Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Патоморфология фолликулярных опухолей щитовидной железы и их дифференциальная диагностика методом компьютерного анализа изображений и нейросетевых технологий

На правах рукописи

003052719

Полоз Татьяна Львовна

ПАТОМОРФОЛОГИЯ ФОЛЛИКУЛЯРНЫХ ОПУХОЛЕЙ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ИХ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА МЕТОДОМ КОМПЬЮТЕРНОГО АНАЛИЗА ИЗОБРАЖЕНИЙ И НЕЙРОСЕТЕВЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

14.00.15. - патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Новосибирск - 2007

003052719

Работа выполнена в ГУ Научном центре клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения РАМН и в ГОУ ВПО Новосибирском государственном медицинском университете Росздрава

Научный консультант:

заслуженный деятель науки РФ, академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор

Шкурупий Вячеслав Алексеевич

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки, доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Зайдман Алла Михайловна Ларионов Петр Михайлович Лепилов Александр Васильевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава, г. Томск

Защита состоится 2007 г. в «10.00.» на заседании диссертаци-

онного совета Д.208.062.05 при ГОУ ВПО Новосибирском государственном медицинском университете Росздрава, 630091, Новосибирск, Красный проспект,52.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского государственного медицинского университета (630091, Новосибирск, Красный проспект^).

Автореферат разослан <Ж> PJL 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Доктор медицинских наук, профессор

А.В.Волков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Цитологическое исследование заболеваний щитовидной железы в предоперационной диагностике является практически незаменимым методом исследования, позволяющим диагностировать такие патологические процессы как адено-матозный и коллоидный зоб, тиреоидиты, папиллярный и медуллярный рак, фолликулярные опухоли (Петрова А. С., 1985; Голъдбрут Н. Н., 1993; Шапиро H.A., 2003; Hamburger J.I., 1987; Aleio М., et al., 1991; Aguüar-Diosdado M., et al., 1997; Bakhos R., et al„ 2000; Naylor В., 2000). Цитологическое исследование является определяющим в выборе метода лечения больного - консервативным или хирургическим путем (Демидов В. П. и др., 1983). Для получения материала применяется аспирационная диагностическая пункция щитовидной железы тонкой иглой, не требующая обезболивания, не травмирующая ткани и, практически, не имеющая осложнений (Богин Ю. Н. и др., 1992).

Особую проблему представляет собой определение объема хирургического вмешательства при операциях на узловых образованиях щитовидной железы (Fransilla К.О., et al., 1985; Akhtar M., et al., 1991; Goldstein R. E., et al., 2002). Диагностика папиллярного, медуллярного и недифференцированного раков щитовидной железы, как правило, не представляют особой сложности (Хмельницкий O.K.,; Kinder В.К., 2003.), однако, значительные трудности возникают при определении критериев злокачественности высоко-дифференцированных фолликулярных раков (Droese М., 1980; Akhtar М. et al., 1991; Carcanqiu М. L., et al., 1985; Collins В. Т., et al., 1995; Sarlis N.J. et al., 2002; Cochand-PrioUet В., et al., 2003; Pasieka J.L., 2003). До сих пор они не могут быть надежно различимы цитологически от фолликулярных аденом. Заключительное гистологические исследование фолликулярных опухолей также является очень трудным, так как клеточные критерии атипии почти ничего не вносят в патогистологическую картину (Краевский H.A., 1993; Хмельницкий O.K., 2003). Окончательным доказательством для диагноза высокодифференцированного фолликулярного рака признается только обнаружение инвазии опухоли в сосуды и капсулу, что требует значительных временных затрат. Таким образом, рядом авторов принят термин "фолликулярная опухоль" или "фолликулярная пролиферация", отражающий сложность разграничения упомянутых новообразований и объединяющий их в одну группу по типу строения (Кондратьева Т.К., 1992; Mazzaferi E.L., 1993; Cibas Е. S.et al., 1996; Sarlis N.J, 2002).

He решенным остается вопрос о сущности, так называемых, атипических аденом. Наличие признаков выраженной атипии в этой группе опухолей при отсутствии капсуляр-ной и сосудистой инвазии является причиной значительного количества диагностических трудностей и ошибок. Природа доброкачественности новообразований, при выраженной

атипии клеток, остается неясной. Появление в ткани опухоли участков пролиферации и сниженной дифференцировки клеток не является критерием начала инвазивного роста в аденоме (Rosaj J., 1996; DeLellis R.A., 2004) Достаточно трудно оценить патологические процессы в опухоли, связанные с наличием минимального инвазивного роста или с переходными состояниями, при усилении пролиферативных и анапластических явлений. В то же время исследование патоморфологических процессов в фолликулярных неоплазиях подтверждает возможность этапного развития злокачественных новообразований с различной скоростью роста и трансформацией переходных структур, о чем свидетельствует наличие структурных и цитологических переходных форм (Хмельницкий O.K., 2003.).

В настоящее время возможен прогресс в практике установления цитологического диагноза при онкологических заболеваниях. Исследования, проводимые с самыми различными алгоритмами (Автандилов Г.Г., 2002; Karakitsos P. et al., 1999), показали, что медицинские задачи, в том числе морфологическую диагностику патологических процессов, можно решать математическими методами с точностью и удобством. С математической точки зрения, диагностика является частным случаем классификации событий (Ежов А Н. и др., 1997). На практике диагноз зависит от множества определенных условий, из которых возможно учесть лишь приблизительный набор наиболее важных. Так как часть условий при этом не учитывается, алгоритм нахождения ответа не может быть определен точно. Искусственные нейронные сети, представляющие собой нелинейные системы, позволяют гораздо лучше классифицировать данные, чем обычно используемые линейные методы, значительно повышая специфичность метода диагностики, не снижая его чувствительности. Нейронные сети способны принимать решения, основываясь на выявляемых ими скрытых закономерностях в многомерных данных и способны к обучению на примерах, обобщая прежний опыт и применяя его в новых диагностических случаях (Горбань А.Н., 1998; Каллан Р., 2001; Окоп К. et al, 2001).

Цель исследования: изучить, проанализировать и сравнить информативность цитологических и гистологических параметров структурной организации доброкачественных и злокачественных фолликулярных опухолей щитовидной железы, полученных при оценке пунктатов, соскобов и гистологических срезов, методами компьютерного анализа изображений, для их дифференциальной диагностики с использованием нейросетевых технологий.

Задачи исследования: 1. Изучить цитологические особенности фолликулярных опухолей в материале, полученном при аспирационной пункции тонкой иглой и интраоперационном соскобе и сопос-

тавить информативность цитологического исследования с диагнозами, установленными в результате независимых гистологических исследований.

2. Провести сравнительный анализ морфологического строения ткани и выполнить морфометрическое исследование структурных компонентов фолликулярных опухолей щитовидной железы в послеоперационном материале.

3. Провести компьютерный анализ изображений с морфометрией ядер клеток фолликулярной аденомы, фолликулярного рака и фолликулярного варианта папиллярного рака щитовидной железы.

4. Выполнить сравнительный статистический анализ морфометрических параметров ядер клеток и выявить достоверные отличия их величин в различных фолликулярных опухолях щитовидной железы.

5. Определить экспрессию антиапоптотического (Ьс1-2), проапоптотического (р53) и пролиферативного (К1-67) генов в клетках фолликулярной аденомы, атипической фолликулярной аденомы, фолликулярного рака щитовидной железы с минимальной инвазией и папиллярного рака щитовидной железы с фолликулярным вариантом строения.

6. Используя цитологические и морфометрические параметры фолликулярных опухолей щитовидной железы обучить и протестировать искусственные нейронные сети, для создания дифференциально-диагностических программ на основе комплексного анализа полученных данных.

7. Используя статистический анализ данных, полученных в результате обучения искусственных нейронных сетей выявить наиболее значимые для дифференциальной диагностики цитологические и морфометрические критерии.

8. Обучить и протестировать искусственные нейронные сети, используя цветные цифровые цитологические изображения фолликулярных аденом и рака и определить дифференциально-диагностические возможности нейросетевого анализатора.

Научная новизна

1. Проведено сравнительное исследование патоморфологических и цитологических особенностей фолликулярных опухолей щитовидной железы и иммуногистохимический анализ экспрессии генов апоптоза и пролиферации, с использованием компьютерной системы анализа изображения, которое выявило дифференциально-диагностические возможности каждого из методов.

2. Определены количественные показатели степени пролиферативной активности, возможной атипии и активности опухолевого роста, которые позволили с высокой степенью достоверности дифференцировать фолликулярные аденомы, фолликулярный и папиллярный раки щитовидной железы при иммуногистохимическом исследовании.

3. Проведена дифференциальная диагностика фолликулярной аденомы, фолликулярного рака и папиллярного рака щитовидной железы с фолликулярным вариантом строения в цитологических и гистологических препаратах с применением методов компьютерной морфометрии. Установлено, что этот метод дает возможность с высокой степенью достоверности диагностировать папиллярный рак с фолликулярным вариантом строения на основании ряда морфометрических параметров.

4. Впервые проведен углубленный математический анализ особенностей распределения величин морфометрических параметров в фолликулярных опухолях щитовидной железы, применение разработанного критерия «наибольших величин» дает возможность успешно проводить дифференциальной диагностику фолликулярных аденом и фолликулярных раков щитовидной железы.

5. Впервые, применение «нейросетевых» технологий с использованием комплекса цитологических признаков и данных компьютерной морфометрии, в качестве входных данных, позволило значительно повысить точность дифференциальной диагностики фолликулярной аденомы и фолликулярного рака щитовидной железы.

6. С применением искусственных нейронных сетей и метода «ассоциативных правил» выявлены сочетания наиболее информативных качественных и количественных цитологических критериев, позволяющих проводить дифференциальную диагностику фолликулярной аденомы и фолликулярного рака щитовидной железы.

7. Впервые, с применением искусственной нейронной сети, с высокой степенью достоверности проведена дифференциальная цитологическая диагностика фолликулярных аденом и фолликулярных раков щитовидной железы по их цветным цифровым изображениям.

Теоретическое и практическое значение. Выявленные морфологические особенности доброкачественных и злокачественных фолликулярных опухолей щитовидной железы позволят устанавливать точный морфологический диагноз, проводить дифференциальную диагностику с другими поражениями (папиллярным раком). Это снижает вероятность ошибочного диагноза, и дает возможность планировать рациональное лечение, помогает выбирать адекватную хирургическую тактику, уточнить прогноз заболевания Повышение уровня дооперационной диагностики опухолей позволяет снизить количество неоправданных хирургических вмешательств. Использование новых высокотехнологичных методов исследования (компьютерного анализа изображения, нейросетевых систем) способствует сокращению времени на установление диагноза, повышению диагностической чувствительности и точности метода клинической цитологии как на дооперационном

этапе, так и во время интраоперационного исследования, уменьшая их зависимость от квалификации врача.

Положения, выносимые на защиту:

1. Морфометрическое исследование структур опухоли в гистологических образцах объективизирует результат исследования фолликулярных опухолей на послеоперационном этапе, позволяет дифференцировать фолликулярных аденомы и рак при сравнении величины площади сосудов (васкуляризации), степени фиброзирования и плотности распределения клеток в ткани опухоли. Вместе с тем, отсутствуют количественные критерии цитологической дифференциальной диагностики фолликулярных аденом и фолликулярного рака щитовидной железы при изучении тонкоигольных аспирационных пунктатов и интраоперационных соскобов.

2. Возможна дифференциальная гистологическая и цитологическая диагностика папиллярного рака с фолликулярным вариантом строения от иных фолликулярных опухолей щитовидной железы, на основании свойственных всему семейству папиллярных раков особенностей ядер, а также ряда объективных дифференциально-диагностических параметров, полученных при компьютерной морфометрии опухолевой ткани и клеток (соотношение диаметров фолликулярных структур, величина площади стромального компонента и плотность распределения клеток, средние величины площади, периметра и оптической плотности ядер).

3. Иммуногистохимическое исследование экспрессии генов р53, Ьс1-2 и К-67 в клетках фолликулярных опухолей с определением количественных параметров (индексов мечения и оптической плотности клеток), вычислением показателей, характеризующих «баланс» противо- и проапоптотических факторов может иметь объективное дифференциально-диагностическое и прогностическое значение, характеризуя пролиферативный потенциал и активность опухолевого роста фолликулярных и папиллярных раков щитовидной железы. Полученные данные свидетельствуют о том, что атипическая аденома является опухолью с высокой степенью риска злокачественной трансформации.

4. Применение искусственных нейронных сетей для дифференциальной диагностики фолликулярных аденом и фолликулярного рака щитовидной железы с использованием наиболее информативных качественных цитологических признаков, морфометрических параметров ядер и цветных цифровых изображений образцов цитологических препаратов, позволяет максимально объективизировать процесс диагностики, сократить время и трудоемкость исследования и вывести его на принципиально новый технологический уровень, повысив чувствительность метода до 92%.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на IV международном съезде Ассоциации клинических цитологов России (Великий Новгород, 2001), на IX научной конференции "Новые направления и разработки в онкомор-фологии" (Москва, 2003), международной научно-практической конференции "Современные проблемы морфологической диагностики опухолей" (Иркутск, 2003), на V всероссийском съезде Ассоциации клинических цитологов России, (Псков, 2003), на VI международном семинаре патологоанатомов и клинических цитологов (Нижний Нового-род, 2004), на VI международном съезде Ассоциации клинических цитологов (Новосибирск, 2005), на международной научной конференции «Интеллектуальные системы принятия решений и прикладные аспекты информационных технологий» (Евпатория,

2005), на расширенном Пленуме Центрального Исполнительного Совета Ассоциации клинических цитологов России, посвященного 160-лет ию компании «Carl Zeiss» (Москва,

2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 печатных работ, в том числе 8 статей в периодических и научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Содержание диссертации изложено на 297 стр. машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований с обсуждением, заключения, выводов, списка литературы, приложения. Текст иллюстрирован 30 таблицами, 30 графиками, 72 микрофотографиями, 25 приложениями Список литературы включает 460 источников, из которых 91 отечественный и 369 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Клиническим материалом для настоящего исследования послужили данные о 266

больных злокачественными и доброкачественными опухолями (дифференцированный рак и аденома) щитовидной железы, которые находились на лечении в эндокринологическом и хирургическом отделениях НУЗ Дорожная клиническая больница на ст. Новосибирск-Гл. ОАО «РЖД» с 1996 по 2005 гг. Все пациенты относились к группе первичных больных. Средний возраст больных фолликулярным раком составил 43,4 года, фолликулярной аденомой - 47,6 лет, фолликулярным вариантом папиллярного рака - 45,3 года.

Материалом для морфологического исследования служили пунктаты щитовидной железы, полученные методом аспирационной пункции тонкой иглой, под контролем ультразвукового исследования, интраоперационные соскобы с ткани опухоли, и гистологические срезы опухолей щитовидной железы, удаленных в результате хирургического вме-

шательства. Материал гистологически верифицирован во всех наблюдениях независимыми экспертами.

При интраоперационном цитологическом исследовании проводили макроскопическую оценку удаленного участка ткани щитовидной железы, отмечали форму и размеры узлового образования, цвет, консистенцию, наличие капсулы и взаимоотношение с другими участками железы, наличие или отсутствие лимфатических узлов. Соскобы с поверхности разреза удаленной ткани производили острым скальпелем; мазки окрашивали по указанной методике и производили цитологическое исследование.

Окраска цитологических препаратов стандартизирована. Материал, полученный при аспирационной пункции тонкой иглой и интраоперационном соскобе, окрашивали азур - эозиновыми растворами по Май-Грюнвальду (Ермолова Т.П. и др., 1994, Богатырев В.Н., 2005) и экспресс-методом в модификации Н.Г. Алексеева (Кост Е. А., 1975).

Препараты изучали в световом микроскопе. Методологические принципы изучения мазка сводились к обязательному исследованию краев препарата по всему периметру и двухразовому перекрестному анализу многих полей зрения. Результат цитологического исследования учитывали только в том случае, если оно было проведено на адекватном материале с соблюдением всех методических требований (Hamburger J.I., et al.,1988; Богин Ю. H., и др., 1992).

После резецирования доли щитовидной железы проводили гистологическую обработку ткани по общепринятой методике, срезы толщиной в 5 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином и по Ван Гизону (Елисеев В.Г. и др., 1972). Для проведения иммуно-гистохимического исследования серийные парафиновые срезы толщиной 5 мкм инкубировали с антителами к белкам Ki-67, bcl-2, р53 («Novocastra Lab. Ltd»,United Kindom). Пе-роксидазу выявляли раствором диаминобензидина (наборы «Vector Lab.», USA), дающим коричневое окрашивание (Петров C.B. и др., 2004)

Для компьютерного анализа цитологических и гистологических препаратов использовали систему анализа изображений (САИ), состоящую из микроскопа проходящего света «AxioStar+» (Carl Zeiss, Germany), компьютера Pentium IV IBM, цветной цифровой видеокамеры Axiocam (Carl Zeiss, Germany) и программы AxioVision 3.1. С помощью системы анализа изображения была создана графическая база данных из адекватных для изучения цитологических и гистологических препаратов, проведена компьютерная морфо-метрия структурных компонентов опухоли, кариоцитометрия и определение оптической плотности ядер с последующей статистической обработкой полученных данных.

Для получения адекватной характеристики выбранных групп наблюдений применяли метод случайного бесповторного отбора объектов исследования. При морфометрии

структур опухоли исследовали 5-10 полей зрения в 10-20 гистологических срезах опухолей в наблюдениях каждой группы больных; измеряли внутренний и внешний диаметр фолликулов, их соотношение, относительную площадь сосудов и стромального компонента, плотность расположения клеток опухоли в срезе. При кариоцитометрии в ручном режиме измеряли 150-250 клеток и ядер (объем выборки определяли по критерию «достаточная точность среднего»). Определяли геометрические параметры ядер - периметры, площади, коэффициент формы, ядерно-цитоплазматическое соотношение в группе наблюдений фолликулярного варианта папиллярного рака, а также структурные характеристики ядер (Окоп К. й а1., 2001) - оптическую плотность (ОП) ядер (средние величины и стандартные отклонения), как меру непрозрачности среды, измеряемую в уровнях градаций «серого» цвета от 0 до 255. С помощью объект - микрометра была проведена калибровка системы анализа изображений, при которой было найдено соответствие микрометров к пикселям на экране монитора по горизонтальной и вертикальной шкале, для определения площадей и периметров ядер в абсолютных единицах - микрометрах (мкм).

С помощью системы анализа изображения был проведен подсчет индекса мечения (ИМ) ядер с экспрессией Ю-67, Ьс1-2, р53 и цитоплазмы клеток с экспрессией Ьс1-2, р53. Измерения проводили в среднем в 30 полях зрения. В каждом из полей зрения производили автоматический подсчет количества ядер и цитоплазмы, специфично окрашенных (коричневый цвет). Выбор объектов для подсчета осуществлялся автоматически по цвету с 8-битной градацией глубины цветности. Индекс мечения определяли по отношению количества окрашенных ядер к 100 (Батороев Ю.К. и др., 2005). Для количественного исследования уровня экспрессии изучаемых белков, определяли оптическую плотность ядер с выявленной экспрессией Кл-67, Ьс1-2, р53, для чего в полуавтоматическом режиме выделяли специфично окрашенные ядра, после чего программа компьютерного анализа Изображений АхюХ^юп 3.1. в черно-белом изображении среза ткани автоматически вычисляла средние величины и среднее отклонение оптической плотности в уровнях градаций «серого» цвета от 0 до 255 (ШУ.Р. е1 а1., 2005).

Результаты исследования были подвергнуты статистической обработке. Сравнение полученных массивов данных для определения вероятности достоверности отличий сравниваемых средних величин проводили по тесту Колмогорова-Смирнова (р< 0,01).

Для решения задач дифференциальной диагностики фолликулярных опухолей с помощью нейросетевых технологий использовали многослойные нейронные сети, обученные при помощи алгоритма обратного распространения ошибки (Уоссерман Ф., 1992; Щетинин В.Г., 1998; Царегородцев В Г., 2003). Моделирование нейронной сети осуществляли при помощи специально созданного, для этих целей, на языке «С++», нейроимита-

тора «НЕЙРОКЛАСС» (регистрационный № 2006612844, фирма МИКРОМЕД), работающего в среде MS Windows 95, 98, 2000, NT, ХР, позволяющего моделировать различные архитектуры искусственных нейронных сетей, обучать их и тестировать.

В качестве входных данных для искусственных нейронных сетей использовали цитологические признаки: при характеристике клеток наличие признака определяли путем сравнения частоты его встречаемости среди клеток препарата с пороговой величиной, установленной для каждого признака путем экспертных оценок. В среднем порог частоты составил 50-70%. Превышение установленного порога считалось наличием признака, иначе - отсутствием. Если частота встречаемости двух не взаимоисключающих признаков (например, форма ядер), была одинакова, то учитывали наличие обоих признаков. В среднем оценивали 100-150 клеток в каждом наблюдении. Цитологические признаки кодировали булевыми значениями («0» - отсутствие признака, «1» - присутствие). Полученный таким образом вектор значений признаков подается на вход нейронной сети. Выходом сети является класс, к которому принадлежит образец (рак или аденома). Аналогичным образом происходило обучение нейронной сети по морфометрическим параметрам. Для создания ассоциативных правил, позволяющих диагностировать фолликулярные опухоли щитовидной железы, использовали булеву нейронную сеть («0» - отсутствие признака, «1» - присутствие) с применением алгоритма APriori (Agrawal R. et al., 1993,1994).

При нейросетевой диагностике фолликулярных опухолей по компьютерным цитологическим изображениям опухолей использовали изображения стандартно окрашенных по вышеуказанной методике цитологических препаратов фолликулярных аденом и рака.

Изображения были получены с помощью системы анализа изображений (САИ), состав который приведен выше. В эксперименте исходные цветные изображения сжимались до размера 256 х 256 пикселей (диапазон пространственных частот 1 +128 в относительных единицах). Для каждого класса (аденома и фолликулярный рак) использовалось по 30 эталонных изображений (по 3 изображения на каждого из 10 пациентов с установленным гистологическим диагнозом). Тестирование нейронной сети проводили по трем изображениям тех наблюдений, которые не предъявлялись в процессе обучения, с установленным независимыми экспертами гистологическим диагнозом. Выходом сети был диагноз: фолликулярный рак или фолликулярная аденома.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для описания цитологической картины фолликулярной опухоли необходимо анализировать большое количество признаков, ни один из которых объективно не свидетельствует о принадлежности опухоли к доброкачественному или злокачественному явлению

(табл.1). Наиболее информативными, с нашей точки зрения признаками являются наслоение ядер клеток в фолликулярных структурах и, образованные ядрами «цепочки», а также «смазанная», нечеткая структура хроматина. Однако попытки дифференцировать атипическую фолликулярную аденому и рак, основываясь на этих критериях, не увенчались успехом. В нашем исследовании совпадение цитологических диагнозов с окончательными гистологическими диагнозами составило 56%. Установление диагноза папиллярного рака щитовидной железы было сопряжено с наименьшими затруднениями: в 95% случаев фолликулярный вариант папиллярного рака был диагностирован при цитологическом исследовании, и только 5% наблюдений были расценены как фолликулярный рак или фолликулярная опухоль, вероятно рак. Данные проведенного в работе исследования подтверждают цитологические особенности строения папиллярного рака и его отличие от фолликулярных аденом и фолликулярного рака. При цитологическом исследовании материала тонкоигольной аспирационной биопсии или интраоперационного соскоба дифференциальная диагностика фолликулярного варианта папиллярного рака и фолликулярного рака была основана на структурных особенностях клеток и ядер папиллярного рака.

Дифференциальная диагностика фолликулярного рака и аденомы при гистологическом исследовании опухолевой ткани была основана на наличии инвазии опухолевых клеток в капсулу и сосуды. Выделение атипических фолликулярных аденом из группы фолликулярных опухолей без признаков инвазии, связано с явлениями резкой пролиферации опухолевых клеток, преобладанием солидных структур и признаками более выраженной атипии ядер в этой группе наблюдений. Отсутствие инвазивного роста при послойном исследовании срезов опухолевой ткани, наряду со значительной атипией опухолевых клеток, является критерием определения этих опухолей как атипических фолликулярных аденом, которые по своей сути могут быть отнесены к раку без инвазии, что должно определять иную, чем при других фолликулярных аденомах тактику ведения больных.

Структура ткани фолликулярного рака, как правило, микрофолликулярная с незначительно выраженным полиморфизмом клеток и ядер, в сочетании с солидными участками относительно мономорфных клеток, с нарушенной полярностью расположения ядер, и крупными единичными клетками с резко атипичными ядрами. В большинстве наблюдений ткань фолликулярного рака незначительно отличается по строению от фолликулярной аденомы и выглядит даже менее «злокачественно», чем в атипических фолликулярных аденомах. Рост фолликулярного рака на фоне узлового зоба показателен в тех наблюдениях, когда опухолевая ткань соседствует с зобно-измененной тканью щитовидной железы, заполняя промежутки между растянутыми коллоидом фолликулами. Только полное про-

растание капсулы опухолевой тканью и обнаружение опухолевых «тромбов» в кровеносных сосудах позволяет отнести фолликулярную опухоль к раку.

Гистологическое исследование папиллярного рака с фолликулярным типом строения может представлять даже большие трудности, чем цитологическое, если отталкиваться только от гистоархитектоники опухоли. В наблюдениях фолликулярного варианта папиллярного рака, ткань опухоли образована фолликулярными структурами и солидными пластами, при полном отсутствии участков сосочкового строения. Основополагающим при дифференциальной диагностике с фолликулярным раком щитовидной железы являются, как и в цитологическом исследовании, особенности ядер опухоли: вытянутые, прозрачные, с «пустым» центром.

Частота встречаемости некоторых морфологических признаков фолликулярных опухолей щитовидной железы представлена в таблице 2.

Компьютерный анализ изображений показал, что морфометрическое исследование структур опухоли в гистологических образцах не позволяет дифференцировать фолликулярные аденомы и атипические фолликулярные аденомы, так как величины большинства параметров (диаметры фолликулов и их отношение, площадь стромы) не имеют достоверных отличий. Также не были выявлены отличия при сравнении величин ряда параметров атипической фолликулярной аденомы и фолликулярного рака (диаметры фолликулов и их отношение, площадь сосудов, плотность распределения клеток). Вместе с тем, дифференциальная диагностика фолликулярных аденом и рака возможна на основании морфо-метрического исследования и сравнения таких параметров, как величины площади сосудов (васкуляризации), степени фиброзирования и плотности распределения клеток в ткани опухоли (табл. 3).

Сходство гистоархитектоники атипических фолликулярных аденом и фолликулярного рака очевидно при анализе морфометрических данных, полученных при исследовании площади опухолевой ткани, занимаемой сосудами и плотностью расположения опухолевых клеток, что подтверждает гипотезу о принадлежности атипических фолликулярных аденом к промежуточному патологическому процессу между доброкачественными и злокачественными фолликулярными опухолями в щитовидной железе. Компьютерный анализ изображений фолликулярных неоплазий дает возможность оценить этапное развитие фолликулярного рака, подтверждаемое наличием структурной и клеточной атипии в атипических фолликулярных аденомах (табл. 3).

Частотный анализ встречаемости цитологических признаков фолликулярных опухолей щитовидной железы

Частота признаков в фолликулярных опухолях

Фолликулярная Атипическая Фолликулярный Папиллярный

Цитологические признаки аденома (%) аденома (%) рак (%) рак (%)

Коллоид Обильный 36 0 11 0

Скудный,плотный 45 60 54 95

Отсутствует 19 40 35 5

Внугрифолликуллярный 42 60 40 0

Преобладающие структуры фолликулы 97 100 100 100

Пласты 9 10 13 55,5

Трабекулярные структуры 15 22 18,5 0

Папиллярные структуры 0 0 0 12

Разрозненные клетки 35 62 54 86

Сосуды 29 35 35 30

Виды фолликулов однотипные 65 32 46 0

Полиморфные 35 68 54 100

Нормо 36 2 24 0

Микро 77 54 54 0

Шаровидные 26 5 16 70

Атипичные 18 100 92,5 96

Контур цитоплазмы четкий 9 25 31 59

Нечеткий 81 75 69 41

Вакуоли 57,5 42 33 12

По периферии 55 0 5 50

Около ядра 45 100 95 50

Форма ядра' округлая 100 78 89 50

Овальная 15 22 42,5 100

Контур ядра- ровный 95 82 89 33

Неровный 5 18 11 67

Полиморфизм ядер слабый 82 46 63 82

Значительный 8 54 37 18

Наслоение ядер 33 100 92,5 100

"Цепочки" из ядер 42 52 46 0

Много "голых" ядер 64 65 55,5 0

Структура конденсированного хроматина равномерная 72,5 10 13 0

Неравномерная 27,5 90 87 100

Мелкозернистая 88 43 57 70

Крупнозернистая 11 27 22 30

Смазанная 1.5 30 30 0

Включения в яггое. ВЦВ 4,5 12 26 80

Вакуоли 39 62 55,5 10

Ядрышки 67 95 63 100

Одиночные 64 76 55,5, 95

Множественные 3 24 13 5

Расположение ядрышек цешральное 39 20 18 0

Эксцентрическое 27 80 82 95

Примечание за 100% принято количество наблюдений в каждой группе больных, ВЦВ - внутриядерные цито плазматические включения

Сравнительная характеристика частоты встречаемости некоторых морфологических признаков в образцах ткани фолликулярных опухолей щитовидной железы по данным визуального гистологического исследования

Частота признаков в наблюдениях фолликулярных опухолей (%)

Морфологические признаки Фолликулярная аденома Атипическая аденома Фолликулярный рак Папиллярный рак

Мультицегарическое поражение 2 0 2 И

Соединительнотканная карсула 100 100 100 38

Высокодиффегвнштоованные структуры

Фолликулы 100 100 100 100

Умереннопифференцированные структуры

Сосочки 0 0 0 6

Трабекулы 25 100 20 1

Низкодифференцированные структуры'

Пласты 25 100 45 100

Некротические изменения 0 5 6 10

Кистозные изменения б 0 0 18

Выраженая гфолиферация эпителия 0 100 100 100

"Пустые ядра", борозды, внутриядерные включения 0 0 0 100

Инвазивный рост-

в окружающую ткань 0 0 1 62

в капсулу 0 0 100 38

в сосуды 0 0 75 0

Метастазирование

в лимфоузлы шеи 0 0 0 3

Отдаленные 0 0 1 0

Примечание за 100% принято количество наблюдений в каждой группе больных

Выделение папиллярного рака с фолликулярным вариантом строения из группы фолликулярных опухолей было подтверждено при компьютерной морфометрии опухолевой ткани, так как соотношение диаметров фолликулярных структур, величина площади стромального компонента и плотность распределения клеток достоверно отличаются от таких параметров в других фолликулярных опухолях щитовидной железы (табл. 3).

При компьютерном анализе изображений и кариоцитометрии фолликулярных опухолей щитовидной железы в аспирационных пунктатах и соскобах были получены достоверные отличия величин ряда исследуемых параметров (периметр, площадь, коэффициент формы и оптическая плотность ядра) в различных группах этих новообразований, подтвердившие принадлежность фолликулярных аденом, атипических аденом, фолликулярного и папиллярного рака с фолликулярным типом строения к различным генеральным совокупностям.

Однако, как показал статистический анализ, средние арифметические величины полученных параметров, характеризующие форму и структуру ядер фолликулярных аде-

15

ном и рака, не являются дифференциально-диагностическими критериями для выявления этих опухолей при цитологическом исследовании (табл. 4).

Вместе с тем, компьютерный анализ изображений опухолевых клеток дает возможность дифференцировать фолликулярный вариант папиллярного рака, не только на основании упомянутых выше качественных признаков, но и по средним величинам площади, периметра и оптической плотности ядер, достоверно превышающим средние величины аналогичных параметров других фолликулярных неоплазий (табл. 4).

Таблица 3

Количественные соотношения некоторых структурных компонентов в образцах ткани опухолей и плотность распределения клеток в них по данным компьютерной

морфометрии (М ± т)

Опухоли щитовидной железы Внутренний диаметр фолликула (мкм) Внешний диаметр фолликула (мкм) Внутренний диаметр/внешний диаметр Васкуля-ризация (%) Степень фиброзирования (%) Плотность распределения клеток (кол-во ядер на мм2)

1 Фолликулярная аденома 12 57 ± 0.59 (2, 4) 27 3±1 19(2, 4) 0 46± 0 01 5 51±0.19 (2,3,4) 17 7± 0 32 (2,3,4) 16,7± 0,32(2,3, 4)

2 Атипическая аденома 10 67 ±0 36(1, 3.4) 22 65 ± 0 53 (1,3,4) 0 47± 0 01 670±021 (1,3,4) 14 2± 0.20 (1,3,4) 10,0 ±0,22 (1,4)

3 Фолликулярный рак 12 62 ±0 36 (2, 4) 26 04 1045 (2,4) 04810 02 770±012 0,2,4) 23 80 ± 0 19 (1,2,4) 11,2±0,25 (1,4)

4 Папиллярный рак 16 62 ±047 (1,2,3,4) 334±1 65 (1,2,3,4) 0 49± 0 01 5.89±0 16 (1,2.3) 26 23± 0 31 (1,2,3) 9,3±0,18(1,3)

Примечание 1 -достоверное отличие с величиной данного параметра фолликулярной аденомы, 2 -атипической фолликулярной аденомы, 3 - фолликулярного рака, 4 - фолликулярного варианта папиллярного рака Отношение внутреннего и внешнего диаметров фошгикула - в относительных единицах Степень фиброзирования и васкуляризации высчитаны относительно измеряемой площади препарата в процентах. Критерий достоверности отличий р< 0,01

Таблица 4

Сравнительные данные статистической обработки некоторых параметров ядер фол-

Параметры ядра Фолликулярная аденома Атипическая аденома Фолликулярный рак Папиллярный рак

М т СКО М т СКО М т СКО М т СКО

в (мкм2) 7671 0 58 11 68 75.81 0.53 17 21 75 65 044 17 72 89 44 24 142 0 85 13 45 2 89

Р (мкм) 3244 0 10 3 16 34 10 0 12 3 62 33 36 010 4.24

Коэффициент формы 1.20 0.01 0 06 1.28 0 60 0 35 1 20 0 01 0 06 1 18 00 0.03

Оптическая плотность 114 24 0.71 25 76 100 89 1 14 36 78 122 59 0 81 31 19 130.20 0 21 2 1

Примечание 5 - площадь, Р - периметр, М - среднее арифметическое, т - ошибка репрезентативности, СКО - среднее квадратичное отклонение

Иммунофенотипирование опухолевых клеток является важным этапом послеоперационного диагностического исследования фолликулярных неоплазий щитовидной же-

лезы, поскольку позволяет судить о степени дифференциации новообразований и, следовательно, прогнозировать дальнейшее течение патологических процессов (Афанасьева 3. А. и др., 2004; Петров С. В. и др., 2004).

Поскольку злокачественная трансформация клеток сопровождается их неконтролируемой пролиферацией и замедлением процесса апоптотической гибели, то можно было бы предположить, что интенсивная гибель опухолевых клеток ассоциируется с лучшим прогнозом заболевания, и наоборот. Однако в действительности прогрессирование опухоли зависит от баланса противоположно направленных процессов, связанных с пролифера-тивными и апоптотическими изменениями клеток (Пожарисский K.M. и др., 2000). В ряде наблюдений фолликулярных опухолей отмечается прямая корреляция между интенсивностью спонтанного апоптоза и активностью пролиферации. В большинстве наблюдений соотношение уровней экспрессии апоптотических и антиапоптотических белков является решающим фактором, определяющим прогностическое значение для этих патологических процессов. Явления клеточной атипии в ткани фолликулярной аденомы в сочетании с высоким уровнем экспрессии белков, регулирующих процессы апоптоза, даже без обнаружения инвазивного опухолевого роста, может явиться неблагоприятным для больного прогностическим фактором течения патологического процесса.

Количественное определение уровня экспрессии белков, регулирующих процессы апоптоза и пролиферации клеток, основанное на исследовании величин оптической плотности клеток с экспрессией bcl-2, р53 и Ki-67 и индексов мечения при компьютерном анализе изображений образцов фолликулярных опухолей щитовидной железы, позволяет объективно оценить соотношение этих факторов, выявить их взаимосвязь и наличие прямой или обратной корреляции (табл. 5).

Таблица 5

Индекс мечения ядер (Ki-67, Bcl-2 и Р-53) и цитоплазмы (Вс1-2 и Р-53) в образцах ткани

фолликулярных опухолей щитовидной железы

Опухоли щитовидной железы Индекс мечения (ИМ) ядер Индекс мечения (ИМ) цитоплазмы

Ki-67 Вс12 Р53 Ki-67 Вс12 Р53

1 Фолликулярная аденома 8,2 ±0,2 (4) 8,4±0,4 (2, 3,4) 31,4±1,2(2, 3) - 4,4±0,2 (2, 3,4) 30,5±1,1 (2, 3)

2 Атипическая фолликулярная аденома 7,4±0,1 12,6±1,1(1,4) 13,6±0,9(1,4) - 10,2±1,2 (1,4) 27,2±1,0 (3, 4)

3 Фолликулярный рак 6,6±0,19 16,8±1,2 (1,4) 12,8±0,7(1,4) - 13,6±1,1 (1,4) 18,8±0,8 (1, 2,4)

4 Папиллярный рак 34,1±1,3 (1,2, 3) 32,0±1,1 (1,2,3) 33,8±1,4(2, 3) - 24,0±1,1 (1,2, 3) 28,4±1,2 (2, 3)

Примечание индекс мечения определяли по отношению количества специфически окрашенных ядер (цитоплазмы) к 100 1 -достоверное отличие с величиной данного параметра фолликулярной аденомы, 2 -атипической фолликулярной аденомы, 3 - фолликулярного рака, 4 - фолликулярного варианта папиллярного рака Критерий достоверности отличий р< 0,01

Проведен сравнительный анализ величин оптической плотности ядер с экспрессией белков Ьс1-2 и р53 в образцах ткани фолликулярных неоплазий, как регуляторов апоптоза и К1-67, как маркера пролиферации. Отмечен высокий уровень Ьс1-2 при достаточно высоком уровне р53, в опухолях с признаками атипии клеток, но без наличия инвазивного роста - атипических фолликулярных аденомах, которые могут являться первым неинвазив-ным этапом развития фолликулярного рака. В данном случае гиперэкспрессию Ьс1-2 можно расценивать в качестве неблагоприятного прогностического фактора в тех наблюдениях, где экспрессия р53 не была обнаружена

Преобладание гиперэкспрессии антиапоптотического Ьс1-2, отмеченной при исследовании величин оптических плотностей ядер в образцах ткани фолликулярного рака с минимальным инвазивным ростом над уровнем экспрессии р53, индуцирующего апоптоз в опухолевых клетках, также может являться фактором плохого прогноза для больного. Вместе с тем, в образцах ткани папиллярного рака с фолликулярным типом строения, характеризующегося медленным ростом и не дающего отдаленных метастазов, при сравнении величин оптических плотностей клеток с экспрессией белков - регуляторов апоптоза. отмечена высокая экспрессия р53 при наличии высокой экспрессии Ьс1-2.

При исследовании индексов мечения ядер К1-67, Ьс1-2 и р53 в ткани фолликулярных опухолей также было отмечено, что его величины не имеют достоверных отличий в образцах ткани фолликулярного рака и фолликулярных аденом, свидетельствуя о сходных патологических процессах этих новообразований. Соответственно индекс мечения не может служить дополнительным дифференциально-диагностическим критерием при исследовании фолликулярных аденом с клеточной атипией и фолликулярного рака.

Вместе с тем высокие величины индексов мечения ядер при экспрессии всех трех белков (Ю-67, Ьс1-2 и р53) были отмечены в образцах ткани фолликулярного варианта папиллярного рака, достоверно отличающиеся от величин индексов мечения в других фолликулярных опухолях, коррелируя только по величине этого показателя при экспрессии р53 в фолликулярной аденоме. Высокий индекс мечения в образцах ткани папиллярного рака при экспрессии белков, «отвечающих» за процессы, как пролиферации, так и апоптоза опухолевых клеток, возможно, является отражением процессов канцерогенеза этого типа опухоли, отличающейся длительным течением, медленным ростом и отсутствием отдаленного метастазирования. С другой стороны выявление высокого индекса мечения при экспрессии всех трех белков Кь67, Ьс1-2 и р53 выделяет папиллярный рак с фолликулярным вариантом строения из ряда фолликулярных опухолей щитовидной железы и может

явиться дополнительным дифференциально-диагностическим параметром при послеоперационном иммуногистохимическом исследовании.

Для выявления объективных и интегративных критериев, по которым можно было бы судить о принадлежности опухоли к доброкачественному или злокачественному процессу, было предложено количественное определение баланса между показателями, характеризующими противоположно направленные процессы в опухолевых клетках (табл. 6). Вычисление коэффициента пролиферативности дает возможность объективно оценить пролиферативный потенциал опухоли и показывает различные пролиферативные возможности фолликулярных аденом и фолликулярного рака Близкие величины показателя пролиферативности в атипических фолликулярных аденомах и фолликулярном раке могут свидетельстве о сходстве этих патологических процессов на генетическом уровне. Вместе с тем, обращает внимание значительное превышение величины коэффициента пролиферативности в папиллярном раке по сравнению с фолликулярным. Это подтверждает наше предположение о более высоком пролиферативном потенциале папиллярного рака щитовидной железы, основанное на особенностях цитологических и структурных признаков этой опухоли.

Исходя из того, что для злокачественной клетки характерны признаки атипии, проявляющиеся на всех структурных уровнях, в том числе на субклеточном уровне, и, прежде всего митохондрий (Maximo V. et al., 2005), была предпринята попытка объективно, с применением количественных методов исследования оценить возможную атипию митохондрий опухолевых клеток, по соотношению величин индексов мечения цитоплазмы при экспрессии противо- и апоптотических факторов bcl-2 и р53.

Полученный фактор возможной атипичности, позволяет дифференцировать фолликулярные опухоли, что особенно ценно при отсутствии выраженной атипии ядер опухолевых клеток, в том числе практическом отсутствии атипических митозов. При больших различиях в пролиферативном потенциале фолликулярных и папиллярных раков, отмечена близость величин возможной атипии, значительно превышающих величины этого показателя при фолликулярных аденомах. Таким образом, атипия на субклеточном уровне может служить вспомогательным критерием для дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований (табл. 6).

Вместе с тем, в сложных случаях, для решения стратегических задач лечения больного, необходимо выяснение более точно потенциала активности роста опухоли Для этого в исследовании было использовано математическое усиление показателей пролиферативности и возможной атипии для количественного определения показателя активности опухолевого роста новообразований щитовидной железы (табл. 6).

Таблица 6

Показатели пролиферации, возможной атипии и активности опухолевого роста клеток фолликулярных опухолей щитовидной железы

Опухоли щитовидной железы Коэффициенты

Коэффициент пролиферации (КП= Вс12/Р53Х И-67) Коэффициент вероятной атипии (КВА=Вс12/Р53) Коэффициент активности опухолевого роста (КАОР=КВА ХКП)

1 Фолликулярная аденома 2,2±0,0б (2,3,4) 0,14±0,01 (2,3,4) 0,3±0,01 (2,3,4)

2 Атипическая фолликулярная аденома б,8±0,1 (1,3,4) 0,37±0,02 (1,3,4) 2,5±0,02 (1,3,4)

3 Фолликулярный рак 8,б±03 (1,2,4) 0,72±0,02 (1,2,4) б,2±0,02 (1,2,4)

4. Папиллярный рак 32,2±1,0 (1,2,3) 0,84±0,01 (1,2,3) 27,М: 1,0 (1,2,3)

Примечание 1 -достоверное отличие с величиной данного параметра фолликулярной аденомы, 2 -атипической фолликулярной аденомы, 3 - фолликулярного рака, 4 - фолликулярного варианта папиллярного рака. Критерий достоверности отличий р< 0,01.

Полученный показатель активности опухолевого роста является объективным дополнительным критерием, позволяющим дифференцировать фолликулярные аденомы и фолликулярный рак щитовидной железы при гистологическом исследовании. Значительное превышение величины коэффициента активности опухолевого роста в папиллярном раке, по сравнению с фолликулярным раком щитовидной железы, связано с большим про-лиферативным потенциалом папиллярного рака, тогда как по величине показателя возможной атипии эти два типа неоплазий близки.

Таким образом, вычисление коэффициентов пролиферации, возможной атипии и активности опухолевого роста на основе определения индексов мечения ядер и цитоплазмы опухолевых клеток, может сделать послеоперационную гистологическую диагностику опухолей щитовидной железы более объективной и прогностически направленной.

Вместе с тем, основной нерешенной проблемой является дооперационная и ин-траоперационная диагностика фолликулярной аденомы и фолликулярного рака щитовидной железы, осуществляемые методом цитологического исследования, не дающим возможности в полной мере оценить структуру ткани и исключающим возможность определения инвазивного роста опухоли.

Для решения задачи дифференциальной цитологической диагностики фолликулярного рака и аденомы щитовидной железы в аспирационных пунктатах и интраоперацион-ных соскобах, была применена нейросетевая технология с тремя видами обработки и ввода исходных данных: описание качественных цитологических признаков опухолей, количественные морфометрические параметры ядер опухолевых клеток, полученные при ком-

пьютерном анализе изображений и автоматический анализ изображений цитологических образцов опухоли, полученных с использованием системы анализа изображений.

В качестве входных данных системы использовали 39 цитологических признаков фолликулярных опухолей (аденом и раков), которые кодировали булевыми величинами («О» - отсутствие признака, «1» - присутствие). Комплекс этих качественных цитологических признаков был сформирован при визуальном цитологическом исследовании тонкоигольных пунктатов и интраоперационных соскобов с ткани фолликулярных опухолей (аденом и раков) щитовидной железы (табл 1). Полученный, таким образом, вектор величин цитологических признаков подавали на вход нейронной сети. Выходным признаком сети являлся класс, к которому принадлежал образец («1» - фолликулярный рак, «О» - или фолликулярная аденома), определенный при независимом гистологическом исследовании.

Для экспериментов, из общей выборки, случайным образом, было выделено обучающее множество из 70 примеров. Еще 25 примеров фолликулярных опухолей, с уже известными гистологическими диагнозами, использовали для тестирования и не участвовали в обучении. В процессе обучения происходила корректировка весовых коэффициентов для того, чтобы общая ошибка между выходом сети и требуемым ответом была минимальной. Двадцать пять примеров фолликулярных опухолей, которые не участвовали в обучении, с уже известными гистологическими диагнозами, установленными независимыми экспертами, использовали для тестирования. В результате тестирования системы 23 тестовых примера были правильно распознаны, а два наблюдения атипической фолликулярной аденомы были расценены системой как фолликулярный рак. После добавления этих примеров к обучающей выборке все примеры были распознаны правильно.

Важным результатом работы искусственной нейронной сети является выделение наиболее значимых по информативности признаков, выявление которых значительно упрощает предварительную работу врача-цитолога по обучению нейронной сети и дальнейшей проверке ее диагностических свойств. В результате сравнения различных качественных признаков по критерию противоречивости, было показано, что наиболее информативными, а следовательно, достаточными для нейросетевой дифференциальной диагностики фолликулярных аденом и рака, являются три параметра: преобладание атипичных фолликулов, наслоение ядер и неравномерность структуры хроматина (табл. 7). На основании использования качественных цитологических признаков был применен метод ассоциативных правил (булева нейронная сеть). В результате были получены сочетания качественных цитологических признаков, позволяющих эффективно решать задачи дифференциальной цитологической диагностики, значительно повышая чувствительность метода (до 92% по сравнению с 56% при рутинном цитологическом исследовании). Из полу-

ченных правил видно, что наиболее информативными дифференциально-диагностическими признаками фолликулярного рака являются отсутствие коллоида, наличие атипичных фолликулов, размерный полиморфизм фолликулов, наслоение ядер, округлая форма ядер, наличие одиночных центрально расположенных ядрышек.

Таблица 7

Оценка значимости признаков по критерию противоречивости_

Качественные признаки Противоречивость Количественные признаки Противоречивость

Фолликулы атипичные 1,143 Площадь ядер [М +2СКО, Мах] 1,008

Наслоение ядер 1,787 Площадь ядер' максимальная 1,085

Распределение конденсированного хроматина неравномерное 1,857 Оптическая плотность ядер [М+2СКО, Мах] 1,137

Фолликулы микрофолликулы 2,193 Оптическая плотность ядер максимальная 1,160

Фолликулы однотипные 2,439 Площадь ядер [М +2СКО, Мах] 1,008

Разрозненные клетки 2,439 Площадь ядер максимальная 1,085

Коллоид внутрифолликуляр-ный 2,579 Оптическая плотность ядер [М +2СКО, Мах] 1,137

Структура конденсированного хроматина- мелкозернистая 2,787 Оптическая плотность адер. максимальная 1,160

Для нейросетевой цитологической диагностики фолликулярной аденомы и фолликулярного рака щитовидной железы по количественным признакам использовали многослойные нейронные сети, обучавшиеся методом обратного распространения. Набором входных данных системы являлись нормированные результаты морфометрических измерений площади, периметра, коэффициента формы и интегральной оптической плотности ядер клеток фолликулярной аденомы и фолликулярного рака и их статистические производные: средние арифметические, минимальные и максимальные величины, среднее квад-ратическое отклонение и вариация. Как и на предыдущем этапе, выходом системы был класс («1» - рак, «О» - аденома), установленный при независимом гистологическом исследовании. Для обучения нейронной сети морфометрические критерии использовали в различных сочетаниях признаков, с целью выявления наиболее значимых критериев для дифференциальной диагностики фолликулярного рака и фолликулярной аденомы. После проведения пробного обучения нейронной сети в ходе тестирования было выявлено, что статистически наиболее достоверно значимыми данными являются максимальные величины площади и оптической плотности ядер (табл. 8). Экспериментально, для увеличения точности исследования, и определения наиболее информативных для нейросетевой диагностики данных, в качестве дополнительных входных векторов нейронной сети были ис-

22

пользованы максимальные величины из интервала между средней величиной плюс два средних квадратичных отклонения и максимальной величиной [М + 2СКО, Мах], которые были получены при делении всех величин на шесть интервалов, каждый из которых был равен величине среднего квадратичного отклонения (СКО). С этой же целью, были использованы величины эксцесса и асимметрии. Сравнение различных количественных признаков по критерию противоречивости, для выявления наиболее информативными, а следовательно, достаточными для нейросегевой дифференциальной диагностики фолликулярных аденом и рака, приведено в таблице 7.

В результате экспериментирования с различными наборами входных признаков, было обнаружено, что для успешного обучения и правильного распознавания всех тестовых примеров достаточно использовать только четыре входных параметра: максимальная площадь ядра, относительное количество максимальных величин площади ядра (находящихся в интервале [М +2СКО, Мах]), максимальная величина оптической плотности ядер и относительное количество максимальных величин оптической плотности ядер [М +2СКО, Мах] (табл. 8).

Таблица 8

Диагностически значимые морфометрические параметры ядер фолликулярных аденом и фолликулярного рака

Фолликулярная опухоль Параметры ядра

Площадь ядра ядра (мкм2) Оптическая плотность ядер

Мах [М +2СКО, Мах] Мах [М +2СКО, Мах]

Фолликулярная аденома 133 70 3 48 1812 4 58

Фолликулярный рак 170 82 0 98 193 65 0 96

Примечание Мах - максимальная величина, [М +2СКО, Мах] - относительное количество величин площади ядра клетки, находящихся в интервале между максимальной величиной и максимальной величиной плюс 2 средних квадратичных отклонения

Таким образом, очевидно, что величины площади и оптической плотности ядра клетки являются наиболее информативными морфометрическими признаками, выявляемыми в результате компьютерного анализа изображений. Важным является факт, что система определила как наиболее информативные признаки максимальную площадь и оптическую плотность ядра, а также относительное количество максимальных величин из интервала между максимальной величиной и максимальной величиной плюс два средних квадратичных отклонения В этот интервал попадают ядра клеток с наиболее выраженной атипией, небольшое количество которых не сказывается значительно на величине средней арифметической. При субъективном цитологическом исследовании такие препараты также могут не вызывать подозрения на злокачественность из-за незначительного количества клеток с крупными, интенсивно окрашенными ядрами.

23

Тот факт, что в процессе тестирования два наблюдения атипической фолликулярной аденомы при использовании качественных параметров и одно наблюдение атипической фолликулярной аденомы при использовании морфометрических критериев были ошибочно приняты системой за фолликулярный рак, свидетельствует об идентичности ряда изменений в ядрах клеток этих опухолей. Совпадение цитологических результатов исследования после проведения диагностики с применением искусственной нейросети с окончательными цитологическими диагнозами составило 92% по качественным признакам и 95% по количественным параметрам, что значительно повысило чувствительность метода цитологической диагностики новообразований на дооперационном и интраопера-ционном этапах (для сравнения совпадение с гистологическими диагнозами при рутинной цитологической диагностике составила 56%).

Однако определение большого массива качественных цитологических признаков для обучения и тестирования нейронной сети, связано с относительным субъективизмом исследования и требует значительных временных затрат, также как и морфометрическое исследование опухолевых клеток. Применение нейросетевого анализатора, обученного на примерах изображений опухолей, полученных с использованием компьютерной системы анализа изображений (САИ) и прошедшего предварительное тестирование, способно значительно повысить диагностическую ценность цитологического метода исследования фолликулярных опухолей щитовидной железы, как в пункционном материале, так и при интраоперационном исследовании, благодаря своей быстроте и высокой чувствительности. Для этого на основе нейросетевых технологий была создана программа «НЕЙРОКЛАСС». Основной задачей при создании данного классификатора было выделение существенных признаков, позволяющих повысить сепарабельность классов и качественно выполнить классификацию изображений. Для повышения сепарабельности классов изображений использовали преобразование их частотного спектра Фурье (X -У. Л1Щ,е1 а1., 2005). В качестве диагностирующей системы, разбивающей множество изображений на два класса («аденома» и «фолликулярный рак»), использовали двухслойную нейронную сеть. В эксперименте исходные изображения сжимали до размера 256x256 пикселей. Для обучения и тестирования нейронной сети использовали по 10 наблюдений фолликулярной аденомы и рака, полученных при интраоперационном соскобе с опухолевой ткни, в каждом случае применяя три цветных изображения цитологических препаратов (три поля зрения). Экспериментально был выделен диапазон частот 96 - 128, дающий наилучшие результаты классификации, приведенные в таблице 10.

Таблица 10

Результаты классификации фолликулярного рака и фолликулярной аденомы _ по цветным компьютерным изображениям_

т 0 10 20

Класс Аденома Рак Аденома Рак Аденома Рак

37 16 36 15 33 14

№ 0 0 3 5 7 8

ЛГ 8 23 6 19 5 17

Достоверность классификации 070 074 0.71 0 76 0.70 0 77

Доля правильно распознанных 0 82 0 59 08 0 49 073 044

Примечание. Т - порог распознавания, N+ количество образов, отнесенных к аденоме, N~ - количество образов, отнесенных к фолликулярному раку, № - количество нераспознанных образов

В исследовании в качестве тестовых использовали изображения трех полей зрения 45 фолликулярных аденом и 39 фолликулярных раков с установленным гистологическим диагнозом. Совпадение с гистологическим диагнозом составило 92%.

Актуальность задачи разработки метода классификации изображений фолликулярных опухолей обусловлена трудностями дифференциальной диагностики этих новообразований, высокой ответственностью и «ценой» принятого решения. Проведенное исследование показало, что использование нейросетевой технологии, может значительно повысить чувствительность метода цитологической диагностики фолликулярных опухолей щитовидной железы, за счет унифицирования и стандартизации способа диагностики, исключающего компонент субъективизма при автоматическом распознавании серии цветных цифровых изображений образцов при этих патологических процессах.

Тот факт, что атипические фолликулярные аденомы, которые не могут быть диагностированы при визуальном цитологическом исследовании, и не выявляют достоверных отличий при морфометрическом исследовании и иммуногистохимическом исследовании от фолликулярного рака, и в то же время могут быть диагностированы искусственной нейронной сетью при анализе изображений, свидетельствует о том, что нейронная сеть «улавливает» те комбинации существенных признаков, которые не доступны глазу исследователя при рутинном подходе к изучению этого новообразования, а также при использовании стандартных дополнительных методов исследования. Вычисление коэффициентов - производных индексов мечения ядер и цитоплазмы клеток при экспрессии генов регулирующих процессы пролиферации и апоптоза и их достоверное отличие в различных типах фолликулярных опухолей, в том числе и в атипической аденоме, подтверждает, что эта опухоль объективно отличается от других новообразований фолликулярного типа.

выводы

1. Визуальное цитологическое исследование материала, полученного при тонкоигольных аспирационных пункциях и интраоперационных соскобах фолликулярных опухолей щитовидной железы имеет ограниченные дифференциально-диагностические возможности, связанные со сходством строения фолликулярных неоплазий этого органа:

а). Дифференцировать фолликулярные аденомы и рак на основании субъективных цитологических критериев не представляется возможным, так как отсутствие признаков выраженной атипии, полиморфизма клеток и ядер, на фоне пролиферации фолликулярного эпителия не исключает наличия инвазивного роста опухоли, при этом совпадение цитологических диагнозов с гистологическими составляет около 56%;

б). Фолликулярный вариант папиллярного рака можно диагностировать цитологически и дифференцировать с другими фолликулярными опухолями щитовидной железы с точностью до 95%, на основании свойственных всему семейству папиллярных раков «ядерных критериев», к которым относятся продолговатая форма, борозды и включения ядер, неравномерное распределение хроматина с образованием «пустого» центра ядра, а также наличие плотной базофильной цитоплазмы клеток;

в). Наиболее информативными цитологическими признаками при визуальном наблюдении, которые необходимо учитывать при подозрении на фолликулярный рак щитовидной железы являются плотный капельный коллоид, расположенный внутрифолликулярно, атипические микрофолликулы с наслоением ядер, большое количество разрозненных «голых» ядер, часто образующих «цепочки».

2. Основным дифференциально-диагностическим признаком фолликулярного рака при визуальном гистологическом исследовании опухолей, имеющих фолликулярное строение ткани является инвазивный рост, даже при минимальной инвазии капсулы и сосудов и незначительной атипии клеток и ядер, а отсутствие инвазивного роста, участки опухолевой ткани со сниженной степенью дифференцирования, в сочетании с выраженной атипией клеток и ядер, в атипических фолликулярных аденомах, является признаком рака без инвазии.

3. Морфометрическое исследование структур фолликулярных опухолей щитовидной железы в гистологических образцах не позволяет дифференцировать фолликулярные аденомы и атипические фолликулярные аденомы, так как величины большинства параметров (диаметры фолликулов и их отношение, площадь стромы) не имеют достоверных отличий. Дифференциальная диагностика фолликулярных аденом и рака возможна на основании морфометрического исследования и сравнения величин таких параметров как пло-

щадь сосудов (васкуляризации), степень фиброзирования и плотность распределения клеток в ткани опухоли.

4. Дифференциальная гистологическая и цитологическая диагностика папиллярного рака с фолликулярным вариантом строения возможна не только на основании субъективных морфологических признаков, но и объективных дифференциально-диагностических параметров, полученных при компьютерной морфометрии клеток и структур опухоли (по соотношению диаметров фолликулов, величине площади стромального компонента и плотности распределения клеток, средним величинам площади, периметра и оптической плотности ядер).

5. Сравнение средних арифметических величин параметров ядер фолликулярной аденомы и фолликулярного рака не может быть использовано в качестве метода их дифференциальной цитологической диагностики.

6. При компьютерном анализе изображений клеток опухолей щитовидной железы с фолликулярным типом строения ткани, величина оптической плотности и индекс мечения специфично окрашенных ядер, характеризуют соотношение количественных уровней экспрессии генов р53 и Ьс1-2 и Ю-67, что является важным фактором в определении степени дифференцированное™ опухолей, отражая взаимосвязь процессов пролиферации и апоп-тоза опухолевых клеток, характеризуя процессы злокачественной трансформации клеток и канцерогенеза на этапе развития начальной неинвазивной формы рака.

7. Высокий уровень экспрессии антиапоптотического белка Ъс1-2 и маркера пролиферации Ю-67, при наличии высокой экспрессии р53 в атипических фолликулярных аденомах и одинаковые с фолликулярным раком величины индекса мечения ядер, свидетельствует о принадлежности атипических фолликулярных аденом к промежуточным опухолевым процессам и возможности дальнейшей злокачественной трансформации их клеток.

8 Высокий индекс мечения всех трех белков Ю-67, Ьс1-2 и р53 выделяет папиллярный рак с фолликулярным вариантом строения из ряда других фолликулярных опухолей щитовидной железы и может служить дополнительным дифференциально-диагностическим параметром для послеоперационного гистологического исследовании этого типа опухоли

9. Коэффициенты пролиферативности, вероятной атипии и активности опухолевого роста, являющиеся производными от величин индексов мечения при экспрессии генов Ьс1-2, Ю-67, и р53 регулирующих процессы апоптоза и пролиферации, могут быть использованы для количественной характеристики степени злокачественной трансформации клеток в новообразовании, и могут быть объективными факторами прогноза для пациентов с фолликулярным и папиллярным раком щитовидной железы.

10. Искусственные нейронные сети повышают качество дифференциальной цитологической диагностики фолликулярных опухолей щитовидной железы, накапливая и обобщая объективные данные об их строении, и обучаясь на известных диагностических примерах

а). Использование метода ассоциативных правил при цитологическом исследовании фолликулярных аденом и рака щитовидной железы, разработанных с помощью нейросетевых технологий, позволяет выявлять скрытые (неявные) закономерности в сочетаниях качественных цитологических признаков, имеющих важное значение для существенного повышения чувствительности дифференциальной диагностики.

б). По данным нейросетевого анализа, наиболее информативными качественными признаками являются: преобладание атипичных фолликулов, наслоение ядер, неравномерная структура хроматина, на основании которых искусственная нейронная сеть дифференцировала фолликулярный рак и фолликулярные аденомы, причем совпадение с результатами независимых гистологических заключений составило 92%.

11. Использование в нейросетевых программах количественных параметров компьютерной кариоцитометрии, позволяет объективизировать исследование, уменьшив зависимость отбора критериев для дифференциальной диагностики от субъективного восприятия и опыта врача-морфолога; наиболее значимыми для нейросетевой диагностики фолликулярных аденом и раков цитологическими морфометрическими критериями, являются: максимальная площадь и оптическая плотность ядра, а также относительное количество наибольших величин площади и оптической плотности ядер, находящихся в интервале между максимальными величинами и максимальными величинами плюс два средних квадратичных отклонения, что позволяет улучшить достоверность диагноза до 95 %.

12. Использование нейросетевого анализатора для автоматической классификации фолликулярных аденом и фолликулярных раков щитовидной железы по цветным цифровым изображениям образцов цитологических препаратов опухолей, позволяет максимально объективизировать процесс диагностики, повысить чувствительность метода до 92%, значительно сократив время, трудоемкость исследования и зависимость результата от квалификации врача, и вывести его на принципиально новый технологический уровень.

Внедрение результатов исследования в практику. Нейросетевые технологии, с применением цветных цифровых изображений для классификации опухолей щитовидной железы внедрены в практическую работу цитологической лаборатории Дорожной клинической больницы на ст. Новосибирск-Гл. ОАО «РЖД». Выявленные сочетания наиболее информативных качественных и количественных дифференциально-диагностических критериев фолликулярных опухолей щитовидной железы внедрены в работу кафедры патологической анатомии Новосибирского государственного медицинского университета по те-

мам «Общие вопросы опухолевого роста. Доброкачественные и злокачественные эпителиальные опухоли» и «Заболевания эндокринных органов». Разработанные в исследовании показатели определения противо- и проапоптотической активности опухолей по соотношению индексов мечения ядер Ki-67, Ъс12 и р53 внедрены в практику научных исследований ГУ Научного центра клинической и экспериментальной медицины СО РАМН. Создана компьютерная программа для дифференциальной цитологической диагностики фолликулярных раков и аденом щитовидной железы «НЕЙРОКЛАСС» (регистрационный № 2006612844).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Камнева Т.Н., Пупышева Т.Л. Современные представления о цитологической диагностике сосочкового рака щитовидной железы// Новости клинической цитологии России.- 1997. - № 1,- С. 10- 15.

2. Пупышева Т.Л., Митерева Н.Г. Цитологическая диагностика различных вариантов сосочкового рака щитовидной железы // Новости клинической цитологии России. - 1997. -№ 2. - С.59 - 62.

3. Пупышева Т.Л. Сравнительная цитоморфологическая и цитометрическая характеристика различных вариантов сосочкового рака щитовидной железы// Новости клинической цитологии России: тез. докл. 2-го съезда Ассоциации Клинических Цитологов России (АКЦР), 1997 -1997. - № 3. - с. 140

4.1Пкурупий В.А., Пупышева Т.Л Дифференциальная цитологическая диагностика различных вариантов сосочкового рака и других объемных образований щитовидной железы методом полуавтоматической морфометрии //Новосибирск: СО РАМН,1998. -124 с.

5. Пупышева Т.Л., Шкурупий В.А. Дифференциальная цитологическая диагностика фолликулярных пролифератов щитовидной железы с использованием цитоморфометрии //Проблемы саногенного и патогенного эффектов и экологического воздействия на внутреннюю среду организма: тез. докл. 4-го междунар. симпозиума, Чолпон-Ата, 1999. - С. 109-110.

6. Shapiro N., Kamneva Т., Bondarenko V. and Pupysheva Т. The cytologic characteristics of various variants of papillary thyroid carcinoma//Acta Cytologica - 1998. - V.42,№4.- P. 566.

7. Пупышева Т.Л., Митерева Н.Г., Жибкова T.B. Интраоперационная цитологическая диагностика портлеклеточных опухолей щитовидной железы. Описание двух наблюдений // Новости клинической цитологии России. - 2000. - Т. 4, № 1-2. - С. 19-20.

8. Пупышева Т.Л., Хальзов A.B. Проблемы срочной интраоперационной цитологической диагностики узловых образований щитовидной железы // Хирургия и морфология: сб. тр./ НГМА. - Новосибирск, 2000. - С.32.

9. Пупышева Т.Н., Митерева Н.Г. Проблемы цитологической диагностики фолликулярных пролифератов щитовидной железы во время срочного интраоперацион-ного исследования. // Новости клинической цитологии России. - 2000- Т.4, № 3-4.-С.88-89.

10. Пупышева Т.Л., Митерева Н.Г. Цитологическое исследование фолликулярных пролифератов щитовидной железы в тонкоигольных аспиратах с использованием цитоморфометрии //Новости клин, цитологии России: тез. докл. 4-го между-нар.съезда Ассоциации клинических цитологов России (АКЦР), Великий Новгород, 2001г. - 2001. - Т. 5, № 1-2. - С. 95.

11. Пупышева Т.Л., Митерева Н.Г. Возможности цитологической диагностики заболеваний щитовидной железы по аспиратам при пункции тонкой иглой и при интраоперационной экспресс-диагностике // Новости клин, цитологии России. - 2001.Т. 5, №3-4.-С. 131-134

12. Пупышева Т.Л. Морфометрия клеток фолликулярных пролифератов щитовидной железы в тонкоигольных аспиратах //Новости клинической цитологии России. - 2002. - Т. 6, №1-2-С. 24-26.

13. Tatiana L. Pupysheva, Naum Shapiro. Morphometric study the fine needle aspirates (ENA) of the thyroid follicular lesions // Acta Cytol.- Materials of 16th International Congress of Cytology, 2001, Amsterdam. -2002. - V. 46, № 1 - P.210

14. Пупышева Т.Л., Демин A.B. Применение искусственных нейронных сетей в цитологической диагностике фолликулярных пролифератов щитовидной железы //Системный анализ и управление в биомедицинских системах -2003. - Т.2, №1, С.38-40.

15. Пупышева Т.Л., Демин A.B. Возможности использования искусственных нейронных сетей в цитологической диагностике фолликулярных неоплазий щитовидной железы / Новые направления и разработки в онкоморфологии: тез.докл.9-й науч. конф., Москва, 2003. - С.50.

16. Пупышева Т.Л., Демин A.B. Цитологическая диагностика фолликулярных неоплазий щитовидной железы с использованием нейросетевых технологий //Актуальные вопросы онкологии: Современные проблемы морфологической диагностики опухолей: тез. докл. междунар. научно-практ. конф., Иркутск - 2003. - С.59.

17. Пупышева Т.Л., Демин A.B. Возможности нейросетевой технологии при дифференциальной диагностике фолликулярных пролифератов щитовидной железы // Новости клинической цитологии России - 2003. - Т.7, № 1-2. - С. 4-7.

18. Пупышева Т.П., Демин A.B. Использование ассоциативных правил для решения задач цитологической диагностики фолликулярных новообразований щитовидной железы // Системный анализ и управление в биомедицинских системах -

2003.-Т.2, №2. - С.116-119.

19. Пупышева Т.Л., Демин А. В. Применение нейросетевых технологий в цитологической диагностике фолликулярных пролифератов щитовидной железы // Новости клинической цитологии России: тез. докл. 5-го Всероссийского съезда АКЦР, Псков, 2003 - 2003. - Т. 7. - № 1-2. - С. 70.

20. Полоз В.В, Полоз T.JI., Демин AB Морфометрия в нейросетевой технологии для цитологической диагностики фолликулярных пролифератов щитовидной железы // Новости клинической цитологии России- тез. докл. 6-го междунар. семинара патологоанатомов и клинических цитологов, Нижний Новогород, 2004 - 2004. - Т.8, № 1-2. - С. 56.

21. Полоз T.JI., Демин A.B. Опыт применения нейросетевых технологий для цитологической диагностики некоторых заболеваний щитовидной железы // ZEISS СЕГОДНЯ - 2004. - № 24. - С. 4.

22. Полоз Т.Л, Тарков М.С. Классификация изображений при цитологической диагностике фолликулярных опухолей щитовидной железы // Новости клинической цитологии России: тез. докл. 6-го междунар. съезда АКЦР, Новосибирск, 2005. -

2004. - Т. 8, № 3-4. - С.67.

23. Полоз Т. Л. Дифференциальная диагностика - фолликулярной аденомы, фолликулярного рака и фолликулярного варианта папиллярного рака щитовидной железы методом компьютерной морфомегрии // Новости клинической цитологии России: тез. докл. 6-го междунар.съезда АКЦР, Новосибирск, 2005 - 2004-Т. 8, №3-4 -С.66

24. Полоз Т. Л. Статистический анализ величин параметров ядер клеток фолликулярных опухолей щитовидной железы, полученных методом компьютерного анализа изображений// Новости клинической цитологии России: тез. докл 6-го междунар.съезда АКЦР, Новосибирск, 2005. - 2004 - Т. 8. - № 3-4. - С. 66.

25. Полоз Т.Л, Тарков М.С. Классификация изображений при цитологической диагностике фолликулярных неоплазий щитовидной железы // Интеллектуальные системы принятия решений и прикладные аспекты информационных технологий: тез. докл. Междунар.научн. конф., Евпатория, 2005. - Т. 1. - С. 130-133.

26. Полоз Т.Л, Полоз В.В, Тарков М.С. Автоматическая нейросетевая классификация цитологических изображений фолликулярных опухолей щитовидной железы // ZEISS СЕГОДНЯ - 2006. - № 33. - С.4.

27. Полоз Т. Л., Шкурупий В.А., Полоз В.В. Компьютерная кариоцитометрия фолликулярных опухолей щитовидной железы // Сибирский онкологический журнал: Актуальные вопросы морфологической, иммуногистохимической и цитологической диагностики злокачественных новообразований: тез. докл. Российской научно-практ.конф., Томск, 2006 -2006,- №3(19). -С.123-124.

28. Полоз Т.Л., Шкурупий В.А., Полоз В.В. Исследование индекса мечения ядер в фолликулярных опухолях щитовидной железы при компьютерном анализе экспрессии Ki-67, Ъс12, р53 // Сибирский онкологический журнал: Актуальные вопросы морфологической, иммуногистохимической и цитологической диагностики злокачественных новообразований: тез. докл.Российской научно-практ.конф., Томск, 2006 -. - №3(19). - С.124-125.

29. Полоз Т.Л., Шапиро H.A., Тарков М.С., Полоз В.В. Новый метод дифференциальной цитологической диагностики некоторых опухолей щитовидной железы: использование искусственной нейронной сети для анализа цитологических изображений // Современные микроскопические исследования в биологии и медицине: сб.тр./ М.: Лабора, 2006,- С.160-163.

30. Полоз Т. Л., Шкурупий В.А., Полоз В.В. Результаты компьютерного анализа экспрессии Ki-67, Ьс12, р53 в ткани фолликулярных опухолей щитовидной железы // Современные микроскопические исследования в биологии и медицине: сб.тр./ М.: Лабора, 2006,- С.163-165.

31. Тарков М.С., Полоз Т.Л, Полоз В.В. Нейронная сеть для классификации изображений цитологических препаратов // Нейроинформатика: тез.докл. 9-й научн.-тех. конф., Москва -2007. -С. 52.

32. Тарков MC., Полоз Т.Л., Полоз В В. Нейросетевой анализатор изображений для цитологической диагностики фолликулярных опухолей щитовидной железы // Вестник Томского гос. Университета. Приложение - 2006. -№ 18 .-С. 185-188.

33. Полоз Т.Л., Шкурупий В.А. Компьютерный анализ результатов иммуногистохимиче-ского исследования пролиферативных и апоптотических процессов фолликулярных опухолей щитовидной железы // Сибирский Консилиум - 2006. - №2(49). - С. 36-39.

34. Полоз Т. Л., Шкурупий В.А. Проблемы дифференциальной цитологической диагностики фолликулярных опухолей щитовидной железы (обзор лит^атуры) // Сибирский Консилиум - 2006. - № 3(50) - С. 15-20.

35. Полоз Т.Л , Тарков М.С., Полоз В.В., Шкурупий В.А. Нейросетевая классификация цитологических изображений фолликулярных опухолей щитовидной железы //Системный анализ и управление в биомедицинских системах- 2006 - Т.5, №3. - С.501-501.

36. Полоз Т. Л., Шкурупий В. А, Полоз В. В Дифференциально-диагностические возможности метода компьютерного анализа изображений фолликулярных опухолей щитовидной железы // Клиническая лабораторная диагностика - 2006. — № 3. - С. 42-44.

37. Полоз Т.Л., Шкурупий В.А. Полоз В.В. Компьютерная морфометрия в дифференциальной диагностике новообразований щитовидной железы //Архив патологии. -2006. —№4. - с. 11-13.

38. Полоз Т.Л., Шкурупий В.А., Полоз В.В., Демин A.B. Результаты количественного цитологического анализа строения фолликулярных опухолей щитовидной железы с помощью компьютерных и нейросетевых технологий // Вестник Рос. АМН - 2006. - № 8. - С. 7-10.

39. Полоз Т.Л., Демин A.B., Шкурупий В.А. Положительное решение от 28.06.2006 о выдаче патента на изобретение по заявке № 2005112953/14 (014947) «Способ дифференциальной диагностики фолликулярной аденомы и фолликулярного рака щитовидной железы».

40. Полоз Т.Л., Полоз В.В., Шкурупий В.А. Положительное решение от 22.11.2006 о выдаче патента на изобретение по заявке № 2005124890/14 (027978) «Способ дифференциальной диагностики фолликулярной аденомы, фолликулярной атипической аденомы, фолликулярного рака и фолликулярного варианта папиллярного рака щитовидной железы».

41. Shapiro N А , Poloz T.L., Shkurupij V.A., Tarkov M.S., Poloz V.V., Demin A.V. Application of Artificial Neural Network for Classification of Thyroid Follicular Tumors // Anal. Quant. Cytol. Histol. -2007. -V. 29. -P 112-119.

Автор приносит искреннюю признательность академику РАМН, проф. В.А. Шкурупию, д.м.н., проф. H.A. Шапиро, генеральному директору ООО «Микромед» к.т.н. В.В. Полозу, к.т.н. М.С. Таркову, А В. Демину, зав. патологоанатомическим отделением ГКБ № 11 Н. Ю. Изуповой, зав. патологоанатомическим отделением ОКБ на ст. Барнаул В.В. Шарапову, Н.Г. Митеревой, администрации Дорожной клинической больницы на ст. Новосибирск-Гл. ОАО «РЖД» и коллективам цитологической лаборатории и патолого-анатомического отделения Дорожной клинической больницы.

Подписано в печать 05.02.07 г. Формат 60 х 84/16 Усл. печ. л. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ № 44п

Отпечатано в типографии НГМУ г. Новосибирск, ул. Залесского, 4. Тел.: (383) 225-24-29

Наряду с важнейшими вопросами патогенеза и лечения заболеваний щитовидной железы, значительно участившихся в последнее время, проблема диагностики патологических процессов этого органа, является одной из наиболее серьезных проблем эндокринологии, хирургии и онкологии. Трудную задачу представляет собой отбор больных с узловыми образованиями щитовидной железы для хирургического лечения, так как до последнего времени многими специалистами практикуется неоправданно широкие показания к оперативному вмешательству. Радиоизотопное и ультразвуковое исследования щитовидной железы не позволяют отличить злокачественное новообразование от доброкачественного поражения (Валдина Е. А., 1993; Ashcraft М. W., 1981; Fransilla К.О. el al., 1985; Aggarwai S. К. et ah, 1989; Okour Kbalil I., 1999; Peccin S. et al., 2003; Mansi L. et al., 2004).Цитологическое исследование заболеваний щитовидной железы в предоперационной диагностике является практически незаменимым методом исследования, позволяющим диагностировать такие патологические процессы как аденоматозный и коллоидный зоб, тиреоидиты, папиллярный и медуллярный рак, фолликулярные опухоли (Петрова А. С, 1985; Голъдбрут Н. Н., 1993; Шапиро Н. А., 2003; Hamburger J.I., 1987; Aleio М. etal., 1991; Aguilar-Diosdado М., et al., 1997; Bakhos R. et al., 2000; Naylor В., 2000). Цитологическое исследование является определяющим в выборе метода лечения больного - консервативным или хирургическим путем (Демидов В. П. и др., 1983; Belfiore A. et al., 2001). Для получения материала применяется аспирационная диагностическая пункция щитовидной железы тонкой иглой, не требующая обезболивания, не травмирующая ткани и, практически, не имеющая осложнений (Богин Ю. Н. и ДР-, 1992).Особую проблему представляет собой определение объема хирургического вмешательства при операциях на узловых образованиях щитовидной железы (Akhtar М-, et al., 1991; Fransilla КО., et a!., 1985; Goldstein R. E., et al., 2002).Диагностика папиллярного, медуллярного и недифференцированного раков щитовидной железы, как правило, не представляют особой сложности (Хмельницкий O.K., 2002; Kinder В.К.. 2003), однако, значительные трудности возникают при определении критериев злокачественности высокодифференцированных фолликулярных раков (Droese, 1980, Carcanqiu М. L., et al., 1985; Akhtar M. et al., 1991; Collins В. Т., et al., 1995; Sarlis N.J. et al., 2002; Cochand-Priollet В., et al., 2003; Pasieka J.L., 2003). До сих пор они не могут быть надежно различимы цитологически от фолликулярных аденом. Иммуниоцитохимические исследования и определение количества ДНК не всегда позволяют дифференцировать злокачественные и доброкачественные поражения, они не применимы при рутинной диагностике (Краевский Н. А., 1993; Хмельницкий О. К. 1993, 2002; Saiz A.D., 2002, Foppiani L., et al., 2003). Заключительное гистологические исследование фолликулярных опухолей также является очень трудным, так как клеточные критерии атипии почти ничего не вносят в патогистологическую картину (Краевский Н.А., 1993; Хмельницкий O.K., 2003; Clary К.М. et al., 2005). Окончательным доказательством для диагноза высокодифференцированного фолликулярного рака признается только обнаружение инвазии опухоли в сосуды и капсулу, что требует значительных временных затрат. Таким образом, рядом авторов принят термин "фолликулярная опухоль" или "фолликулярная пролиферация", отражающий сложность разграничения упомянутых новообразований и объединяющий их в одну группу по типу строения (Кондратьева Т.Т., 1992; Mazzaferi E.L. et al., 1993; Cibas E. S. et al., 1996; Sarlis N.J, 2002). He решенным остается вопрос о сущности, так называемых, атипических аденом. Наличие признаков выраженной атипии в этой группе опухолей при отсутствии капсулярной и сосудистой инвазии является причиной значительного количества диагностических трудностей и ошибок. Природа доброкачественности новообразований, при выраженной атипии клеток, остается неясной.Появление в ткани опухоли участков пролиферации и сниженной дифференцировки клеток не является критерием начали ннвазивного роста в аденоме (Rosaj J., 1996). Достаточно трудно оценить патологические процессы в опухоли, связанные с наличием минимального инвазивного роста или с переходными состояниями, при усилении пролиферативных и анапластических явлений. В то же время исследование патоморфологических процессов з фолликулярных неоплазиях подтверждает возможность этапного развития злокачественных новообразований с различной скоростью роста и трансформацией переходных структур, о чем свидетельствует наличие структурных и цитологических переходных форм (Хмельницкий O.K., 2003).В настоящее время возможен прогресс в практике установления цитологического диагноза при онкологических заболеваниях. Исследования, проводимые с самыми различными алгоритмами (Автандилов Г.Г.. 2002; Nafe R. et al..1992; Karakitsos P. et al, 1999). показали, что медицинские задачи, в том числе морфологическую диагностику патологических процессов, можно решать математическими методами с точностью и удобством.С математической точки зрения, диагностика является частным случаем классификации событий (Ежов А. Н. и др.. 1997). На практике диагноз зависит от множества определенных условий, из которых возможно учесть лишь приблизительный набор наиболее важных. Так как часть условий при этом не учитывается, алгоритм нахождения ответа не может быть определен точно.К таким технологиям относятся искусственные нейронные сети, представляющие собой нелинейные системы, позволяющие гораздо лучше классифицировать данные, чем обычно используемые линейные методы, значительно повышая специфичность метода диагностики, не снижая его чувствительности.Нейронные сети способны принимать решения, основываясь на выявляемых ими скрытых закономерностях в многомерных данных и способны к обучению на примерах, обобщая прежний опыт и применяя его в новых диагностических случаях (Горбань А.Н., 1998; Каллан Р., 2001; Окоп К. et. al..200!)Цель исследования - изучить, проанализировать и сравнить информативность цитологических и гистологических параметров структурной организации доброкачественных и злокачественных фолликулярных опухолей щитовидной железы, полученных при оценке пунктатов. соскобов и гистологических срезов, методами компьютерного анализа изображений, для их дифференциальной диагностики с использованием нейросетевых технологий.Задачи исследования: 1. Изучить цитологические особенности фолликулярных опухолей в материале, полученном при зспирационной пункции тонкой иглой и интраоперационном соскобе и сопоставить информативность цитологического исследования с диагнозами, установленными в результате независимых гистологических исследований.2. Провести сравнительный анализ морфологического строения ткани и выполнить морфометрическое исследование структурных компонентов фолликулярных опухолей щитовидной железы в послеоперационном материале.3. Провести компьютерный анализ изображений с морфометрией ядер клеток фолликулярной аденомы, фолликулярного рака и фолликулярного варианта папиллярного рака щитовидной железы.4. Выполнить сравнительный статистический анализ морфометрических параметров ядер клеток и выявить достоверные отличия их величин в различных фолликулярных опухолях щитовидной железы.5. Определить экспрессию антиалопготического (bcl-2). проапоптотического (р53) и пролиферативного (Ki-67) генов в клетках фолликулярной аденомы, атипической фолликулярной аденомы, фолликулярного рака щитовидной железы с минимальной инвазией и папиллярного рака щитовидной железы с фолликулярным вариантом строения.6. Используя цитологические и морфометрические параметры фолликулярных опухолей щитовидной железы обучить и протестировать искусственные нейронные сети, для создания дифференциально-диагностических программ на основе комплексного анализа полученных данных.7. Используя статистический анализ данных, полученных в результате обучения искусственных нейронных сетей выявить наиболее значимые для дифференциальной диагностики цитологические и морфометрические критерии.8. Обучить и протестировать искусственные нейронные сети, используя цветные цифровые цитологические изображения фолликулярных аденом и рака и определить дифференциально-диагностические возможности нейросетевого анализатора.Научная новизна 1. Проведено сравнительное исследование патоморфологических и цитологических особенностей фолликулярных опухолей щитовидной железы и иммуногисто химически и анализ экспрессии генов апоптоза и пролиферации, с использованием компьютерной системы анализа изображения, которое выявило дифференциально-диагностические возможности каждого из методов.2. Определены количественные показатели степени пролиферативной активности, возможной атипии и активности опухолевого роста, которые позволили с высокой степенью достоверности дифференцировать фолликулярные аденомы, фолликулярный и папиллярный раки щитовидной железы при иммуногистохимическом исследовании.3. Проведена дифференциальная диагностика фолликулярной аденомы, фолликулярного рака и папиллярного рака щитовидной железы с фолликулярным вариантом строения в цитологических и гистологических препаратах с применением методов компьютерной морфометрии. Установлено, что этот метод дает возможность с высокой степенью достоверности диагностировать папиллярный рак с фолликулярным вариантом строения на основании ряда морфом етр и чески х параметров.4. Впервые проведен углубленный математический анализ особенностей распределения величин морфометрических параметров в фолликулярных опухолях шитовидной железы; применение разработанного критерия «наибольших величин» дает возможность успешно проводить дифференциальной диагностику фолликулярных аденом и фолликулярных раков щитовидной железы.5. Впервые, применение «нейросетевых» технологий с использованием комплекса цитологических признаков и данных компьютерной морфометрии. в качестве входных данных, позволило значительно повысить точность дифференциальной диагностики фолликулярной аденомы и фолликулярного рака щитовидной железы.6. С применением искусственных нейронных сетей и метода «ассоциативных правил» выявлены сочетания наиболее информативных качественных и количественных цитологических критериев, позволяющих проводить дифференциальную диагностику фолликулярной аденомы и фолликулярного рака щитовидной железы.7. Впервые, с применением искусственной нейронной сети, с высокой степенью достоверности проведена дифференциальная цитологическая диагностика фолликулярных аденом и фолликулярных раков щитовидной железы по их цветным цифровым изображениям.Положения, выносимые на защиту 1. Морфометрическое исследование структур опухоли в гистологических образцах объективизирует результат исследования фолликулярных опухолей на послеоперационном этапе, позволяет дифференцировать фолликулярных аденомы и рак при сравнении величины площади сосудов (васкуляризации). степени фиброзирования и плотности распределения клеток в ткани опухоли.Вместе с тем. отсутствуют количественные критерии цитологической дифференциальной диагностики фолликулярных аденом и фолликулярного рака щитовидной железы при изучении тонкоигольных асп и рационных пунктатов и интраоперационных соскобов.2. Возможна дифференциальная гистологическая и цитологическая диагностика папиллярного рака с фолликулярным вариантом строения от иных фолликулярных опухолей щитовидной железы, на основании свойственных всему семейству папиллярных раков особенностей ядер, а также ряда объективных дифференциально-ли агностических параметров, полученных при компьютерной морфометрии опухолевой ткани и клеток (соотношение диаметров фолликулярных структур, величина площади стромального компонента и плотность распределения клеток, средние величины площади, периметра и оптической плотности ядер).3. Иммуногистохимическое исследование экспрессии генов р53. bcl-2 и Ki67 в клетках фолликулярных опухолей с определением количественных параметров (индексов мечения и оптической плотности клеток), вычислением показателей, характеризующих '<баланс» противо- и проапоптотических факторов может иметь объективное дифференциально-диагностическое и прогностическое значение, характеризуя лролиферативный потенциал и активность опухолевого роста фолликулярных и папиллярных раков щитовидной железы. Полученные данные свидетельствуют о том. что атипическая аденома является опухолью с высокой степенью риска злокачественной трансформации.4. Применение искусственных нейронных сетей для дифференциальной диагностики фолликулярных аденом и фолликулярного рака щитовидной железы с использованием наиболее информативных качественных цитологических признаков, морфометрических параметров ядер и цветных цифровых изображений образцов цитологических препаратов, позволяет максимально объективизировать процесс диагностики, сократить время и трудоемкость исследования и вывести его на принципиально новый технологический уровень, повысив чувствительность метода до 90%.

za выводы

1 Визуальное цитологическое исследование материала, полученного прн тон-коигольиых аепирацнонных пункциях и интраонерацнониых соскоба* фолликулярных опухолей щитовидной железы имеет ограниченные дифференциально-диагностические возможности, связанные со сходством строения фолликулярных неошжнЯ тгого органа: а). Дифференцировать фолликулярные аденомы и рак на основании субъективных цитологических критериев ие представляется возможным, так кок отсутствие признаков выраженной атнпни. полиморфизма клеток и «дер, на фоне пролиферации фолликулярного зпнтелня не исключает наличия инващцного роста опухоли, при тгом совпадение цитологических диагнозов с гистологическими составляет около 56%; б), Фолликулярный вариант папиллярное о рока можно диагностировать цитологически и дифференцировать с другими фолликулярными опухолями щитовидной железы с точностью до 95%, на основании свойственных всему семейству папиллярных раков «ядерных критериев», к которым относятся продолговатая форма, борозды и включения ядер, неравномерное распределение хроматина с образованием «пустого» центра ядра, а также наличие плотной бою-филыгой цитоплазмы клеток; в). Наиболее информативными цитологическими признаками при визуальном наблюдении, которые необходимо учпымть при подозрении на фолликулярный рак щитовидной железы являются плотный капельный коллоид, расположенный внутрифолликулярио, атипические мнкрофолднкуды с иаслосннсм ядер, большое количество разрозненных «голых» ядер, часто образующих «це-почкил

2, Основным дифференциально-диагностическим npinnaxoM фолликулярного рака при визуальном гистологическом исследовании опухолей, имеющих фолликулярное строение тканн является инвазианый рост, даже ори минимальной инвазии капсулы и сосудов и незначительной атипии клеток и ядер, а отсутствие ннваэивиото роста, учпстки опухолевой ткани со сниженной степенью дифференцирования, в сочетании с выраженной ятнпией клеток и клер, в атипических фолликулярных аденомах, является при таком рака бет инвазии

3. Морфоме1рнческое нсследоваиие структур фолликулярных опухолей щитовидной железы в гистологических образцах не позволяет дифференцировать фолликулярные аденомы и атипические фолликулярные аленоны, так как величины большинства параметров (диаметры фолликулов и их отношение, площадь стромы) не имеют достоверных отличий, Дифференциальная диагностика фолликулярных аденом и рака возможна на основании морфометрнческо-го исследования и сравнения величии таких параметров как площадь сосудов I васкулярнзацни). степень фнбрознровоиия и плотность распределения клеток в ткани опухоли.

4. Дифференциальная гистологическая и цитологическая диагностика папиллярного рака с фолликулярным вариантом строения возможна не только иа основании субъективных морфологических признаков, но и объективных дифференциально-диагностических параметров, полученных при компьютерной морфомстрнн клеток и структур опухоли (по соотношению диаметров фолликулов, величине площади етромадьиого компонента и плотности распределения клеток, средним величинам плошали, периметра н оптической плотности ядер).

5. Сравнение средних арифметических величин параметров ядер фолликулярной аденомы и фолликулярного рака не может быть использовано в качестве метода их дифференциальной цитологической диагностики

6 При компьютерном анализе «гзображений клеток опухолей щитовидной железы с фолликулярным типом строения ткани, величина оптической плотности и индекс мечения специфично окрашенных ядер, характеризуют соотношение количественных уровней экспрессии генов р53 н bcl-2 и Ki-67. >00 является важным фактором в определении степени дифференцированное™ опухолей, ограагия взаимосвязь процессов пролиферации и виоптоя опухолевых клеток, характеризуя процессы злокачественной трансформации клеток и канцерогенеза на этапе развития начальной иеинвазивной формы рока,

7. Высокий уровень экспрессии антнвпоптотнческого белка bd-2 и маркера пролиферации Ki-67, при наличии высокой экспрессии р53 а атипических фолликулярных аденомах и одн пиковые с фоллн кулярн ым роком величины индекса меченая ядер, свидетельствует о принадлежности атипических фолликулярных аденом к промежуточным опухолевым процессам н возможности дальнейшей злокачественной трансформации их клеток

В. Высокий индекс мсчсния всех трех белков Ki-67, bct-2 и р53 выделяет папиллярный рак с фолликулярным вариантом строения m ряда других фолликулярных опухолей щитовидной железы и может служить дополнительным дифференциально-диагностическим параметром для послеоперационного гистологического исследовании этого типа опухоли.

9. Коэффициенты пролифсратзсвности, вероятной агнпнн и активности опухолевого роста, являющиеся производными от величин индексов мечення при экспрессии генов bcl-2, Ki-67. и р53 регулирующих процессы апоптоза и пролиферации, могут быть использованы для количественной характеристики степени злокачественной трансформации клеток в новообразовании, н могут быть объективными факторами прогноза для пациентов с фолликулярным и папиллярным роком щитовидной железы.

10. Искусственные нейронные сети повышают качество дифференциальной цитологической диагностики фолликулярных опухолей щитовидной железы, накапливая и обобщая объективные данные об их строении, и обучаясь на известных диагностических примерок а). Использование метода ассоциативных правил при цитологическом исследовании фолликулярных аденом и рока щитовидной железы, разработанных с помощью нсйросетевых технологий, позволяет выявлять скрытые (неявные) закономерности в сочетаниях качественных цитологических признаков, имеющих важное значение для существенного повышения чувствительности дифференциальной диагностики б). По данным нсйросетевого анализа, наиболее информативными качественными пралиаквми являются, преобладание атипичных фолликулов, наслоение ядер, неравномерная структура хроматина, ни ос и Паники которых искусственная нейронная сеть дифференцировало фолликулярный рак и фолликулярные аденомы, причем совпадение с результатами независимых гистологических заключений составило 92%.

11 Использование в иейроестевых программах количественных параметров компьютерной кариоцнтометрии, позволяет объективизировать исследование, уменьшив зависимость отбора критериев для дифференциальной диагностики от субъективного восприятия и опыта врача- морфолога; наиболее значимыми для иейросетеаой диагностики фолликулярных аденом и раков цитологическими морфомстрическнми критериями, являются; максимальная площадь и опти* ческая плотность ядра, а также относительное количество наибольших величин площади и оптической плотности ядер, находящихся в интервале между максимальными величинами и максимальными величинами плюс лва средних квадратичных отклонения, что позволяет улучшить достоверность диагноза до 95%.

12. Использование нсйросстевого анализатора для автоматической классификации фолликулярных аденом и фолликулярных раков щитовидной железы по цветным цифровым изображениям образное цитологических препаратов опухолей, позволяет максимально объективизировать процесс диагностики, повысить чувствительность метода до 92%, значительно сократив время, трудоемкость исследования и зависимость результата от квалификации врача, и вывести его ив принципиально новый технологический уровень

137

1ЛКЛЮЧЕ НИЕ

Таким обратим, при сравнении возможностей различных методов исследования irpir диагностике фолликулярных опухолей щитовидной железы, объединенных в эту группу по принципу фолликулярного типа строения, отмечено, что рутинный цитологический метод исследования, обладает низкой чувствительностью и не позволяет с высокой точностью дифференцировать фолликулярные аденомы и фолликулярный pax. Дифференцировать фолликулярные аденомы и рок на основании цитологических критериев достаточно сложно и не всегда возможно, так как большинство цитологических критериев встречается как при доброкачественных процессах, так и при раке Отсутствие признаков выраженной атипии и полиморфизма клеток и ядер, на фоне пролиферации фолликулярного зпнтелия делает невозможной достоверную дифференциальную цитологическую диагностику фолликулярных аденом и фолликулярного рака. В нашем исследовании совпадение цитологических диагнозов с окончательными гистологическими диагнозами составило 56%,

Вместе с тем, фолликулярный вариант папиллярного рака можно диагностировать цитологически и дифференцировать с другими фолликулярными опухолями ил основании характерных ядерных критериев, свойственных всей группе папиллярных раков. Форма и расположение ядер, особенности их структуры позволяют выделять папиллярный рак с фолликулярным типом строения с высокой степенью уверенности. Наличке солидных пластов, вие-фоллнкуляриое расположение коллоида, относительно больший полиморфизм, атнпня ядер и цитоплазмы опухолевых клеток свидетельствуют о более низкой дифференцированности папиллярного рака но сравнению с фолликулярным раком щитовидной железы,

Компьютерный анализ изображений с морфометрнческим исследованием структурных компонентов опухоли позволяет решать ряд дифференциалы!о-лнапюстнческих проблем, связанных с окончательной гистологической диагностикой атипических фолликулярных аденом и фолликулярного рака с минимольной инвазией, которые представляют собой агачнтельные трудности из-Ml субъективности подхода к анализу строения опухолевой ткани. Величины внутренних и внешних диаметров фолликулов, плотность распределения клеток. степень взскуляризации и фнброшровання опухолевой ткани являются объективными Критериями, которые дают возможность решать дифференциально-диагностические задачи по определению фолликулярных аленом и фолликулярного рака, фолликулярного раха н папиллярного рака с фолликулярным вариантом строения. Сходство величин большинства морфомстрнческих параметров этнической фолликулярной аденомы it фолликулярного рака, и отсутствие капсулярной и сосудистой инвазии опухолевой ткани, является основанием относить атипическую фолликулярную аденому к потенциально злокачественным новообразованиям, возможно находящуюся на тгояе злокачественной трансформации, когда процесс инвазивного роста еще не наступил. Объективизация процесса морфологической диагностики фолликулярных неонлдзнВ щитовидной железы с помощью компьютерного морфометрического анализа изображения значительно повышает его качество и информативность.

Достоверные отличия величин ряда исследуемых параметров (периметров. площадей, коэффициентов формы и оптической плотности ядер) в различных группах фолликулярных опухолей, полученные в результате компьютерной корноцнтометрин в цитологических itpenapttmx н статисти'кското анализа полученных величин, подтверждают принадлежность фолликулярных аленом, атипических аденом, фолликулярного и папиллярного рака с фолликулярным пшом строения к различным генеральным совокупностям. Однако, средние арифметические величины полученных параметров, характеризующие форму и структуру ядер фолликулярных аденом и рака, ие являются дифференцнальио-диагностичсскими критериями для выявления зтнх опухолей при цитологическом исследовании.

Вместе с тем. компьютерный анализ изображений опухолевых клеток дает возможность дифференцировать фолликулярный вари ант папиллярного рака, не только на основании упомянутых выше качественных признаков (плотная базофнлыни цитоплазма, овальная форма ядер с «пустым» центром, неоднородной структурой хроматина, бороздами ядер и внутриядерными вхлючении-ми), но it по средним величинам площади, периметра и оптической плотности ядер, достоверно превышающим средние величины анолопгчиых параметров других фолликулярных неоплазнй Таким образом, субъективные качественные и объективные количественные признаки позволяют с высокой степенью достоверности диагностировать фолликулярный вариант папиллярного рака, как менее дифференцированное, по сравнению с другими фолликулярными опухолями. новообразование с явными признаками анаплзнии.

Нммунофснотипнровдннс опухолевых клеток является важным этапом послеоперационного диагностического исследования фолликулярных неоплазнй щитовидной железы, поскольку позволяет судить о степени дифференциаций новообразований и. следовательно, прогнозировать дальнейшее течение патологических процессов Иммуиогистохимнчсское исследование послеоперационных образцов фолликулярных опухолей щитовидной железы является дополнительным фактором для дифференциальной диагностики фолликулярных опухолей, лапая возможность прогнозирования течения патологических процессов при различных типах злокачественных и доброкачественных фолликулярных неоплазнй. Количественное определение уровня экспрессии белков, регулирующих процессы апоптоза н пролиферации клеток, основанное на исследовании величии оптической плотности ядер с экспрессией bcl-2, р53 и Ki-67 н индексов мечения ядер прн компьютерном анализе изображений образцов фолликулярных опухолей щитовидной железы, позволяет объективно оценить соотношение этих факторов, выявить их взаимосвязь и наличие прямой или обратной корреляции

Таким образом, лгипнзм опухолевых клеток в новообразованиях, имеющих фолликулярную гистоархитетонику, сочетающуюся с высоким уровнем экспрессии белков bcl-2. р53. регулирующих апапготические процессы клеток опухолевой тканн. лаже при отсутствии опуммеипй инвазии, может явиться неблагоприятным аз я бояыинх» прогностическим фактором течения патологиноского процесса, Сходство патологических процессов при сравнении величин индексов мсчснкя н величины оптической плотности ядер в образипя ткани атипических фолликулярных аденом и фолликулярного рака может являться объясненном сходства тэзсгоархитектоннки «их опухолей и подтвердить вероятность того, что атипическая фолликулярная аденома является начальной стадией развития фолликулярного рака щитовидной железы, его нсинвазнвной формой,

Фолликулярный рак щитовидной железы, несмотря на отсутствие признаков резко выраженной стншн в клетках опухоли, отличающийся более агрессивным ростом по сравнению с папиллярным раком, быстрым гематогенным метлстазированисм и неблагоприятным прогнозом для жизни больного, характеризуется высоким уровнем экспресс ни bcl-2, отмеченным во всех наблюдениях и коррелирующим со снижением уровня экспрессии р53. Возможно, наличие белка bcl-2 во всех наблюдениях атипических фолликулярных аденом и фолликулярного рака является маркером плохого прогноза при этих заболеваниях.

При исследовании индекса мечения при экспрессии Ki-67. bcl-2 it р53 в ткани фолликулярных опухолей также было отмечено, что его величины не имеют достоверных отличий в образиах ткани фолликулярного рака и фолликулярных аденом, свидетельствуя о сходных патологических процессах этих новообразований. Соответственно индекс мечения не может служить дополнительным дифференциально-диагностическим критерием при исследовании фолликулярных аденом с клеточной атнпией и фолликулярного рака.

Вместе с тем высокие величины индекса мсчснкя при экспрессии всех трех белков (Ki-67. bc|-2 и р53> были отмечены в образцах ткани фолликулярного варианта папиллярного рожа, достоверно отличающиеся от величины индекса мечения в других фолликулярных опухолях, коррелируя только по величине этого показателя при экспрессии рЗЗ в фолликулярной аденоме. Выявление высокого индекса метения при экспрессии все* трех белков Ki-67. bcl-2 и р53 выделяет папиллярный рак с фолликулярным вариантом строения, харахтеритующнйся более благоприятный длительным течением опухолевого процесса и отсутствием отдаленною метастазироваиия, «л ряд» фолликулярных опухолей щитовидной железы и может явиться дополнительным лифференци-алыго-дкапюсгическнм критерием при послеоперационном исследовании.

Таким образом, соотношение уровней экспрессии белков K.i-67, р53 и be I-2 а клетках опухолей щитовидной желе*ы с фолликулярным швом строения ткани, при компьютерном анализе изображений образцов новообразований, с определением величин оптической плотности и индексов мечения, специфично окрашенных ядер клеток, является важным фактором в определении дифференциации опухали, отражав взаимосвязь процессов пролиферации и ацоптоза опухолевых клеток, процессы злокачественной трансформации клеток и процессов канцерогенеза на этапе развития начальной неннвазнвной формы рака

Предложенное количественное определение баланса между показателями хврактернзуэощнии противоположно направленные процессы в опухолевых клетках дапо возможность выявить объект виые и ннтстратнаныс кри терии, по которым можно было бы судить о принадлежности опухоли * доброкачественному или злокачественному процессу Вычисление коэффициента пролиферя-тивиости даст возможность объективно оценить пролпфератнвный потенциал опухоли и показывает различные нролнфервтнвиые возможности фолликулярных аденом и фолликулярного рака. Близкие величины показателя пролнфера-тивиости в атипических фолликулярных аденомах и фолликулярном раке могут свидетельствовать о сходстве этих патологических процессов на генетическом уровне. Вместе с тем, обращает внимание значительное превышение величины коэффициента пролнфератнвности в папиллярном раке по сравнению с фолликулярным. Это подтверждает наше предположение о более высоком пролифе-рлтнвиом потенциале папиллярного рока, основанное на особенностях цитологических н структурных признаков этой опухоли.

Исходя из предположения, что для злокачественной клетки существуют признаки атнпии, которые проявляются лтнпнсН не только ядра но и шггоплаэ-матическнх структур, была предпринята попытка объективно, с применением количественных методов исследования оценить возможную апшию опухолевых клеток, по соотношению неличин индексов мсиння цитоплазмы клеток с экспрессией противо- и Ы№1Гготнч«кнх факторов ЬсЗ-2 и р53. Полученный критерий возможной л типичности митохондрий* позволяет дифференцировать фолликулярные опухоли, что особенно ценно при отсутствии выраженной лтн-iiHH ядер онухолеаых клеток, в том числе практическом отсутствии атипических митозов, При больших различиях в пролиферативном потенциале фолликулярных и папиллярных раков, отмечена близость величин возможной дтнпни на субклеточном уровне, значительно превышающих величины зГОго показателя в фолликулярных аденомах. Таким образом, атипия субклеточного уровня может служить вспомогательным критерием для дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований.

Вместе с тем. в сложных случаях для решения стратегических задач лечения больного, необходимо выяснение более точна потенциала злокачественности опухоли. Для этого в исследовании было использована математическая интеграция показателей пролифератнвноети и возможной атипнн для количественного определения показателя активности опухолевого роста новообразований щитовидной железы. Полученный коэффициент активности опухолевого роста позволяет обьехтнмю дифференцировать фолликулярные аденомы н фолликулярный рак щитовидной железы. Значительное превышение величины коэффициента активности опухолевого роста в папиллярном раке, по сравнению с фолликулярным роком щитовидной железы, связано с большим пролн-фератнвным потенциалом папиллярного рака, тогда как по величине показателя возможной итинин тги два типа неонлизий близки. Возможно, это является подтверждением различия по типу роста и метастазироваяпя этих опухолей.

Таким образом, вычисление коэффициентов пролиферативиостн, вероятной атинин н активности опухолевого роста на основе определения индексов мечення ядер и цитоплазмы опухолевых клеток, может елужнть дополнительным методом исследования, позволяющим сделать послеоперационную гнетологическую диагностику опухолей щитовидной железы более объективной и прогностически направленной

Для эффективного решения залач дифференциальной цитологической днопюстнкн фолликулярных нсошазнй на пооперационном и интраоперацнон* ном лапе, был применен метод многослойной самоорганизации искусственных нейронных сетей- Использование в качестве входных данных системы массива качественных цитологических признаков фолликулярных опухолей, которые в виде вектора величин подаются дл» обучения и дальнейшего тестировония системы, дает возможность программе самостоятельно выделять наиболее значимые комбинации признаков, основываясь на скрытых закономерностях и внутренних связях Использование нейросетевой технологии, для усовершенствования процесса цитологической диагностики фолликулярных пролифератов щитовидной железы, значительно повышает чувствительность метода. Способность искусственной нейронной сети к накоплению и обобщению данных, а также к обучению на конкретных примерах, позволяет дополняй, данные исследования цитолониеского материала не только качественными, но и количественными признакам н,

Возможности использования метода нейросотсаого акали за на основе ассоциативных пролил позволяет эффективно решать задачи дифференциальной цитологической диагностики, значительно повышая чувствительность метода и выявляя те комбинации качественных признаков, которые не являются явными и очевидными для исследователя. Изучение сознаваемых с помощью нейросетевой технологи ассоциативных правил дает возможность исследователю объективно оценить информативность различных цитологических критериев, в зависимости от их сочетания, и тем самым, улучшил качество дооперацноиной и ин ^итерационной дифференциальной диагностики фолликулярных опухолей щитовидной железы. К наиболее значимым, по информативности, качественным признакам, по данным нейросетевого анализа, было отнесено преобладание атипичных фолликулов, наслоение ядер, неравномерная структура хроматина На основании анализа качественных цитологических критериев иекуссткипи нейронная с en. диагностировала фолликулярный рак и фолликулярные аденомы с точностно 91% при сравнении с данными независимого гистологического исследования,

ЕС наиболее информативным количественным признакам, при нейрОсеТе-вом анализе данных, полученных при компьютерной карношпомстрик онтологических препаратов фолликулярных аленом и рака, были отнесены величины площади и оптической плотности ядра клетки. Нейронная сеть определила как наиболее информативные признаки не средине арифметические величины, а максимальные величины плошали и оптической плотности ядер, а также относительное количество наибольших величин, находящихся в интервале между максимальным значением и максимальным значением плюс два средних квадратичных отклонения. 8 этом интервале находятся величины параметров ядер клеток с наиболее выраженной птипией. небольшое количество которых ж сказывается значительно на величине средних арифметических, а их сравнение не выявляет достоверных отличий данных групп опухолей. При субъективном цитологическом исследовании такие препараты также могут не вызывать подозрения на злокачественность, из-за незначительного количества меток с крупными, неравномерно окрашенными ядрами

Отбор критериев при помощи математического яши», при подготовке к обучению и тестированию нейронной сети дает возможность эффективно использовать количественные данные для успешной дифференциальной диагностики фолликулярных аденом и рпха, Точность цитологической диагностики с использованием иейросетевых технологий повышается до 95%, по сравнению с субъективным визуальным исследованием, составляюишм 56- 65 %,

Анализ наблюдений атипических фолликулярных аденом ошибочно классифицированных нейронной сетью как фолликулярный рак, полтеержюет сходство патологических процессов в клетках тгих опухолей, вместе с тем, использование способности нейронных сетей к накоплению данных и обучению, с учетом многовариантности цитологических картин фолликулярных опухолей, дает возможность дальнейшего усовершенствования системы неЯросетеисно анализа. доя улучшения ка'»ествл дифференциальной диагностики фолликулярных неоплазнй.

Однако определение большого массива качественных цнтолопокских признаков для обучения н тестирования нейронной сети, связано с относительным субъективизмом исследования и требует значительных временных затрат, также квк и морфометричсскос нсслеловмгне опухолевых клеток. Наиболее перспективным представляется применение метода нсйросетевой классификации опухолей щитовидной железы на основании компьютерного акали» изо-брожений цитологических образцов новообразований, Нсйросетевой анализатор, обученный на примерах изображений опухолей, полученных с использованием компьютерной системы он плита изображений (САН) и прошедший предварительное тестирование, способен значительно повысить диагностическую ценность (до 92%) цитологического метода исследования фолликулярных опухолей щитовидной железы, как в нунхционном материале, так и прн ннтраопе-ранионном исследовании, благодаря своей быстроте н высокой чувствительности Необходимость улучшения качества декларационной цитологической диагностики фолликулярных новообразований щитовидной железы является важнейшей задачей, на решение которой было направлено создание диагностических систем на основе нсйросетевой технологии

Тот факт, что атипические фолликулярные аденомы, которые не могут быть диагностированы при визуальном цитологическом исследовании, н ис вы-являзот достоверных отлнчнй прн норфомегрнческом исследовании и иммуно-щ сто химическом исследования от фолликулярного рак:!, и в то же время могут быть диагностированы искусственной нейронной сетью при анализе изображений. свидетельствует о том, что нейронная сеть «улавливает» те комбинации существенных приз)тиков, которые не доступны глазу исследователя при рутинном подходе к изучению этого новообразования, а также при использовании стандартных дополнительных методов исследования. Вычисление коэффициентов - производных индексов мечения ядер и цитоплазмы клеток с экспрессией генов, ретулируючшх процессы пролиферации и апоигтоза и их достоверное отличие в различных типах фолликулярных опухолей, в том числе и в атипической аденоме, подтверждает, что зга опухоль объективно отличается от других новообразований фолликулярного типа.

Проведенное исследование демонстрирует целесообразность использования качественных и количественных цитологических признаков, в сочетании с данными компьютерного анализа изображений в качестве обучающих н тестирующих данных, для применения нейросетевых технологий с целью достижения нового качественного уровня и повышения точности цитологической диагностики доброкачественных и злокачественных фолликулярных опухолей щитовидной железы на доопераииоином этапе и при ннтраопераииоином исследовании.