Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Патоморфологический анализ регенерации костной ткани и регионарных лимфатических узлов при имплантации аутологичных мезенхимальных стромальных клеток

9 15-14/232

На правах рукописи

Маслов Роман Владимирович

ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ РЕГЕНЕРАЦИИ КОСТНОЙ ТКАНИ И РЕГИОНАРНЫХ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ ПРИ ИМПЛАНТАЦИИ АУТОЛОГИЧНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК

14.03.02 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 2015

Работа выполнена в ФГБУН Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск) и ГБОУ ВПО Московском государственном медико-стоматологическом институте им. А.И.Евдокимова Минздрава России.

Научные консультанты:

доктор медицинских наук,

профессор Майбородин Игорь Валентинович

кандидат медицинских наук,

доцент Рунова Галина Сергеевна

Официальные оппоненты:

Горчаков Владимир Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией функциональной морфологии лимфатической системы ФГБНУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии (Новосибирск).

Авдалян Ашот Меружанович, доктор медицинских наук, заведующий лабораторией исследований молекулярно-генетических характеристик опухолей ФГБНУ Российского онкологического научного центра имени H.H. Блохина, Алтайский филиал (Барнаул).

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО Алтайский государственный медицинский университет МЗ РФ, кафедра патологической анатомии (Барнаул).

Защита состоится: «_» _ 2015 г. в _ час.

на заседании совета Д 001.037.01 в ФГБНУ Институте молекулярной патологии и патоморфологии по адресу 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБНУ Института молекулярной патологии и патоморфологии http://pathomorphology.soramn.ru

Автореферат разослан «_»

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

2015 г.

Молодых Ольга Павловна

1 Российская ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА венная

iñ1 "отека

ле-

Актуальность темы. Успех восстановительного хирургического1; чения травматических повреждений во многом определяется процессами репаративной регенерации костной ткани пациента. В связи с развитием репаративной биологии и репаративной медицины появилась возможность влияния на процессы заживления, что является важным и актуальным в связи с постоянным увеличением числа больных с травматическими повреждениями и воспалительными заболеваниями челюстпо-лицевой области в настоящее время. Анализ причин неудачного лечения таких больных свидетельствует о том, что пути их преодоления состоят как в усовершенствовании технологии самого хирургического вмешательства, так и в создании оптимальных условий для регенерации костной ткани.

Полигидроксиалканоаты (ПГА) — полимеры гидроксипроизводных алкановых кислот (масляной, валериановой и др.), могут представлять большой интерес для клинической медицины в связи с их механической прочностью, высокой биосовместимостью и медленной биодеградацией (Федоров М.Б. и др., 2007; Волова Т.Г. и др., 2010; Яковлев А.В. и др., 2010; Chen G.Q., Wu Q., 2005). В экспериментах по изучению репарагив-ного остеогенеза было показано, что имплантаты из некоторых ПГА, в частности полигидроксибутират, обладают выраженными направленными остеопластическими свойствами (Шишацкая Е.И. и др., 2008).

Красный костный мозг содержит прогениторные клетки (мезен-химальные стволовые клетки (МСК)), способные к дифференцировке в кость, хрящ, сухожилия и другие виды соединительной ткани. Это позволяет широко применять такие клетки для ускорения регенерации костной ткани (Chanda D. ct al., 2010; Goldschlager Т. et al., 2010; Goepferl C. et al., 2010).

Введение МСК в организм многие исследователи осуществляют на различных носителях, лучше трехмерных, в которых клетки лучше взаимодействуют между собой и могу! обмениваться клеточными сигналами (Granchi D. et al., 2010; Tasso R. el al., 2010; Zippel N. et al., 2010; Burastero G. etal., 2010), ПГА является перспективным материалом для таких матриц.

Степень разработанности темы исследования. В доступной литературе имеется множество данных об эффективности использования клеточных технологий и биодеградируемых полимерных материалов в стоматологии, травматологии и хирургии. Однако, в литературе полностью отсутствуют результаты исследования лимфатических узлов после указанных способов воздействия на репаративную регенерацию, тогда как именно эти органы являются маркером выраженности воспалительного процесса в регионе, по их изменениям можно точно оценивать результативность проведения тех или иных лечебных мероприятий, предсказывать развитие многих осложнений, а, значит, и успешно принимать меры по их профилактике.

Цель исследования. Определить основные этапы репарации костной ткани и реакций лимфоидных фолликулов регионарных лимфатических узлов при имплантации аутологичных мезенхимальных стромальных клеток костномозгового происхождения (АМСККП), адсорбированных на полимерной матрице из 11ГА.

Задачи исследования:

1. Методами световой микроскопии и рентгеновской денситометрии изучить процессы репаративной регенерации участка поврежденной кости нижней челюсти крыс и клеточные реакции лимфоидных фолликулов регионарных (субмандибулярных) лимфатических узлов в различные сроки при естественном заживлении.

2. Определить основные этапы репарации кости нижней челюсти и изменения лимфатических узлов после имплантации ПГА.

3. Исследовать особенности заживления дефекта кости нижней челюсти и реакций лимфатических узлов после использования ПГА с адсорбированными АМСККП с трансфицированным геном вРР.

Научная новизна. Впервые проведено исследование процессов регенерации в участке повреждения кости нижней челюсти и реакций лимфоидных фолликулов регионарных (субмандибулярных) лимфатических узлов крыс после имплантации ПГ А с адсорбированными АМСККП.

Впервые показано, что после применения полимера на основе ПГА в течение всего эксперимента сохранялось неизменным отверстие в кости, где находился сам полимер. Признаков консолидации ПГА с краем дефекта кости ни в одном случае не было. На все сроки наблюдения происходит активное образование костной ткани между краем дефекта и полимером, сам ПГА непосредственно инкапсулируется фиброзной тканью с большим числом клеточных элементов. Свидетельства деградации искусственного материала на все сроки эксперимента отсутствуют. На хронический воспалительный процесс в тканях нижней челюсти, индуцированный присутствием инородного тела - ПГА, лимфатические узлы отвечают гипертрофией лимфоидных фолликулов с центрами размножения, которые становятся больше исходных к 5 неделе после операции.

Впервые получены данные, что на фоне имплантации ПГА с адсорбированными АМСККП на все временные точки отверстие в кости сохранялось неизменным. Внедрение такого полимера приводит к образованию большего числа кровеносных сосудов в грануляциях и соединительной ткани, формирующихся вокруг имплантированного инородного тела. Трансфекцией гена СРР было доказано, что в данном случае АМСККП не мифируют и не разрушаются в месте введения, а формируют кровеносные сосуды за счет дифференцировки в «легки их структур. После внедрения ПГА с адсорбированными АМСККП с трансфицированным геном вРР в лимфоидных фолликулах регионарных лимфатических узлов появляются многочисленные крупные макрофаги с множеством овальных светящихся включений в цитоплазме. По-видимому, введенные таким способом

АМСККП частично поглощаются макрофагами. При разрушении структур, сформированных из АМСККП, детрит также фагоцитируется макрофагами.

Теоретическое и практическое значение работы. Получены новые знания об особенностях регенерации кости нижней челюсти после имплантации АМСККП, адсорбированных на полимерной матрице из ПГА. Применение ПГА и материалов на их основе для ускорения репарации костных тканей нецелесообразно. Имплантация ПГА не только не ускоряет репарацию участка повреждения кости нижней челюсти, но препятствует процессам заживления, в регионарных лимфатических узлах снижается количество иммунокомпетснтных клеток и прогрессирует склеротическая трансформация. Прочность поврежденных тканей после применения Г1ГА не только не восстанавливается, а остается сниженной за счет соединительной ткани между полимером и краем кости. По результатам денситомегрических исследований с получением точных численных данных возможно слежение за процессами регенерации поврежденных костных тканей и определение эффективности воздействия на этот процесс различных методов.

Методология и методы исследования. В работе использованы современные методы сбора и обработки исходной информации. Диссертация основана на результатах сравнительного морфологического исследования процессов заживления участка повреждения кости угла нижней челюсти и состояния субмандибулярпых лимфатических узлов 170 крыс-самцов инбредной линии Wag в разные сроки при заполнении дефекта кости ПГА и ПГА с адсорбированными АМСККП.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Имплантация П1А с адсорбированными АМСККП в искусственно созданный дефект кости нижней челюсти приводит к образованию большого числа кровеносных сосудов в грануляциях и соединительной ткани, формирующихся вокруг имплантированного инородного тела.

2. Трапсфекция гена GFP в АМСККП доказывает, что они не мигрируют и не разрушаются в месте введения, а формируют кровеносные сосуды за счет дифференцировки в клетки их структур.

3. Со временем АМСККП с трансфицированным геном GFP, доставленные в ткани на полимерной матрице из ПГА, а также структуры, сформированные из этих клеток, фагоцитируются макрофагами, которые затем оказываются в герминативных центрах лимфоидных фолликулов регионарных лимфатических узлов.

Апробация материалов диссертации. Все использованные методические приемы и способы статистической обработки соответствуют поставленным цели и задачам и позволяют получить достоверные и доступные анализу результаты. Диссертация выполнена на достаточном экспериментальном материале с использованием сертифицированного оборудования, современных высокоинформативных методов исследования и анализа результатов. Сформулированные научные положения, выводы

и практические рекомендации основаны на результатах собственных исследований, не носят характера умозрительных заключений и вытекают из результатов работы.

Основные положения диссертации доложены на 8-й межрегиональной конференции, посвященной памяти акад. РАМН проф. Л.В. Полуэктова, «Актуальные проблемы хирургии» (Омск, 2014), 7-м Санкт-Петербургском венозном форуме «Актуальные вопросы флебологии» (Санкт-Петербург, 2014) и на заседании научного персонала лабораторий стволовой клетки, восстановительной медицины и персонализованной медицины Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск, 2015).

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты диссертационной работы внедрены в научно-исследовательскую работу «Центра новых медицинских технологий» Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 7 печатных работ, из них 4 - в ведущих научных изданиях, рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертационных исследований.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, собственных результатов, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 185 страницах компьютерного текста, содержит 6 таблиц, иллюстрирована 42 многокомпонентными комбинированными рисунками. Список литературы включает 378 источников (87 отечественных и 291 иностранных). Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа основана на результатах сравнительного морфологического исследования процессов заживления участка повреждения кости угла нижней челюсти и состояния субмандибулярных лимфатических узлов крыс-самцов инбредной линии Wag в разные сроки при различных способах воздействия на репаративный процесс. Все манипуляции с животными осуществляли под эфирным наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Биодеградируемый ПГА (сополимер из 85% полигидроксибутирата и 15% гидроксивалериага) в виде матриксов холодного прессования (авторское название) диаметром и высотой 2 мм был предоставлен для исследования Институтом биофизики СО РАН (г. Красноярск). Стерилизацию ПГА проводили автоклавированием вместе с хирургическим инструментарием.

АМСККП выделяли, культивировали и трансфицировали ДНК плазми-ды pEGFP-N 1 в соответствии с литературными рекомендациями (Майбо-

родин И.В. и др., 2010, 2011; Maiborodin I. et al., 2011). Непосредственно перед имплантацией проводили пассивную адсорбцию АМСККП из взвеси в культуральной среде на полимерные матриксы из ПГА в течение 4 часов.

Модель дефекта костной ткани в эксперименте: Под общим ингаляционным эфирным наркозом, в условиях чистой операционной, при соблюдении правил асептики и антисептики, после обработки кожи спиртом, скальпелем производили разрез кожи длиной 1,5-2 см по нижнему краю нижней челюсти. Тупым способом при помощи распатора отслаивали жевательную мышцу и обнажали поверхность кости нижней челюсти в области ее угла. Стоматологическим бором делали круглое отверстие диаметром 2 мм в кости угла нижней челюсти, с полостью рта дефект кости не сообщался. Затем послойно ушивали рану викрилом. Животных выводили из эксперимента передозировкой эфирного наркоза через 1, 2, 3, 4 и 5 недель после создания дефекта кости нижней челюсти.

Животные были разделены на 5 групп, в зависимости от хода регенерации участка поврежденной кости нижней челюсти:

1. Интактные - 12 животных.

2. Естественное течение репаративного процесса - 58 крыс.

3. Регенерация поврежденных тканей нижней челюсти на фоне имплантации в участок повреждения ПГА - 50 животных.

4. Заживление костной ткани после внедрения в дефект ПГА с адсорбированными АМСККП - 50 крыс.

Фрагменты нижней челюсти и субмандибулярные лимфатические узлы фиксировали в 4 % растворе параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) не менее 24 часов.

Для оценки результатов методом рентгеновской денситометрии использовали фиксированные и препарированные фрагменты нижней челюсти крыс с удаленной кожей, подкожной клетчаткой и жевательными мышцами. В компьютере радиовизиографа «Heliodont+» (Негопа, Germany, 2010) установлена программа «Tomodent» (Anvisystem, Россия) по исследованию плотности костной ткани, которая представлена в условных единицах: отношение полученных данных плотности кости в участке повреждения к результатам исследования аналогичных неповрежденных участков на контрлатеральной стороне.

После чего фрагменты нижней челюсти декальцинировали в растворе «Биодек R» (Bio Optica Milano, Италия) в течение 24 часов. Далее весь материал обезвоживали в серии этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в гистопласт. Срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и по Романовскому, изучали на световом микроскопе Axioimager Ml (Zeiss, Германия) при увеличении до 1500 раз. Также исследовали неокрашенные срезы в режиме люминесценции светового микроскопа Axioimager Ml с фильтром Alcxa 488.

Для исследования структурной организации субмандибулярных лимфатических узлов и подсчета клеточных элементов в их лимфоид-

ных узелках применяли квадратную тестовую систему, совмещаемую на экране компьютера с изображением, нолученным при помощи цифровой видеокамеры микроскопа. Для изучения показателей структуры лимфоидных фолликулов (использование объектива с увеличением X 5) конечная площадь тестового квадрата была равна 16900 мкм2 (сторона квадрата 130 мкм), при подсчете цитограммы клеток (применение объектива с увеличением X 40) - 256 мкм2 (сторона квадрата 16 мкм). Статистическую обработку результатов проводили на прикладной статистической программе MS Excel (Microsoft, USA), определяли среднее арифметическое и стандартное отклонение. Различия между средними считали достоверными при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Регенерация дефекта кости нижней челюсти после применения полигидроксиалканоата с адсорбированными стромальными клетками

Участок повреждения кости нижней челюсти в условиях естественной регенерации. Через 1 неделю после повреждения кости нижней челюсти при спонтанной регенерации было найдено, что отверстие частично заполнено кровью, на некоторых участках в дефекте кости уже присутствовали фраг менты рыхлой волокнистой соединительной ткани и грануляции. Следует отметить начало образования кости в дефекте (формирование отдельных островков молодой кости и хряща среди грануляций). Кроме того, было найдено присутствие нежизнеспособных фрагментов костной ткани, скорее всего, образованных при создании дефекта (опилки). Вокруг этих фрагментов были расположены макрофаги и многоядерные клетки, видимо, остеокласты или гигантские клетки инородных тел, сформированные для лизиса крупных фрагментов нежизнеспособных тканей.

Через 2 недели после создания дефекта кости нижней челюсти отверстие было полностью закрыто слившимися островками молодой костной ткани с большим числом полнокровных кровеносных сосудов по краю дефекта. Среди вновь образованных структур иногда присутствовала хрящевая ткань, особенно в центре искусственного отверстия.

На 3 неделе после повреждения кости нижней челюсти отверстие было полностью закрыто вновь образованной молодой костной тканью. О месте операции можно было судить по оставшимся крупным сосудам и хаотично расположенным костным балкам (костная мозоль). К этому моменту появились полностью сформированные полости с костным мозгом. Иногда кость в дефекте практически не отличалась от окружающей ткани, только расположенные в некоторых участках структуры костной мозоли позволяли найти место хирургического вмешательства.

Через 4-5 недель в большинстве случаев самостоятельного заживления только по следам костной мозоли можно было найти место операции.

Участок повреждения кости нижней челюсти после имплантации полигидроксиалканоата. Следует отметить, что практически во всех наблюдениях матрикс из ПГА сохранялся в дефекте кости нижней челюсти без изменений и выпадал из отверстия во время подготовки материала (удаление жевательных мышц после фиксирования формалином) к изучению методами морфологического и рентгенологического анализа. Это было отмечено, несмотря на многочисленные литературные данные о биодеградируемости и биосовместимости полимерных материалов на основе ПГА (Шишацкая Е.И. и др., 2008, 2009; Босхомджиев А.П., 2010; Freier Т. et al., 2002).

После применения матриксов из биодеградируемого полимера па основе ПГА через 1 неделю отмечено активное образование островков костной ткани между краем дефекта и матриксом. Сам матрикс на этот срок был окружен фиброзной тканью с большим числом клеточных элементов (фиброциты, фибробласты и макрофаги). Свидетельств деградации искусственного материала на этот срок не получено, также не обнаружено признаков формирования гигантских клеток инородных гсл (гранулема-тозной воспалительной реакции) по краю матрикса.

Спустя 2 недели матрикс был окружен тонкой фиброзной капсулой с большим числом макрофагов, далее между стенкой отверстия в кости и этой капсулой располагалась молодая костная ткань. Спустя 3 недели после введения ПГА между капсулой и самим краем дефекта была расположена молодая костная ткань с большим числом кровеносных сосудов и формированием полостей со структурами красного костного мозга. Можно отметить формирование грубой костной мозоли с хаотичным расположением структур кости, по-видимому, обусловленное длительным раздражением или постоянным разрушением и восстановлением костной ткани но краю инородного тела.

Через 4 недели после использования ПГА отверстие по краю было окружено молодой костной тканью с сосудами, далее следовала фиброзная ткань с большим числом макрофагов, по месту границы фиброзной и костной тканей было расположено множество очень широких полнокровных кровеносных сосудов. Через 5 недель после использования матриксов, как и па все предыдущие сроки, сохранялось отверстие в кости. 11о краю костного дефекга развивалась молодая костная ткань, между ней и матриксом присутствовала тонкая фиброзная капсула с макрофагальной инфильтрацией.

Участок повреждения кости нижней челюсти после применения полигидроксиалканоата с адсорбированными стромальпыми клетками. На все сроки наблюдения после применения полимерного матрикса с адсорбированными АМСККП не было найдено значительных отличий от результатов исследования использования самого полимера без клеток. В данной группе в качестве эффекта применения АМСККП можно от-

метить только большее число кровеносных сосудов в непосредственно окружающих полимер тканях, более позднее формирование фиброзной ткани вокруг инородного тела и меньшую степень клеточной инфильтрации этой ткани.

Результаты применения стромальных клеток с трансфициро-ванным геном СГР. Для точной идентификации введенных АМСККП и структур, сформированных из них, в эксперименте были использованы стромальные клетки с трансфицированным геном ОРР. При исследовании неокрашенных срезов тканей вокруг ПГА с АМСККП в отраженном ультрафиолетовом свете через 1 неделю после имплантации были найдены единичные клетки с ярко светящейся цитоплазмой и темным ядром. Иногда присутствовали цепочки из ярко светящихся клеток. Спустя 2 недели на неокрашенных срезах тканей вокруг полимерных пленок присутствовали большие группы светящихся клеток и кольцевые структуры, сформированные из них. На 3 неделе были найдены уже полностью сформированные сосуды со светящимися оболочками. В некоторых случаях такие сосуды были извиты, что может свидетельствовать об их варикозном изменении (нарушение оттока или блокада в результате хронического воспаления). На следующие даты число специфически светящихся объектов значительно уменьшилось, только в стенке некоторых кровеносных сосудов было отмечено слабое свечение, практически на уровне фона.

Радиовизиографическое исследование репаратнвных процессов в участке повреждения кости нижней челюсти. При естественном заживлении плотность кости в участке повреждения была меньше соответствующе!« здорового участка на контрлатеральной стороне на 1, 2, 3 и 5 неделях па 12,1%, 11%, 10,5% и 9,3%, соответственно. На срок в 4 недели достоверных отличий с другой стороной не было. То есть при естественном ходе репаративной регенерации происходит медленное и постепенное возрастание платности костной ткани в участке повреждения, но даже к концу наблюдения (5 недель) не произошло нормализации плотности ткани в дефекте.

В результате денситометрии участка повреждения кости нижней челюсти после заполнения его матриксом из ПГА было найдено, что плотность тканей в дефекте практически всегда (за исключением срока в 4 недели) была статистически достоверно меньше, относительно состояния интактной кости: эта разница составляла 11,9%, 8,9%, 8,6% и 2,5%, соответственно, через I, 2, 3 и 5 недель после операции.

После заполнения дефекта кости нижней челюсти матриксом из ПГА с адсорбированными АМСККП было обнаружено, что плотность тканей в участке повреждения уже на все сроки эксперимента была статистически достоверно меньше, относительно состояния интактной кости на 7,29%, 6,7%, 9,9%, 14,3% и 8%, соответственно, через 1, 2, 3, 4 и 5 недель после операции. Достоверных отличий плотности костной ткани между применением ПГА и полимера с АМСККП обнаружено не было.

Состояние субмандибулярных лимфатических узлов после имплантации в дефект кости нижней челюсти полигидроксиалканоата с адсорбированными стромальными клетками

Результаты применения стромальных клеток с геном GFP: данные люминисцентной микроскопии. Через 1 неделю после имплантации ПГА с адсорбированными АМСККП в дефект кости нижней челюсти в регионарных (субмандибулярных) лимфатических узлах были найдены овальные скопления ярко светящихся клеток. Эти клетки были очень крупными (до 20 мкм в диаметре) и располагались в лимфоидных фолликулах. В месте применения АМСККГТ с трансфицированным геном GFP их цитоплазма светилась более-менее равномерно, и в ряде случаев можно было проследить темное ядро. В лимфатических узлах в светящихся клетках светилась не вся цитоплазма, а разные по размерам овальные гранулы, то есть клетка представляла собой скопление ярко светящихся частиц с четкими ровными краями. Размер этих гранул достигал 10 мкм. Иногда было видно темное овальное ядро.

Спустя 2 недели после применения ПГА с АМСККП для воздействия на репарацию поврежденной нижней челюсти в лимфатических узлах количество крупных специфически светящихся клеток увеличилось. Причем увеличилось как число овальных скоплений таких объектов, так и число клеток в них. По-прежнему в таких клетках светилась не вся цитоплазма, а множество различных по размерам гранул.

К следующему сроку наблюдения, к 3-й неделе, площадь скоплений крупных светящихся клеток значительно уменьшилась, также сократилось и количество клеток в них. Этот процесс сокращения размеров скоплений светящихся клеток и числа самих объектов со свечением в них прогрессировал и на 4-й и 5-й неделях. К этому времени можно отметить не равномерное расположение крупных светящихся клеток в лимфоидных фолликулах, а выстраивание светящихся объектов по периферии узелков. Также следует отмстить постепенное уменьшение количества светящихся гранул в указанных крупных клетках.

В лимфатических узлах животных после применения ПГА без АМСККП светящиеся объекты отсутствовали как по одиночке, так и скоплениями, как в лимфоидных фолликулах, так и в других структурах данных органов. Иногда были видны единичные небольшие светящиеся объекты (клетки), но э то были эритроциты во внутриузловых сосудах, об аутофлуоресценции красных клеток крови в литературе имеется множество публикаций (Wu X . et al., 2010; Campo J.J . el al., 2011; Watson J., 2011).

Изменения центров размножения лимфоидных фолликулов при естественной регенерации. При естественной регенерации в фолликулах с центрами размножения субмандибулярных лимфатических узлов площадь самих герминативных центров через I педелю была ниже в 2,2 раза, по сравнению с данными на 5-й неделе.

Содержание иммуно- и плазмобластов резко возросло к 1 -й неделе, затем оставалось на высоком уровне до 4-й недели и далее (на 4-й и 5-й неделях) достоверно не отличалось от исходного. Значение этого показателя через 1 неделю было на 51% и 37,6% больше, соответственно, чем в контроле и спустя 5 недель. На 2 неделе бластов было больше на 66,5%, 31,4% и 51,8%, соответственно, относительно контроля и состояния на 4-й и 5-й неделе. К 3-й неделе незрелых клеточных форм было больше на 51,9% и 38,5%, соответственно, по сравнению с контролем и с состоянием на 5-й неделе.

Количество макрофагов увеличилось к 1 -й неделе и оставалось повышенным в течение всего времени наблюдения. Этот показатель у интакт-ных животных был меньше на 95,4%, в 2,3, 2,1 раза, на 63,5% и 63,5%, соответственно, по сравнению с состоянием через 1, 2, 3, 4 и 5 недель.

Митотическая активность была выше контроля на 1 -й и 2-й неделе на 87,3% и 93,6%, соответственно, потом этот показатель постепенно снижался и достоверно не отличался от исходного.

Число фигур митозов на 105 мкм2 площади среза центра фолликула через 1 неделю было в 2,3, 2,2 и 2,2 раза выше, соответственно, чем в контроле и спустя 4 и 5 недель. На 2-й неделе делящихся клеток было больше в 2,2, 2,1 и 2,1 раза, соответственно, относительно контроля и состояния на 4-й и 5-й неделе.

Содержание клеток с признаками деструктивных изменений резко увеличилось к 1-й неделе, далее этот показатель постепенно уменьшался и на 3-й неделе и позже достоверно не отличался от исходного. Значение этого показателя через 1 неделю было в 2,9 раза выше, чем в контроле. На 2-й неделе нежизнеспособных клеток было больше в 3,1 и 2,2 раза, соответственно, относительно контроля и состояния на 5-й неделе.

Изменения центров размножения лимфоидных фолликулов при внедрении полигидроксиалканоата. После имплантации ИГА в дефект кости нижней челюсти площадь центров размножения в узелках со светлыми центрами в регионарных лимфатических узлах на 5-й неделе после операции стала больше па 66,8% и в 2,1 раза, соответственно, относительно интактных животных и состояния через 2 недели после применения ПГА.

Содержание иммуно- и плазмобластов резко возросло к 1-й неделе, затем постепенно снижалось и достоверно не отличалось от исходного. Значение этого показателя через 1 неделю было на 58,7%, 30,8%, в 2 и 2,5 раза больше, соответственно, чем в контроле, на 3, 4 и 5 неделях. При этом на 2-й неделе бластов также было больше на 63,1%, 34,4%, в 2,1 и 2,5 раза, соответственно, по сравнению с состоянием в контроле, на 3-й, 4-й и 5-й неделях. Кроме того, спустя 3 недели таких клеток было на 56,3% и 88% больше, соответственно, относительно их содержания спустя 4 и 5 недель. К 5-й неделе значение этого показателя стало уже на 54,9% меньше, чем у интактных животных.

Через 1 неделю ретикулярных клеток было на 53,7%, 29,5%, в 2 и 2,2 раза меньше, соответственно, чем в контроле, на 3-й, 4-й и 5-й неделях.

Спустя 2 недели клеток стромы было меньше на 44,6%, 92,1% и в 2 раза, соответственно, относительно состояния в контроле, на 4-й и 5-й неделях. К 3-й неделе число данных клеточных элементов было на 57,7% и 66,7% меньше, соответственно, чем на 4-й и 5-й неделях. Следует отметить, что на 4-й и 5-й неделях число ретикулярных клеток было на 32,9% и 40,4% выше, соответственно, чем в контроле.

Показатели относительного и абсолютного содержания моноцитов на 4-й, 5-й неделях превышали исходные значения в 4,5, 4,2 раза и в 5,3, 5,1 раза, соответственно.

Макрофагов во все сроки эксперимента было больше, чем в контроле. Через 1, 2, 3, 4 и 5 недель значение этого показателя было на 77,1 %, в 2,1, 2,3, 2,5 и 2,7 раза, соответственно, больше, чем в контроле. Кроме того, на 5-й неделе макрофагов было на 51,2% больше, чем на 1 -й неделе.

Число фигур митозов было высоким на 1 -й и 2-й неделе, потом этот показатель постепенно снижался и достоверно не отличался от исходного. Значение этого показателя через 1 неделю было на 96,6%, в 2,1, 4,2 и 4,5 раза, соответственно, больше, чем в контроле и спустя 3, 4 и 5 недель. На 2-й неделе фигур митозов было больше на 99,6%, в 2,1, 4,3 и 4,6 раза, соответственно, относительно состояния в контроле, на 3-й, 4-й и 5-й неделях. Кроме того, через 5 недель делящихся клеток было в 2,1 раза меньше, чем на 3-й неделе.

Содержание клеток с признаками деструктивных изменений резко возросло к 1-й неделе, далее этот показатель всегда был выше исходного. Через 1, 2, 3, 4 и 5 недель число таких клеточных элементов в 2,4, 2,5, 3, 3,2 и 3,3 раза, соответственно, превосходило контрольный уровень.

Изменения центров размножения лимфоидных фолликулов при имплантации полигидроксиалканоата с адсорбированными стро-мальными клетками. На фоне применения ПГА с адсорбированными АМСККП для влияния на регенерацию поврежденной кости нижней челюсти площадь герминативных центров в узелках со светлыми центрами в регионарных лимфатических узлах на 5-й неделе после операции стала больше на 80%, в 2,3 раза и на 93,1%, соответственно, относительно ин-тактных животных и состояния через 1 и 2 недели после операции.

Иммуно- и плазмобластов через 1 неделю было на 60,7%, 30,8%, в 2 и 2,4 раза больше, соответственно, чем в контроле, на 3-й, 4-й и 5-й неделях. На 2-й неделе бластов также было больше - на 64,6%, 34%, в 2,1 и 2,5 раза, соответственно, по сравнению с состоянием в контроле, на 3-й, 4-й и 5-й неделях. Кроме того, спустя 3 недели таких клеток было на 53,3% и 83,3% больше, соответственно, относительно содержания спустя 4 и 5 недель.

Через 1 неделю процент ретикулярных клеток был на 51%, в 2 и 2,2 раза меньше, соответственно, чем в контроле, на 4-й и 5-й неделях. Спустя 2 недели клеток стромы было меньше на 40,4%, 90,4% и в 2 раза, соответственно, относительно состояния в контроле, на 4-й и 5-й неделях. К 3-й неделе число данных клеточных элементов также было меньше - на

59,7% и 71,8%, соответственно, по сравнению с состоянием на 4-й и 5-й неделях. Следует отметить, что на 4-й и 5-й неделях число ретикулярных клеток было на 35,6% и 45,9%, соответственно, выше, чем в контроле.

Макрофагов во все сроки эксперимента было больше, чем в контроле. Через 1, 2, 3, 4 и 5 недель значение этого показателя превышало контрольные данные на 95,4%, в 2,2, 2,5, 2,6 и 2,8 раза, соответственно. Кроме того, на 5-й неделе макрофагов было на 43,7% больше, чем на 1-й неделе после операции. Число макрофагов на единицу площади среза на 2-й, 3-й, 4-й и 5-й неделях было в 2,2, 2,6, 3 и 3,3 раза, соответственно, больше, чем в контроле.

Содержание фигур митозов через 1 и 2 недели было в 2,1, 2, 3,4 и 3,7 раза больше, соответственно, чем в контроле и спустя 3, 4 и 5 недель.

Относительное содержание клеток с признаками деструктивных изменений через 1, 2, 3, 4 и 5 недель в 2,6, 2,6, 3,1, 3,5 и 3,5 раза, соответственно, превосходило контрольный уровень.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

В литературе имеются свидетельства о лизисе ПГА и активном формировании костной ткани на месте его внедрения в участки повреждения различных костей (Шишаикая Е.И. и др.. 2008).

В острых и хронических экспериментах на лабораторных животных было показано, что биодеградация ПГА зависит ог химической структуры полимера, от места имплантации и формы изделия, происходит медленно гуморальным и клеточным путями, главным образом с поверхности изделия, без образования локальных дефектов и резкого снижения прочности. В биодеградации Г1 ГА принимают участие макрофаги и гигантские клетки инородных тел с высокой активностью кислой фосфатазы, коррелирующей с активностью фермента в сыворотке крови животных. Основной мишенью для полимерных частиц являются ткани печени, а также почек и селезенки. Наиболее активное разрушение микрочастиц полимерного матрикса происходит в селезенке и печени. ПГА пригодны к использованию от нескольких месяцев до года, не вызывают воспалительных, некротических, склеротических или иных негативных реакций в окружающих тканях и не препятствуют репарации in vivo, что особенно ценно для хирургических нитей, эндопротезов и остеоимплантатов (Шишацкая Е.И. и др., 2008, 2009; Босхомджиев A.M., 2010; Freier Т. et al., 2002). В экспериментах по изучению репаративного остеогенсза было показано, что имплантаты из некоторых ГН А, в, частности, полигидроксибутират, обладают выраженными направленными остеопластическими свойствами (Шишацкая Е.И. и др., 2008).

Однако, несмотря на многочисленные литературные данные о биоде-градируемости и биосовместимости полимеров из ПГА (Шишацкая Е.И. и др., 2008,2009; Босхомджиев А.Г1., 2010; Freier Т. et al., 2002), свидетельств

деградации матриксов не было найдено как в случае применения чистого ПГА, так и после имплантации ПГА с адсорбированными АМСККП, следует повторить, что под наблюдением находилось 170 животных.

В данном эксперименте после применения ПГА на все точки наблюдения сохранялось неизменным отверстие в кости, где находился сам матрикс. Матрикс оставался в дефекте кости нижней челюсти без изменений и выпадал из отверстия во время подготовки материала (удаление жевательных мышц после фиксирования формалином) к изучению методами морфологического и рентгенологического анализа. Признаков консолидации полимера с краем дефекта костной ткани ни в одном случае не было. По результатам денситометрии дефекта кости нижней челюсти крыс после применения ПГА с АМСККП и без них было обнаружено, что плотность тканей в участке повреждения практически на все сроки наблюдения была постоянно достоверно меньше, чем на интактных участках кости на контрлатеральной стороне.

То есть полимер из ПГА при внедрении в участок повреждения кости нижней челюсти не деградирует, не встраивается в молодую костную ткань и не консолидируется к окружающим участкам поврежденной кости. Этот полимер в костной ткани ведет себя не как биодеградируемая субстанция, а как биологически инертное вещество. В результате проведенных экспериментов получены данные не о влиянии ПГА на репаративный процесс, а об особенностях регенерации костной ткани и реакций рег ионарных лимфатических узлов в условиях внедрения в участок повреждения биологически инертного инородного тела.

После имплантации ПГА между краем дефекта и полимером также сначала формируется кровяной сгусток, который потом замещается грануляциями, молодой костной тканью и, далее, костной мозолью. Однако в дефекте присутствует инородное тело - ПГА, которое не только не деградирует, но и не консолидируется с окружающей костной тканыо в участке повреждения.

Начиная с 3 недель, по краю костного дефекта начинается формирование грубой костной мозоли с хаотичным расположением структур кости, видимо, обусловленное длительным раздражением или постоянным разрушением и восстановлением костной ткани по краю участка повреждения. Возможно, что такое разрушение и восстановление костной ткани обусловлено смещением, даже небольшом, полимера при жевании, тем более, что крысы, в основном, употребляют твердую пищу.

Процесс имплантации и процесс интеграции матрикса из ПГА в организм сопровождается воспалением, обусловленным альтерацией и репарацией тканей и формированием соединительнотканной капсулы, что, в свою очередь, приводит к развитию и инволюции грануляционной ткани. Грануляции характеризуются наличием большого числа кровеносных сосудов, которые развиваются как вследствие разрастания уже существующих сосудов, так и роста новых, обусловленных миграцией клеток-предше-

ственников эндотелиоцитов и перицитов, имеющих костномозговое происхождение (Майбородин И.В. и др., 2010,2011; Ма1Ьогос1т I. е1 а1., 2011).

При исследовании неокрашенных срезов тканей вокруг ПГА с АМСКК11 в отраженном ультрафиолетовом свете через 1 неделю после имплантации были найдены единичные клетки с ярко светящейся цитоплазмой и темным ядром. Иногда присутствовали цепочки из ярко светящихся клеток. Спустя 2 недели на неокрашенных срезах тканей вокруг полимерных пленок присутствовали большие группы светящихся клеток и кольцевые структуры, сформированные из них. На 3-й неделе были найдены уже полностью сформированные сосуды со светящимися оболочками

Доказательством того, что сосуды в грануляциях были сформированы именно в результате введения АМСККП и из них, является свечение стенки этих сосудов. Ген ОЯР, введенный в ДНК АМСККП, неизменным передается дочерним клеткам и клеткам следующих поколений. Эти клетки и структуры, сформированные из них, точно также светятся в отраженном ультрафиолетовом свете. В случае имплантации ПГА без клеток объекты с ярким свечением в окружающих тканях отсутствуют.

Свечение оболочек сосудов, обнаруженное в наших исследованиях, указывает на то, что именно введенные АМСККП прямо, а не опосредованно (через цитокины или другие клеточные сигналы), участвуют в формировании сосудов, возможно, из-за присутствия мультипотентных клеток, уже стимулированных к дифференцировке в эндотелиоцитарном или перицитарном направлениях. Также не исключено, что гипоксия тканей в результате воспаления стимулирует дифференцирование введенных АМСККП в эндотелиоциты (Маг1т-Яеп(1оп Е. е1 а1., 2007; Ни X. е1 а1„ 2008).

Кроме этого, присутствие в стенке сосудов очень ярких светящихся объектов указывает, что в данном случае введенные АМСККП, не мигрируют из места имплантации, не разрушаются и не служат только «строительным материалом» или «сигналом» к началу ангиогенсза для собственных клеток организма-донора.

По-видимому, имплантация ПГА с АМСККП ускоряет процесс ангиогенсза при развитии грануляций за счет привнесения в место повреждения тканей (операция и процессы отграничения инородного тела) клеточных элементов, способных к дифференцировке в любом, в том числе эндотелиоцитарном и перицитарном, направлениях. Не исключено, что нарушения микроциркуляции при воспалении (прямое повреждение сосудов, пережатие сосудов инородным телом, отек, тромбозы и пр.) и соответствующая гипоксия вызывают направленную дифференцировку введенных АМСККП в направлении клеток-предшественников эндотелиоцитов и перицитов (Маг1т-К.еп(1оп Е. сЛ а1., 2007; Ни X. е1 а!., 2008). Таким образом экономится время на миграцию собственных стволовых клеток. А ускорение роста сосудов приводит к улучшению оксигенации поврежденных тканей и способствует миграции лейкоцитов в участок воспаления для более быстрого и успешного лизиса тканевог о и клеточного детрита.

Возможно, что в случае острой воспалительной реакции с небольшим объемом поврежденной ткани применение АМСККП и связанные с этим ангиогенез и быстрое развитие грануляций приведет к более быстрому очищению тканей от детрита. Однако в случае имплантации синтетических биоинертных материалов (согласно нашим результатам и данным литературы, материалы из ПГА являются именно такими (Майбородин И.В. и др., 2010-2012) активное формирование сосудов рядом с полимером приводит к большему объему грануляций (сосудов в них).

После индукции воспалительного процесса созданием отверстия в кости нижней челюсти и при естественном течении регенерации в субман-дибулярных лимфатических узлах в фолликулах с центрами расширяется мантийная зона и уменьшаются герминативные центры. Однако значения этих показателей нормализуются ко 2-й неделе и затем остаются на уровне контроля до конца времени наблюдения.

Скорее всего, поступление антигенов из места операции и создания искусственного костного дефекта приводит к пролиферации В-лимфоцитов коркового плато. Кроме пролиферации в этих клетках стимулируется дифференцировка. Активно делящиеся и созревающие лимфоциты формируют лимфоидные фолликулы без герминативных центров. Далее в таких узелках, по мере дифференцировки клеток, образуются светлые центры.

При микроциркуляторных расстройствах блокируется не только микроциркуляции крови, но и лимфоток. Острый и хронический воспалительный процесс затрагивает, в первую очередь, лимфатическую систему, которая и осуществляет дренаж посторонних чужеродных и антигенных веществ из патологического очага (Жданов Д. А., 1952; Буянов В.М., Алексеев A.A., 1990; Бородин Ю.И. и др., 1995 - 1997; Foldi М., 1969; Caslev-Smith J.R., 1973; Guyton A.C. et al., 1975).

По мере разрешения лимфостаза сначала в лимфатические сосуды, а затем в регионарные лимфатические узлы, в данном случае - субманди-булярные, поступает большой объем детрита, антигенов и иммунокомпе-тентных клеток. Эти антигенные вещества стимулируют образование и гипертрофию лимфоидных фолликулов.

В центрах размножения лимфатических узлов крыс с естественным протеканием репаративных процессов на 1-2-й неделях возросло число иммуно- и плазмобластов, делящихся клеток и клеточных элементов с признаками деструктивных изменений. Кроме того, в течение всего периода наблюдения было повышено содержание макрофагов.

Поступление антигенов из разрушенных в результате хирургического вмешательства тканей вызывает пролиферацию и дифференцировку B-клеток герминативных центров, из-за этого в данной зоне возрастает число фигур митозов и содержание незрелых клеточных элементов - им-мунобластов и плазмобластов.

В данном случае мы связываем увеличение численности клеток с признаками деструкции, во-первых, с активацией собственных лизосом

в результате возрастания миготической активности и стимуляции диф-ференцировки лимфоцитов, иммуно- и плазмобластов. Во-вторых, также не исключено, что на процессе увеличения числа клеток с необратимыми изменениями сказывается и возрастание прямого воздействия антигенных и токсических веществ из места воспалительной реакции.

Подъем числа макрофагов, по-видимому, обусловлен или необходимостью лизиса детрита, поступающего из места хирургического вмешательства, или образованием и присутствием большого числа клеток с явлениями деструкции.

Постепенно, по мере регенерации тканей в ране, объем антигенов, поступающих в лимфатические узлы, снижается. За счет этого в лимфоидных узелках нормализуется численность вышеуказанных клеточных элементов.

В лимфоидных фолликулах субмандибулярных лимфатических узлов после применения ПГА для воздействия на репарационный процесс в конце срока наблюдения (к 4-5-й неделям) после операции было больше рет икулярных клеток, макрофагов и клеток с явлениями деструкции, относительно аналогичных сроков спонтанного заживления.

Такие изменения цитограммы подтверждают данные о длительном хроническом воспалении в регионе лимфосбора. При естественной репарации быстро уменьшается объем антигенных и токсических веществ, поступающих в лимфатические узлы, и постепенно изменения цитограммы нормализуются. После применения ПГА воспалительный процесс вследствие имплантации инородного тела идет длительное время, и изменения клеточного состава сохраняются все это время или даже прогрессируют.

Для элиминации антигенов в лимфатические узлы мигрируют моноциты и дифференцируются в макрофаги, и поэтому число указанных клеточных элементов остается повышенным длительное время. Большое количество клеток с явлениями деструкции также свидетельствует о продолжающейся антигенной стимуляции и токсическом воздействии на лимфатические узлы.

Отличия между состоянием центров размножения субмандибулярных лимфатических узлов после имплантации в участок повреждения кости нижней челюсти чистого ПГА или ПГА с АМСККП не найдены. Если применение АМСККП и вызывает какие-либо изменения в центрах размножения лимфоидных фолликулов, то такие изменения маскируются изменениями, которые обусловлены присутствием в дефекте кости нижней челюсти инородного тела - ПГА, способствующего инициации и поддержанию хронической воспалительной реакции (Майбородин И.В. и др., 2010 - 2012).

Через I неделю после имплантации ПГА с адсорбированными АМСККП с трансфицированным геном СЕР в дефект кости нижней челюсти в субмандибулярных лимфатических узлах присутствовали овальные скопления ярко светящихся крупных (до 20 мкм в диаметре) клеток.

В лимфатических узлах в светящихся клетках светилась не вся цитоплазма, а разные по размерам овальные гранулы, то есть клетка представ-

ляла собой скопление ярко светящихся частиц с четкими ровными краями. Размер этих гранул достигал 10 мкм. Кроме того, в узлах светящиеся клетки никогда не выстраивались в цепочки и не формировали замкнутых кольцеобразных структур, даже отдаленно похожих на сосуды.

Такие клетки со свечением располагались в лимфоидных фолликулах, в пользу чего свидетельствует то, что на некоторых препаратах четко видны различия в плотности тканей между скоплениями светящихся клеток и вокруг них и то, что такие скопления имеют шаровидную форму и расположены только в корковом веществе недалеко от капсулы, то есть в корковом плато, а не в паракортексе и не среди мозговых синусов в мякотных тяжах.

Скорее всего, светящиеся клетки в лимфатических узлах являются макрофагами. Такое заключение сделано на основании нескольких причин:

1. Размер клеток. Только очень немногие клетки могут превышать по размеру 20 мкм, и среди таких клеточных элементов - макрофаги.

2. Наличие множества разнокалиберных включений, которые, скорее всего, являются лизосомами.

3. Неправильная форма клеток.

4. Расположение в лимфатических узлах. Выше уже было отмечено, что в лимфатических узлах макрофагов очень много в герминативных центрах лимфоидных фолликулов, куда они представляют антигены для осуществления иммунных функций и где они фагоцитируют и лизируюг клетки с признаками деструктивных изменений, множество которых образуется при делении и дифференцировке B-лимфоцитов. Кроме того, при исследовании цитограммы лимфоидных узелков было обнаружено, что уже через I неделю после имплантации ПГА с адсорбированными АМСККП количество макрофагов значительно превышало исходный уровень.

Наиболее вероятно, что светящиеся разнокалиберные гранулы в макрофагах являют ся лизосомами с поглощенным флуоресцентным материалом.

Существует множество данных об аутофлуоресценции макрофагов в некоторых условиях (Mitchell A.J. et al., 2010; Li F. et al., 2012; Duan M. et al., 2012). Но в таком случае должна быть точно такая флуоресценция макрофагов в лимфатических узлах животных после применения ПГА без АМСККП. Однако, в широком поле зрения были видны только единичные небольшие светящиеся объекты (клетки), но это были эритроциты во внутриузловых сосудах, об аутофлуоресценции красных клеток крови в литературе также имеется множество публикаций (Wu X. et al., 2010; Campo J.J. et al., 2011; Watson J.. 2011).

Можно сделать предположение, что такие крупные светящиеся клетки в лимфатических узлах являются не просто макрофагами, а макрофагами, которые фагоцитировали введенные АМСККП или структуры, сформированные из таких клеток. В научной литературе имеются результаты исследований, указывающие на возможность флуоресценции макрофагов за счет свечения фагоцитированного и метаболизированного материала

в их гранулах (Luhmann U.F. elal., 2009; lida Т., 2011; Lei L. etal., 2012).

В месте повреждения кости нижней челюсти с последующей имплантацией ПГА с адсорбированными АМСККП развивается асептическая воспалительная реакция, характеризующаяся поступлением в регионарные лимфатические узлы, в данном случае - субмандибулярные, большого объема клеточного и тканевого детрита (Жданов Д.А., 1952; Панченков Р.Т. и др., 1986; Бородин Ю.И. и др., 1995 - 1997; Foldi М„ 1969; Casley-Smith J.R., 1973), который поглощается макрофагами этих органов.

Макрофаги фагоцитируют вместе с детритом и попавшие в лимфатические узлы AMCKKii вместе со светящимся белком GFP. В таких случаях лизосомы макрофагов, в которых находится флуоресцентный белок, могут светиться в отраженном свете так же, как и сами АМСККП с трансфицированным геном GFP.

То, что макрофаги с поглощенным клеточным светящимся детритом сконцентрированы в герминативных центрах лимфатических узлов, можно объяснить с 2-х позиций:

Во-первых, в герминативных центрах идут размножение, активация и дифференцировка клеток B-линии, которые в дальнейшем будут синтезировать антитела против определенных антигенов. Для запуска и успешного осуществления этого процесса необходимо присутствие макрофагов с данным антигеном. В самих центрах размножения имеется множество макрофагов, которые могут поглощать антигены из окружающих тканей и, по-видимому, лимфы, проходящей по промежуточным синусам.

Во-вторых, макрофаги могут фагоцитировать светящиеся клетки или вышедший из них при разрушении белок GFP из лимфы и либо мигрировать в фолликулы для активации и запуска процесса пролиферации и дифференцировки B-лимфоцитов, либо передавать антигены другим макрофагам, находящимся уже непосредственно в лимфоидных узелках. Не исключена возможность фагоцитирования АМСККП и их детрита в месте имплантации ПГА, миграции макрофагов с антигеном в лимфатические узлы вместе с током лимфы и уже в этих органах миграции или передачи антигенов фагоцитам центров размножения.

Таким образом, на основании вышеизложенного, можно заключить, что имплантация ПГА не только не ускоряет репарацию участка повреждения кости нижней челюсти, а препятствует процессам заживления.

Применение ПГА с адсорбированными АМСККП с трансфицированным геном GFP не вызывает значительных изменений как в месте дефекта кости нижней челюсти, так и в состоянии регионарных лимфатических узлов. Введенные таким способом АМСККП частично поглощаются макрофагами. При разрушении структу р, сформированных из АМСККП, детрит также фагоцитируется макрофагами. В том и другом случае эти макрофаги оказываются в центрах размножения лимфоидных фолликулов лимфатических узлов, где не исключена инициация иммунитета против ДНК и белка GFP. Не исключено, что после повторного введения клеток

с трансфицированным геном вРР такие клеточные элементы будут очень быстро уничтожаться системой иммунитета, и из них не будет формироваться никаких структур.

ВЫВОДЫ

1. У крыс после повреждения кости нижней челюсти и естественном ходе регенерации происходит заполнение дефекта кровью, формирование кровяного сгустка с большим числом эритроцитов. Через 1 неделю в дефекте кости среди фрагментов кровяного сгустка и грануляций формируются отдельные островки молодой костной ткани, через 2 недели дефект в кости нижней челюсти полностью замещается молодой костной тканью. На 3^-й неделе в костной мозоли на месте дефекта появляются структуры красного костного мозга. По данным денситометрии отмечено медленное и плавное возрастание плотности костной ткани в участке повреждения.

2. При заживлении участка повреждения нижней челюсти в фолликулах с центрами размножения субмандибулярных лимфатических узлов относительное содержание и численная плотность митозов, клеток с признаками деструкции, иммуно- и плазмобластов резко возросли к 1 -й неделе, затем оставались на высоком уровне до 2-й недели и далее (на 3-5-й неделях) достоверно не отличались от исходных. Процент и абсолютное количество макрофагов были повышенными в течение всего времени наблюдения.

3. После применения полимера на основе ПГА в течение всего эксперимента сохранялось неизменным отверстие в кости, где находился сам полимер. Признаков консолидации ПГА с краем дефекта кости ни в одном случае не было. На все сроки наблюдения происходит активное образование костной ткани между краем дефекта и полимером, сам ПГА непосредственно инкапсулируется фиброзной тканью с большим числом клеточных элементов. Свидетельства деградации искусственного материала на все сроки эксперимента отсутствуют

4. На хронический воспалительный процесс в тканях нижней челюсти, индуцированный присутствием инородного тела - ПГА, лимфатические узлы отвечают гипергрофией лимфоидных фолликулов с центрами размножения, которые становятся больше исходных к 5-й неделе после операции. Относительное и абсолютное число делящихся клеток, имму-^ но- и плазмобластов резко возросли к 1-2-й неделям, затем постепенно снижались и достоверно не отличались ог исходного. Процент и численная плотность ретикулярных клеток и моноцитов стали возрастать, начиная

с 4-й недели после операции. Процент и число макрофагов и клеток с признаками деструктивных изменений на единицу площади среза на все точки наблюдения были выше, чем в контроле.

5. На фоне имплантации ПГА с адсорбированными АМСККП на все временные точки отверстие в кости сохранялось неизменным. Внедрение

такого полимера приводит к образованию большего числа кровеносных сосудов в грануляциях и соединительной ткани, формирующихся вокруг имплантированного инородного тела. Трансфекцией гена GFP было доказано, что в данном случае АМСККГ1 не мигрируют и не разрушаются в месте введения, а формируют кровеносные сосуды за счет дифференци-ровки в клетки их структур. Начиная с 3-й недели введенные АМСККП и структуры, построенные из них, постепенно замещаются собственными клетками организма.

6. После внедрения в участок повреждения кости нижней челюсти ПГА с адсорбированными АМСККП с трансфицированным геном GFP в лимфоидных фолликулах регионарных лимфатических узлов появляются многочисленные крупные макрофаг и с множеством овальных светящихся включений в цитоплазме. Численность таких макрофагов нарастает в течение 2 недель после операции, а далее начинает уменьшаться. Светящиеся клетки не исчезают полностью к окончанию времени наблюдения, а выстраиваются на периферии лимфоидных узелков. Видимо, введенные таким способом АМСККП частично поглощаются макрофагами. При разрушении структур, сформированных из АМСККП, детрит также фагоцитируется макрофагами. В гом и другом случае эти макрофаги оказываются в герминативных центрах лимфоидных фолликулов лимфатических узлов, где не исключена инициация иммунитета против ДНК и белка GFP.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. По результатам дснситометрических исследований с получением точных численных данных возможно слежение за процессами регенерации поврежденных костных тканей и определение эффективности воздействия на этот процесс различных методов.

2. Применение ПГА (сополимера из 85% полигидроксибутирата и 15% гидроксивалериата) как в чистом виде, так и с адсорбированными АМСККП для ускорения репарации костных тканей нецелесообразно, несмотря на многочисленные литературные сообщения об эффективности использования таких полимеров. Имплантация ПГА не только не ускоряет репарацию участка повреждения кости нижней челюсти, но препятствует процессам заживления. Прочность поврежденных тканей после применения ПГА не только не восстанавливается, а остается сниженной за счет соединительнотканной капсулы между полимером и краем кости.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Майбородин И.В., Матвеева В.А., Маслов Р.В., Оноприенко Н.В., Кузнецова И.В., Частикин Г.А. Макрофаги со свечением в лимфатических узлах после введения мультипотентных мезенхимальных стромальных кле-

ток с трансфицированным геном флуоресцирующего белка в эксперименте // Фундаментальные исследования. - 2014. - № 7. - С. 529-533.

2. Майбородин И.В., Матвеева В.А., Маслов Р.В., Оноприенко Н.В., Кузнецова И.В., Частикин Г.А. Флуоресцирующие макрофаги в лимфатических узлах после применения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток с трансфицированным геном СРР // Новости хирургии. - 2014. - Т. 22, № 5. - С. 526-532.

3. Майбородин И.В., Матвеева В.А., Маслов Р.В., Оноприенко Н.В., Кузнецова И.В., Частикин Г.А. Поднижнечелюстной лимфатический узел крысы после введения в мандибулярный костный дефект матрицы из поли-гидроксиалканоата с мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками // Стоматология. - 2014. - № 6. - С. 4-7.

4. Частикин Г.А., Маслов Р.В., Оноприенко Н.В., Кузнецова И.В., Матвеева В.А., Майбородин И.В. Лимфатические узлы крыс после применения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в регионе лимфосбора // Вестн. Новосибирского гос. ун-та: Сер. биол., клин. мед. - 2014. - Т. 12, № 4. - С. 25-32.

5. Майбородин И.В., Матвеева В.А., Маслов Р.В., Оноприенко Н.В., Кузнецова И.В. Лимфатические узлы крыс после применения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток // Актуальные проблемы хирургии: Сб. науч. тр. 8 межрегион, конф., посвященной памяти акад. РАМН проф. Л.В. Полуэктова. - Омск, 2014. - С. 271-273.

6. Майбородин И.В., Частикин Г.А., Мошак С.В., Морозов В.В., Матвеева В.А., Оноприенко Н.В., Маслов Р.В. Паравазальное введение мезенхимальных стромальных клеток при тромбозе магистральной вены в эксперименте // 7-й Санкт-Петербургский венозный форум: Актуальные вопросы флебологии: Сб. тезисов. - С-Пб., 2014. - С. 35-36.

7. Майбородин И.В., Частикин Г.А., Мошак С.В., Морозов В.В., Матвеева В.А., Оноприенко Н.В., Маслов Р.В. Возможность внутривенного применения мезенхимальных стромальных клеток для коррекции экспериментального флеботромбоза// 7-й Санкт-Петербургский венозный форум: Актуальные вопросы флебологии: Сб. тезисов. - С-Пб., 2014. - С. 36-37.

Подписано в печать 31.03.2015. Формат60x84/16. Г арнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. меч. л. 1.0. Тираж 100 чк'1. Заказ № 68. Отпечатано в типографии ОАО "НИИ систем" Новосибирск-58, ул. Русская, 39. т. 306-67-39

Соискатель

Р.В.Маслов

2015676070

2015676070