Автореферат и диссертация по медицине (14.03.07) на тему:Поиск и фармакологическое изучение производных 4-ацетилсукцинаниловой кислоты, проявляющих гемостатическое действие

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

рго од

иа правах рукопису

1 7 'і

НАСКЕВІІЧ ОЛЬГЛ ШЛ1ІІВГ1Л

ПОШУК ТА ФАРМАКОЛОГІЧНЕ ВИВЧЕННЯ ПОХІДНИХ 4-АЦЕТИЛСУКЦННАІІШОВОЇ КИСЛОТИ, ЯКІ ВИЯВЛЯЮТЬ ГЕМОСТАТИЧНУ ДІЮ . .

¡4.03.07 - фармакологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Одеса - 1996

Робота виконана в Українській фармацевтичній академії' (м. Харків)

Науковий керівник: Заслужений діяч науки і технки України, член-кореспондент АНТК, доктор медичних наук, професор Березнякова Алла

Іллівна

Науковий консультант: Доктор медичних наук

Попов Сергій Борисович

Офіційні опоненти: 1. Доктор медичних наук, професор . Демидов Володимир Михайлович

2. Доктор біологічних наук, професор ІІапхаяюк Володимир Клеонтієвич

Провідна установа - Інститут фармакології та токсикології АМН України

Захист відбудеться “2^' 0 /3> годині 1996 року на

засіданні спеціалізованої ради Д 05.04.02 при Одеському державному медичному університеті за адресою: 270100, м.Одеса, пров.Валіховський, 2.

Автореферат розісланий 1996 року.

З дисертацією іМожна ознайомитись в бібліотеці Одеського державного меднчігого університету. -

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор медичних наук, пофесор

Л.С.Годлсвський

. Загальна характеристика роботи

Актуальність темн. Практична медицина відчуває відомій! дефіцит у ирмакологічних засобах, які активно впливають на систему зсідання рові. Виникає безліч нових проблем при зупинці капілярно-аренхіматозних кровотеч, незважаючи на широкій вибір гемостатичних [репаратів. З існуючих препаратів коагулотрошюї дії найбільш фективіпімн є фармакологічні речовини тваринного походження (фактори сідання крові, стрептокіназа та інші). Дорога сировина створює певні кладпості для адекватного задовольненім потреби охорони здоров’я у цих грепаратах. Обмежено вибір як гемостатичних, так і аіггифібринолітичних репаратів. За даними вітчизняної літератури (Машковський М.Д., 1988; [екмаи І.С., 1988) серед синтетичних антифібринолітичних препаратів для упинки капілярно-паренхіматозних кровотеч використовується найчастіше асто лише Е-амінокапронова кислота. Все це диктує необхідність одальшого пошуку нових гемостатйків, що дозволять поліпшити якість ікування, завдяки впливу на різні етапи зсідання крові. Пошук біологічно іетивних сгюлук у ряду похідних янтарної кислоти становить науковий та рахтичшш інтерес, так як ці сполуки володіють широким спектром »армакологічної дії та низькою токсичністю (Бендер К.І., 1977; Богацька [.М., 1986; Боренбойм Г.М., 1990; Ковальов М.М., 1990).

У зв’язку з цим пошук , відбір для подальших фармакологічних «пробувань найбільш ефективних та малотоксичних сполук у ряду охідних 4-ацетилсукцинанілової кислоти є перспскгашшм. У іармакологічному аспекті ці сполуки раніше не вивчалися.

Метою рободи стало фармакологічне вивчення нових похідних 4-гстилсукцинанілової кислоти; воно поєднувало пошук та відбір речовини, ка виявляє виразну активність по відношенню до системи зсідання крові, доклінічне вивченім, та встановлення деяких механізмів гемостатичної

1. Провести машинне прогнозування фармакологічної активності похідні сукцинанілової кислоти за допомогою комплексу програм “ОРАКУЛ”.

2. За результатами машинного аналізу вивчити нові похідні ацетилсухцинанілової кислоти на прогнозовані види біологічн активності.

3. Вивчити зв’язок хімічної структури з біологічною дією у ряду ‘ ацетилсукцшіанілової кислоті!.

4. Відібрати для доклінічного фармакологічного вивчення сполуки, я виявляють виразну дію на систему зсідання крові при місцевому ' загальному використанні, з метою створення ефективного вітчизняної гемостатика.

Визначити:

- гостру токсичність сполуки;

- ефективну дозу на здорових тваринах та в умовах модельної патології. Вивчити:

- можливу алергізуючу дію;

- можливу ембріотоксичну, тератогеїшу та гонадотропну дію;

- вплив на систему зсідання крові: тромбоцитарно-судинни

коагуляційний гемостаз, фібринолітичну систему крові.

5. Сформулювати на основі отриманих результатів можливі механіз\ гемостатичної дії.

Наукова новизна дослідження. Вперше були досліджені 45 нові похідних 4 - ацетилсукциі іан ілової кислоти з 5 видів фармакологічн активності з визначенням гострої токсичності. Встановлена залежніс “сіруктура-дія-активність” у ряду похідних 4-ацетилсукцинаііілов кислоти. Вперше виявлені коагулотроппі властивості у нових похідних ■ ацетилсукцшіанілової кислоти. Новизна дослідження захищена авторські свідоцтвом Держкомітету СРСР у справах винаходу та відкриття ( 1573803). Вперше досягнуто виразного гемостатичного ефекту натрієв

олі 4-ацетилсукцинанілової кислоти, яка умовно була названа Сукцифенат”. Встановлено, що сукцифеїіат належить до практично іетоксичних сполук при пероральному та парентеральному шляхах іведення.

Теоретичне та практичне значення роботи. Показана перспективність іивченпн похідних 4-ацетилсукцинанілопої кислота як високоактивних ііологічних речовин з метою створення фармакологічних препаратів різноманітної дії. ’

Створено оригінальний синтетичний препарат антифібринолітичної ;ії - сукцифенат - для місцевого та парентерального застосування, ’езультати доклінічного фармакологічного вивчення сукцифенату свідчать гро те, що препарат не виявляє загальнотоксичного впливу на організм варин, слабо кумулює в організмі, володіє незначною алергізуючою дією іри тривалому застосуванні, не виявляє ембриотоксичної, тератогенної та онадотрогшої дії.

Сукцифенат з успіхом пройшов І фазу клінічних випробувань, •езультати якої свідчать про високу ефективність препарата при зупинці апілярно-паренхіматозних кровотеч, за гемостатичним ефектом він не оступається дії гемостатичної губки та тромбіна. Нині дозволена II фаза ліпічннх досліджень.

Теоретичні аспекти впроваджені в учбово-викладацьку діяльність па афедрі патології УкрФА по гемі “Порушення системи зсідання крові” та а кафедрі оргапічної хімії по темі “Вивчення дикарбонових кислот”. Іоложепия висунуті на захист.

. Похідні 4-ацстилсукцинанілової кислоти - регулятори системи зсідання рові.

. Вплив сукцифената на систему зсідання крові (деякі механізми гмостатичної дії).

. Нешкідливість сукци(}юнату у іххггрому та хронічному експерименті.

Дисертаційна робота виконана відповідно плацу науково-дослідни: робіт УкрФА за проблемою Міністерства охорони здоров’я Україні “Фармація” (шифр теми ВІІ 10.06.018.86, N державної ресстраці 01.86.0042142).

Апробапія дисертації. Основні положення дисертації викладені т; обговорені на:

а) конференції молодих учених та спеціалістів УкрФА, ХІУ1І (Харків квітень, 1992 р.);

б) науково-практичній конференції “Лікарські засоби України, синтез наукові дослідження, виробництво, реалізація” (Харків, жовтень, 1992 р.);

в) 1 Українській науковій конференції за участю країн СНД (Вінниця 1993 р.);

г) засіданні Харківського обласного суспільства фармакологів (Харків травень, 1993, 1994 р.);

д) 2 Російському національному конгресі “Человек и лекарство” (Москва квітень, 1995 р.);

є) першому національному з’їзді фармакологів України (Полтава, вересень 1995 р.).

Публікапії. За темою дисертації опубліковано 8 друкованих робот, них 2 статті у центральних журналах і збірниках, 1 авторське свідоцтво.

експериментальні дослідження по виявленню гострої токсичності ефективної та, алергізуючої дії, ембріотоксичної, тератогенної гонадотропної дій, вивчено вплив на систему зсідання крові.

Структура дисертації та Ті обсяг. Робота має вступ, огляд літератури опис методів дослідження, розділи власних досліджень, заключения висновки, додатки. Загальний обсяг дисертації складає 177 сторіної машинописного тексту. Ілюстрований матеріал подано на 10 малюнках, 2 таблицях. Список літератури включає 158 джерел, з них 65 іноземних.

)

Матеріали 1 метоли дослідження. Об’єкт вивчення - 45 нових похідних щетилсукцинанілової кислоти, які були синтезовані на кафедрі ганічної хімії УкрФЛ.

Поглибленому доклінічному вивченню була піддана натрієва сіль 4-зтилсукцинанілової кислоти, яка була умовно названа “Сукдифенат” та явила виразпу гемостатичну активність. Експериментальне дослідження копано на 1964 білих мишах вагою 18-20 г, 1010 білих пацюках вагою 0-220 г, 46 морських свинках, вагою 250-300 г, 8 кроликах вагою 2-2.5 16 собаках вагою 8-10 кг, які знаходилися на стандартному харчовому ціоні та звичайному температурному режимі віварію. Досліди оводилися на ненаркотизованих тваринах (за рішенням Ученої Ради >нМІ від 28 травня 1980 року) з мстою наближення до природних умов авматизації. Контрольні і основні досліди ставили одночасно, аховуючи добові та сезонні коливання біоритмів. Прогнозування ірмакологічної активності нових похідних 4-ацетилсукцинанілової слоти проведено за програмою “ОРАКУЛ” (Оптимізований Алгоритм шструювання Удосконалених Ліків) у лабораторії автоматизації хімічних сліджень Інституту органічного синтезу АІІ Латвії.

При скринінгу вивчалась гостра токсичність, антиексудативна, альгетична, діуретична, антигіпоксична та гемостатична дії 45 похідних щетилсукцинанілової кислоти.

Гостру токсичність сполук вивчали на двох видах тварин: білих мишах білих пацюках обох статей при внутрішньочеревному та пероральному іяхах введення. Розрахунок проводили за методом Б. М. ІІІтабського та івавт. (1980) та за методом Літчфілда та Уілкінсона (Беленький М.Л., 72 р.). Протиексудативну активність нових похідних 4-

етилсукцинанілової кислоти вивчали на моделі гострого карагенінового талешія (Тринус Ф.П. та інш., 1987). Анальгетичпу активність вивчали моделі оігювокислих корчів (Тринус Ф.ГІ. та інш., 1974). Діуретичну гивпість вивчали за методом Берхіна (1977). Антишюксичпу дію нових

сполук вивчали на моделі гіиоксичної гіпоксії (Корабльов М.В., Лукіє

Н.Ч., 1976). Дію на систему зсідання крові нових похідних

ацетилсукцинанілової кислоти оцінювали, використовуючи Bi3yaj методи (ІІредтеченський В.Е., I960; Гацура В.В., 1974).

Вплив сукцяфенату на систему зсідання крові. Вивчення тромбоцита; судинного гемостазу.

Час кровотечі визначали за методом А.С.Шитикової (1975), я; полягає в тому, що піддослідній тварині (білому пацюку) робили на; хвоста та вміщували його у пробірку з певною кількістю підігрітої во після чого визначали час кровотечі та кількість утраченої кр (колориметрично).

Підрахунок тромбоцитів у периферичній крові робили у как Горясва з використанням 1% розчину оксалату амонію як розчинної гемолізуючої рідини (Предтеченський В.E., I960). При нідраху:

використовували мікроскоп з фазоконтрастпою приставкою.

Спонтанну агрегацію тромбоцитів вивчали за допомогою електрон спектроскопії. Оцінку агрегацікної здатності тромбоцитів проводі шляхом підрахунку кількості агрегатів та кількості вибуханій та парості які характеризують процес активації тромбоцитів. Ретракцію кров’ян згустка оцінювали шляхом тромбоеластографії (Апдрієнко Г.В., 1981).

Дослідження коагуляційного гемостазу.

Тромбіновий час визначали за Maibet та Winterstein (1984). Кількії визначення фібриногену у плазмі здійснювали шляхом коагуляційних п] за методом Рутберга РА. (1984). Фібринстабілізуючий фактор (X] оцінювали за методом Балуда В.П. та співавт. (198П), шляхом іпкубг зіустків плазми, яку вивчали у 5М щавлевокислій сечовині. Про кількі фактора XIII орієнтовно судили за часом розчинення зіустків, яі знаходиться у прямій залежності від рівня XIII фактора. Для кількісн

изначення фібринстабілізуючого фактора до дослідної плазми додавали іаростаючі кількості монойодоцетної кислоти, яка робила інгібуючий плив па XIII фактор. Визначали швидкість, ступінь лізису та за аліброваними кривими встановлювали рівень фактора XIII.

Іосліджепня внутрішнього механізму зсідання.

Час зсідання крові визначали методом JIi-Уайта та методом Сухарева 1987). Мікрокоаіуляційний тсет, який відтворює динаміку створення та ¡¡активацію тромбіну, виконували за Баркаганом Л.З. (1975). З цією метою

1.1 мл стабілізованої цитратом крові змішували з 2 мл 0.222% розчином аюриду кальцію, внаслідок чого утворювалася гемолізат-кальцієва суміш, у ікій починався процес активації протромбіну та перетворення його у громбін. Цю суміш у різні строки (у перші 10 хвші. вивчення через кожні 2 шил., потім через кожні 10 хвил.) додавали до ріпного обсягу нативної їлазми. Тромбін, який знаходиться у гємолізат-кальціевій суміші, шкликає зсідання цієї плазми тим швидше, чим вище його концентрація.

Іосліджепня зовнішнього механізму зсідання.

ІІротромбіновий час визначали за А.Квік (Детинкина у співавт., 1984). $ цією метою фіксували час зсідання рекальцифікованої плазми при юдаваїші до неї стандартної кількості тканинного тромбопластшіу. Останній запускає процес зсідання через активацію фактора VII, тобто ювнішнім шляхом.

вивчення протизсідаючаїх механізміз.

Гепаринорсзистентність плазми визначали за допомогою серійного ■епарітотромбінового тесту по К.М. Бишевському (1987). До дослідної та гонтрольної нормальної плазми додавали розчин гепарину, який юдовжував тромбіновнй час, та шляхом порівняння дослідної та

контрольної плазми за тромбіновим часом, визначали індекси активацї антитромбіну та антитромбіновий резерв плазми.

Дослідження фібринолітичної системи крові.

Спонтанний лізис згустків визначали візуально та шляхол тромбоеластографії. Фібринолігичну активність крові вивчали методом Е.Бїдвел (Андрієнко Г.В., 1979), який полягає у визначенні різниці концентрації фібриногену у пробах до та після інкубації досліджуваної плазми. Протягом її вивчення йде деградація фібрину ферментом плазміном. Концентрацію фібриногену визначали

фотоелекіроколориметрично.

Розрахунок фібринолітичної активності проводила за формулою:

А • Б А - кількість фібриногену через 60 хвил.

ФА(%)=----------х 100 , де інкубації;

А Б - кількість фібриногену через 3 год. (при

дослідженні плазми пацюків) та 24 год. (при дослідженні плазми кроликів) інкубації.

Продукти деградації фібрину визначали методом С.З.Габитова та співавт. Еуглобуліновий лізис згустків вивчали за методом Коваржика-Булука (Детинкина Г.Н., 1984). Еуглобулінову фракцію осаджували у кислотному середовщці при низькій температурі, розчинювали та викликали у неї зсідання шляхом додавання хлориду кальцію. Фіксували час лізису згустка, отриманого при 37 "С. Проводили тромбоеластографічні дослідження, які характеризують швидкість створення протромбінази і тромбіну, перетворення фібриногену у фібрин, час створення фібринового згустка, тривалість коагуляції, обсяг, густину та еластичність згустка, масу фібриногену у зсідаючій крові, початок ретракції (Іванов Е.П., 1983). Ефективну дозу визначали у тварин на моделі паренхіматозної кровотечі (Каравапов А.І'., 1972). Розрахунок ефективної дози робили по (Хаджай Я.І., 1965). Можливу алергізуючу, ембріотоксичну, терато генну.

гонадотропну дію сукцифенату вивчали за загальноприйнятими методиками відповідно до офіційних методичних рекомендацій фармакологічного комітету МОЗ СРСР, від 1 липня 1988 р.

Вивчення аятнохендантної дії сукцифената.

Дослідження впливу сукцифената на дихання та окисне фосфорилювання мітохондрій з печінки білих щурів вагою 200-220 г, проводили за методом Рутенберга Ю.С. у системі in vitro. Кількість білка мітохондрій визначали за Лоурі О.Х.

Вивчення дії сукцифената на ПОЛ мікросом проводили за методом Каматч С.А. у системі in vitro на мікросомах з печінки білих щурів. Кількість білка мікросом визначали за Лоурі О.Х.

Результати досліджень піддавали статистичній обробці на ЕОМ.

Результата досліджень

За результатами машинного прогнозування, яке проводилося за допомогою комплексу програм “ОРАКУЛ”, були вивчені солі, ефіри, игкіламіди, арил аміди 4'ацетилсукцинанілової кислоти. Взагалі досліджено t5 сполук з 5 видів фармакологічної активності: протизапальної, шальгетичної, діуретичної, протигшокеичної та гемостатичної з шзначенням гострої токсичності. У результаті проведених скринінгових досліджень була виявлена залежність “структура-дія”. Встановлено, що ххпра токсичність сполук, які вивчалися, коливається від 190 до 2520 ¿г/кг. При цьому 29 сполук за класифікацією К.К.Сидорова (1979), іалежать до малотоксичних, а 16 до практично нетоксичных, що, напевно, юяснюється тим, що сукцинова кислота є природним метаболітом >рганізму, який бере активну участь у енергетичних обмінних процесах -щклах Кребса та Робертса.

Серед похідних R-сукцинапілових кислот знайдені сполуки, які іиявляють протизапальну дію (Чувурин A.B. та ін., 1985), це склало основу

для вивчення антиексудативної активності досліджених сполук, я проводилося на моделі гострого карагенінового запалення (Трииус Ф.ГІ. ін., 1974).

Встановлено,' гцо всі похідні 4-ацетшісукцинанілової кисла пригноблюють розвиток запального набряку. Отримані у хо експерименту дані свідчать про перспективність подальшого пошуку сер< цих сполук, які володіють антиексудативним ефектом, що співпадає . даними машинного прогнозування.

> Завдяки тому, що нестсроідт протизапальні засоби наряду антиексудативним справляють знеболюючий ефект (Тринус Ф.П. та ін 1974), 18 визначених для вивчення сполук були також досліджені з мето виявлення анальгетичної активності На моделі оцтовокислих корч (Тринус Ф.П. та ін., 1987) встановлено, що досліджені похідні <-ацетилсукцинанілової кислоти володіють слабким виразним анальгеични ефектом, що дозволяє зробити висновок про недоцільність подальшої пошуку потенційних анальгетиків.

На підставі літературних даних про діуретичну дію сукцинові кислоти та її солей (№^ег V., 1978), результатів біопрогнозу нами бух вивчена діуретична дія нових сполук за тестом водного навантажень (Берхіп Е.Б., 1977). Аналіз отриманих експериментальних даних показу що похідні 4 -ацетилсукцинанілової кислоти вказують на сечогінний ефек З 23 досліджених похідних 4-ацетилсукцинанілової кислоти 22 сполук посилюють видільну функцію нирок, що дозволяє вважати перспектишни подальший цілеспрямований пошук діуретичних засобів у вивчаємому ря/ хімічних сполук, які досліджуються.

. Раніше вже був доведений вплив похідних сукцинової кислоти І резистентність тварин до кисневого голодаїшя (Чувурин А.В. та ін., 1983 Серед похідних 4-ацетилсукцинанілової кислоти, на моделі гіпоксичні гіпоксії (Корабльов М.В. та ін., 1986) не знайдено сполук з виразно

антигіпоксичною активністю, що дозволяє вважати недоцільним подальший пошук антигілоксаіпів у досліджуваному ряду хімічішх сполук.

В УкрФА більше 15 років продовжується вивчення здатності похідних дикарбопових кислот на наявність здати ості впливати на систему зсідання крові. Використовуючи машинне прогнозування, аналізуючи зв’язок хімічної структури з фармакологічною дією, раніше були встановлені коагулотропні властивості у деяких дикарбонових кислот (Чсрних В.П., Гриценко І.С., 1985).

Згідно з результатами біопрогнозу, який був проведений за допомогою комплексу програм “ОРАКУЛ”, було встановлено, що серед похідних 4 - ацетилсукцинаніловоГ кислоти повинні бути як гемостатики так і антикоагулянти.

Раніше похідні Л-сукцинанілової кислоти не були досліджені на предмет наявності коагулотропної активності. У зв’язку з викладеним вивчали вплив 45 досліджених сполук на систему зсідання крові лабораторних тварин. Аналіз отриманих результатів підтвердили дані біопрогнозу про неоднозначний вплив нових похідних 4-ацетилсукципанілової кислоти на процес гемокоагуляції. 4-ацетилсукцинанілова кислота виявляє гемостатичний ефект, який за активністю наближається до вікасолу. Найбільш виразну гемостатичну активність проявили сполуки лід шифрами 3.5 та 3.6 - натрієва та калієва солі 4-ацетилсукцинанілової кислоти відповідно. Амід 4-ацетилсукцинанілової кислоти (сполука під шифром 3.18) вия'вив антикоагулянтний ефект (табл.1).

Враховуючи наявність виявленого нами гемостатичного ефекту натрієвої солі 4-ацетилсукцішанілової кислоти, було необхідно виявити ефективність досліджених сполук в умовах паренхіматозної кровотечі. З цією метою використовували модель різаної рани печінки (Гацура В.В., 1974).

u

Встановлено, що в умовах паренхіматозної кровотечі натрієва • калієва солі 4-ацетилсукцинанілової кислоти виявляють ефект, аналогічяи дії препарату порівняння - Е-амінокалроцової кислоти (табл.2).

Таблиця 1.

Гостра токсичність та коагулотропна активність нових сполук, які вплинули

на систему зсідання крові

Досліджувана речовина Час зсідання крові, % від контролю Середньосмертельна доз (ЛД50)

Вікасол 48.8

3.5 56.7 2450 ± 85.7

3.6 57.2 1980 ± 99.3

3.18 . 155.3 720 ± 21.8

Таким чином, у результаті проведення цілеспрямованого скриніїп вперше була встановлена здатність похідних 4 -ацетилсукцинаніловс кислоти справляти і гемостатичний, і аптикоаіулянтний ефект.

Таблиця 2.

Досліджувана речовина Час зсідання крові, с Час зсідання крові, % віл контролю

Е-амінокапронова к-та 54.4 ± 2.9 79.3

3.5 52.6 ± 5.3 80.1

3.6 - 53.3 ± 3.8 79.8

' контроль 263.3 ± 7,6 100

Примітка: р < 0.05 у порівнянні з контролем

Враховуючи більш низькі токсикологічні характеристики, які булі отримані у ході скринінгових досліджень, натрієва сіль 4

ацетилсукцинанілової кислоти, умовно названа “сукцифенатом”, бул відібрана для доклінічноіо вивчення. Гемостатична активність сукнифенат та похідних 4-ацетилсукциналілової кислоти захищена авторськш свідоцтвом Держкомітету СРСР у справах винаходу та відкриття (А.С.

1540277 та А.С. N 1573803). При вивченні гострої токсичності сукцифепату встановлено, що препарат є практично нетоксичною сполукою (Сидоров К.К., 1979). При внутрішньошлунковому споживанні середньосмертельних доз встановити не вдалось, а при внутрішньочеревному засобі введення ЛДя» складала на мишах 2780 мг/кг, на пацюках - 2590 мг/кг. Ефективну дозу визначали у тварин в умовах паренхіматозної кровотечі на різаній рані печінки (Караванов А.Г., 1972). Згідно з отриманими даними ЕДзо склала 7.0 мг/кг; ЕД4» - 10.5 мг/кг та ЕД» - 13.9(14.0) мг/кг. -

Таким чином, за гемостатичною дією сукцифенат та Е-амінокапронова кислота виявили однакову ефективність, а за широтою терапевтичної дії сукцифенат у 10.3 рази перевищує рефренс-препарат (мал.1). Для характеристики дії сукцифенату на систему зсідання крові ми вивчали його вплив на кількість тромбоцитів в периферичній крові при одноразовому та тривалому використанні, тро м боцитарно - суди нний та коаіуляцінний гемостаз, вивчали дію препарату на внутрішні, зовнішні механізми зсідання крові та проти зсідаючі механізми. З цією метою вивчали належність та агрегаційну здатність тромбоцитів, тромбіновий та протромбіновий час, активований час рекальцифікації, активований частковий тромбопластиновий час, кількість фібриногену, активність фібринстабілізуючого фактора (XIII фактор - фібрипаза), фібринолітичпу активність та наявність у сироватці крові.

Специфічну нешкідливість сукцифенату визначали у порівнянні з широко використовуваною у медичній практиці Е-аміноканроновою кислотою. Препарати вводили внутрівенно в ефективних дозах: сукцифенат - 13.9 мг/кг, Е-АКК - 100 мг/кг, враховуючи час

максимального виявлення ефекту Е-амінокапронової кислоти (Гаврилов А. П., 1966).

У результаті проведених досліджень було встановлено, що одноразове введення сукцифенату не змінює кількість тромбоцитів у периферичній крові. Тривале введсїіня (протягом місяця) сукцифенату в ефективній дозі

призводило до незначного, але статично значного збільшення кілька тромбоцитів у периферичній крові. Крім того, під впливом тривал введення сукцифенату збільшувалась агрегаційна здатність тромбоцитів. ЕДммг/кг ЛДямг/кг ТИ

110* 5000. 550.

105. 4500' ’ 500.

100. 4000. . 450 ..

95 . 3500. 400.

90 . 3000- 350.

85 . 2500. 300.

80 2000 . . 250 .

200 .

14 ~ ' 1500. . 150..

10 100 ..

5 1000 . 50 ..

ДЕ?«

ііТІТа

дли

ІТИ

114.

сукцифенат

Е-амінокапронова кислота

Мал. і Порівняльна характеристика сукцифенату та Е-АКК.

Напевно, сукцифенат володіє здатністю проходити через мембрі тромбоцита й активно втручатися у процес обміну, так як є похідн природного метаболіту організму - сукцинової кислоти.

Встановлено, що препарат помітно скорочує час рекальцифікації 29.4% у порівнянні з контролем (табл.З). Як відомо, цей тест характери переважно швидкість 1 фази гемокоагуляції (Баркаган З.С., 1975) свідчить про тс, що сукцифенат прискорює створення тромбопласти викликаючи гіперкоагуляцію у фазі генерації тромбокінази. Акгнвоваї частковий тромбопластиновий час також зменшується на 29.8%, підтверджує вищесказане. Сукцифенат виявляє вплив і на 2 фазу зсідаі крові, порушуючи конверсію протромбіну у тромбіп: протромбіно] індекс зменшується на 10.7% (Караванов А.Г., 1972). Препарат ііриско[ перехід фібриногену у фібрин під впливом тромбіну на 14.7%, що свідч

про вилив препарату на 3 фазу гемокоагуляції (Кузнин Б.І., 1974). Фібринстабілізуючий фактор (фактор XIII - фібриназа), який бере участь у З етапі перетворення фібриногену у фібрин, здійснює створення стабілізованого, важко розчинного фібрину (Куденко ТА., 1976). Під впливом сукцифенату час лізису згустха фібршюполімеру у щавлевокислій сечовині збільшується у порівнянні з контролем на 30.3%. При цьбму кількість фібриногену та тромбіновий час з протамінсульфатом значно не відрізняються від показників контрольної групи тварин, тоді як ці величини виявляють порушення фібриноутворення через кількісне та якісне порушення фібриногену та наявність інгібіторів тромбіну (Бишсвський А.М, 1987). Про фібринолітичну активність крові можна судити також по наявності у неї продуктів деградації фібриногену -фібрину (ПДФ). Підвищення рівня ПДФ розглядається як ознака гперфібрииолізу. Після введення сукцифенату • проба на виявлення продуктів деградації фібрину надала негативний результат. Найбільш значні зміни були відзначені у фібринолітнчній системі крові: під дією сукцифенату лізис еуглобулінового згустка сповільнюється у 2.8 рази у порівнянні з контролем (табл.З). В цих же умовах Е-амінокапронова кислота інгібує фібринолітичну активність крові у 2.3 рази, відносно до контролю, на протромбіновий іпдекс та активність XIII фактора впливає аналогічно сукцифенату. Інші показники при дії Е-АКК мають незначні зміни, що відповідає даним літератури (Пелькис П.С., 1986; Трегубенко А.І., 1977; Куценко ТА., 1972; Амирхаявян В.Б. та ін., 1980). Так як сукцифенат виявив виразну антифібринолітичну активність на систему крові пацюків, ми вивчили вплив препарату на процес природного лізису фібринового згустку у дослідах на собаках у порівнянні з Е-АКК. Дослідження підтвердили інгібуючу дію сукцифенату на фібринолітичну активність крові (табл.4). -

Ми виходили з даіпіх літератури про різносирямовані дії інгібіторів фібринолізу, які можна поділити на активатори, які перешкоджали процесу

активації плазміногену, тобто утворенню активного протеолітичноп ферменту, та анти плазміни, які блокують протеолітичну дію плазмін; відносно фібриногену та інших білків (Андреенко Г.В , 1979; Огстап Д. 1982). У зв’язку з викладеним ми модулювали порушення фібринолізу введенням прямого та непрямого активаторів плазміногену - урокшази т< стрсптокінази - in vitro. Враховуючи односпрямованість дії, як препара' порівняння використовували Е-амінокапронову кислоту (Скипетров В.П. 1980). Передбачувану інгібуючу дію ’ сукцифенату на активаторі профібринолізину реєстрували методом тромбоеластографії. Дл> порівняльної інтерпретації отриманих результатів готували суміші, як містили цитратну кров, розчин хлориду кальцію, розчин активаторів плазміногену у веркальному буфері та розчин препаратів, які вивчалися.

Попередньо були зняті 5 тромбоеластоірафічнйх контролен : інтактний, стрептокіназний, урокіназний, контроль з сукцигемом та кошроль з Е-АКК (мал.2,3,4,5,6).

При реєструванні процесу зсідання сумішей, які містять сгрептокіназу та сукцифенат, отримували тромбоеластограми, що засвідчували повне гальмування процесу стрептокіназної активації фібринолізу, утворення повноцінного фібринового згустка та зберігання динамічних властивостей утворюваних фібрииових ниток. У дослідах з урокіназою результати ідепггачні, але з менш виразним ефектом. Аналогічні результати спостерігаються при по черговому додаванні до крові суміші Е-АКК та активаторів (мал.7,8,9,10).

Таким чином, було встановлено, що механізм антифібринолітичної діі сукцифенату має антиферментний характер: блокуючи у дослідах in vitre активатори профібринолізину (плазміногену) - стрентокілазу та урокіназу,

- та пригноблюючи дію фібринолізшіу (плазміну), препарат чинить специфічну кровоспинну дію. Одночасно спостерігали тенденцію де зниження початкових фаз коагуляції.

Для вивчення сукцифенату в умовах модельної патології ми икликали капілярну кровотечу на різаній рані печінки пацюків. Фібриноліз активізували внутрівенним ввведенням стрентокінази.

'аблиця 3.

Показники зсідання крові при внутрівенному введенні сукцнфенату та

Е-амінокапронової кислоти

Показники Контроль Х±х Сукцифснат Х±х Е-АКК Х±х

Іротромбіновий час, с 32.6 ± 0.22 27.8 ±0.18 31.2 ± 0.14

Іротромбіновий індекс, % 78.16 ± 0.35 69.57 ± 0.17 70.8 ± 0.26

іктивований час екальцифікації, с 23.5 ± 0.1 16.6 ± 0.1 21.5 ± 0.12

[III фактор - фібрнназа, с 59.1 ± 0.48 77.0 ± 0.26 71.2 ± 0.16

іктивований частковий ромбопластиновий час, с 21.5 ± 0.19 15.1 ± 0.1 18.4 ± 0.14

>ібриногеп, г/л 3.5 ± 0.05 3.6 ± 0.03* 3.6 ± 0.02’

ромбіновий час з ротамінсульфагом, с 23.0 ± 0.2 24.5 ± 0.01 23.7 ± 0.15

>ібринолгтчна акивність, хЬ 63.1 ± 0.75 169.5 ± 1.35 157.5 ± 1.46*

Іродукти деградації фібрину 0 0 0

[риміткд: п=10, р < 0.05 у порівнянні з контролем;

* - р > 0.05 у порівнянні з контролем.

аблиця 4.

Натуральний лізис фібрннового згустеа при внутрівенному введенні сукцнфенату та Е-аміиокапронової кислоти

Показники Контроль Суктш4>епат Е-АКК

ематокріт 50.7 ± 1.3 49.1 ± 1.5 49.0 ± 0.9*

Мбринолітнчна активність, % 20.1 ± 1.03 12.8 ± 0.3 13.9 ± 0.1

етракція кров’яного згустка 38.03 ± 1.2 27.3 ± 1.4 30.4 ± 0.5 .

Іримітка: п~10, р < 0.05 у порівнянні з контролем.

Результати досліди} показали, що сукцифсиат зменшує час кровотечі

2.2 рази у порівнянні з контрольною іруною тварин, які не лікупалио ГІри введенні сукцифенату тваринам із стрептокіназною актшіаціп фібринолізу, тривалість кровотечі наближається до контрольних даних, щ< дозволяє говорити про повну інактивацію дії стрентокінази та ефективніст використання препарату при капілярній кровотечі.

Отримані нами результати щодо сукцифенату погоджуються з даннмі літератури про дію Е-амінокаирнової кислоти (Куценко Т.А., 1971, 1986 ІІЇк;«'о.наеБЛ Ь.Е., 1986). Згідно з результатами вивчення нешкіддивосі сукцифенату у хронічному експерименті (Черкасова JI.H., 1990) булі відомо, що препарат не виявляє загальнотоксичної дії на організм твариї при тривалому використанні в ефективній дозі, слабо кумулюс в організм та за фармакологічною характеристикою відноситься до швидкі елімінуючих сполук, які розподіляються тловним чином у ііітсиснши перфузованих тканинах.

З метою глибокого вивчення токсикологічних характеристи сукцифенату нами досліджувалася специфічна нешкідливість препарату При пероральному введенні у дозі ЮхЕДзо га й при парентеральном введенні у дозі ЕДзо препарат не володіє алергізуючою дією, а пр парентеральному введенні у дозі 70 мг/кг виявляє помірний виразіші алергізуючий ефект.

Сукцифенат не виявив ембріотоксичної, гонадотропної т тератогенної дії. Усі показники, які характеризують ці види специфічне нешкідливості, практично не відрізнялись від контролю (р < 0.05).

Була досліджена антиоксидантна дія сукцифенату. Вивчено впли сукцифенату на дігхання та окисне фосфоршповашія мітохоидрі (Ротенберг Ю.С., 1973), дія сукцифенату на ПОЛ мікросом у системі і vitro (Гордієнко А.Д., 1988; Лоурі О.Н., 1951). Згідно з отриманим результатами можна зробити висновок, що сукцифенат не є роз'єднувача процесів окислення та фосфорилювання у системі in vitro.

Мал.З. Громбоелястограма кролика N 1. Контроль л Е-АКК

Мал.5. Тромбоеластограма кролика N 2. Контроль з урокіназом.

Мал.6. Тромбоеластограма кролика N 3. ГІри додаванні до експериментальної суміші сукцпфенату та стрептокшази.

Мал.7. Тромбоеластограма кролика N 4 при додаванні до експериментальної суміші урокінази та сукцифенату.

Мал.8. 'Громбоеластограма кролика N 4 при додаванні до експериментальної суміші урокінази та Е-АКК.

Мал.9. І >імГ«и:л а сто гра м а кролика N 5 при додаванні до експериментальної суміші стрєитокшази та Е-АКК.

Таким чином, належність високої специфічної активності відсутність негативною впливу препарату на орішш та системи хронічному експерименті, відсутність специфічної токсичності ДОЗВОЛЯГ рекомендувати сукцифенат до клінічних іспитів. Препарат з успіх пройшов 1 фазу клінічних випробувгінь, і нині знаходиться на 2 ст; (протоколи N1 - 26.01.1995 p., N 10 - 28.12.1995 p.).

Висновки

1. Вивчені 45 нових похідних 4-ацетилсукцинапілової кислоти з 5 ви прогнозованої фармакологічної дії. Машинний прогноз підтвердився з видів фармакологічної активності, що дозволяє проводи цілеспрямований-синтез сполук з певним видом біолог ічної дії.

2. Вперше з-поміж похідних 4-ацстилсукциианілової кислоти визнач« сполуки, які здійснюють регулюючий вплив на систему зсідання кро Визначена залежність “структура-дія”: введения в карбоксильну групу ацетилсукцинанілової кислоти метальної групи, а також аміди метиламідної, гідроксиетиламідної угруповань збільшують час зсідай крові, поява в карбоксильній групі 4-ацетилсукцинанілової кислоти різи катіонів, а при амідному атомі азоту різних ароматичних замісиш призводить до зменьигешш часу зсідання крові.

3. За широтою терапевтичної дії сукцифенат (умовна назва натрієвої сс 4-ацетилсукцинанілової кислоти) у L0.3 рази перевищу*: Гі-аміиокапронс кислоту. Гостра токсичність сукцифенату дорівнює 2590 мг/кт. Нфектив доза в умовах модельної патології - 13.9 мг/кг.

4. Препарат не виявляє ембріотоксичної, терагогенної дій, не впливає репродуктивну функцію. ГІрн парентеральному введенні у дозі 10xlv володіє помірно виразним алергізуючим ефектом. При перорально введенні в аналогічній дозі алерптзуючої дії пе виявлено. Сукцифенат проявляє антиоксидантної дії і не роз'єднує процеси окислення фосфоріглювання у системі in vitro.

5. Механізм антифібринолітичиої дії сукцифенату мас. антиферментний характер: блокуючи активатори профібриполізину - сгрептокіназу та уроісіиазу - і пригнічуючи дію фібрішолізину, препарат виявляє специфічну кровоспинну дію. Гемостатичний ефект сукцифенату реалізується за рахунок ігрискорешга течії І фази гемо коагуляції, викликаючи гіперкоагуляцію в стадії генерації тромбокінази; впливу на II фазу зсідання, змінюючи конверсію протромбіну в тромбін; дії па III фазу гемокоагуляції, прискорюючи перетворення фібриногену в фібрин.

6. Наявність виразної гемостатичної активності, широта терапевтичної дії, відсутність специфічного токсичного впливу ira органи і системи при тривалому введенні сукцифенату - все це дозволило рекомендувати препарат для клінічних іспитів. На цей час препарат знаходиться на 2 стадії клінічних досліджень (Протокол N 1 від 26.01.1995 і Протокол N 10 -28.12.1995).

Список основних наукових праць, опублікованих за темою дисертації.

1. Соли 4-ацетилсукцинашіловой кислоты, проявляющие гемостатическую активность. A.C. N 1573803 от 22.02.90 г. Совместно с Черных 13.П., Гриценко И.С. и др.

2. Деякі параметри фармакокінетики сукцифенату//3бірник наукових праць: Фармакологія: історія, розвиток,досягнення. - Харків, 1995.-е.66-68. Сумісно з Березняковою А.І., Тищенко І.Ю.

3. Биологическая активность новых производішх дпкарбоновых кнслот//Тез. докл. науч.-практ. коне]).: Лекарственные средства Украины, синтез, научные исследования, производство, реализация.- Харьков, 1992 -с.185. Совместно с Волковым В.А., Лемитпко Ю.А.

4. Изучение влияния субстанции из чины посевной, сукцнфената субстанции и их лекарственных форм на ПОЛ мнкросом в системе ИН ВИТРО//Тез. докл. науч.-практ. конф.: Научные достижения и проблемы производства лекарственных средств,- Харьков, 1995.-е. 177. Совместно с Полковим В.Л.

5. Производные 4-ацетилсукцинаниловой кислоты- возможные регуляторы гемостаза//Тез. докл. II Российской» конгресса “Человек и лекарство” -Москва, 1995.-с.380. Совместно с Березняковой Д.И., Тищенко И.Ю.

6. Вплив сукцифенагу на нротизсідаючи механізми крові//Тез. доповід. I

національного з’їзду фармакологів України: Проблеми сучасної

фармакології.-Полтава, 1995.-е.126. Сумісно з Березшпсовою А. І.

7. Сукцифеиат - новий гемостатик місцевої дії // Тез. доповід. наук, -практ. конф., присвяч. 75-річчю УкрФА: Досяшсішя сучасної фармації в медичну практику. - Харків, 1996. - С. 353. Сумісно з Тіщенко А.М., Березияковою А.І., Козловою Т.В., Ракнцькою Н А., Сар’ян І.В.

8. Клінічна апробація сукцифенату // Тез. доповід. наук, практ. конф., присвяч. 75-річчю УкрФА: Досягнення сучасної фармації в медичну практику. - Харків, 1996. - С. 353. Сумісно з Вересневим О. П.. Березияковою Вересневим О.В Вересневим О В Вересневим О.В -Прийнято до друку. Сумісно з Вересневим О.В., Березияковою Л.Т., Фесько В.М.

Паскевич О.И. Поиск и фармакологическое изучение производных 4 а цетил су кци на н и л о вой кислоты, проявляющих гемосштическію действие. Днсертацня на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.07 фармакология, Одесский государственный медицинский университет, Одесса, 1996 г.

Работа посвящена изучению 45 производных 4-ацетилсукцинаниловой кислоты. Впервые выявлены краіулотрошшс свойства новых производных 4-ацетилсукцинаниловой кислоты. Показана перспективность изучения данных соединений с целью создания фармакологических препаратов разнонаправленного действии. Создан оригинальный синтетический гсмостатический препарат сукцифенат для остановки капилярно-царепхимакушых кровотечений. Сукцифенат не оказывает

I

f

г

эбщетоксического влияния на организм животных, слабо кумулирует в организме, обладает незначительным аллергнзиругощим действием при шительном применении, не обладает тератогенным, эмбриотоксическим и онадотрогашм действием, Сукцифенат успешно прошел 1 фазу слинических испытаний. В настоящее время разрешена 2 фаза цинических испытапин. Если 2 фазаа клинических испытаний препарата акже будет проведена успешно, то сукцифенат может заменить тромбин и емоетатическую губку, производимые из Дорогостоящего сырья.

>.I.Paskevich “Searching and pharmacological research of 45 products of 4-:etilsuccmanil acid that have heamostatic property”. This is for the Candidate of fedical Sciences degree in speciality: 14.03.07. - Pharmacology. Odessa, State iedical University, 1996.

his work deals with the research of 45 products of 4-acetilsuccinani] acid. For e first time the coagulotropic properties of new products of 4-acetilsuccinanil :id are shown. We showed the perspective of these substances with aim of eation of pharmacologic drug preparations causing various effects. We have eated the synthetic drug preparation “Succifenat” for the cessation of ppilary-parenchymatous blooding, as the blood-standing remedy. Succifenat >esn’t render general toxic influence an animals’ organisms, feebly cumulates in з organism, has minor aUergic effect, when used for a long period of time, esn’t have teratogenecily, embiyo-toxicity and gonadotropic effects. The first ase of chuic tests has proved to be successful. At present time we have been emitted to conduct the second clinic test phase. In case the second phase of lie test provides successtiil results “Succifenat” can rcplace trombin and nostatic sponge, made of expensive ran materials. '

илография ХарГАЖТа, ! Закач№ 5^0S - Тираж