 24,6+1,6

24 ч после воздействия Интактный контроль - 10,8±1,2 22,4+1,3

Подопытная динорфин - 6,3±0,9* 20,2+0,8

Примечание. * - отличие от интактного контроля достоверно (р<0,05).

Таким образом, динорфин индуцировал уменьшение количества клеток в периоде синтеза ДНК, в С2-периоде и самом митозе.

Повышение дозы до 100 мкг/кг не изменяло характера влияния пептида на процессы Ъинтеза ДНК в эпителии роговицы. Величина ИМЯ была через 12 и 24 ч после введения к-агониста в 2,1 и 1,6 раза ниже ее уровня у ингактных крыс . Показатель ИМ через 12 ч был также в 1,6 раза меньше, а через 24 ч не отличался от контрольного уровня. Напомним, что при дозе 10 мкг/кг изменение скорости синтеза ДНК сохранялось и на этом сроке наблюдения. МИ в эпителии роговицы через 12 часов после воздействия динорфина не изменялся, а спустя 24 ч его показатель почти в 2,7 раза, превышал величину кош роля. Эти опыты показывают, что 10-кратное увеличение дозы вводимого животным к-агониста динорфина способствует дальнейшему угнетению пролиферации в эпителии роговицы.

В эпителии языка (табл. 15) динорфин в дозе 100 мкг/кг вызывал угнетение синтеза ДНК на обоих сроках наблюдения. Спустя 12 и 24 ч после введения динорфина ИМЯ в эпителии языка был снижен в 1,3 и 1,6 раза в сравнении с показателями контроля, а ИМ соответственно, в 1,4 и 1,6 раза. Уменьшение МИ в эпителии языка через 12 часов после инъекции динорфина было детерминировано сопутствующим угнетением процессов синтеза ДНК. На 24-часовом сроке исследования увеличение МИ в эпителии языка могло быть обусловлено замедлением скорости митоза.

Результаты опытов свидетельствуют, что агонист к- опиоидных рецепторов динорфин в дозах 10 и 100 мкг/кг вызывает в эктодермальных эпителиях роговицы и языка угнетение процессов синтеза ДНК.

В эпителии фундального отдела желудка динорфин в дозе 100 мкг/кг угнетал процессы синтеза ДНК на обоих сроках исследования. Спустя 12 и 24 ч показатель ИМЯ уменьшался, соответственно, в 1,7 и 2 раза по сравнению с контролем. ИМ оставалась на обоих сроках стабильной. В эпителии 12-перстпой кишки через 12 и 24 ч после в/б инъекции динорфина в дозе 100 мкг/кг ИМЯ был, соответственно, в 2,2 и 1,7 раза ниже величины этого показателя у контрольных крыс. ИМ на обоих сроках не изменялась.

Динорфин в дозе 10 мкг/ кг вызывает угнетение процессов синтеза ДНК и изменение митотической активности в эпителиях роговицы, а в дозе 100 мкг/кг, кроме того, эпителиев языка, фундального отдела желудка и 12-перетной кишки спустя 12 и 24 ч после экспериментального воздействия.

Эти эксперименты позволяют предполагать, что все 4 исследуемых семейства опиоидных пептидов вовлечены в механизмы регуляции синтеза ДНК в эпителиальных тканях. Показательно, что каждое опиоидное семейство (за исключением динорфина) включает лиганды, вызывающие активацию процессы клеточного деления и их ингибирование. Наиболее вероятной причиной этого мы считаем дифференцированное взаимодействовие изучаемых лигандов с субпопуляциями опиоидных рецепторов. Представители семейства энкефалинов (ДАГО, дерморфин, пептид А-43), взаимодействуя с ц-популяцией опиоидных рецепторов, вызывали в эпителии угнетение синтеза ДНК. В определенной мере это свойственно и •у-эндорфину. Лиганды 5-ониоидных рецепторов (ДАДЛ, ДАСЛЕТ, даларгин), вызывают активацию процессов синтеза ДНК в эпителии роговицы и языка.

В эптодермальном эпителии фундального отдела желудка и 12-перстной кишки агонисты ц- и 8-опиоидных рецепторов стимулировали процессы синтеза ДНК и клеточную пролиферацию. Биологическая целесообразность подобного разграничения требует дополнительного анализа.

Полученные данные свидетельствуют о вовлеченности опиоидэргичес кой системы в регуляцию процессов пролиферации эпителиальных тканей. Характер митогешюго влияния зависит от вида секретируемых пептидов и субпопуляиии и подтипа опиоидных рецепторов, с которыми они взаимодействуют.

8. Известно, что реализация биологических эффектов опиоидов на организм осуществляется за счет инициации систем внутриклеточных мессенджеров, к которым относится и циклонуклеотидный механизм. По W. Moens et a!, (1975), увеличение содержания цГМФ или снижение концентрации цАМФ вызывает стимуляцию процессов пролиферации в культуре фибробластов. Данные H.A. Федорова и соавт, (1990) свидетельствуют, что подобные изменения соотношения циклических нуклетотидов в клетках являются универсальным механизмом реализации процессов клеточного деления в различных тканях в физиологических условиях и при патологии.

Большая часть биологических эффектов опиоидов, также опосредуется через изменения активности в тканях циклических нуклеотидов. Как показано В.В. Закусовым и соавт. (1982), введение животным цАМФ снижает у них аналгетический эффект опиоидных аналогов энкефалина. Опиоидные пептиды вызывают активацию фосфодиэстеразы и увеличение содержания цГМФ, которые инициируют далее угнетение адемилатциклазы с последующим торможением образования цАМФ (К. Schror, 1986). На способность ß-эндорфина снижать содержание цАМФ in vivo и in vitro указывает G. Matsuniura et al., (1990), а к-агониста динорфина Р. Eriksson et al., (1990).

Эти представления стали основанием для изучения изменения содержания цАМФ в ряде эпителиальных тканях при однократном введении крысам синтетических агонистов 6-, р.- и к-опиоидных рецепторов в наших опытах. Опиоидные пептиды: даларгин, ДАГО, аналог дерморфина, пептид (А-10) и динорфин вводили крысам в/б в дозе 100 мкг/кг. В этих дозах опиоиды почти не проникают через ГЭБ и реализуют в основном свои периферические влияния (E.Brovvnson et al., 1994 ). Забой животных осуществляли через 4 часа после воздействия пептидов, с тем чтобы оценить влияние агонистов не только на Go - М, точку клеточного цикла, но и большую часть G2 периода (С.С. Тимошин, 1983).

Определение цАМФ осуществляли в эктодермальном эпителии роговицы и энтодермальном эпителии фундалыюго отдела желудка радиоиммунным методом.

Через 4 часа после однократного в/б введения крысам ц-агониста ДАГО в дозе 100 мкг/кг содержание цАМФ в ткани роговицы в сравнении с контролем не изменялось (табл. 9). Хотя через 4 и 12 ч после введения данного пептида в аналогичной дозе в эпителии роговицы наблюдалось ингибирование синтеза ДНК и клеточного деления (табл. 8). Это угнетение пролиферации на фоне неизменного уровня цАМФ может быть обусловлено снижением в роговине содержания цГМФ. Такое предположение представляется правомерным, так как для реализации эффектов опиоидов по мнению H.A. Федоров и соавт.,(1990) необходимо относительное преобладание цАМФ.

Не изменялся уровень цАМФ в ткани роговицы и после ведения животным S -агоииста - даларгипа, который по данным Т.Д. Паньковой (1992), индуцировал в эпителии роговицы активацию синтеза ДНК. В то же время, к-агонист динорфин через 4 ч после в/б введения в дозе 100 мкг/кг вызывал в ткани роговицы достоверное увеличение содержания цАМФ (табл. 14), что совпадает с угнетением в ее эпителии процессов синтеза ДНК и клеточного деления (табл. 15).

Изменение содержания цАМФ в ткани фундального отдела желудка через 4 ч после в/б однократного раздельного введения им в дозе 100 мкг/кг агонистов ц-, 5- и к -рецепторов был недоставерным. Однако, на процессы пролиферации в эпителии желудка эти агонисты оказывали выраженное влияние (табл. 9). Агонист ц-рецепторов ДАГО также не вызывал изменений в ткани желудка крыс содержания цАМФ. В то же время, в эпителии фундального отдела желудка аналогичное введение ДАГО вызывало через 2 и 12 ч активацию синтеза ДНК (табл. 16).

Неодинаковое влияние обоих пептидов с ц-агонистическими свойствами на процессы пролиферации в СОЖ крыс может быть обусловлено различием продуктов протеолиза ДАГО и А-10, создающим в эпителии желудка разный баланс стимулирующих и угнетающих клеточное деление влияний.

Кроме того, оба пептида могуг взаимодействовать с разными подтипами р,-рецепторов (Б. В1юип$и1е е1 а!., 1994). Содержание цАМФ под влиянием даларгина в ткани фундального отдела желудка имело лишь незначительную тенденцию к снижению (табл. 16).

Можно полагать, что стимуляция синтеза ДНК в желудочном эпителии под влиянием даларгина может быть реализована при относительно стабильном цАМФ за счет увеличения в ткани содержания цГМФ. Согласно полученным нами ранее данным (табл. 15), агонист к-опиодных рецепторов дииорфип вызывает в эпителии СОЖ белых крыс угнетение синтеза ДНК, что совпадает в данном случае лишь с незначительным увеличением в ткани этого отдела желудка содержания цАМФ (табл. 16).

Таким образом, через 4 ч после в/б введения животным агонистов ц-, 5- и к-опиоидных рецепторов изменений содержания цАМФ в ткани фундального отдела желудка не происходило. При этом синтез ДНК в эпителии фундального отдела же лудка под влиянием р- и 5-агонистов достоверно возрастал (табл. 6, 8-10). Изучая со-

Таблица 16

Влияние однократного введения опиоидных пептидов в дозе 100 мкг/кг на содержание цАМФ в тканях роговицы и желудка белых крыс

Группы животных Объекты исследования

Ткань роговицы Ткань желудка

Интактный контроль 10,1 ±0,5 41,4±6,1

ДАГО 8,2+0,7 44,7+4,4

Дерморфин 8,3+1,4 44,1+5,1

Даларгин 9,0±0,4 40,7+4,3

Динорфин 13,3+1,3* 45,4+6,7

Примечание: * - отличие от контроля достоверно (р<0,05). держание цАМФ в эпителии роговицы и фундального отдела желудка, мы исходили из данных С. МШ^ап е!: а1. (1987) о том, что способность опиоидных пептидов угнетать в клетках образование цАМФ уменьшается в ряду их: б- > Ц- > к-агонистического связывания.

Полученные данные не подтвердили этого предположения для эпителиальных тканей. По-видимому, наряду с изменением концентрации цАМФ, значительная роль принадлежит также изменению в эпителии цГМФ или соотношения цАМФ/цГМФ (L. Wang , A. Gintzler, 1994). Определение цГМФ по техническим причинам в наших экспериментах не проводилось.

Биологическая целесообразность вовлеченности лигандов олиоидных рецепторов в регуляции клеточного деления эпителиев,по-видимому, заключается в том, что они выделяются в ответ на болевой стимул, который, как правило, сопровождает нарушения тканевого гомеостаза.

Возможно, что мет-энкефалин участвует в реализации «реактивного торможения» митозов в первые часы стрессорных воздействий. Приспособительная роль «реактивного торможения» заключается в предотвращении формирования митотического аппарата в период максимального нарушения тканевого гомеостаза и активации процессов перекисного окисления липидов, которые индуцируют образование аберрантных митозов (С.С.Тимошин, 1983).

Выделяющиеся позднее лей-энкефалин и Р-эндорфин способствуют восстановлению целостности поврежденных в период воздействия стрессора внутриклеточных структур (T. Tomoaki et al., 1991). В то же время, опиоидные агонисты могут вовлекаться в реализацию постстрессорного восстановления тканей и поддержания их клеточной дифференцировки (S. Bhounsule et al., 1994).

9. Для получения максимального биологического эффекта нейропептидов их наименьшими дозами важное значение имеет поиск оптимальных путей их введения в организм. Это положение актуально и в отношении опиоидных пептидов (А.А.Каменский и соавт., 1988).

Раличие биологических эффектов нейропептидов и лигандов опиоидных рецепторов при различных способах введения в организм возможно за счет несовпадением их центральных и периферических влияний. Это может быть обусловлено их разной способностью проникать через ГЭБ, неодинаковой устойчивостью к влиянию эндопептидаз, дифференцированной аффинностью к субпопуляциям опиоидных рецепторов и спектром индуцируемого ими регуляторного континуума (И.П. Ашмарин и соавт., 1988).

Интраназальный способ введения дает методическую возможность выявления новых неизвестных ранее функций у уже изученных нейропептидов (О.А. Гомазков, 1996). Выявление у ряда нейропептидов и опиоидных лигандов митогенного влияния в отношении эпителиальных тканей организма (С.Е. Спевак и соавт., 1987; С.С. Тимошии и соавт., 1994) предполагает возможность модификации этого эффекта в зависимости от способа введения этих веществ в организм. Сопоставление характера митогенного эффекта нейропептидов при их интраназальном и в/б введении представляет прагматический интерес и для нужд офтальмологической практики так как позволяет воспроизводить меньшими дозами биологические эффекты более выраженные, чем при в/б введении.

В опытах были использованы два опиоидных пептида: даларгин и дерморфин. Пептиды вводили раздельно по группам однократно в/б в дозах 10 и 100 мкг/кг. Параллельным группам крыс эти пептиды вводили в аналогичных дозах микродозатором в объеме 0,02 мл и/н. Клеточное деление изучали спустя 4, 12 и 24 ч после экспериментального воздействия. Результаты исследований представлены на рис. 1, 2.

Агонист 5-опиоидных рецепторов даларгин в дозах 10 и 100 мкг/кг при в/б введении вызывал в эпителии роговицы белых крыс через 4, 12 и 24 часа активацию процессов синтеза ДНК.

В дозе ,100 мкг/кг при в/б введения данная активация показателя ИМЯ была гораздо более выражена па 4- и 12-часовом сроке, но спустя 24 ч не отличалась от уровня контроля.

Влияния на синтез ДНК даларгина при и/н введении носил более сложный и неоднозначный характер. В дозе 10 мкг/кг при и/к введении даларгин стимулировал активацию синтеза ДНК спустя 4 и 24 ч после воздействия, как и при в/б введении пептида, но на 12-часовом сроке вызывал его угнетение (рис. 1).

В дозе 100 мкг/кг даларгин при и/н ведении на 4- и 12-часовом сроке не изменял величины ИМЯ. Напротив, спустя 24 ч после инсталляции даларгина в дозе 100 мкг/кг в эпителии роговицы происходило почти 2-кратное снижение ИМЯ по сравнению с контролем.

Диаметрально противоположный характер влияния даларгина, по сравнению с его воздействием при аналогичном введении в дозе 10 мкг/кг, мог быть обусловлен несколькими обстоятельствами. Возможно, меньшая доза даларгина не проникает через ГЭБ в мозг, но за счет чрезвычайно быстрого проникновения в кровоток стимулирует в эпителии роговицы активацию синтеза ДНК.

По-видимому, реакция механизмов регулирования тканевого гомеостаза, активируемая такой мощной активацией синтеза ДНК способствует компенсаторному снижению ИМЯ на 12-часовом сроке наблюдения. А спустя 24 ч величина ИМЯ, индуцируемая дозой 10 мкг/кг, пе отличалась от ее значения при в/б воздействии даларгина. Напротив, доза пептида 100 мкг/кг при и/н введении не оказывала влияния па синтез ДНК в эпителии роговицы через 4 и 12 ч после ее воздействия.

Возможно, этот парадоксальный эффект обусловлен суммированием центрального и периферического влияния даларгина на процессы пролиферации. Косвенным свидетельством реальности подобного центрального компонента могут быть данные Я.А. Росина, (1984) о диаметральной противоположности биологических эффектов БАВ при их влутримозговом и периферическом воздействии на организм.

Угнетение синтеза ДНК в эпителии роговицы под влиянием и/н введения даларгина в дозе 100 мкг/кг на 24-часовом сроке также может быть вызвано подобным центральными механизмами. Частично проникая в мозг из слизистой носа в дозе 100 мкг/кг, 5/(j -агонист опиоидных рецепторов даларгин может более энергично взаимодействовать с высоко аффинными р-опиоидными рецепторами, которые преобладают в гипоталамусе (R. Goodman et al., 1980). Активация этой субпопуляции опиоидных рецепторов способна индуцировать угнетение процессов пролиферации и синтеза ДНК в ряде эпителиальных тканей (С.С. Тимошин и соавт., 1994).

'Уровень контроля О—10 мкг/кг интраназально

•"•О—»100 мкг/кг интраназалыю ' в " 10 мкг/кг внутрибрюшинно

' • ~ 100 мгк/кг внутрибрюшинно

Рис. 1. Влияние даларгнна на процессы синтеза ДНК в эпителии роговицы белых крыс при однократной ннтраназальном и внугрибргошинном введении в дозах 10

и 100 мкг/кг.

* - отличие от контроля статистически достоверно (Р<0,05).

В то же время, часть даларгина, проникая из слизистой носа в кровоток, способна вызывать выраженную стимуляцию процессов синтеза ДНК, как это демонстрирует эффект и/н введения пептида в дозе 10 мкг/кг. Взаимодействие этого центрального и периферического влияния даларгина, по-видимому, и обуславливает своеобразную динамику ИМЯ в эпителии роговицы через 4, 12 и 24 ч после его и/н введения в дозе 100 мкг/кг.

Соотношение эффектов в/б и и/н введения агониста Ц-опиоидных рецепторов дерморфина на процессы синтеза ДНК в эпителии роговицы имело существенные отличия от картины, имевшей место при введении даларгина. При в/б введении в дозе 10 мкг/кг дерморфин индуцировал в эпителии роговицы снижение ИМЯ через 4 ч после воздействия. На 12- и 24-часовом сроках наблюдения ИМЯ было соответственно почти в 3 и 2 раза ниже показателя контроля. При в/б введении дерморфина в дозе 100 мкг/кг угнетение процессов синтеза ДНК в эпителии роговицы было более

выраженным. ИМЯ через 4 и 12 ч после воздействия этой дозы был почти в 2 и 1,3 раза ниже уровня контроля (рис. 2).

"Уровень контроля —■О—10 мкг/кг интраназально

-—О—- 100 мкг/кг интраназально • " 10 мкг/кг внутрибрюшинно

100 мгк/кг внутрибрюшинно

лс. 2. Влияниедерморфннл па процессы синтеза ДНК в эпителии роговицы белых крыс при однократном ннтраназалыюм и внутрибрюшинном введении в дозах 10 и 100

мкг/кг.

* - отличие от контроля статистически достоверно (Р<0,05).

Это более раннее и более выраженное угнетение ИМЯ под влиянием высокой дозы дерморфина закономерно сменялось к 24 ч достоверным в 1,7-кратным его возрастанием. Оно, по-видимому, имело компенсаторный характер и была обусловлена предшествующим угнетением синтеза ДНК.

Таким образом, эффекты дерморфина на процессы синтеза ДНК в эпителии роговицы при и/н и в/б введении носило сходный характер. В то же время, дерморфин в дозе 10 мкг/кг при и/н введении на протяжении 24 ч вызывал угнетение процессов синтеза ДНК в эпителии роговицы более слабое, чем при в/б аналогичной дозы пептида. Максимальный иигибирующий эффект дозы дерморфина 10 мкг/кг при обоих путях введения приходился на 12 ч после его воздействия.

Дерморфипа при и/н введеиеии в дозе 100 мкг/кг индуцировала угнетение ИМЯ в эпителии роговицы только через 12 ч после воздействия . К 24 ч эта депрессия сменялась, как и при в/б воздействии аналогичной до'зы пеп-тида, увеличением синтеза ДНК. Однако это увеличение ИМЯ было в 3 раза меньше, чем при в/б введении пептида.

При и/н введении дерморфипа на всех сроках воздействия в дозе 10 и 100 мкг/кг так же, как и при в/б введении, вызывал в эпителии роговицы угнетение показателя ИМЯ однако, оно носило более кратковременный характер.

Тот факт, что угнетение ИМЯ при в/б и и/н введении обоих доз дерморфипа не утрачивает своей направленности и имеет сходный характер, позволяет предполагать, что в реализации этого эффекта участвуют сходные регуляторные периферические механизмы.

В то же время, данные о возможном парадоксальном соотношении эффектов и/н и в/б введения дерморфипа (ЕЛО. Батурина и соавт,, 1988), отсутствие единого представления о механизмах и/н влияния нейропептидов на организм (A.A. Каменский и соавт., 1989) не позволяют проанализировать механизмы изменений ИМЯ при и/н воздействии дерморфипа в наших экспериментах более подробно.

Влияниям нейропептидов и опиоидов на физиологические процессы носит модуляторный характер (Ю.Б. Дишманов и соавт., 1997). Конечный эффект их влияний во многом зависит от исходного состояния регулируемых физиологических функции, в том числе, клеточного деления. ОАС сопровождает большинство патологических процессов в организме (О.И. Кириллов, 1996), поэтому оценка фармакологических веществ проводится, как правило, и на фоне воздействия ОАС.

В серии исследований ЦНИИ ДВГМУ получены сведения о способности опиоидных пептидов ослаблять постстрессорное угнетение синтеза ДНК в эпителиальных тканях ускорять наступление компенсаторной стимуляции клеточного деления, а также предотвращать ускорение вертикальной миграции эпителиоцитов при стрессе (С.С. Тимошин и соавт., 1990).

В тоже время опыты лаборатории Е.Д. Гольдберга (1988) свидетельствуют, что иммобилизационный стресс вызывает гипертрофию костного мозга, которая обусловлена гиперсекрецией глюкокортикоидов и адреналина. При этом даларгин предотвращает развитие постстрессорной гиперплазии ткани, а мет-энкефалин вызывает ее усиление, причем введение налоксена отменяет эффекты обоих опиоидных агонистов.

Различие реакций пролиферативных процессов на стресс и воздействие опиоидных пептидов в наших опытах и исследованиях Е.Д. Гольдберга может быть обусловлено различным гистогенезом покровного эпителия и костный мозг, характером их гистофизиологических функций и разной ролью этих тканей в развитии ОАС, а также исследованием процессов пролиферации в разные сроки после экстремальных воздействий.

Разнонаправленная реакция процессов пролиферации на стресс и неоднозначная роль эндогенных опиоидных пептидов в устранении постстрессорных нарушений тканевого гомеостаза, послужил основанием для изучения влияния опиоидных пептидов на процессы пролиферации эпителиев на двух моделях физических стрессов.

1. Однократное и пятикратное общее перегреваиие животных при 41°С, относящееся к тяжелым, некомпенсируемым стрессам с высокой интенсивностью пероксидации тканей (Г.И.Блекман, 1987).

2. Пятикратное общее 7-облучение животных в суммарной дозе 5 Гр, относящееся к слабо компенсируемым стрессам с высокой интенсивностью пероксидации тканей (В.А. Барабой и соавт.,1992).

10. Общее перегревание до температуры 41,0°С является для млекопитающих животных одним из наиболее тяжелых экстремальных воздействий (Н.Б. Козлов, 1990). Оно вызывает выраженные нарушения рецепторного аппарата и механизмов ионного транспорта клеточных мембран и цитоплазматических структур клеток (Я. Ма1уара а а1., 1991), что способствует нарушению под влиянием гипертермии в тканях, в том числе эпителиальных, процессов клеточной пролиферации (М.И. Радивоз, С.С. Тимошин, 1980). Основной причин гипертермических нарушений пролиферации в тканях является ингибирование синтеза ДНК и увеличение уровня аберрантных митозов.

Перегревание осуществляли в вентилируемой термокамере при температуре 41,0°С на протяжении 2 ч. В опытах было использовано 4 группы животных. Первой группе животных за 30 минут до перегревания в/б в дозе 10 мкг/кг однократно вводили даларгин. Вторая группа крыс получала в/б изотонический раствор хлорида натрия и подвергалась перегреванию. Для выяснения участия эндогенных опиоидных пептидов в регуляции процессов клеточного деления при воздействии гипертермии третьей группе животных перед перегреванием в/б в дозе 100 мкг/кг вводили блокатор опиоидных рецепторов - налоксон. В этой дозе он, помимо ц- блокирует и 5-опи-оидные рецепторы (И.П.Ашмарин, 1982). Животным четвертой группы в/б вводили раствор хлорида натрия.Они не подвергались воздействию гипертермии и служили интактпым контролем.

Через 24 ч после однократного перегревания в эпителии роговицы белых крыс отмечалось почти 1,25 кратное (Р<0,05) угнетение ИМЯ в сравнении с интактным контролем. Как проявление компенсаторной активации синтеза ДНК при однократном перегревании следует расценивать почти 1,3- кратное повышение в эпителии роговицы ИМ. 1,4-кратное уменьшение МИ в этих условиях может быть обусловлено растяжкой во времени митоза. Выражением цитопатического влияния однократной гипертермии стало 2-кратное повышение уровня аберрантных митозов в сравнении с интактными животными и расширение их спектра за счет увеличения «мостов» (табл. 17).

Эти изменения свидетельствуют, что однократное перегревание вызывает значительное нарушение процессов пролиферации в эктодермальном эпителии роговицы. Введение белым крысам 5-агониста даларгина, способствовало ослаблению нарушений процессов клеточного деления в эпителии рого вицы под влиянием однократной гипертермией. Это иллюстрирует 1,3- кратное увеличение ИМ.

Таблица 17

Влияние парентерального введения даларгина на процессы клеточного деления в эпителиях роговицы н языка белых крыс при однократной общей гипертермии

Группы

животных

Показатели пролиферации

МИ, 96»

ПМ, %

ИМЯ, %

ИМ

Эпителий роговицы

Интактный контроль

6,6±0,6

5,6+0,3

9.1 ±0,2

14,9+0,4

Подопытные: гипертермия

4,5+0,4*

11,3+0,5*

7,2±0,6*

19,8+1,5*

гипертемня +даларгин

17,6±1,7*

7,9±0,6*

5,8±0.4*

26,0±1.8*

гппертемня ч-налоксон

30,9+1,9*

14,2±0,5*

5,3+0,2*

16.2*1.5

Эпителий языка

Интактный контроль

11,6±0,8

5,2+0,4

30,9±2,2

Подопытные: гипертермия

13,4+0,5

Ю,б±0,8*

27,9+2,5

гипертемня +даларгин

18,8±0,8*

4,8+0,4

25,5±0,9

гипертемня +наюксон

16,6+0,9«

7,2±0,4*

32,8±0,7

Примечание: * достоверное отличие от интактного контроля (р<0,05); **-отличие от показателей гипертермнческого контроля достоверно (Р<0,05).

Стимуляция ИМ является одним из проявлений компенсаторной активации процессов клеточного деления, направленной на восстановление нарушенного тканевого гомеостаза (С.С. Тимошин, 1983).

Подтверждением цитопротективного влияния даларгина является снижение под его влиянием уровня аберрантных митозов, индуцированных воздействием высокой температуры. И хотя их количество превышало в 1,4 раза уровень интактного контроля, оно в 1,4 раза было ниже их содержания в эпителии роговицы перегретых животных.

В эпителии языка однократное перегревание вызывало 2-кратное увеличение ИМЯ ,без изменения ИМ. Ранее нами было показано, что снижение ИМЯ в эпителии языка отмечается в интервале 4-12 ч после однократного перегревания. Спустя 24 ч в эпителии языка перегретых крыс наблюдалась компенсаторная волна стимуляции клеточного деления (М.И. Радивоз и соавт., 1982).

Предварительное введение даларгина вызывало в эпителии языка перегретых животных 1,2-кратпое снижение ИМЯ. Это снижение числа ДНК-синтезируюших ядер можно расценивать как проявление нормализации тканевого гомеостаза, которое может быть обусловлено ослаблением повреждения эпителия языка высокой температурой на фоне введения животным даларгина.

Свидетельством о цигопротективном влиянии даларгина при однократной гипертермии является уменьшение содержания аберрантных митозов. Несмотря па кажущуюся противоречивость снижения процессов синтеза ДНК под влиянием даларгина при воздействии однократной гипертермии оно, по-видимому, является проявлением единого гистофизиологического механизма - нормализации нарушенного тканевого гомеостаза покровного эпителия после экстремального воздействия за счет активации субпопуляции р-огшоидных рецепторов.

Другим подтверждением цитопротективного влияния опиоидных пептидов стало дальнейшее нарастание аберрантных митозов в эпителии роговицы перегреваемых крыс при введении им блокатора ониоидных рецепторов налоксона. Важно, что предварительное введение налоксона перегреваемым животным ослабляло компенсаторное повышение ИМЯ и в эпителии языка.

Пятикратное перегревание крыс вызывало в эпителии роговицы компенсаторную активацию процессов синтеза ДНК. Через 24 ч после заключительной гипертермии ИМЯ в эпителии роговицы был в 2,3 раза выше его уровня у интактных крыс, а ИМ увеличивалась почти в 3 раза. Эта активация синтеза ДНК является характерным проявлением стимуляции процессов клеточной пролиферации при убыли или гибели клеток от разных по своей природе причин (С.С. Тимошин, 1983). Отсутствие на фоне активации процессов синтеза ДНК увеличения МИ обусловлено .по-видимому, уменьшением количества, вступающих в митоз клеток или сокращением времени самого митоза. Проявлением цитопатического влияния пятикратной гипертермии в эпителии роговицы стало почти 2- кратное увеличение уровня аберрантных митозов.

Предварительное введение даларгина при пятикратном перегревании иарадоксолыю тормозило компенсаторную активацию процессов синтеза ДНК. Через 24 ч после заключительной гипертермии на фоне введения агониста 8-ониоидных рецепторов даларгина ИМЯ в эпителии роговицы был в 4,3 раза ниже его уровня у крыс, подвергнутых только воздействию повторных перегреваний. ИМ при этом уменьшалась почти в 4,4 раза. Подтверждением цитопротективного влияния даларгина у пятикратно перегретых крыс является 1,7-кратное снижение, в эпителии роговицы уровня ПМ. Блокада даларгином компенсаторной стимуляции синтеза ДНК в эпителии роговицы при повторных перегреваниях может происходить за счет интенсивного теплового цитолиза в эпителии роговицы клеток пролиферативного пула и нарушение вступления их в 8-период.

Возможно потенцирование даларгином теплового коллапса и гипоксии, что способствует расстройству диффузного питания эпителия роговицы и ипгибированию синтеза ДНК. В эпителии языка пятикратная гипертермия также вызывала компенсаторную стимуляцию процессов синтеза ДНК. Через 24 ч величина ИМЯ и ИМ в эпителии языка была почти в 2 раза выше уровня обоих этих показателей у животных интактной группы. Этой активации синтеза ДНК в эпителии языка соответствовало почти 1,6-кратное увеличение МИ.

Предварительное введение даларгина ослабляло компенсаторное увеличение синтеза ДНК в эпителии языка под влиянием теплового стресса. Через 24 ч после заключительной гипертермии ИМ в эпителии языка была почти в 1,4 раза ниже этого показателя у животных, подвергнутых только воздействию повторных перегреваний. ИМЯ, напротив, был почти в 1,5 раза выше аналогичного показателя у животных, перегреваемых без введения даларгина.

Возможно равнозначные, но противоположные изменения ИМЯ и ИМ не являются проявлением стабилизации синтеза ДНК в эпителии языка в этих условиях. Напротив, 1,4-кратное увеличение ИМЯ, по-видимому, отражает нарушения прохождения клетками 8-периода. В пользу этого предположения свидетельствует 1,4-кратное угнетение показателя ИМ. 1,5-кратное увеличение МИ в эпителии языка на фоне ингибирования ИМ, по-видимому, обусловлено увеличением времени митоза.

Даларгин при пятикратной гипертермии предотвращал компенсаторную активацию синтеза ДНК и способствовал дальнейшему нарастанию нарушений тканевого гомеостаза под влиянием теплового стресса и в эпителии языка.

В эпителии фундалыюго отдела желудка через 24 ч после пятикратного перегревания в сравнении с интактиыми животными наблюдалось 3,6-кратное увеличение ИМЯ и 1,3-кратное увеличение ИМ. Предварительное введение даларгина предотвращало развитие компенсаторной стимуляции синтеза ДНК в эпителии желудка, как в эпителии роговицы и языка. ИМЯ и ИМ в эпителии фундалыюго отдела желудка были в 3,4 и 2,3 раза ниже соответствующих показателей в группе крыс, подвергнутых воздействию 5-кратной гипертермии без введения пептида. Это свидетельствует, что даларгин препятствует нормализации клеточного деления и тканевого гомеостаза покровных эпителиев крыс в условиях повторных воздействий сублетального перегревания (табл. 18).

Причиной разнонаправленного влияния 5-агониста даларгина на процессы синтеза ДНК в эпителиях при однократном и пятикратном перегревании является, по-видимому, потенцирование даларгином теплового коллапса и развитием циркуляторной гипоксии (В.Н. Елецкий и соавт., 1985).

11. Наряду с перегреванием ионизирующее излучение является одним из наиболее тяжелых экстремальных воздействий, вызывающих стойкое нарушение процессов физиологической регенерации в тканах и органях организма (Т.П. Сегеда, 1996), а также значительные изменения деятельности нервной, иммунной и эндокринной систем, формирующих клиническую картину лучевой болезни (Н.П. Савина, 1996).

Таблица 18

Влияние внутрибрюшинного введения даларгина на процессы клеточного деления в эпителиях роговицы, языка и фундалыюго отдела желудка белых крыс _при 5-кратной общей гипертермии_

Группы животных Показатели пролиферации

МИ, 96» ПМ, % ИМЯ, % ИМ

Эпителий роговицы

Интактный контроль 7,5±0,6 5,7±0,3 7,2±0,2 11,2+0,3

Подопытные: гипертермия 8,2±0,8 13,6+1,5* 17,0±1,2* 34,3±1,1*

Гипертемия +даларгин 7,4±0,7 7,8+0,6* 4,0±0,2*' 7,7±0,3*'

Эпителий языка

ИнтактныП контроль 10,3 ±0,4 - 5,3+0,2 17,1 ±0,5

Подопытные: гипертермия 16,4+1,1* - 11,2±0,3* 36,9±1,9*

Гипертемия +■даларгин 23,9+1,2*' - 16,7±1,4* 26,0+1,1*'

Эпителий фундалыюго отдела желудка

ИнтактныН контроль - - 3,8+0,3 15,8*1,8

Подопытные: гипертермия - - 13,8+0,6* 20,7+2,1*

Гипертемия +даларгин - - 4,0±0,3' 9,1 ±0,5*'

Примечание. *- отличие от интактного контроля достоверно (Р<0,05); '*-отличие от показателей гинертермического контроля достоверно (Р<0,05).

Наиболее высокой чувствительностью к воздействию у-издучения в организме обладают кроветворная и лимфоидная ткань, эпителий желудочно-кишечного тракта, сперматогенный эпителий (Л.П. Косиченко, 1987; A.M. Никифорова и соавт., 1996).

Угнетение пролиферативных процессов ионизирующим излучением может быть обусловлено нарушением систем вторичных мессенджеров (Б.А. Цудзевич и соавт., 1993), локальным повреждением хромосом (Н. Tateno et al., 1996; A. Biccialini et al., 1996), митотического аппарата делящихся клеток (Е. Weller, 1996), изменением ионного гомеостаза клеток (I. Dullinean et al., 1996), повреждением цитоскелета (Б.В. Сорочинский, 1993), рецепторного аппарата клеток (В.М. Новикова и соавт., 1996) и контактных структур между гетерогенными клеточными элементами в тканях и органах организма (E.H. Гопчаренко и соавт., 1994).

Эти изменения являются одной из причин нарушения в организме тканевого гомеостаза. К важным биологическим эффектам у-облучения относятся индукция в клетках патологических митозов, которые являются информативным показателем накопления в организме доз ионизирующего облучения (H.A. Мазник, В.А. Винников, 1993).

Наиболее перспективным методом реализации радиопротекторных эффектов в тканях организма в настоящее время расценивается стимуляция специфических клеточных рецепторов (В.И. Кулинский, 1993), к которым относятся опиоидные рецепторы.

Пятикратное воздействие у-облучения в суммарной дозе 5 Грей вызывает в эпителии роговицы белых крыс угнетение процессов клеточного деления и резкое повышение уровня аберрантных митозов. Через 24 часа после заключительного воздействия показатель ИМЯ в эпителии роговицы был в 4,7 раза ниже величины интактного контроля, величина ИМ уменьшалась в 1,37 раза (табл. 19).

Таблица 19

Влияние парентерального введения дерморфина и даларгина на процессы клеточного делення в эпителии роговицы белых крыс при пятикратном общем у_облучении_

Группы животных Показатели пролиферации

МИ.%, пм, % ИМЯ, % ИМ

Контрольные группы:

Интактная 5,8±0,3 5,3+0.1 8,9±0,2 10,7+0,7

Облученная 2,9±0,1 * 13,1+0,2* 1,9±0,1 * 7,8+0.5*

Подопытные группы:

«седатнн» 1 3,4+0,2* 7,1 ±0,1 12,5+0,9* 9,2+0,4

«седат11н»+у-облучение 2,9+0,1 6,5±0,2** 3,6+0,2** 11,0+0,3

Даларгин 6,0±0,2 6,0*0,1 14,5+0,5* 12,1 ±0,3

Даларгин+у-облучение 2,9±0,1 7,7±0,1** 2,8±0,1** 11,7±0,8

Примечания. * - достоверное отличие от интактного контроля (р<0,05); ** -достоверное отличие от облученного контроля (р<0,05).

У крыс, котрым ежедневно в дозе 100 мкг/кг в/б вводили аналог дерморфина -«седатин» без воздействия у-облучения в эпителии роговицы отмечалась стимуляция клеточного деления. Через 24 ч после заключительного введения «седатина» ИМЯ в эпителии роговицы был в 1,8 раза выше уровня интактного контроля, ИМ не изменялся. МИ был почти в 1,7 раза ниже уровня интактного контроля. Уровень патологических митозов в эпителии роговицы животных, получавших «седатин», не отличалось от уровня контроля.

Таким образом пятикратное в/б введение смешанного ц/5 агониста «седатина» в дозе 100 мкг/кг вызывало в эпителии роговицы стимуляцию синтеза ДНК; аналогичные изменения отмечались и в опытах М.Ю. Флейшман, (1997).

Через 24 ч после 5-го заключительного облучения у крыс, получавших «седатин», величина ИМЯ и ИМ в эпителии роговицы была, соответственно, в 1,9 и 1,4 раза выше аналогичного показателя у животных, подвергнутых только воздействию у-облучения. Компенсаторная волна синтеза ДНК после облучения и других стрессорных воздействиях направлена на восстановление тканевого гомеостаза. Введение «седатина» ускоряло ее наступление.

Другим важным свойством «седатина» в этих условиях оказалось его способность уменьшать почти 2-кратно повышенный (13,2%) уровень патологических митозов и препятствовать нарушению соотношения фаз митоза, индуцированных у-облучением в эпителии роговицы. Аберрантные митозы являются одним из важных критериев цитопатического воздействия факторов внешней среды (А.П. Авцын, В.А. Шахламов, 1979). Способность «седатина» уменьшать уровень ПМ является одним из показателей его цитопротективного действия.

Пятикратное введение даларгина в дозе 100 мкг/кг вызывало у животных в эпителии роговицы почти в 1,6-кратное увеличение ИМЯ, величина ИМ не изменялась. Спонтанный уровень ПМ в эпителии роговицы при введении пептида не изменялись. В эпителии роговицы облученных животных в/б введение даларгина вызывало активацию процессов синтеза ДНК и снижение высокого уровня ПМ. Через 24 ч после заключительного облучения величина ИМЯ и ИМ в эпителии роговицы у животных, получавших даларгин, был, соответственно, в 1,4 и 1,5 раза выше аналогичных показателей крыс из облученного контроля.

Таким образом, введение даларгина при облучении животных вызывало ускорение наступления в эпителии роговице компенсаторной фазы пролиферации. Эта компенсация не является окончательной, и полная нормализация тканевого гомеостаза наступает, по-видимому, позднее.

Влияние лигандов опиоидных рецепторов на процессы пролиферации в эпителии языка облученных животных совпадают с их влиянием в эпителии роговицы (табл.20). Через 24 ч после заключительного пятого облучения ИМЯ в эпителии языка был почти в 1,5 раза ниже уровня интактных животных. Величина ИМ не изменялась. Пятикратное в/б введение «седатина» не облученным животным не вызывало изменений в эпителии языка процессов пролиферации. Подобное влияние пептида отмечался в эпителии языка крыс и в опытах М.Ю. Флейшман (1997). Введение

«седатииа» облученным животным индуцировало в эпителии языка, как и в эпителии роговицы, компенсаторную волну увеличения ДНК-синтезирующих клеток.

Через 24 ч после введения этой группе животных седатииа ИМЯ был достоверно в 1,4 раза выше показателя облученного контроля. ИМ оставалась без изменений. Как видно, полной нормализации процессов синтеза ДНК под влиянием «седатипа» па этом сроке наблюдения не наступало. Почти 1,4-кратное увеличением МИ могло быть обусловлено увеличением количества вступающих в митоз клеток.

Таким образом, «седатин» способствовал восстановлению нарушений процессов синтеза ДНК в эпителии языка у облученных животных.

Пятикратное введение агониста б/ц-опиоидных рецепторов даларгина вызывало активацию синтеза ДНК и в эпителии языка. Через 24 ч после заключительного введения пептида ИМЯ в эпителии языка был почти 1,5 раза, а ИМ в 1,3 раза выше соответствующих показателей интактного контроля. Введение даларгина на фоне пятикратного общего у-облу'-.ения не предотвращало индуцированного облучением в эпителии языка угнетения синтеза ДНК. Через 24 ч после заключительных воздействий в эпителии языка отмечалось только 1,9- кратное увеличение показателя МИ, которое может быть обусловлено не увеличением количества вступающих в митоз клеток, а растяжкой во времени самого митоза.

Таблица 20

Влияние парентерального введения дерморфнна и даларгина на процессы клеточного деления в эпителии языка белых крыс при пятикратном общем _гамма-облу чен н и__

Группы животных Показатели пролиферации

МИ, %о ИМЯ, % ИМ

Контрольные группы:

Интактиая 4,6+0,3 16,3±0,9 18,8+1,3

Облученная 2,6+0,2* 10,9+0,8* 18,2±!,5

Подопытные группы:

«седатнн» 4,1 ±0,4 22,1+1,2* 10,5+0,4*

«седатпн»+ ! ¡-облучение 3,8+0,07** 15,5±0,9** 16,2+0,9

Далар! им 4,7±0,3 24,9+0,5* 24,4+1,2*

даларпш+ -облучение 5,0+0,1 ** 12,0+0,7 15,3±0,8

Примечания. * - достоверное отличие от интактного контроля (р<0,05); ** -достоверное отличие от облученного контроля (р<0,05).

Таким образом, даларгин не вызывал в эпителии языка облученных животных нормализации ингибированного синтеза ДНК, хотя в эпителии роговицы он оказывал такой эффект.

В эпителии фундального отдела желудка через 24 ч после заключительного общего у-облучепия животных ИМЯ и ИМ были, соответственно, достоверно в 1,3 и 1,7 раза ниже одноименных показателей интактного контроля.

Пятикратное введение животным «седатина» в дозе 100 мкг/кг вызывало в фуидалыюм эпителии желудка достоверное увеличение в 1,3 раза показателя ИМЯ. ИМ не изменялась (табл.21).

Инъекции животным "седатина" на фоне общего у-облучения предотвращало уменьшение в эпителии фундального отдела желудка ИМЯ. Однако полной нормализации процессов синтеза ДНК не происходило. ИМ в этой группе опытов была достоверно ниже показателя интактного контроля.

Пятикратное в/б введение животным даларгина в дозе 100 мкг/кг индуцировало в эпителии желудка 1,6-кратное увеличение ИМЯ по сравнению с интактным контролем. Величина ИМ оставалась стабильной. Введение животным даларгина на фоне общего 7-облучения индуцировало в эпителии фундального отдела желудка возрастание компенсаторной волны ДНК синтезирующих клеток. Через 24 ч после заключительного воздействия ИМЯ в эпителии желудка достоверно превышал показатель интактного контроля ив 1,6 раза превосходил соответствующую величину у облученных животных. Однако достоверное уменьшение ИМ свидетельствует, что скорость синтеза ДНК в этих условиях оставалась сниженной.

Таким образом, введение даларгина компенсировало нарушения синтеза ДНК в эпителии желудка, но не устраняло их полиостью. Результаты опытов показывают, что в эпителиях эктодермллыюго гистогенеза - роговицы и языка -воздействия ц-агониста «седатина» и 5-агониста даларгина оказывали на синтез ДНК разнонаправленное влияния. В то же время, в эпителии фундального отдела желудка активацию процессов синтеза ДНК индуцировали оба различных по своей опиоидной селективности пептида.

Таблица 21

Влияние парентерального введения дреморфина и даларгина в дозе 100 мкг/кг на

процессы клеточного деления в эпителии фундального отдела желудка белых _крыс при пятикратном общем у-облучении_

Группы животных Показатели пролиферации

ИМЯ, % | ИМ

Контрольные:

Интактный 18,1 ±2,2 24,3+1,2

Облученный 13,9±2,2* 14,3+0,9*

Подопытные:

«седатин» 24,4+1,4* 21,9±1,7

«седатин»+7-облучение 19,3+2,2** 16,4+1,6

Дапаргин 27,5±1,8* 26,1+1,5

даларгин+у- облучение 23,2+2,7** 18,4±0,9**

Примечания. * отличие от интактного контроля достоверно; ** - отличие от облученного контроля достоверно (р<0,05).

Эти данные свидетельствуют о дифференцированном влиянии опиоидных пептидов на процессы синтеза Д11К в тканях в зависимости от их гистогенетического происхождения и органной принадлежности. В то же время, на фоне воздействия общего 7-облучепия характер влияния двух разных по агонистическим свойствам

пептидов на процессы синтеза ДНК в эпителиальных тканях белых крыс приобретал стимулирующий характер.

Способность опиоидных пептидов «седатина» и даларгина активировать ингибированный под влиянием ионизирующего излучения синтез ДНК в эпителиях экто- и энтодермального гистогенеза свидетельствует о их цитопротективных свойствах в этих условиях.

Механизм подобного защитного влияния опиоидных пептидов может быть обусловлен их характерным антиоксидантным влиянием (O.D. Годухин и соавт., 1995). Известно, что выраженная активация процессов ПОЛ в клеточных мембранах (В.А. Барабой и соавт., 1992) является одним из основных альтеративных факторов ионизирующего излучения в организме. Снижение уровня ПОЛ в тканях у крыс, подвергнутых пятикратному у-облучению, на фоне введения им даларгина и «седатина», в наших совместных исследованиях с H.A. Пушкиным (1998) подтверждает реальность антиокснданого механизма нивелирования высокого уровня аберрантных митозов под влиянием (1- и 5-агонистов в условиях у-облучения.

Антиоксидантное действие даларгина, сопровождающееся снижением высокого уровня аберрантных митозов, продемонстрировано при иммобилизационном стрессе у крыс в опытах С.И.Швеца, (1994). О способности «седатина» изменять уровень ПОЛ в эпителии желудка в физиологических условиях свидетельствуют данные М.Ю. Флейшман (1997).

Полученные данные свидетельствуют, что ц- и 5-агонисты опиоидных рецепторов способствуют частичному ослаблению нарушений процессов клеточного деления, индуцированных в экто- и энтодермальных эпителиях под влиянием общего у -облучения. Важно подчеркнуть, что оба опиоидных пептида, несмотря па различный характер их д- и 5-рецепторного связывания, оказывали на ингибированный под влиянием "¡"-облучения синтез ДНК в различных по гистогенезу эпителиях однонаправленное стимулирующее влияние. В то же время, неодинаковая интенсивность и полнота стимуляции синтеза ДНК в различных эпителиях свидетельствует, что радионротекторный эффект опиоидов имеет, по-видимому, множественные механизмы реализации. Необходимо отметить, что способность опиоидов нивелировать индуцированный воздействием у- облучения высокий уровень аберрантных митозов не зависит от их опиоидных агонистических свойств.

ВЫВОДЫ

1. Опиоидиые пептиды четырех основных семейств организма являются существенным компонентом системы регуляции процессов клеточного деления эпителиев в физиологических условиях.

2. Преимущественный агонист ц- опиоидных рецепторов ДАГО вызывает угнетение процессов пролиферации в эктодермальном эпителии роговицы и стимуляцию в эпителии языка и фундального отдела желудка.

3. При возрастании ц- селективности лиганды семейства дерморфина вызывают угнетение клеточного деления в эктодермальном эпителии роговицы и языка, сохраняя в энтодермалыюм эпителии фундального отдела желудка и 12-перстной кишки свое стимулирующее влияние.

4. Селективные лиганды 5- опиоидных рецепторов ДАДЛ и ДАСЛЕТ вызывают стимуляцию процессов пролиферации в эпителии роговицы, языка, фуидалыюго отдела желудка и !2-перстной кишки.

5. Смсшаный о/ц- агонист даларгин стимулирует клеточную пролиферацию в эпителии роговицы, языка, пищевода, фундального отдела желудка и 12-перстной кишки.

6. Смешаный ц/5 агонист ¡} - эндорфин вызывает угнетение клеточного деления в зктодермальном эпителии роговицы, которое при увеличении дозы сменяется стимуляцией пролиферации.

7. Смешанный ц/к - агонист у- эпдорфкн вызывает в экто- и энтодермадьных эпителиях роговицы, языка, фундального отдела желудка и 12-перстной кишки угнетение процессов клеточной пролиферации.

8. Селективный к- агонист динорфин вызывает в экто- и энтодермадьных эпителиях роговицы, языка, фундального отдела желудка и 12-перстной кишки угнетение процессов пролиферации.

9. Изменение специфического связывания синтетических опиоидных лигандов в ряду: 5 -, ц -, к - рецепторной аффинности, модифицирует их влияние на процессы пролиферации эпителия от активации к частичной стимуляции и ингибированию.

10. При интраназальном воздействии смешанный 5/ц - агонист даларгин оказывает на процессы пролиферации в эпителии роговицы влияние, разнонаправленное со стимулирующим влиянием этого пептида при опутрнбрюшинном введении.

11. При ннтраиазачьном воздействии сметанный р/5 - агонист дерморфнн оказывает на процессы пролиферации в эпителии роговицы влияние, однонаправленное с его ингибирующим влиянием при внутрибрюшинном введении.

12. Седатин и даларгин ослабляют ингибирующее влияние многократного воздействия общего у-облучения на процессы синтеза ДНК в эпителии роговицы, языка и фундального отдела желудка, понижают высокий уровень аберрантных митозов и сокращают их спектр. Опиоидные пептиды способствуют поддержанию тканевого гомеостаза покровных эпителиев при воздействии на организм экстремальных факторов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные данные о влиянии агонистоо субпопуляций опиоидных рецепторов на процессы пролиферации рекомендуется учитывать при использовании опиоидных пептидов в клинике.

2. Результаты исследования создают возможность прогнозировать характер влияния синтетических агонистов опиоидных рецепторов на процессы клеточной пролиферации в зависимости от соотношения в пептидах различных типов рецепторной селективности.

3. Расширена теоретическая база для целенаправленного синтеза опиоидных пептидов с заданным влиянием на процессы синтеза ДНК в эпителиальных тканях.

4. Показана возможность стимуляции опиоидными пептидами процессов синтеза ДНК в эпителии роговицы при интраназальном введении в организм.

5. Доказано дифференцированное влияние агониетов ¡1- и 5- опиоидных рецепторов в коррекции нарушений процессов синтеза ДНК в эпителиальных тканях при патологических процессах, вызывающих резкую активацию реакций ПОЛ (ионизирующее облучение и общая гипертермия).

6. Показана возможность снижения опиоидными пептидами в эпителии роговицы высокого уровня аберрантных митозов, индуцированных воздействием на организм общего гамма облучения или гипертермии.

СПИСОК СТАТЕЙ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Радивоз М.И., Тимошин С.С., Баранов А.П., Мурзина Н.Б. Влияние многократного перегревания на цитогенетические процессы в эпителии роговицы и клетках костного мозга белых крыс.// Бюл. эксп. биол. и мед.- 1982.- Т.93, №¡4.- С.98-100.

2. Тимошин С.С., Панькова Т.Д., Радивоз М.И., Титов М.И. Влияние стабильного аналога лей-энкефалина - даларгина на процессы клеточного деления эпителия роговицы белых крыс.//Бюл. эксп. биол. и мед.- 1988.-Т.106,№7.-С.97-98.

3. Тимошин С.С., Радивоз М.И., Мурзина Н.Б., Мельник Е.И. Механизмы адаптационного действия опиоидных пептидов // V Всесоюзный съезд патофизиологов .Тез. док. Кишинев,- 1989,- Т.2.- С.640.

4. Тимошин С.С., Радивоз М.И., Мурзина Н.Б., Обухова Г.Г. Экспериментальное и клиническое изучение механизмов адаптационного действия нейропептидов. // Науч. конфер. ХГМИ. Тез. док.- Хабаровск,- 1989.-С.2-3.

5. Тимошин С.С., Гончарова E.H., Радивоз М.И., Беспалова Ж.Д. Влияние предсердного патрийуретичсского пептида АП-11 на процессы пролиферации эпителиальных тканей белых крыс. // Бюлл. эксп. биол. и мед.- 1991.- Т. 112, №9,- С.303-305.

6. Тимошин С.С., Швец. С И., Александрович А.Г., Радивоз М.И. Влияние даларгина па пролиферативныс процессы эпителия желудка при повторных воздействиях различных стрессоров. //Бюлл. эксп. биол. и мед.-1991,-Т.112, М>8.-С.130-132.

7. Тимошин С.С., Панькова Т.Д., Жданова Т.Д., Радивоз М.И. и др. Влияние лигандов опиоидных рецепторов на процессы клеточного деления эпителия. // Биология репродукции клеток,- М.: Изд-во РГМУ.- 1994,-С. 137-145.

8. Радивоз М.И. Влияние агонистов мю- и дельта-опиоидных рецепторов на процессы синтеза ДНК в эпителии роовицы белых крыс. // Годовая итоговая науч. коиф,- ХГМИ. Тез. док.-Хабаровск,- 1994.-С.30-31.

9. Флейшман М.Ю., Радивоз М.И., Тимошин С.С., Ярова Е.П., Кесельман С.А. Влияние синтетического аналога дерморфина на процессы клеточного деления в эпителии роговицы и языка белых крыс. // Бюлл. эксп. биол и мед. - 1994.- Т. 118, №11,-С,508-510.

10. Флейшман М.Ю., Кузнецов A.B., Радивоз М.И, и др. Влияние дерморфнна и его системных аналогов на процессы клеточного деления эпителия белых крыс // Матер. 2-го съезда фи ¡пологов Сибири н Дальнего Востока,- Новосибирск, 1995.- С.461-462.

11. Тимошин С.С., Радивоз М. И. Участие нейропептидов в регуляции пролифератпвиых процессов. // Матер. 2-го съезда физиологов Сибири и Дальнего Востока-Новосибирск, 1995,- С.428-429.

12. Флейшман М.Ю., Кузнецов A.B., Радивоз М.И., Тимошин С.С, Ярова Е.П. Влияние синтетического аналога дерморфина - седатина на процессы клеточного деления в эпителии роговицы и языка белых крыс, // Бюлл. эксп. биол и мед.- 1996.-Т.121, Каб.- С.641-644.

13. Радивоз М.И., Тимошин С.С., Соколовская Н.Б., Гицевич А.Б. Проблемы фармакологической коррекции нарушений процессов пролиферации эпителия при воздействии гипоксии и гипертермии, // Матер, регион, науч. коиф,- Проблемы фармакологии и фармации на Дальнем Востоке,-Хабаровск,: Изд-во ДВГМУ.-1997,- С.71-75.

14. Радивоз М.И., Чушкин H.A., Мелышк Е.И. Радиопротективное влияние лигандов опиоидных рецепторов на процессы клеточного деления эпителиальных тканей белых крыс при общем гамма-облучении, // Матер, регион, науч. конф,- Проблемы фармакологии и фармации на Дальнем Востоке. Изд-во ДВГМУ,- Хабаровск, 1997,- С.75-78.

15. Оскольскнй Г. И., Радивоз М. И., Астахова А. Ю. Радиоавтографический анализ пролиферации эпителия десны при хрониченских формах гингивита. // Бюлл. эксп. биол. и мед,-1997,- Т, 124,- № 10,- С.473-476.

16. Радивоз М.И., Кузнецов A.B., Флейшман М.Ю., Мельник E.H., Тимошин С.С. Влияние агонистов мю- и дельта-опиоидных рецепторов на процессы клеточного деления эпителия фумдалыюго отдела желудка белых крыс. // 111 съезд физиологов Сибири и Дальнего Востока: Тез, док. - Новосибирск, 1997,- С.184.

17. Радивоз M.И,, Тимошин С.С., Замараев В.А., Приходько U.K. Влияние нейопсптида даларпша на процессы клеточного деления при ннтраназальном введении. // Ш съезд физиологов Сибири и Дальнего Востока: Тез.док,- Новосибирск, 1997,-С. 184.

18. Раднвоз М.И., Чушкнн H.A., Мельник Е.И., Замараев В.А. Защитное влияние ониолдных пептидов на процессы пролиферации эпителия при общем гамма облучении. // 11! съезд физиологов Сибири и Дальнего Востока: Тез. док. - Новосибирск, 1997,- С.185.

19. Раднвоз М.И.. Мельник Б.И., Соколовская Н.Б., Замараев U.A. Перспектива применения даларпша в коррекции тканевых нарушений при его интерназальном введении. // Матер, регион, науч.-прак. конф. «Физическая культура, спорт, здоровье населения Дальнего Востока» Хабаровск: Изд-во ХГИФК, 1997.- С .93-94.

20. Раднвоз М.И., Мелышк Е.И., Чушкнн Н А., Гицевич А.Б. Роль нейропептидов в регуляции тканевого гомеостаза организма при воздействии экстремальных факторов. // Матер, регион, науч.-прак. конф. «Физическая культура, спорт, здоровье населения Дальнего Востока» Хабаровск: Изд-во ХГИФК. 1997 -С 91-92.

21. Раднвоз М.И., Вдовенко C.B.. Замараев В.А., Малыпша Е.И. Цитопртективный эффект треннровки к кислородному голоданию. // Матер, межрегион. науч.-прак. конф. «Физкультурное образование на Дальнем Востоке. Хабаровск: Изд-во ХГПУ, 1997,- С. 130-132.

22. Вдовенко C.B., Раднвоз М.И.. Замараев В.А. Митотическая активность эпителия кожных покровов человека в условиях гипертермии. Ч Матер, межрегион, науч.-прак. конф. «Физкультурное образование на Дальнем Востоке» Хабаровск: Изд-во ХГПУ, 1997,-С.65-66.

23. Чушкин H.A., Тимошин С.С., Бсрдов Б.А., Раднвоз М.И. Некоторые результаты лучевой терапии неоперабельного рака прямой кишки в условиях применения даларгина. // Дальневост. мед. жури,- 1998,-№2,-С.56-59.

24. Чушкнн H.A., Тимошин С.С., Бердов Б.А., Мурзина Н.Б., Радивоз М.И., Мельник Е.И. Анализ механизмов цитопротективиого действия даларгина при лучевой терапии больных раком прямой кишки// Дальневост. мед. жури.- 1998.-№2.-С.60-63.

25. Вдовенко C.B., Раднвоз М.И., Мелышк Е.И.,Замараев В.А. Оценка влияния биологически активных веществ на клеточные механизмы адаптации к гипо- и гипертермии // Международная научная конференция «Роль физической культуры и спорта в оздоовлении молодежи» Тез.докл -Смоленск - 1998.-С.30.

26. Радивоз М.И..Замараев В.А.Вдовенко СВ. Радиопротекторный эффект нейрпептидов в условиях радиационного повреждения органнзма.//Региоиальная науч->сх.коифер. «Приморские зорн-99 »Тез.докл - Владивосток.-I999.-C.