Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изучение фармакологической активности пролинмодифицированных аналогов дерморфина

На правах рукописи

СОСНОВСКАЯ Ирина Витальевна

изучение фармакологической активности пролин-модифицированных аналогов дерморфина

14.00.25 - Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□03459Э16

Москва-2009

003459916

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Гузеватых Людмила Сергеевна

Официальные оппоненты:

профессор, доктор медицинских наук Верткин Аркадий Львович профессор, доктор медицинских наук Жердев Владимир Павлович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Росздрава

Защита состоится « » 2009 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 001.024.01 при ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315 г. Москва, ул. Балтийская д. 8

С диссертацией можно ознакомиться в Ученой части ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315 г. Москва, ул. Балтийская д. 8.

Автореферат разослан «_»«

» 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д. м. н.

Е.А. Вальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Поиск новых высокоэффективных анальгетиков остается актуальной проблемой современной фармакологии, поскольку применяемые в настоящее время обезболивающие средства обладают рядом недостатков. Наркотические анальгетики характеризуется сильным обезболивающим действием, что позволяет их применять при травмах и при заболеваниях, сопровождающихся выраженным болевым синдромом (злокачественные новообразования, инфаркт миокарда и другие). Однако наркотические анальгетики вызывают эйфорию, а при их повторном применении наблюдаются синдромы психической и физической зависимости, а при прекращении приема развивается синдром отмены. Кроме того, при длительном применении развивается толерантность, и для достижения анальгетического эффекта необходимо увеличение дозы, что сопровождается риском угнетения дыхательного центра (Wintle, 2008).

Ненаркотические анальгетики не оказывают влияния на дыхательный центр, не вызывают эйфории и явлений физической и психической зависимости, однако их обезболивающее действие проявляется только при определенных видах болевых ощущений: главным образом при невралгических, мышечных, суставных болях, при головной и зубной боли. При сильной боли, связанной с травмами, полостными оперативными вмешательствами, злокачественными новообразованиями и т.п., они практически не эффективны. Некоторые ненаркотические анальгетики характеризуются хорошими жаропонижающим и противовоспалительным эффектами. Негативным побочным действием этих соединений является влияние на систему кроветворения, желудочно-кишечный тракт, выводящую систему (Krenzischek et al., 2008).

Перспективным направлением поиска эффективных анальгетиков представляется создание веществ на основе структуры эндогенных пептидов. В настоящее время установлены общие механизмы систем ноцицепции и терморегуляции. Показано, что вещества, проявляющие гипотермическое действие, могут оказывать влияние на болевую чувствительность (Woods et al., 1994). Среди изученных эндогенных пептидов наиболее выраженным гипотермическим действием обладают пептиды групп бомбезина (Lin, Lin, 1986) и дерморфина (Broccardo et al., 1981, Emel'yanova et al., 1986).

Дерморфин (Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser) - эндогенный опиоидный пептид, выделенный из кожи южноамериканской лягушки (Montecucchi et al., 1981) -обладает преимущественным сродством к ц-опиатным рецепторам (Broccardo et al., 1981). Анальгетическая активность дерморфина в 3-5000 раз превосходит по уровню эффективности морфин в тестах горячей пластины, отдергивания хвоста и корчей (Stevens et al., 1986). У людей, дерморфин вызывает анальгезию в 100 раз сильнее морфина (Basso et al., 1985). В анальгетических и даже кататонических дозах дерморфин не влияет на частоту дыхания (Paakkari et al., 1993). У крыс и мышей центральное и периферическое введение дерморфино-подобных пептидов вызывает достоверно более медленное развитие толерантности по анальгетическому эффекгу, чем у морфина (Broccardo et al., 1985; Negri et al., 1995). Синдром отмены, провоцируемый налоксоном, значительно слабее у крыс хронически получавших дерморфин и его аналоги, чем у крыс, потреблявших морфин (Broccardo et al., 1985; Nakata et al., 1986; Chaki et al., 1988, 1989; Negri et al,. 1995;Ribaetal., 2002).

Исходя из, вышеизложенного, поиск эффективных анальгетиков из группы аналогов дерморфина представляется перспективным. Группа оригинальных аналогов дерморфина с замещениями пролина в шестом положении была синтезирована под руководством академика РАН Н.Ф. Мясоедова в Институте молекулярной генетики РАН. Соединения обладают сильным анальгетическим действием в несколько раз превосходящим морфин (Гузеватых и др. 2002).

Цель работы:

Изучение анальгетической, нейротропной активности, побочных эффектов, толерантности и синдрома отмены пролиновых аналогов эндогенного пептида дерморфина.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) Исследовать анальгетическую активность пролиновых аналогов дерморфина при использовании широкого диапазона тестов определения анальгетической активности и выбрать наиболее активные соединения.

2) Оценить развитие синдрома отмены пролинового аналога дерморфина.

3) Изучить развитие толерантности анальгетического действия отобранного соединения.

4) Изучить нейротропную активность и сопутствующие побочные эффекты, в том числе на систему дыхания и терморегуляцию, отобранного соединения.

5) Оценить возможный механизм действия отобранного соединения на нейромедиаторном и рецепторном уровне.

6) Обосновать выбор соединения для расширенного клинического изучения.

Научная новизна

Впервые показано, что стереохимическая модификация или дегидрирование пролипа в шестом положении в молекуле дерморфина усиливает анальгетическую активность, уменьшает противовоспалительное и седативное действие пептида. Дерморфин, [7>Рго6]-дерморфин и [Д-Рго6]-дерморфин проявляют анальгетическую активность в тестах соматической и висцеральной болевой чувствительности, вызванной механическими, термическими и химическими стимулами. В тесте соматической болевой чувствительности, вызванной термическим стимулом анальгетическая активность [£>-Рго6]-дерморфина сопоставима с активностью морфина и снижается неселективным антагонистом опиоидных рецепторов налоксоном.

Впервые установлено, что дерморфин, [£>-Ргоб]-дерморфин и [Д-Рго6]-дерморфин уменьшают частоту дыхания при увеличении терапевтических доз в 500 раз. Синдром отмены [£)-Ргоб]-дерморфина, провоцируемый налоксоном, протекает с менее выраженными симптомами, по сравнению с морфином. При субхроническом 7-дневном введении к анальгетическому и седативному эффекту [£>-Рго6]-дерморфина развивается толерантность.

Впервые установлено, что бомбезин и его фрагмент бомбезин-(1-2) обладают анальгетическрй активностью. Показано, что бомбезин и его фрагмент бомбезин-(1-2) связываются с периферическими ц- и 6-опиатными рецепторами препаратов изолированных органов подвздошной кишки морской свинки и семявыносящего протока мыши.

Практическая значимость

В результате проведенных исследований, выявлены новые соединения, пролиновые аналоги дерморфина - [£»-Ргоб]-дерморфин и [Д-Рго6]-дерморфин, обладающие высокоэффективным обезболивающим действием, превышающим

морфин. Пептиды обладают высоким сродством к периферическим р- и 5-опиоидным рецепторам препаратов изолированных органов и анальгетическое действие пептидов блокируется неселективным антагонистом опиоидных рецепторов налоконом. Прекращение приема [1>-Рго6]-дерморфина не сопровождается резко выраженным синдромом отмены, характерным для морфина. Способность угнетать дыхательный центр у [£>-Рго6]-дерморфина и [Д-Рго6]-дерморфина проявляется в дозах в сотни раз превышающие терапевтические дозы, что свидетельствует о большой терапевтической широте. [£>-Рго6]-дерморфин, в отличие от [Д-Рго6]-дерморфин не снижает температуру тела при комфортной температуре окружающей среды. Таким образом, [Д-Рго5]-дерморфин и [Д-Рго6]-дерморфин по уровню эффективности приближаются к наркотическим анальгетикам, в то время как эндогенная природа соединения позволяет снизить риск возникновения негативных побочных эффектов.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на II Международной конференции "Химия, структура и функция биомолекул" (Минск, 2006), International Conference "Basic science for biotechnology and medicine" (Новосибирск, 2006), XIV Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2007), III Съезде фармакологов (Москва, 2007), III Российском симпозиуме "Белки и пептиды" (Пущино, 2007).

Публикации

По основным результатам диссертации опубликовано 7 научных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 7 глав экспериментальных исследований, обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, состоящего из ... наименований. Работа изложена на 105 страницах, содержит таблиц и рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Эксперименты проводились на 890 самцах нелинейных белых крыс массой 180-250 г, на 1650 самцах беспородных белых мышей и мышей линии СВА и С57/Ыаск весом 2225 г, на 10 самцах рыжих морских свинок весом 500 г (питомник «Столбовая»).

В исследованиях использовались блокаторы и анализаторы фирмы Sigma: неселективный антагонист опиоидных рецепторов налоксон, предшественник серотонина 5-гидрокситриптофан, холиномиметики ареколин и оксотреморфин, барбитурат гексенал, агонист Дд дофаминовых рецепторов апоморфин, токсин дофаминовых нейронов МФТП. Пептиды синтезировали в Институте молекулярной генетики РАН (рук. акад. Н.Ф.Мясоедов), в лаборатории биоорганической химии (рук. д.б.н. В.П. Голубович) Института биоорганической химии НАНБ, г. Минск. В работе изучали активность следующих пептидов: дерморфин (Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2) - ДМ; [D-Pro6]-дерморфин, [ДРго6]-дерморфин, бомбезин, литорин, бомбезин-(1-3), [Тгр3]-бомбезин-(1-3), [01и3]-бомбезин-(1 -3), бомбезин-(1 -2).

Тестируемые пептиды, 5-гидрокситриптофан, оксотреморфин, ареколин, гексенал, МПТП растворяли в дистиллированной воде, апоморфин гидрохлорид - в дистиллированной воде с добавлением аскорбиновой кислоты. Тестируемые пептиды -дерморфин и его аналоги вводили в дозах 0.1-10 мг/кг внутрибрюшинно за 20 минут до эксперимента; бомбезин и его аналоги вводили внутрибрюшинно и интраназально.

Исследования проводились в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ», (ред - Р.У. Хабриев, 2005), где дано подробное описание используемых в работе методов.

Оценка влияния на болевую чувствительность. При оценке болевой чувствительности в тесте отдергивания хвоста учитывали латентный период отдергивания хвоста крысы после погружения его в горячую воду (t°=54°C) (D'Amor, 1941). При оценке болевой чувствительности в тесте горячей пластины регистрировали латентный период первого облизывания задней лапы после помещения крысы на разогретую до 53,5°С металлическую поверхность (Woolfe, Macdonald, 1944). Оценка болевой реакции, вызываемой сдавливанием основания хвоста крысы, проводилась по 3-х бальному модифицированному методу Haffner (1929). При оценке болевой чувствительности в тесте корчей регистрировалось число корчей после внутрибрюшинного введения 0.6 % раствора уксусной кислоты (Chernov et. al., 1967). Болевая чувствительность в тесте формалиновой боли оценивалась по числу болевых реакций, возникавших у крыс после субплантарного введения 50 мкл 5% формалина (Bannon et al., 1998). Воспалительную реакцию определяли по разнице масс контрольной и опытной задних лап мышей линии СВА после субплантарного введения конканавалина А в дозе 100 мкг/20 г массы тела (Любимов и др, 2000).

Оценка дополнительных эффектов. Оценка влияния на частоту дыхания проводилась на бодрствующих мышах; регистрировалось число дыхательных движений в

минуту (Булаев, Коробов, 2000). Оценка токсичности проводилась через 24 часа и 7 дней после внутрибрюшинного введения соединения мышам, содержащимся в индивидуальных боксах при постоянной (+20 С) температуре окружающей среды (Арзамасцев и др, 2000). Развитие толератности оценивали в тестах уксусных корчей и открытое поле. Пептид вводили ежедневно на протяжении 7 дней. Оценка синдрома отмены, провоцируемого налоксоном, проводилась на мышах. Морфин и пептид вводили 2 раза в день в течение 5 дней по схеме 3 инъекции по 50 мг/кг, 3 инъекции по 75 мг/кг и 3 инъекции по 100 мг/кг; через 5 часов после последней инъекции вводили налоксон (10 мг/кг, п/к). Регистрировали число прыжков, корчей, встряхиваний, тремора и птоза на протяжении одного часа после инъекции налоксона (Fernandes et al., 1977). Оценка влияния на систему терморегуляции проводилась на крысах при холодной (4-б°С), комфортной (27-28°С) и жаркой (32-33°С) температурах окружающей среды. Температуру камеры, и ректальную температуру, регистрировали непрерывно с помощью медно-константановых термопар.

Оценка нейротропной активности. Влияние на двигательную активность и ориентировочно-исследовательскую реакцию изучалось в тесте открытое поле. Регистрировалось число пересеченных квадратов, стоек, обследованных норок на протяжении 2 минут (Makanjuola et.al., 1977). При оценке влияния на уровень эмоциональности крыс использовали модифицированную методику Brady и Nauta (1953). Оценка влияния на уровень тревожности в тесте приподнятого крестообразного лабиринта проводилась на крысах, согласно методу Pillow и Lister (1987). Оценка антидепрессантной активности в тесте "неизбегаемое плавание" проводилась на мышах. Регистрировали длительность иммобильности на протяжении 5 минут в установке, предложенной Porsolt (1979). Влияние на гексеналовый сон исследовали на мышах. Определяли процент уснувших животных и длительность сохранения бокового положения (в минутах) после введения гексенала в дозе 30 мг/кг (в/б) (Winter, 1948).

Оценка взаимодействия пептида с анализаторами нейромедиаторных систем. Влияние на опиоидергическую систему оценивали в тестах отдергивания хвоста и уксусных корчей. Налоксон вводили в дозах 1 и 10 мг/кг подкожно одновременно с пептидом. Влияние на встряхивания головой (head twitch), вызванные предшественником серотонина 5-гидрокситриптофаном, исследовалось на мышах. Подсчитывали число специфических "встряхиваний" головы с 3 по 12 минуту после введения 5-гидрокситриптофана в дозе 200 мг/кг (в/б) (Come et. al., 1963). Влияние на тремор, вызванный ареколином или оксотреморином, также исследовали на мышах. Регистрировали длительность тремора после введения ареколина в дозе 25 мг/кг (в/б) или

оксотреморина в дозе 0.5 мг/кг (в/б) (Rathbun, Slater, 1963). Тест вертикализации, вызванной апоморфином, проводили на мышах линии C57/black, которым вводился апоморфин в дозе 5 мг/кг (п/к) за 10 минут до тестирования. Интенсивность вертикальной активности оценивалась по 4-х бальной системе (Vasse et. al., 1985). Тест стереотипии, вызванной апоморфином проводили на крысах, которым вводили апоморфин в дозе 0.75 мг/кг подкожно. Интенсивность стереотипии оценивали через 20 минут после введения по 4-х бальной системе по методу Blumstein (1987). Модель экстрапирамидных нарушений, вызванных МФТП, проводили на мышах линии C57/black. Регистрировали тремор, пилоэрекцию, ретро/латеропульсшо, ригидность туловища и конечностей, синдром Штрауба и двигательную активность после внутрибрюшинного введения МФТП в дозе 30 мг/кг (внутрибрюшинно) (Воронина и др. 2000).

Взаимодействия пептидов с периферическими опиоидными рецепторами оценивали по их способности ингибировать стимулируемое электрическими импульсами сокращение препаратов, полученных из гладкой мышечной мускулатуры подвздошной кишки морской свинки (р-опиоидные рецепторы) и семявыносящего протока мыши (6-опиоидные рецепторы) (Broccardo et al., 1981).

Статистическая обработка данных проводилась с использованием параметрического t-Student теста, непараметрического Вилкоксона-Мэнна-Уитни (U-test) и альтернативного метода Фишера (F-test).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение анальгетического действия ДМ и его пролиновых аналогов.

ДМ в дозе 1 и 10 мг/кг (в/б) вызывает анальгетическое действие в тесте отдергивания хвоста (табл. 1). Замена в молекуле ДМ Pro6 на ¿)-стереоизомер или дегидрирование Pro6 приводит к усилению анальгетической активности и пролонгированию эффекта (рис.1). По уровню анальгетической активности [D-Рго6]-ДМ в дозе 10 мг/кг сопоставим с морфином в дозе 5 мг/кг (таб.1).

В тесте отдергивания хвоста бомбезин не обладает анальгетической активностью при внутрибрюшинном и интраназальном введении. Его фрагмент бомбезин-(1-2) в дозах 1 и 0.1 мг/кг при внутрибрюшинном и в дозах 0.1 и 0.01 мг/кг при интраназальном введении проявляет анальгетическое действие (таб. 3). Анальгетическая активность бомбезина-(1-2) в изученных дозах менее выражена по сравнению с ДМ и его пролиновыми аналогами, а также морфином и анальгином.

Рисунок 1. Влияние ДМ и его пролиновых аналогов в дозе 10 мг/кг (в/б) на болевую чувствительность в тесте отдергивания хвоста.

—•—контроль —■—ДМ - -а- - [ДРгоб]ДМ — — [ОРго6]ДМ

* - достоверные отличия относительно контрольной группы (р<0.05);

Таблица 1. Сравнительная активность ДМ, [£>-Рго6]-ДМ и [ДРго6]-ДМ в

сравнении с морфином, анальгином и бомбезином.

Вещество Доза Изменение порога (сек)

(мг/кг) 20 мин 40 мин 60 мин 90 мин 120 мин

Дерморфин 0.1 (в/б) -3+0.9 0.4±0.2 0.6±0.1 0.2±0.1 0.2Ю.1

1.0 (в/6) 3.411.3* 1.910.8 1.7±0.8 0.2±0.2 0.0510.05

10.0 (в/б) 2.8±1.1* 3.8±1.3* 8.1+3.5* 5.1±1.2* 4.212.2*

[ДРго"]дерморфин 0.1 (в/б) 0±0.05 0.8±0.3 0.2±0.05 0.2±0.05 0.110.05

1.0 (в/б) 7.6±3.1 * 7.2+2.6* 4.6±1.8* 1.6±0.7 0.410.1

10.0 (в/б) 5.7+2.3* 7.5+2.8* 5.4±2.1* 4.0±1.8* 0.2+0.1

[ОРго"]дерморфин 0.1 (в/б) 2.211.2* 4.811.9* 3.7+1.0* 2.511.3* 1.010.5

1.0 (в/б) 5.713.1* 7.5±3.1* 5.411.7* 4.012.1* 0.210.1

10.0 (в/б) 11+4.3* 13.б±б.9* 12.9+5.2* 6.6±2.5* 4.411.2*

Морфин 1.0(в/6) ).4±0.б 0.7±0.2 0.9±0.3 0.510.1 0.210.1

5.0 (в/б) 11.614.1* 13.2+4.6* 13.5+3.8* 13.514.7* 1315.7*

Анальгин 2500 (в/б) -0.2±0.05 0.210.05 0.2±0.05 0.210.05 0.210.05

Бомбезин 1 (в/б) 0.1+0.1 0.2+0.1 0.3±0.2 0.1+0.1 0.1+0.1

0.1 (и/ц) 0.1±0.1 0.1±0.1 0.2±0.1 0.1±0.1 0.1±0.1

Бомбезин-(1-2) 1 (в/б) 2.6+1.4* 2.4±1.2* 0.2±0.2 0.1±0.1 0.1±0.1

0.1 (в/б) 2.3±0.9* 2.7±1.4* 0.5±0.5 0.4+0.2 0.2+0.2

0.1 (и/н) 0.5±0.5 2.3±0.9* 0.6±0.5 0.2+0.1 0.2+0.1

0.01 (и/н) 0.3+0.5 3.1±1.1* 1.1 ±0.7 0.510.5 0.2+0.1

Пенталгин 750 (в/б) 3.9±1.9* 7.9+3.7* 7.5+3.7* 7.512.9* 7.013.9 *

контроль 0.5+0.2 0.4±0.2 0±0.2 -0.2+0.1 -0.410.3

* - достоверные отличия относительно контрольной группы (р<0.05)

и

Рисунок 2. Влияние ДМ, его пролиновых аналогов (1 мг/кг) и пенталгина (750 мг/кг) на болевую чувствительность в тесте горячей пластины.

■ котггроль [ОРго6]-ДМ

— ДМ — пенгалгин

- -а- - [ДРго6]-ДМ

* - достоверные отличия относительно контрольной группы (р<0.05);

В тесте горячей пластины ДМ (1 мг/кг, в/б) обладает анальгетическим действием. [£>-Ргоб]-ДМ и [ДРго6]-ДМ в этой же дозе проявляют меньшую активность и уступают ДМ и пенталгину в дозе 750 мг/кг (рис. 2).

В тесте механического раздражения основания хвоста ДМ и [£>-Рго6]-ДМ в дозах 1 и 10 мг/кг (в/б) обладают анальгетическим действием. [ДРго6]-ДМ проявляет активность в дозе 10 мг/кг (рис. 3).

В тесте уксусных корчей в контрольной группе животных наблюдалось 35.8±3.8 корчей за 30 минут наблюдения. ДМ и [ДРго6]-ДМ в дозах 0.1-10 мг/кг проявляют дозо-зависимое анальгетическое действие (рис. 4). Уровень активных доз у [Д-Рго6]-ДМ сдвинут вправо, пептид оказывает обезболивающее действие в дозах 1-10 мг/кг.

Рисунок 3. Влияние ДМ и его пролиновых аналогов на болевую чувствительность в тесте механического раздражения основания хвоста (по Гаффнеру).

[№го6]-ДМ

[ДРго6]-ДМ

! контроль

О 0,1 мг/кг

53 1 мг/кг

□ 10 мг/кг

* - достоверные отличия относительно контрольной группы (р<0.05); Рисунок 4. Влияние ДМ и его пролиновых аналогов на болевую чувствительность в тесте уксусных корчей.

[РРГо6]-ДМ

[ДРго6]-ДМ

I контроль

О ОД мг/кг

й ] мг/кг

□ 10 мг/кг

* - достоверные отличия относительно контрольной группы (р<0.05);

Рисунок 5. Анальгетическая активность ДМ и его пролиновых аналогов в формалиновом тесте.

О контроль

3 0,1 мг/кг

к 1,0 мг/кг

1 - достоверные отличия относительно контрольной группы (р<0.05);

В тесте формалиновой боли в I фазе, характеризующей действие на первичные афференты боли, наблюдается 3.8 ± 1.2 болевых реакций и 6.7 ± 1.3 болевых реакций во II фазе, вызванных воспалительной реакцией. ДМ, [£>-Рго6]-ДМ и [ЛРго6]-ДМ (0.1 - 1.0 мг/кг) уменьшают число болевых реакций в первой и во второй фазе (рис. 5).

Рисунок 6. Противовоспалительное действие ДМ, [£>-Рго6]-ДМ и [ЛРго6]-ДМ в тесте с конканавалином А.

100 -

s X 80 -

U

R0 -

о

m 40 -

гг 20 -

о. 0 -

íüfnn

ДМ

[DPro6]-flM

[ДРго6]-ДМ

Р контроль В 0,1 мг/кг S 1 мг/кг 0 10 мг/кг

* - достоверные отличия относительно контрольной группы (р<0.05);

Субплантарное введение пектина растительного происхождения конканавалина А вызывает высвобождение медиаторов воспаления и развитие воспалительной реакции. ДМ (0.1 - 10 мг/кг, в/б) обладает противовоспалительным действием (рис. 6). [£>-Рго6]-ДМ и [ДРго6]-ДМ оказывают менее выраженное противовоспалительное действие.

Влияние дерморфина и его пролиновых аналогов в сравнении с бомбезином на температуру тела.

Открытие TRP каналов, чувствительных к температурным стимулам и способным активировать ноцицепторы указывает на наличие общих механизмов в системе терморегуляции и ноцицепции (Clapham, 2003). В качестве препарата сравнения был выбран пептид бомбезин (Pyr-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2), который связываясь с собственными бомбезиновыми рецепторами, обладает выраженным гипотермическим действием при центральном введении (Jensen et al., 2007, Gonzalez et. al., 2008; Tache et. al, 1980).

В условиях холодной и термонейтральной среды ДМ и [ДРго6]-ДМ вызывают гипотермию (рис. 7). [Б-Рго6]-ДМ снижает температуру тела только при холодной температуре окружающей среды. Максимум гипотермического действия развивается через 20 минут после введения. В жаркой среде ДМ повышает, а [£>-

Рго6]-ДМ и [ДРгоб]-ДМ не влияют на температуру тела. Бомбезин и его аналог бомбезин-(1-2) обладают выраженным гипотермическим действием в условиях холодной окружающей среды. Температура тела после введения бомбезина и бомбезина-(1-2) постепенно снижается на протяжении 120 минут и достигает уровня гипотермического действия ДМ.

Рисунок 7. Влияние ДМ и его пролиновых аналогов на динамику температуры тела крыс, находящихся в холодной (А) (Тк = 4-6° С), термонейтральной (Б) (Тк = 27-28° С) и жаркой (В) среде (Тк = 31-32° С).

-2 -2-> [ДРго6]-ДМ

* - достоверные отличия относительно контрольной группы (р<0.05)

Рисунок 8. Влияние бомбезина и его аналогов (0.1 мг/кг, и/н), на динамику температуры тела крыс, находящихся в холодной среде (Тк = 4-6°С).

Изучение связывания дерморфина и его пролиновых аналогов и бомбезина с периферическими опиоидными рецепторами.

Связывание с периферическими р-опиатными рецепторами оценивали на препарате подвздошной кишки морской свинки (СР1), а связывание с 5-опиатными рецепторами на препарате семявыносящего протока мыши (М\Т)).

ДМ снижает амплитуду сокращений препаратов СР1 и МУБ в наномолярной области концентраций, что свидетельствует о его высокой специфичности к р- и 8-

опиатным рецепторам. Расчет отношения концентраций ингибирования (ICjo) GPI и MVD количественно показывает, что ДМ обладает большим сродством к р-, чем к 5-опиатным рецепторам (таб. 2). Замена Pro6 на D-стереоизомер в молекуле ДМ не влияет на связывание пептида с рецепторами. Дегидрирование Pro6 в молекуле ДМ приводит к увеличению аффинности к р-опиатным рецепторам. Бомбезин и бомбезин-(1-2) уменьшают амплитуду сокращения препаратов в микромолярной области концентраций. Бомбезин проявляет большее сродство к б-ОР, по сравнению с ц-ОР. Бомбезин-(1-2), напротив, обладает большим сродством к р-ОР и практически не связывается с 5-ОР.

Таблица 2. Сравнительная активность (1С50) ДМ, [£>-Рго6]-ДМ, [ДРго6]-ДМ, бомбезина и бомбезина-(1-2) на препаратах изолированных органов.

ICsoGPI (ц-ОР) ICsoMVD (5-ОР) ц/5

ДМ 2.6*10"8 (3.1*10"8-2.2*10"8) 9.0* Ю-8 (1.1*10'7-7.3*10"8) 0.29

[Я-Рго6]-ДМ 3.0*10"8 (3.5*10"8 -2.6*10"8) 8.7* 10"8 (9.8* 10"8 — 7.6* 10"8) 0.34

[ДРгоь]-ДМ 4.5*10"* (5.1 *10"9-4.0*10"9) 8.4* 10"8 (9.4* Ю-8-7.4* 10"8) 0.05

Бомбезин 1.0*10"5 (1.2*10"5 - 9.0* Ю-6) 7.2*10"" (8.4*10"6 - 6.2*10'6) 1.38

Бомбезин-(1-2) l-llMO* (1.5*10"6- 8.5*10"7) 4.23*10"4 (2.0*10"4-9.1*104) 0.0026

Таким образом, ДМ обладает выраженным анальгетическим действием в тестах соматической и висцеральной боли при действии термических и механических стимулов. Стереохимическая модификация или дегидрирование Pro вызывает увеличение активности в тесте соматической боли при действии термического стимула и снижению противовоспалительного действия. При стереохимической модификации Pro наблюдается увеличение активных доз в тесте висцеральной боли, а при дегидрировании Pro - в тесте соматической боли, вызванной механическим стимулом. Бомбезин и бомбезин-(1-2) проявляют менее выраженное анальгетическое действие. [£>-Рго6]-ДМ, в отличие от [ДРгоб]-ДМ, не вызывает гипотермического действия в условиях комфортной температуры окружающей среды. Таким образом для расширенного преклинического изучения был отобран [£>-Рго6]-ДМ.

Влияние анализаторов нейромедиаторных систем на действие дерморфина и его пролиновых аналогов.

Взаимодействие с антагонистом опиатных рецепторов налоксоном. Налоксон в дозе 1 мг/кг полностью блокирует анальгетический эффект ДМ, [ДРго6]-ДМ и [Б-Рго6]-ДМ в тесте висцеральной боли и снижает в 2 раза действие дерморфина и его аналогов в тесте соматической боли (рис. 9).

Рисунок 9. Влияние налоксона на анальгетический эффект ДМ и его пролиновых аналогов в тесте отдергивания хвоста и уксусных корчей.

150

100

тест отдергивания хвоста * * *

гЬ

#

тест уксусных корчей # * *

т

* I

_г1

контроль ДМ [0Рго6]-ДМ [ДРго6]-ДМ контроль

ДМ

рРго6]-ДМ [ДРго6]-ДМ мг/кг

□ пептид

в пептад+Ма!

* - достоверные отличия относительно контрольной группы (р<0.05)

# - достоверные отличия относительно группы активного контроля (р<0,05)

Взаимодействие с серотониномиметиком.

Введение 5-гидроксотриптофана в дозе 200 мг/кг (в/б) приводит к появлению 57.3+6.8 встряхиваний головой за 30 наблюдаемых минут. ДМ, [ДРго6]-ДМ и [I)-Рго6]-ДМ в дозе 1 мг/кг достоверно ослабляют интенсивность гиперкинеза на 90%, проявляя серотонин-негативное действие в отношении системы 5-НТ2а (рис.10). Рисунок 10. Влияние ДМ и его пролиновых аналогов на встряхивания головой, вызванных предшественником серотонина 5-гидрокситриптофаном.

100

%

80 60 40 20 0

ШШ;

1И

у.' •''

щи

*

в контроль а ДМ

8 ГОРго6]-ДМ в ДРгоб -ДМ

контроль ДМ [ОРгобЬДМ [ДРгоб]-ДМ

- достоверные отличия относительно контрольной группы (р<0.05)

мг/кг

Взаимодействие с холиномиметиками.

Ареколин в дозе 25 мг/кг и оксотреморфин в дозе 0.5 мг/кг вызывают тремор средней продолжительности 628.3±21.9 и 470±218 секунд соответственно. ДМ, [ДРго6]-ДМ и [Б-Рго6]-ДМ в дозе 1 мг/кг не изменяют продолжительности тремора, что указывает на отсутствие М-холиноблокирующего действия.

Взаимодействие с дофаминомиметиком.

Апоморфин в дозе 5 мг/кг вызывал вертикализацию у мышей, средней интенсивности 81.8±13.5 балла, а в дозе 0.75 мг/кг вызывает стереотипию у крыс средней интенсивности 3.2±1.5 балла. ДМ, [ДРго6]-ДМ и [0-Рго6]-ДМ в дозе 1 мг/кг не изменяют интенсивность вертикализации и стереотипии, что указывает на отсутствие антагонизма к Дг дофаминовым рецепторам.

Влияние на эффекты, вызываемые нейротоксином МФТИ, у мышей.

МФТП вызывает появление тремора, пилоэрекции, ретеро/латеропульсии, ригидности конечностей и туловища, синдрома Штрауба, снижение двигательной активности. ДМ, [ДРго6]-ДМ и [0-Рго6]-ДМ в дозе 1 мг/кг достоверно не влияли на нарушения, вызванные МФТП.

Изучение нейротропной активности дерморфина и его пролиновых аналогов.

ДМ в дозах 0.1 - 10 мг/кг (в/б) вызывает дозо-зависимое снижение двигательной активности и ориентировочно-исследовательской реакции (ОИР) беспородных мышей (рис. 11). [0-Рго6]-ДМ оказывает седативное действие в больших дозах (10 мг/кг). [ДРгоб]-ДМ проявляет двухфазное действие. В дозе 0.1 мг/кг наблюдается стимулирующее, а в дозах 1 и 10 мг/кг - седативное действие. ДМ, [£>-Ргоб]-ДМ и [ДРго6]-ДМ в дозах 0.1 - 10 мг/кг не влияют на эмоциональность крыс.

В тесте природнятого крестообразного лабиринта ДМ, [£>-Рго6]-ДМ и [ДРго ]-ДМ в дозах 0.1 — 10 мг/кг не влияют на время пребывания в открытом рукаве, таким образом, соединения не обладают анксиолитическим действием.

В тесте неизбегаемого плавания ДМ в дозах 1 и 10 мг/кг увеличивает время иммобилизации на 24.7 и 63.2% соответственно. [£>-Рго6]-ДМ и [ДРго6]-ДМ увеличивают время иммобилизации только в дозе 10 мг/кг на 45 и 41%

соответственно. Таким образом, ДМ, [ДРгоб]-ДМ и [р-Ргоб]-ДМ не обладают антидепрессантной активностью.

Рисунок 11. Влияние ДМ и его пролиновых аналогов на двигательную активность мышей в тесте открытое поле.

70

I 60

х 50

® ш

о 2 ¿0 о а

® 3 зо -I

с т

Г »-I т 10 о

□ 0,1 мг/кг Я 1 мг/кг в 10 мг/кг

контроль ДМ рРго6]-ДМ [ДВ-061-ДМ мг/кг

* - достоверные отличия относительно контрольной группы (р<0.05)

Рисунок 12. Влияние ДМ и его пролиновых аналогов на продолжительность сна, вызванного гексеналом.

300

о

и 250 о

к 200 о

0

1 150 ¥

1 100 □

5 50

о.

с

о

0 контроль □ ДМ

и тРго6]-ДМ а [дргоб]-ДМ

X

контроль ДМ [ОРго6]-ДМ [ДРго6]-ДМ мг/кг

* - достоверные отличия относительно контрольной группы (р<0.05)

В контрольной группе животных гексенал вызывает

сон

продолжительностью 150±23 сек. ДМ, [ДРго6]-ДМ и [В-Рго6]-ДМ в дозе 1 мг/кг увеличивают продолжительность сна (рис. 12).

Изучение влияния дерморфина и его пролиновых аналогов на развитие синдрома отмены, провоцируемого налоксоном и следование толерантности.

Изучение влияние ДМ, [Э-Рго6]-ДМ и [АРго6]-ДМ на развитие синдрома отмены, провоцируемого налоксоном.

У морфин-зависимых животных налоксон в дозе 10 мг/кг провоцирует прыжки у 94.4% животных, тремор (барабанный бой) у 70.6% животных, встряхивания и птоз - у 35.3% животных (рис. 13). У [£>-Рго6]-ДМ-зависимых

животных налоксон вызывает прыжки у 17.6% мышей, тремор - 94.1%, встряхивания - 11.8%. По основному показателю синдрома отмены прыжкам, [-D-Рго6]-ДМ вызывает меньший по интенсивности синдром отмены. Важным критерием оценки развития зависимости и интенсивности синдрома отмены после провокации налоксона является изменение веса животных. Морфин вызывает достоверное снижение веса на (15%) на 5 день введения, и после введения налоксона (на 20%). [рРго6]-ДМ не вызывает достоверного снижения веса. Рисунок 13. Процент животных с симптомами синдрома отмены, провоцируемого налоксоном у морфин- и [D-Pro6]-ДМ-зависимых животных.

120 100

х

| 80 -

§ 60 | -

20 0

В морфин Н [DPro6]flM

*

J-

прыжки

мг/кг

тремор птоз

* - достоверные отличия относительно контрольной группы (р<0.05)

Изучение толерантности и перекрестной толерантности при субхроническом введении [D-Pro6]-дерморфина.

Субхроническое 7-дневное введение Р>Ргоб]-ДМ в дозе 10 мг/кг приводит к развитию толерантности к анальгетическому эффекту в тесте уксусных корчей, что выражается в его снижении, и к седативному эффекту в тесте открытое поле, о чем свидетельствует повышение двигательной активности. В тесте уксусные корчи пептид-зависимые животные сохраняют чувствительность к морфину, а морфин-зависимые животные, напротив, теряют чувствительность к [£>-Ргоб]-ДМ. В тесте открытое поле введение морфина в дозе 5 мг/кг после субхронического 6-дневного введения [£>-Рго6]-ДМ в дозе 10 мг/кг оказывает стимулирующее действие на горизонтальную и вертикальную двигательную активность.

Изучение побочных эффектов дерморфина и его пролиновых аналогов.

Влияние ДМ, [D-Pro6]-ДМ и [АРго6]-ДМна частоту дыхания мышей.

В контрольной группе мышей частота дыхания соответствовала 314±4 движений в минуту. ДМ, [Г>-Рго6]-ДМ и [ДРго6]-ДМ в дозах до 100 мг/кг достоверно не изменяют частоту дыхания мышей. В дозах более 500 мг/кг пептиды

снижают частоту дыхания (рис. 14). ЕД50 [D-Pro ]-ДМ составляет 322 (221+466) мг/кг.

Рисунок 14. Влияние ДМ, [1)-Рго6]-ДМ и [ДРго6]-ДМ на частоту дыхания через 30 минут после введения.

и дм

□ [DPro6]-flM 8 [ДРго6]-ДМ

контроль 1 10 50 100 500 600 700 800 мг/кг

* - достоверные отличия относительно контрольной группы (р<0.05)

Острая токсичность ДМ, [D-Pro6]-ДМ и [АРгоб]-ДМ.

ДМ в дозах до 600 мг/кг не вызывает гибели животных через 24 часа и 7 дней после введения. Увеличение дозы до 600, 700 и 800 мг/кг вызывает гибель 33.3% животных через 24 часа после введения. [ДРгоб]-ДМ в дозах до 800 мг/кг не вызывает гибели животных. [£>-Рго6]-ДМ в дозе 550 мг/кг вызывает гибель 50% животных, в дозе 600 мг/кг - 66.6%, и в дозах 700 и 800 мг/кг - 100% животных. LD5o [D-Pro6]-ДМ 568 (522±618) мг/кг.

Заключение

В настоящее время поиск лекарств, в частности, анальгетиков на основе пептидов является перспективным направлением. Анализ большого количества работ отечественных и зарубежных исследователей, посвященных ДМ и его аналогам, показал, что эти пептиды проявляют высокую физиологическую активность (Negri et al., 2000). Долгое время считали, что С-конец ДМ не влияет на проявление анальгетической активности, а важна роль У-концевого тетрапептидного фрагмента Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH. В данной работе было показано, что замена Pro6 на D-стереоизомер или его дегидрирование приводит к усилению анальгетической активности. Следовательно, изменения пространственной конформации С-концевого трипептидного фрагмента ДМ могут влиять на изменение анальгетической активности. В результате проведенных исследований было отобрано самое активное соединение [£>-Рго6]-ДМ. Уровень анальгетической активности [0-Рго6]-ДМ сопоставим с активностью морфина

(табл. 3). Пептид проявляет налоксон-чувствительпую анальгезию при действии химических, термических и механических стимулов. Анальгетическая активность [£>-Рго6]-ДМ сопровождается противовоспалительным действием. Гипотермическое действие пептида проявляется только в холодных условиях окружающей среды. [£>-Рго6]-ДМ связывается с высокой аффинностью с периферическими ц,- и 5-ОР препаратов изолированных органов подвздошной кишки морской свинки и семявыносящего протока мыши. Анализ взаимодействия [£>-Ргоб]-ДМ с другими нейромедиаторными системами выявил серотонинблокирующее действие пептида, и отсутствие холино-негативного и дофамин-негативного действия.

Таблица 3. Сравнение активности и морфина

[.D-Pro6"]-ДМ морфин

£ 5 Термический стимул + +

э м s 4> Химический стимул + +

С *г Механический стимул + +

Гипотермия ± +

Двигательная активность t

Синдром отмены ± +

Толерантность + +

Угнетение дыхания (ЕД50) 322 2,3

Токсичность (ЛД50) 552 331

[D-Pro ]-ДМ обладает большой терапевтической широтой. Терапевтический

индекс пептида, определяющий отношение ЕВ50 угнетения дыхания/ЕВ50 анальгетическая активность, в 500 раз больше, чем у морфина. Провоцируемый налоксоном синдром отмены [£>-Рго6]-ДМ протекает с менее выраженными симптомами, чем морфина. При введении пептида в больших дозах и при его отмене не наблюдается изменения веса животных. проявляет

седативное действие, однако при субхроническом введении пептида развивается толерантность к седативному действию. К анальгетической активности толерантность развивается только при субхроническом введении больших доз пептида. [0-Ргоб]-ДМ не проявляет антидепрессантного и анксиолитического действия, характерного для других опиоидных пептидов.

ВЫВОДЫ:

1. Показана возможность создания эффективных анальгетическов на основе структуры дерморфина. Дерморфин и его аналоги [0-Рго6]-дерморфин и [Д-Рго6]-

дерморфин проявляют анальгетическую активность, сопоставимую с морфином, в тестах болевой чувствительности, вызванных термическим, химическим и механическим стимулом.

2. Отобрано соединение [£>-Рго6]-дерморфин, которое вызывает менее выраженный, по сравнению с морфином, провоцируемый налоксоном синдром отмены. При моделировании синдрома отмены пептида не наблюдается изменения веса животных

3. Установлено, что при субхроническом введении [£>-Рго6]-дерморфина наблюдается развитие толерантности к седативному действию, и при введении верхних терапевтических доз - к анальгетическому действию. Кросс-толерантности с морфином не развивается.

. 4. Показано, что [£>-Рго6]-дерморфин обладает большой терапевтической широтой и вызывает угнетение дыхания в дозах близких к токсическим (ЕДзо 322 мг/кг). LD50 [D-Pro6]-дерморфина составляет 476 мг/кг. [£)-Ргоб]-дерморфин проявляет седативное действие в верхних терапевтических дозах, которое устраняется при субхроническом введении. [D-Pro6]-дерморфин не влияет на эмоциональность животных, не оказывает антидепрессантного и анксиолитического действия.

5. Установлено, что анальгетическая активность [0-Ргоб]-дерморфин блокируется налоксоном. [£>-Рго6]-дерморфин обладает высоким сродством к периферическим ц- и 8-опиоидными рецепторами препаратов изолированных органов подвздошной кишки морской свинки и семявыносящего протока мыши.

6. Изученное соединение [£>-Рго6]-дерморфин представляет собой потенциальный анальгетик, по эффективности не уступающий морфину. Преимуществом перед морфином является эффективность в малых дозах (0.1 - 10 мг/кг), большая терапевтическая широта, отсутствие влияния на дыхание в терапевтических дозах, менее выраженные проявления синдрома отмены.

Список работ, опубликованных по теме диссертации: 1. Емельянова,jl.Г. Влияние N-концсвых трипептидов бомбезина, литорина и их аналога на температуру тела и вазомоторные реакции [Текст] / И.В. Сосновская, J1.C. Гузеватых, H.H. Горячева, Т.А. Воронина, Е.Б. Евстигнеева, В.П.

Голубович // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 144, №8.-С. 174-177.

2. Сосновская^И.В. «Терморегуляторная активность N-концевого дипептида литорина» [Текст] / Т.Г. Емельянова, JI.C. Гузеватых, Т.А. Воронина, H.H. Горячева, Е.Б. Евстигнеева, В.П. Голубович // II Международная конференция "Химия, структура и функция биомолекул", Минск, 3-5 октября 2006. - Минск, 2006. - С. 125.

3. Сосновская ^ И.В. «Терморегуляторная активность литорина и его фрагментов» [Текст] / Т.Г. Емельянова, JI.C. Гузеватых, Т.А. Воронина, Е.Б. Евстигнеева, В.П. Голубович // II Международная конференция "Химия, структура и функция биомолекул", Минск, 3-5 октября 2006. - Минск, 2006. - С. 126.

4. Sosnovskaya^ I.V. "Influence of N-terminal threepeptide of litorin and its analogues on thermoregulation in rats at different ambient temperatures" [Текст] / T.G. Emel'yanova, T.A. Voronina, L.S. Guzevatikh, N.N. Gorjacheva, E.N. Galuk, S.V. Egorova, V.P. Golubovitch // International Conference "Basic science for biotechnology and medicine", Novosibirsk, Russia, 3-7 September, 2006. - Новосибирск, 2006. - P. 103.

5. Сосновская, И.В. "Терморегуляторная активность бомбезина при разных способах введения" [Текст] / Т.А. Воронина, H.H. Горячева, JI.B. Внукова, Т.Г. Емельянова // Сборник материалов конгресса (тезисы докладов) XIV Российского национального конгресса "Человек и лекарство", 16-20 апреля, Москва 2007. -Москва, 2008. - С. 878.

6. Сосновская ( И.В. «Роль пролина в молекуле дерморфина в проявлении анальгетической активности пептида» [Текст] / Л.С. Гузеватых, Т.А. Воронина, JI.A. Андреева, Т.Г. Емельянова, Н.Ф. Мясоедов, С.Б. Середенин // Материалы III Съезда фармакологов России. «Фармакология практическому здравоохранению». Санкт-Петербург, 23-27 сентября 2007 г. // Психофармакология и биологическая наркология. -2007. - Т. 7 (спец. выпуск); ч. 2. - С. 1961.

7. Сосновская И.В. «Влияние пролиновых аналогов дерморфина на двигательную активность и ориентировочно-исследовательскую реакцию» [Текст] / Л.С. Гузеватых, Т.А. Воронина, Т.Г. Емельянова, Л.А. Андреева, Н.Ф. Мясоедов //

III Российский симпозиум "Белки и пептиды", 16-21 сентября, Пущино, 2007. -Пущино, 2007. - С. 92.

8. Сосновская ^И.В. «Влияние дерморфина и его пролиновых аналогов на двигательную активность, ориентировочно-исследовательскую реакцию, уровень тревожности и устойчивости к депрессии» [Текст] / JI.C. Гузеватых, Т.А. Воронина, Т.Г. Емельянова, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, С.Б. Середенин, Н.Ф. Мясоедов //

IV Международный Междисциплинарный Конгресс "Нейронаука для медицины и психологии", 10-20 июня Судак, Крым, Украина, 2008 г. - ООО «МАКС Пресс», Москва, 2008. - С. 283.

Напечатано о готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 13.01.2009 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ 008. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.