Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Патоморфологические изменения в регионарном лимфатическом узле после имплантации полимера молочной кислоты

На правах рукописи

Манаев Андрей Александрович

ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В РЕГИОНАРНОМ ЛИМФАТИЧЕСКОМ УЗЛЕ ПОСЛЕ ИМПЛАНТАЦИИ ПОЛИМЕРА МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ

14.03.02 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 2014

Работа выполнена в ФГБУН Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск).

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Майбородин Игорь Валентинович

Официальные оппоненты:

Кливер Евгений Эдуардович, доктор медицинских наук, заведующий патологоанатомическим отделением ФГБУ Новосибирского научно-исследовательского института патологии кровообращения имени академика Е.Н.Мешалкина МЗ РФ.

Авдалян Ашот Меружанович, доктор медицинских наук, заведующий лабораторией молекулярной диагностики Алтайского филиала ФГБУ Российского онкологического научного центра имени Н.Н.Блохина РАМН.

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО Алтайский государственный медицинский университет МЗ РФ (Барнаул).

Защита состоится: «_» _ 2014 г. в _ час.

на заседании совета Д 001.037.01 в ФГБУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН по адресу 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН http://pathomorphology.soramn.ru/

Автореферат разослан «_»_2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Молодых Ольга Павловна

; ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

20 М

Актуальность темы. Изучение процессов интеграции живых тканей и искусственных материалов в различных условиях имеет большое значение для качества жизни больных, нуждающихся в применении эндопротезов в хирургии, травматологии и ортопедии, восстановительной медицине и стоматологии.

Полимеры молочной кислоты (ПМК) являются самыми старыми и потенциально одними из самых интересных и полезных биодеградируемых искусственных полимеров из-за их происхождения из возобновляемых источников, управляемого синтеза, хороших механических свойств и исходной биологической совместимости. Эти имплантаты полностью резорбируются и элиминируются из организма через естественный путь (цикл Крсбса). В ПМК можно добавлять необходимые лекарственные вещества, которые, по мере его деградации, будут медленно поступать в окружающие ткани (Alst van М. et al., 2009; Sinha R.S., 2012).

В научной литературе остается открытым вопрос относительно истинного времени биологического распада полилактидных материалов (Laitinen О. et al., 2002; Willcox N., Roberts S., 2004). Необходимы дальнейшие исследования, чтобы точно предсказывать процессы деградации и выявлять все потенциальные риски, связанные с биодеградируемыми материалами (Stockheim М. et al., 2010).

Имеются противоречивые сведения о воспалительной реакции: от полного отрицания воспаления в ответ на имплантацию ПМК (Ргокор А. et al., 2004) вплоть до сообщений о выраженной воспалительной реакции (асептической), обусловленной именно присутствием этого материала в тканях (Eitenmiiller J. et al., 1996; Bunger C.M. ct al., 2006).

Некоторые исследователи сообщают о полном отсутствии реакций инородного тела на данный класс имплантатов (Kilicoglu О. et al., 2003; Saikku-Backstrom A. et al2004; Lieger О. et al., 2010), тогда как другие - об обязательном формировании гигантских клеток инородных тел (Raghoebar G.M. et al., 2006; Schmidmaier G. et al., 2006; Sena P. el al., 2012) и об абсорбции IIMK только в результате поглощения его фрагментов клетками макрофагального ряда (Paiv Tiainen J. et al., 2004; Sena P. et al., 2012; Niu C. et al., 2012).

Степень разработанности темы исследования. В доступной литературе имеется множество данных об эффективности использования ПМК в клинической медицине. Однако применение этого полимера как самостоятельно, так и в комбинации с другими препаратами и веществами имеет свои недостатки и преимущества и должно осуществляться только с учетом всех возможных показаний и противопоказаний. Следует отметить отсутствие в литературе сведений об изменениях регионарных лимфатических узлов после применения ПМК, тогда как именно лимфатические узлы являются маркерами выраженности вос-

палительного процесса в тканях, и по их изменениям можно оценивать результативность проведения тех или иных лечебных мероприятий (Koch Е. et al„ 2000).

Цель исследования - изучить структурно-клеточные взаимоотношения в регионарном лимфатическом узле после имплантации полимера молочной кислоты в эксперименте.

Задачи исследования:

1. Методами световой микроскопии исследовать процессы деградации полимера молочной кислоты в различные сроки после его внедрения в подкожно-жировую клетчатку межлопаточной области крыс.

2. Определить основные изменения структуры регионарных к месту имплантации полимера молочной кислоты (аксиллярных) лимфатических узлов в различные сроки после имплантации полимера молочной кислоты.

3. Установить особенности изменений клеточного состава различных зон подмышечных лимфатических узлов в различные сроки после внедрения полимера молочной кислоты.

Научная новизна. Впервые исследованы реакции лимфатических узлов на имплантацию ПМК в регионе лимфосбора.

Впервые показано, что после внедрения ПМК в подкожно-жировую клетчатку крыс в регионарных лимфатических узлах через 6 и 12 месяцев возрастает объемная плотность соединительной ткани. В мозговом веществе происходит трансформация части синусов в лимфатические сосуды.

Впервые установлено, что в паренхиме и синусах лимфатических узлов спустя 6 и 12 месяцев после имплантации ПМК возрастает численность макрофагов и клеточных элементов с признаками деструктивных изменений.

Впервые получены свидетельства, что через 6 и 12 месяцев после внедрения ПМК во всех зонах лимфатических узлов, кроме лимфоидных узелков, становится больше ретикулярных клеток и тканевых базофилов, в фолликулах уменьшается содержание делящихся клеток, иммуно- и плазмобластов.

Впервые доказано, что в структурах мозгового вещества лимфатических узлов к исходу I года после внедрения полимера снижается количество плазматических клеток и в 9,1 раза увеличивается численная плотность эозинофилов.

Впервые продемонстрировано, что через 6 и 12 месяцев после имплантации Г1МК в различных отделах лимфатических узлов в 41,7% наблюдений присутствуют гигантские клетки инородных тел вместе с фагоцитированным материалом.

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые знания об особенностях взаимодействия ПМК с тканями организма. Полилактиды, являющиеся «биодеградируемыми» согласно многочисленным литератур-

ным данным, в полной мере такими не являются. Подобные материалы, присутствуя длительное время в тканях организма, или полностью не разрушаются в течение жизни, или деградируют только через значительный промежуток времени.

Целесообразно продолжение дальнейших исследований, чтобы точно предсказывать процессы деградации и выявить все потенциальные риски, осложнения и побочные эффекты, связанные с применением биодегра-дируемых материалов этой группы. В связи с наличием хронического гранулематозного воспалительного процесса в тканях вокруг имплантированного ПМК для профилактики различных осложнений необходимы разработка и проведение мероприятий, направленных на снижение интенсивности воспаления.

Возможность изменений регионарных лимфатических узлов после имплантации изделий из ПМК необходимо учитывать мри выборе методов лечения и определении прогноза заболевания. Любое проводимое лечение (как консервативное, так и хирургическое) может улучшить лимфоток, но не приводит к обратному развитию соединительной ткани в регионарных лимфатических узлах. В связи с нарушением функций лимфатических узлов целесообразен поиск методов их сохранения и быстрого восстановления в процессе использования полилактидных материалов.

Методология и методы исследования. В работе использованы современные методы сбора и обработки исходной информации. Диссертация основана на результатах морфологического исследования аксиллярных лимфатических узлов вместе с окружающей клетчаткой 60 крыс-самцов инбредной линии Wag после внедрения большого фрагмента ПМК в подкожно-жировую клетчатку межлопаточной области.

Стенень достоверности результатов диссертации. Все использованные методические приемы и способы статистической обработки соответствуют поставленным цели и задачам и позволяют получить достоверные и доступные анализу результаты. Диссертация выполнена на достаточном экспериментальном материале с использованием сертифицированного оборудования, современных высокоинформативных методов исследования и анализа результатов. Сформулированные научные положения, выводы и практические рекомендации основаны на результатах собственных исследований, не носят характера умозрительных заключений и вытекают из результатов работы.

Личный вклад автора: весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Полимер молочной кислоты не является полностью биодеградиру-емым, его фрагменты сохраняются в подкожно-жировой клетчатке крыс более 1 года.

2. После внедрения полимера молочной кислоты в подкожно-жировую клетчатку крыс в регионарных лимфатических узлах через 6

и 12 месяцев возрастает объем соединительной ткани, увеличивается численная плотность эозинофилов и появляются гигантские клетки инородных тел.

Апробация работы. Основные положения и выводы диссертации доложены на 7-й межрегиональной конференции, посвященной памяти академика РАМН проф. Л.В. Полуэктова (Омск, 2013), на 4-й Всероссийской научной интернет-конференции с международным участием «Современные проблемы анатомии, гистологии и эмбриологии животных» (Казань, 2013), на международной научно-практической конференции «Фундаментальные проблемы науки» (Уфа, 2013) и на заседании научного персонала лабораторий Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН: лабораторий стволовой клетки, инвазивных медицинских технологий, персонализированной медицины, а также сотрудников кафедр Новосибирского государственного медицинского университета: анатомии человека; гистологии, эмбриологии и цитологии; патологической анатомии; топографической анатомии и оперативной хирургии; судебной медицины (Новосибирск, 2014).

Внсдрсиие в практику результатов исследования. Результаты исследований внедрены в научно-исследовательскую работу отдела «Центр новых медицинских технологий» ФГБУН Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

Публикации. По теме и результатам диссертации опубликованы 11 печатных работ, в том числе 7 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов но списку ВАК для публикаций материалов диссертации.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, главы с обзором литературы, главы описаний материалов и методов исследования, 2 глав собственных результатов с их обсуждением, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованных источников и 3 приложений. Диссертация изложена на 176 страницах машинописного текста, иллюстрирована 9 таблицами и 35 многокомпонентными комбинированными рисунками. Список использованных источников включает 361 источник (74 отечественных и 287 иностранных).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведено морфологическое исследование регионарных (правых аксиллярных) к месту имплантации ПМК лимфатических узлов крыс-самцов инбредной линии Wag.

На работу получено разрешение Локального комитета по медицинской этике Центра новых медицинских технологий в Академгородке ФГБУН Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (протокол № 13 заседания Этического комитета от 09 ноября 2012 года).

Для подкожной имплантации ПМК производили разрез кожи в области шеи от основания черепа до лопаток длиной ] -2 см. Тупым способом (сомкнутым зажимом) формировали слепой канал длиной 1,5-2 см над правой лопаткой. В данный канал помещали фрагмент ПМК с размером граней 3-5 мм, вырезанный ex tempore ножницами. Послеоперационные раны ушивали непрерывными швами, кожу и кожные швы обрабатывали спиртом.

Животных выводили из эксперимента через 1,2,6 и 12 месяцев после операции. В эксперименте всего было использовано 60 крыс.

Указанные даты для выведения животных из эксперимента были выбраны в соответствии с рекомендациями литературы (Prokop A. et al., 2005; Rasse M. et al., 2007; Thomas K.A. et al., 2008). Группу ложноопери-рованных крыс было решено исключить из исследования в связи с тем, что последствия хирургического вмешательства по внедрению ПМК отсутствуют на точке наблюдения позже 1 месяца (Beumer G.J. et al., 1994), a реакции тканей непосредственно на имплантацию ПМК и изменения самого полимера начинаются через 1 месяц (Eitenmüller J. et al., 1987; Holder W.D. et al., 1998).

Для исключения возрастных изменений (так как за крысами наблюдали в течение длительного срока) половину интактных животных выводили из эксперимента через 1 месяц после операции, а оставшихся - спустя 1 год, то есть вместе с первой и последней группой опытных животных.

Методы морфологического анализа. Имплантированный ПМК вместе с окружающими тканями и правые аксиллярные лимфатические узлы фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере (pH 7,4) не менее 24 часов, обезвоживали в серии этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в парафин. Срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, изучали на световом микроскопе Axioimager Ml (Carl Zeiss, Германия) при увеличении до 1200 раз.

Для исследования структурной организации лимфатических узлов и клеточных элементов в их структурах проводили измерения изображений, полученных при помощи цифровой видеокамеры микроскопа, на экране компьютера с использованием программного обеспечения морфологического модуля Axiovision (Carl Zeiss, Германия). При использовании объектива с увеличением *5 конечная площадь тестового прямоугольника была равна 5 600 000 мкм2 (стороны 2800x2000 мкм), при объективе хЮ - 1 400 000 мкм2 (стороны 1400x1000 мкм), при объективе х20 - 350 000 мкм2 (стороны 700x500 мкм), при подсчете цито-1 раммы клеток (применение объектива с увеличением х40) - 87 500 мкм2 (стороны 350x250 мкм).

Статистическую обработку результатов проводили на прикладной статистической программе MS Excel (Microsoft, USA), определяли среднее арифметическое и стандартное отклонение. Различия между средними считали достоверными при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Морфологическое исследование тканей после имплантации полимера молочной кислоты

Через 1 месяц после имплантации полимер был заключен в тонкую капсулу из рыхлой соединительной ткани, содержащей мало межклеточного вещества и множество клеточных элементов, среди которых преобладали фибробласты, лимфоциты и макрофаги. Следует отметить наличие многочисленных мелких тонкостенных кровеносных сосудов вокруг капсулы и формирование единичных слившихся многоядерных макрофагов.

Образование капсулы и сосудистые реакции вокруг полилактидных материалов описаны в литературе.

Необходимо обратить внимание на разнородность данных литературы о макрофагальной реакции на импланты из ПМК: некоторые исследователи сообщают о полном отсутствии реакций инородного тела на данный класс имплантатов (Kilicoglu О. et al., 2003; Saikku-Backstrom A. et al., 2004; Lieger О. et al., 2010), тогда как другие - об обязательном формировании гигантских клеток инородных тел (Raghoebar G.M. et al., 2006; Schmidmaier G. etal., 2006; Sena P. et al., 2012) и об абсорбции ПМК только в результате поглощения его фрагментов клетками макрофагального ряда(ТЫпеп J. et al., 2004; Sena P. et al., 2012; Niu C. et al., 2012).

Воспалительная реакция (лейкоцитарная инфильтрация) тканей вокруг ПМК в литературе также описана противоречиво. Сообщается как об отсутствии воспалительных изменений (Bos R.R. et al., 1991; Gogolewski S. et al., 1993; Prokop A. et al., 2004), так и о длительном выраженном воспалительном процессе (Eitenmiiller J. et al., 1996; Та? С. et al., 1998; Bunger C.M. et al., 2006).

Скорее всего, несмотря на свой состав из мономеров молочной кислоты и потенциальную легкую биодеградируемость, о которой широко сообщается в научной литературе (Wei S. et al., 1999; Leiggener C.S. et al., 2006; Yang Y. et al., 2009), ГТМК постепенно инкапсулируется соединительнотканной капсулой (Kaijzel E.L. et al., 2006; McDougall S. et al., 2006; Schwartz-Arad D. et al., 2007).

Макрофаги в этой капсуле, при невозможности быстро лизировать инородное тело, сливаются и формируют многоядерные формы - гигантские клетки инородных тел (Raghoebar G.M. et al., 2006; Schmidmaier G. et al., 2006; Sena P. et al., 2012). To есть идет асептическая воспалительная реакция, вызванная присутствием инородного тела - полимера (Eitenmiiller J. et al., 1996). Об этом же свидетельствуют мелкие кровеносные сосуды, скорее всего, являющиеся грануляциями (Holder W.D. et al., 1998; Та? С. et al., 1998).

Через 2 месяца по морфологическим изменениям все наблюдения можно было разделить на 2 группы:

Чаще всего полимер был деформирован и инкапсулирован тонкой полоской плотной соединительной ткани с минимальными воспалительными изменениями вокруг: лейкоцитарная инфильтрация и сосудистые реакции. Однако в окружающих тканях даже в этих случаях присутствовали гигантские клетки инородных тел.

Несколько реже полимер был покрыт толстой капсулой из плотной соединительной ткани с выраженной лейкоцитарной (макрофагальной) инфильтрацией. В капсуле было множество различных по размерам гигантских клеток инородных тел. Подкожно-жировая клетчатка была в значительной степени замещена соединительной тканью, инфильтрирована лейкоцитами и содержала полнокровные кровеносные сосуды с широким просветом и тонкими стенками (грануляции).

По-видимому, такие изменения произошли в результате имплантации фрагментов полимера, имеющих больше острых краев, которые сильнее травмировали окружающие ткани как сами по себе, так и при сжатии капсулы (Майбородин И.В. и др., 2011 - 2013). Такая постоянная травма-тизация капсулы и тканей вокруг нее при ее разрывах привела к развитию соединительной ткани, утолщению капсулы и более выраженной воспалительной реакции: лейкоцитарной инфильтрации, формированию слившихся многоядерных макрофагов и значительному объему грануляций.

Следует отметить, что в литературе также описывается возможность разнородного ответа на импланты из ПМК. Во время процесса деградации таких материалов продукты распада индуцируют тканевые реакции из-за неоднородной скорости резорбции (Bahr W. et al., 1999).

Спустя 6 месяцев после имплантации ПМК инородное тело по-прежнему можно было найти в тканях между лопаток. Овальные фрагменты полимера, при изучении гистологических срезов, были окружены тонкой плотной соединительнотканной капсулой с умеренно выраженной лейкоцитарной инфильтрацией. Далее располагался тонкий слой рыхлой соединительной ткани, а затем - жировая ткань. Следует отметить, что у фрагментов полимера практически отсутствовали острые края, но небольшие гигантские клетки инородных тел все равно присутствовали в тканях рядом с капсулой.

Возможно, что под действием лизосомальных фрагментов макрофагов постепенно лизируются острые выступы на поверхности ПМК, который, согласно литературным данным, является быстро биодеградируемым полимером (Wei S. et al., 1999; Leiggener C.S. et al., 2006; Yang Y. et al., 2009).

Также не исключено, что острые выступы на поверхности инородного тела отламываются при сжатии его капсулой в результате все возрастающего действия миофибробластов (Майбородин И.В. и др., 2011 - 2013).

После сглаживания поверхности полимера снижается степень травмирования капсулы и окружающих тканей, следствием этого является снижение уровня воспалительной реакции и постепенное уменьшение толщины капсулы и объема соединительной ткани вокруг нее. Постепенное

снижение выраженности воспалительной реакции на этот срок отмечают и другие исследователи (Bos R.R. et al., 1991; Bahr W. et al., 1999).

Спустя 1 год после внедрения ПМК все еще присутствовал в тканях межлопаточной области крыс. Толщина капсулы варьировала от очень толстой, через промежуточные формы, вплоть до очень тонкой, практически полностью отсутствующей и очень подвижной. В толстой капсуле присутствовали признаки воспалительной реакции, в первую очередь, гиперемия и спаянность с окружающими тканями.

В литературе содержится множество работ, свидетельствующих об очень медленной, в течение нескольких лет, деградации имплантатов из ПМК (Raghoebar G.M. et al., 2006; Walton M., Cotton N.J., 2007; Stockheim M. et al., 2010).

Необходимо отметить возможность разнородного ответа на импланты из ПМК из-за неоднородной скорости их резорбции (Bahr W. et al., 1999). Также была обнаружена активация хронического воспалительного процесса в заключительные периоды имплантации без полной деградации полимера (Bos R.R. et al., 1991).

Наиболее вероятно, что резкое возрастание уровня воспалительной реакции и в случае тонкой, и в случае толстой капсулы связано с уровнем деградации полимера.

В том случае, когда полимер фрагментирован макрофагами и сжатием капсулой, образуется несколько фрагментов с острыми краями, каждый из которых травмирует ткани, повреждает капсулу и активирует воспалительный процесс.

Когда полимер деградировал и представляет собой полужидкое или жидкое вещество, идет активное поглощение различных по величине цепочек полимера как клетками (фагоцитами), так и методом диффузии через окружающие ткани. Воспалительная реакция усиливается в результате миграции в такие участки лейкоцитов для поглощения инородного материала. Скорее всего, свой вклад вносит и повреждение тканей в результате закисления среды (мономеры и различные по длине полимеры молочной кислоты) (Shi X. et al., 2009). Оставшиеся твердыми фрагменты полимера, в силу тех или иных причин устойчивые к деградации, вызывают формирование гигантских клеток инородных тел в капсуле или окружающих тканях.

Следует отметить, что присутствие самого имплантированного материала и гигантских клеток инородных тел на все сроки наблюдения, возможно, служит свидетельством того, что полимер на основе молочной кислоты не является в полной мере биодеградируемым и подвергается разрушению в течение длительного времени и, в основном, через лизис макрофагами. В литературе содержатся данные и об очень длительном лизисе ПМК (Raghoebar G.M. et al., 2006; Walton M., Cotton N.J., 2007; Stockheim M. et al., 2010), и об активном участии в этом процессе макрофагов (Schmidmaier G. et al., 2006; Sena P. et al., 2012; Niu C. et al., 2012).

Структурно-клеточные изменения регионарных лимфатических узлов после имплантации полимера молочной кислоты

Строение лимфатических узлов. В аксиллярных лимфатических узлах через 6 и 12 месяцев после операции объемная плотность всей соединительной ткани была больше в 3,3 и 5,0 раз, соответственно, чем у интактных крыс. У 4 из 12 крыс (33,3 %) через 1 год после имплантации ПМК была найдена трансформация мозговых синусов в сосуды.

Имплантация даже биологически инертного инородного тела в ткани живого организма сопровождается воспалительной реакцией. Сначала это острый воспалительный процесс, являющийся ответом на операцию: повреждение тканей при внедрении имплантата (Майбородин И.В. и др., 2011 - 2013). Потом, по мере регенерации тканей и отграничения имплантата соединительнотканной капсулой (Kaijzel E.L. et al., 2006; McDougall S. et al., 2006; Schwartz-Arad D. et al., 2007), острое воспаление постепенно переходит в хроническое, которое является реакцией на само инородное тело (Майбородин И.В. и др., 2011 -2013; Кузнецова И.В. и др., 2013), в том числе и на полимеры молочной кислоты (Майбородин И.В. и др., 2013).

Скорее всего, расширение соединительнотканных прослоек в корковом и мозговом веществе регионарных лимфатических узлов через 6 и 12 месяце после имплантации ПМК обусловлено хроническим воспалением в регионе лимфосбора, причиной которого является наличие нелизиро-ванного инородного тела (Хлопина И.Д., Михалочкина В.И., 1964; Browse N.L., 1986; Бородин Ю.И. и др., 2000).

Индекс К/М (отношение площади коркового вещества на срезе лимфатических узлов к площади мозгового) у интактных животных составлял 1,74, то есть аксиллярные лимфатические узлы крыс относятся к компактному типу, когда паренхима преобладает над синусной системой (Бородин Ю.И., Григорьев, 1986; Бородин Ю.И. и др., 1990).

Величина индекса К/М к 1 месяцу после имплантации снизилась до 1,21 и стала статистически достоверно ниже контроля на 43,8%, то есть тип лимфатического узла приблизился к промежуточному. Однако на другие точки наблюдения величина значения данного показателя от контроля не отличалась, и лимфатические узлы характеризовались компактным типом структуры.

Необходимо особо отметить, что в корковом и мозговом веществе лимфатических узлов 5 из 12 животных (41,7%) через 6 и 12 месяцев после имплантации ПМК присутствуют гомогенные овальные включения с незначительной зернистостью с наибольшим диаметром до 50 мкм. В таких образованиях иногда можно проследить несколько круглых клеточных ядер.

Скорее всего, подобные структуры являются веществом имплантата, распавшимся до более коротких полимерных цепочек, и в таком виде

пассивно, с током лимфы через лимфатические сосуды, попавшим в лимфатические узлы. Здесь такие скопления инородного вещества инфильтрируются макрофагами и постепенно лизируются ими.

Следует учитывать, что некоторые такие структуры очень похожи на гигантские клетки инородных тел, которыми, по-видимому, и являются. То есть, возможно слияние макрофагов для поглощения инородного вещества не только в месте его имнлантации, но и в регионарных лимфатических узлах.

Клеточный состав коркового плато. Через 6 и 12 месяцев после операции процент ретикулярных клеток стал больше на 41,1% и 52,2%, соответственно, относительно контрольного уровня.

Длительный хронический воспалительный процесс служит причиной того, что в тканях и регионарных лимфатических узлах начинается развитие соединительной ткани, что, согласно литературным данным, начинается именно с «огрубления» их ретикулярной стромы (Хлопина И.Д., Михалочкина В.И., 1964; Цыб А.Ф. и др., 1980; Бородин Ю.И. и др, 2000).

Относительное количество макрофагов на срок в 2; 6 и 12 месяцев после операции было больше контроля в 2,1; 2,7 и 2,6 раза, соответственно, по сравнению с интактными крысами. Абсолютное содержание макрофагов через 6 месяцев после внедрения ПМК возросло в 2,5 раза по сравнению с контролем.

Увеличение относительной и абсолютной численности макрофагов можно объяснить с 3 позиций:

- во-первых, количество макрофагов возрастает в ответ на все увеличивающийся объем антигенов и токсинов, поступающих из очага хронического воспаления в месте имплантации ПМК;

- во-вторых, число фагоцитов в лимфатических узлах может увеличиваться в связи с поступлением туда продуктов деградации и мелких фрагментов ПМК в регионе лимфосбора; микрочастицы 1IMK размером 0,7-2 мкм более тропны к проникновению в лимфатическое русло (Hawley А.Е. et al„ 1997; Liu J. et al., 2006; Shin S.B. et al„ 2010; Chaney U.J. et al, 2010). Полимер в узлах концентрируется в макрофагах (Niu С. et al., 2012);

- в-третьих, макрофаг и принимают активное участие в процессе образования и лизиса компонентов соединительной ткани (Pihlajamaki Н. et al., 2006); в связи с этим существует вероятность возрастания численности данных фагоцитов из-за ее развития в корковом веществе лимфатических узлов.

Скорее всего, увеличение содержания макрофагов связано с комбинацией воздействия всех указанных причин.

Процент клеточных элементов с признаками деструктивных изменений через 6 и 12 месяцев после операции превосходил исходный уровень в 2,7 и 2,8 раза, соответственно. Наиболее вероятно, что возрастание численности клеток с явлениями деструкции обусловлено длительным посту-

плением большого объема антигенов и токсинов из очага хронического воспалительного процесса - места имплантации ПМК.

Кроме того, необходимо обратить внимание на появление тканевых базофилов в цитограмме коркового плато отдельных крыс через 6 и 12 месяцев после внедрения полимера. Возможно, что это отражает процессы более интенсивного формирования соединительной ткани в корковом веществе именно у этих особей (СЬусгечуэка Е. е1 а1., 1995; 81шй1е\уо1111 С.А., 1997; НовЫ К. а!., 2001).

Клеточный состав паракортикальной зоны. Спустя 6 и 12 месяцев после операции процент ретикулярных клеток стал больше на 42,7% и 37,3%, соответственно, относительно контрольного уровня.

Относительное количество макрофагов на срок в 6 и 12 месяцев после операции было больше контроля в 2,0 и 2,1 раза, соответственно.

Наиболее вероятно, что увеличение численности ретикулярных клеток и макрофагов связано с развитием соединительной ткани в корковом веществе лимфатических узлов в поздние сроки после внедрения инородного тела.

Процент тканевых базофилов спустя 1 год после внедрения ПМК возрос в 5 раз, относительно уровня в контроле. Тканевые базофилы или тучные клетки, как и макрофаги, принимают участие в синтезе и лизисе различных форм коллагена и присутствие этих клеток, особенно в большом количестве, может свидетельствовать о прогрессирующем развитии соединительной ткани (СЬусгелувка Е. е1 а1., 1995; 8Ьий1е\У01111 С.А., 1997; НобЫК. е1а1„ 2001).

Процент клеточных элементов с признаками деструктивных изменений через 6 и 12 месяцев после операции превосходил исходный уровень в 2,5 и 2,4 раза, соответственно.

Скорее всего, возрастание содержания клеток с явлениями деструкции обусловлено длительным поступлением токсинов и антигенов из очага хронического воспаления в регионе лимфосбора - места имплантации ПМК. В паракортикальной зоне расположены промежуточные синусы, часть синусной системы лимфатических узлов, по которой проходит лимфа из региона (Жданов Д.А., 1952; Сапин М.Р. и др., 1978; Бородин Ю.И. и др., 1990). Токсические вещества из лимфы частично поступают в паренхиму паракортекса и могут вызвать там повреждение некоторых клеточных элементов.

Клеточный состав центров размножения лимфоидных узелков. Относительное количество иммуно- и плазмобластов в герминативных центрах лимфоидных узелков аксиллярных лимфатических узлов через 6 и 12 месяцев после имплантации ПМК стало статистически достоверно меньше на 35,8% и 33,6%, соответственно, по сравнению с интактным контролем.

Через 6 месяцев после операции процент и абсолютное число ретикулярных клеток стали больше на 40,2% и 70,6%, соответственно, относительно уровня спустя 1 месяц.

Относительная численность макрофагов через 6 и 12 месяцев после имплантации ПМК возросла на 88% и в 2 раза, по сравнению с интакт-ным контролем. Численная плотность макрофагов к 6 и 12 месяцам после имплантации стала больше в 2,3 и 2,5 раза, соответственно, по сравнению с интактными крысами.

Процент делящихся клеток через 6 и 12 месяцев после имплантации ПМК стал меньше в 2,4 и 2,6 раза, соответственно, по сравнению с ин-тактным контролем.

Относительное количество клеточных элементов с признаками деструктивных изменений через 6 и 12 месяцев после операции превосходило исходный уровень в 2,3 и 2,9 раза, соответственно, по сравнению с исходными данными. Численность клеток с деструктивными изменениями на 1(Р мкм2 площади среза герминативного центра через 6 и 12 месяцев после имплантации ПМК стала больше в 2,7 и 3,6 раза, соответственно, чем у интактных крыс.

Уменьшение численности незрелых клеточных элементов В-линии в герминативных центрах, наиболее вероятно, связано с истощением пула митотически активных клеток. Продолжительное по времени хроническое воспаление в регионе лимфосбора приводит к длительному поступлению клеточного и тканевого детрита, обладающего антигенными свойствами, в лимфу и лимфатические узлы. Как реакция на антиген, стимулируется пролиферация и дифференцировка В-лимфоцитов, которые, достигнув зрелости плазматических клеток, начинают синтезировать антитела.

Но со временем численность клеток, которые обладают пролифера-тивной активностью, уменьшается. Численность незрелых клеточных элементов сокращается, так как новых клеток образуется меньше, а уже имеющиеся - быстро созревают. Это подтверждается параллельным снижением содержания фигур митозов в этой зоне. Иммупокомпетентных клеток становится меньше, и их место занимают стромальные клеточные элементы - ретикулярные клетки, число которых увеличивается к окончанию времени эксперимента.

В процессе деления и дифференцировки клеток в некоторых из них происходят различные изменения. Далее в таких клетках включаются процессы апоптоза или они уничтожаются системой иммунитета. Наиболее вероятно, что возрастание численности клеток с признаками деструкции отражает как эти процессы, так и воздействие токсических веществ, поступивших из региона лимфосбора: очага хронического воспаления в месте имплантации ПМК.

Скорее всего, количество макрофагов в герминативных центрах увеличивается как для фагоцитоза деструктивных форм клеток, так и для элиминации токсинов и антигенов, попавших в указанные структуры вместе с током лимфы из места внедрения инородного тела.

Клетки в просвете мозговых синусов. Процент плазматических клеток через 6 и 12 месяцев после имплантации ПМК был меньше на

69,7% и 71,2%, соответственно, чем у интастных крыс. При нарушении тока лимфы через узел плазматическим клеткам просто некуда выделять антитела. Свой вклад в это вносит и параллельное снижение антигенной стимуляции лимфатических узлов при уменьшении объема лимфы и развитии соединительной ткани. Постепенно клетки В-линии исчезают из мозгового вещества аксиллярных лимфатических узлов.

Относительное число ретикулярных клеток через 6 и 12 месяцев после операции стало выше на 51,9% и 63,9%, соответственно, относительно уровня в контроле. Численность ретикулярных клеток на 105 мкм2 площади среза просвета синусов через 6 и 12 месяцев после имплантации ПМК возросла в 3,8 и 4,0 раза, соответственно, по сравнению с состоянием в интактном контроле. Скорее всего, увеличение численности ретикулярных клеток отражает появление компонентов соединительной ткани в синусной системе.

Процент макрофагов спустя 6 и 12 месяцев после внедрения полимера стал больше на 65,5% и 67,5%, соответственно, по сравнению с интактным контролем. Абсолютное содержание макрофагов через 6 и 12 месяцев после имплантации ПМК было больше в 4,1 и 3,8 раза, соответственно, относительно состояния в интактном контроле.

По-видимому, возрастание численности макрофагов, в первую очередь, может быть связано с детритом, поступающим в узлы из места имплантации ПМК при постепенной его деградации с воспалением в тканях вокруг. Также увеличению количества фагоцитов способствует развитие соединительной ткани.

Относительное число эозинофилов через 6 и 12 месяцев после операции стало выше в 3,8 и 3,5 раза, соответственно, по сравнению с уровнем в контроле. Численная плотность эозинофильных лейкоцитов через 6 и 12 месяцев после имплантации ПМК возросла в 10,7 и 9,1 раза, соответственно, чем у интактных крыс.

Скорее всего, эозинофилы, обнаруженные в синусной системе лимфатических узлов, попали туда вместе с лимфотоком из региона лимфосбора, где находится внедренный ПМК. Таким образом, увеличение численности эозинофилов может свидетельствовать об определенной аллергизации организма к 6 месяцу после имплантации ПМК, возможно, продуктами его деградации или тканевым детритом, образовавшимся в результате повреждения тканей организма кислыми мономерами при распаде полимера молочной кислоты.

Спустя 6 месяцев после внедрения полимера процент тканевых ба-зофилов стал больше в 3,8 и 3,9 раза, соответственно, по сравнению с интактным контролем. Абсолютное содержание тучных клеток через 6 месяцев после имплантации ПМК было больше в 9,2 и 8,8 раза, соответственно, относительно состояния в интактном контроле. Как уже было отмечено ранее, увеличение численности тканевых базофилов отражает активность развития соединительной ткани (СЬусгечуяка Е. е1 а1., 1995;

8ЬиМ1ешоЛЬ СЛ., 1997; НоэЫ К. е1 а1., 2001) в мозговом веществе лимфатических узлов.

Относительное количество клеточных элементов с признаками деструктивных изменений через 6 месяцев после операции было больше в 2,4 и 2,3 раза по сравнению с исходными данными. Численность клеток с деструктивными изменениями на 105 мкм2 площади среза зоны через 6 и 12 месяцев после имплантации ПМК стала больше в 6,7 раза, по сравнению с интактным контролем. Возможные причины увеличения численности клеток с явлениями деструкции были неоднократно рассмотрены выше.

ВЫВОДЫ

1. Полимер молочной кислоты после имплантации в организм индуцирует хроническую гранулематозную воспалительную реакцию и инкапсулируется соединительной тканью. Постепенно активность воспалительного процесса снижается, но она резко возрастает, когда в результате действия ферментов фагоцитов и деформации капсулой полилактид или фрагментируется, или разжижается. Материалы, приготовленные из полимера молочной кислоты, не являются полностью биодеградируемыми и присутствуют в тканях крыс, как минимум, в течение 1 года.

2. Статистически значимые изменения в регионарных лимфатических узлах начинаются через полгода после хирургического вмешательства по имплантации полимера молочной кислоты.

3. После внедрения полимера молочной кислоты в подкожно-жировую клетчатку крыс в регионарных лимфатических узлах через 6-12 месяцев возрастает объемная плотность капсулы и соединительной ткани в корковом и мозговом веществе. Кроме того, в мозговом веществе происходит трансформация части синусов в лимфатические сосуды. Основной причиной склеротической трансформации данных органов является длительный хронический воспалительный процесс в регионе лимфосбора: в тканях вокруг полимера.

4. В паренхиме и синусах лимфатических узлов спустя 6-12 месяцев после имплантации полимера молочной кислоты возрастает численность макрофагов и клеточных элементов с признаками деструктивных изменений. Появление большого числа клеток с явлениями деструкции обусловлено хроническим воспалением в регионе. Рост количества макрофагов является следствием реакции как на присутствие нежизнеспособных клеток, так и на антигены, поступающие из места имплантации полимера молочной кислоты.

5. Через 6-12 месяцев после внедрения полимера молочной кислоты во всех зонах лимфатических узлов, кроме лимфоидных узелков, становится больше ретикулярных клеток и тканевых базофилов, в фолликулах уменьшается митотическая активность и содержание иммуно- и плазмобластов. Возрастание содержания клеточных элементов стромы и тканевых базо-

филов отражает значительную активность склеротических процессов на клеточном уровне. В связи с прогрессивным разрастанием соединительной ткани в структурах лимфатических узлах падает количество пролифери-рующих и дифференцирующихся иммунокомпетентных клеток.

6. В структурах мозгового вещества лимфатических узлов к исходу 1 года после внедрения полимера снижается количество плазматических клеток и появляется много эозинофилов. Уменьшение числа плазмоцитов, наиболее вероятно, обусловлено склерозом, когда иммунокомпетентные клетки постепенно замещаются недифференцированными клеточными элементами и соединительной тканью. Тогда как эозинофилия может быть свидетельством присоединения аллергического компонента к воспалительному процессу, симптомом аллергизации организма как продуктами распада собственных тканей при длительном хроническом воспалении, так и кислыми продуктами деградации полимера молочной кислоты.

7. Возможно слияние макрофагов для поглощения инородного вещества не только в месте его имплантации, но и в регионарных лимфатических узлах. Также нельзя исключить миграцию уже сформированных гигантских клеток инородных тел вместе с фагоцитированным материалом из тканей в регионарные лимфатические узлы. Об этом свидетельствует присутствие гигантских клеток инородных тел в корковом и мозговом веществе лимфатических узлов через 6 и 12 месяцев после имплантации полимера молочной кислоты.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полилактиды, являющиеся «биодеградируемыми» согласно многочисленным литературным данным, в полной мере такими не являются. Подобные материалы, присутствуя длительное время в тканях организма, или полностью не разрушаются в течение жизни, или деградируют только через значительный промежуток времени. Целесообразно продолжение дальнейших исследований, чтобы точно предсказывать процессы деградации и выявлять все потенциальные риски, осложнения и побочные эффекты, связанные с применением биодеградируемых материалов этой группы. Необходимо учитывать, что длительное присутствие инородного тела в тканях организма создает проблему онкогенеза (эффект Оппенгейме-ра). Использование полилактидных материалов должно быть критически пересмотрено.

2. В связи с наличием хронического гранулематозного воспалительного процесса в тканях вокруг имплантированного полимера молочной кислоты, для профилактики различных осложнений необходимы разработка и проведение мероприятий, направленных на снижение интенсивности воспаления.

3. Возможность изменений регионарных лимфатических узлов после имплантации изделий из полимера молочной кислоты необходимо учитывать при выборе методов лечения и определении прогноза заболевания.

Любое проводимое лечение (как консервативное, так и хирургическое) может улучшить лимфоток, но не приводит к обратному развитию соединительной ткани в регионарных лимфатических узлах. В связи с нарушением функций лимфатических узлов целесообразен поиск методов их сохранения и быстрого восстановления в процессе использования полилактидных материалов.

4. Задача создания новых имплантатов на основе полимера молочной кислоты сводится к синтезу материалов, достаточно прочных к сжатию капсулой, фрагментированию и без острых выступов, которые могут повредить окружающие ткани и поддерживать высокую активность пери-фокального воспаления.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Майбородин И.В., Кузнецова И.В., Береговой Е.А., Шевела А.И., Баранник М.И., Манаев A.A., Майбородина В.И. Тканевые реакции при деградации имплантатов из полилаюгида в организме // Морфология. -2013. - Т. 143, № 3. - С. 59-65.

2. Кузнецова И.В., Майбородин И.В., Шевела А.И., Баранник М.И., Манаев A.A., Бромбин А.И., Майбородина В.И. Особенности тканевых реакций при абсорбции лизируемых шовных материалов // Морфология. - 2013. - Т. 144, № 4. - С. 53-59.

3. Майбородин И.В., Береговой Е.А., Шевела А.И., Кузнецова И.В., Баранник М.И., Манаев A.A., Майбородина В.И. Морфологические изменения тканей после имплантации биодеградируемого материала на основе коллагена // Морфология. - 2013. - Т. 144, № 6. - С. 63-68.

4. Майбородин И.В., Кузнецова И.В., Береговой Е.А., Шевела А.И., Баранник М.И., Майбородина В.И.., Манаев A.A. Реакция тканей крыс на имплантацию биодеградируемого полимера на основе молочной кислоты // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т. 156, № 12. - С. 848-853.

5. Майбородин И.В., Кузнецова И.В., Береговой Е.А., Шевела А.И., Баранник М.И., Манаев A.A. Отсутствие полной деградации полилактида в эксперименте // Актуальные проблемы хирургии: Сборник научных трудов 7-й межрегиональной конференции, посвященной памяти академика РАМН проф. Л.В. Полуэктова: 7 вып. - Омск, 2013. - С. 385-387.

6. Кузнецова И.В., Майбородин И.В., Баранник М.И., Манаев A.A. Отдаленные последствия вживления в подкожно-жировую клетчатку крыс биодеградируемых шовных материалов // Современные проблемы анатомии, гистологии и эмбриологии животных: Материалы 4-й Всероссийской научной интернет-конференции с международным участием. - Казань: ИН Синяев Д.Н., 2013. - С. 80.

7. Кузнецова И.В., Майбородин И.В., Баранник М.И., Манаев A.A. Отдаленные последствия вживления в подкожно-жировую клетчатку крыс неабсорбируемых хирургических материалов Н Современные проблемы анатомии, гистологии и эмбриологии животных: Материалы 4-й Всероссийской научной Интернет-конференции с международным участием.

- Казань: ИП Синяев Д.Н., 2013. - С. 81.

8. Манаев A.A., Баранник М.И. Строение подкожно-жировой клетчатки крыс после имплантации полилактида // Фундаментальные проблемы науки: Сборник статей международной научно-практической конференции: Часть 2. - Уфа: РИЦ БашГУ, 2013. - С. 193-196.

9. Майбородин И.В., Кузнецова И.В., Береговой Е.А., Шевела А.И., Майбородина В.И., Манаев A.A., Баранник М.И. Отсутствие полной абсорбции полилакгидного материала в организме II Новости хирургии.

- 2014. - Т. 22, № 1. - С. 24-30.

10. Кузнецова И.В., Майбородин И.В., Шевела А.И., Баранник М.И., Манаев A.A., Бромбин А.И., Майбородина В.И. Реакция окружающих тканей на имплантацию абсорбируемых шовных материалов И Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2014. - Т. 157, № 3. - С. 375-380.

11. Кузнецова И.В., Майбородин И.В., Шевела А.И., Баранник М.И., Манаев A.A., Майбородина В.И. Особенности перифокальных тканевых реакций после имплантации нелизируемых хирургических материалов // Морфология. - 2014. - Т. 145, № 1. - С. 53-59.

Подписано в печать 30.05.2014. Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 23.

Отпечатано в типографии ОАО "НИИ систем" Новосибирск-58, ул. Русская. 39. т. 306-67-39

Соискатель

А.А.Манаев

i QU¿

2014155941