Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Патоморфологические аспекты прогнозирования побочного действия и специфической активности новых противоопухолевых препаратов и средств сопровождения цитостатической терапии в доклинических исследованиях

На правах рукописи

ПЕРЕВЕРЗЕВА ЭЛЕОНОРА РАФАИЛОВНА

ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ПОБОЧНОГО ДЕЙСТВИЯ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НОВЫХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ И СРЕДСТВ СОПРОВОЖДЕНИЯ ЦИТОСТАТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ В ДОКЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ.

14.00.14 онкология 14.00.25 фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2007

003060800

Работа выполнена в ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им.

Г.Ф. Гаузе РАМН (директор - профессор М,Н. Преображенская)

Научные консультанты:

Доктор медицинских наук, профессор

Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Т.А Гуськова

В.М Бухман

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Доктор биологических наук, профессор Доктор медицинских наук, профессор

Н Н. Петровичев Л Б Горбачева В Л. Ковалева

Ведущее учреждение:

ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П А Герцена Росмедтехнологий

заседании диссертационного совета (Д 001 017.01) ГУ Российского онкологического научного центра им. Н Н Блохина РАМН, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российского онкологического научного центра им Н Н Блохина РАМН.

Защита диссертации состоится «¿а » 2007 г в /^часов на

Автореферат разослан« > 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного доктор медицинских наук, профессор

ЮВ Шишкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Прогноз безопасности применения лекарственных средств является важнейшей задачей доклинического исследования Несмотря на постоянное совершенствование методических подходов, проблема выявления неблагоприятных эффектов фармакологических веществ в эксперименте остается актуальной Современные этические нормы резко ограничивают проведение токсикологических исследований на высших животных, однако, в настоящее время при оценке безопасности новых лекарственных препаратов эксперименты на животных альтернативы не имеют [Morton DM, 1998] Трудоемкость, длительность и большая стоимость исследований на животных делает актуальным повышение уровня их информативности

Тенденции современной фармакологии - разработка эффективных фармакологических веществ на основе малотоксичных соединений, поиск менее токсичных структурных аналогов эффективных препаратов, создание технологичных лекарственных форм, улучшающих биодоступность и обеспечивающих усиление фармакологического эффекта Развитие этих направлений привело к возникновению ряда проблем в лекарственной токсикологии В частности, малотоксичные лекарственные средства проявляют слабое токсическое действие, которое, как правило, не удается выявить с помощью клинико-лабораторных исследований Установление различий в токсических эффектах близких по структуре фармакологических веществ, выявление особенностей токсического действия новых лекарственных форм препаратов также представляет определенные трудности

Патоморфологические исследования включены в современные программы доклинических токсикологических исследований новых лекарственных средств Однако их возможности используются далеко не в

Су k

полной мере [Гуськова ТА, Чичерина Л А, 1998] Так, на основе патоморфологических исследований может осуществляться прогнозирование токсических реакций организма на введение препаратов, относящихся по классификации токсичности к малотоксичным веществам Патоморфологические исследования могут способствовать выявлению взаимосвязи между структурой и активностью фармакологического средства, а также внести свой вклад в решение проблемы выбора оптимальной лекарственной формы

В лекарственной токсикологии морфологические исследования направлены на выявление деструктивных изменений Что же касается ответных компенсаторных реакций органов и тканей на введение фармакологического вещества, то они, как правило, не учитываются Между тем, анализ компенсаторно-приспособительных процессов, возникающих под действием лекарственного средства, позволяет оценить вероятный механизм действия препарата и на стадии доклинического изучения прогнозировать иные виды его фармакологической активности Эта информация необходима при определении наиболее перспективного вида активности для продвижения препарата в клинику или расширении области его применения

Все вышеизложенное определило актуальность исследования, его цели и задачи

Цель работы. Целью настоящей работы является разработка методологических подходов к патоморфологической оценке токсичности лекарственных веществ, а также прогнозирование новых видов специфической активности на основе доклинических патоморфологических исследований

Основные задачи исследования:

1 В субхронических и хронических экспериментах провести

сравнительное патоморфологическое исследование изменений

внутренних органов экспериментальных животных под воздействием ряда противоопухолевых препаратов и средств сопровождения цитостатической терапии

2 Разработать систему оценки структурных изменений органов и тканей, позволяющую с помощью патоморфологического исследования определять органы-мишени, зависимость от дозы и обратимость повреждающего действия малотоксичных лекарственных средств

3 Разработать патоморфологические подходы к оценке токсичности лекарственного средства в зависимости от его лекарственной формы и входящих в нее вспомогательных веществ

4 Провести патоморфологическую оценку возможности модификации токсических реакций посредством изменения лекарственной формы препаратов на примере доксорубицина

5 Оценить возможности патоморфологических исследований в установлении взаимосвязи между структурой и активностью потенциальных лекарственных средств для противоопухолевой терапии на примере комплексных соединений палладия

6 Разработать патоморфологические подходы для выявления новых видов активности потенциальных фармакологических веществ в ходе доклинических токсикологических исследований на примере препаратов олипифат и аскорбиген

Научная новизна.

Впервые разработана система оценки патоморфологических изменений внутренних органов экспериментальных животных, позволяющая дифференцировать токсические свойства и специфическую активность потенциальных лекарственных средств

Впервые на основе разработанной системы выявлены токсикомодифицирующая и антимикробная активность препарата аскорбиген, гемостимулирующая, иммуномодулирующая и токсикомодифицирующая активность препарата олипифат

Впервые разработаны принципы доклинической токсикологической оценки малотоксичных фармакологических веществ, не проявляющих токсических свойств в функциональных тестах

Впервые в результате патоморфологических исследований установлено, что при применении комплексных соединений палладия органы-мишени определяются свойствами металла, а специфика токсического действия (сроки проявления, интенсивность повреждающего действия, скорость репарации повреждений, тропность к определенным тканям) зависят от структуры лиганда

Впервые обоснована возможность патоморфологической оценки особенностей токсических реакций в зависимости от лекарственной формы препарата

Экспериментально установлено и теоретически обосновано неизвестное ранее свойство препарата олипифат вызывать образование лимфоузлов в мышечной ткани животных, обусловленное местно-тканевой реакцией на введенное вещество, а также его иммуномодулирующей и гемостимулирующей активностью Получено свидетельство об открытии. Научное значение открытия состоит в том, что оно расширяет представления о неоорганогенезе лимфатических узлов, его связи с местно-тканевой реакцией на экзогенные факторы, а также о возможности искусственного влияния на этот процесс Научно-практическое значение.

Установлены особенности токсического действия 11 лекарственных средств различных фармакологических групп, среди которых -противоопухолевые препараты и средства сопровождения терапии

онкологических больных Изучены токсические свойства полимерных носителей для создания иммобилизованных лекарственных форм препаратов

Выявлены общие черты и характерные особенности токсичности двух близких по структуре комплексных соединений палладия - эфазола и морфозола Эфазол, который предполагается использовать для повышения эффективности лечения злокачественных опухолей и снижения побочных эффектов химио- или радиотерапии, прошел первую фазу клинических испытаний Завершено предклиническое изучение морфозола в качестве противоопухолевого средства

Для малотоксичных средств адаптовита, риалама и полидана определены вероятные токсические реакции при передозировках Препараты адаптовит и риалам зарегистрированы в реестре лекарственных средств РФ Полидан в настоящее время используется в клинической практике в качестве гемостимулятора при цитостатической терапии

Экспериментально установлена возможность снижения кардио- и тестикулярной токсичности доксорубицина при применении его в новой наносомальной лекарственной форме

Показано, что введение в лекарственную форму просидола стабилизирующих веществ ослабляет повреждающее действие препарата на ткань легкого, но приводит к появлению деструктивных изменений в поджелудочной железе и слизистой оболочке желудка Стабилизированная лекарственная форма просидола вошла в клиническую практику

Установлено, что аспинат в меньшей степени повреждает ткани печени и почек по сравнению с аспирином С, но вызывает повышенное слизеобразование в желудке и кишечнике Препарат аспинат зарегистрирован в реестре лекарственных средств РФ

Показано, что иммобилизация изониазида на полимерный носитель не влияет на спектр органов-мишеней препарата, характер и интенсивность его

повреждающего действия на структуру печени, почек и сердца, но значительно ослабляет его гонадотоксические и гемолитические свойства

Получен патент и свидетельство об открытии

Апробация диссертации. Апробация проведена 30 ноября 2006 года на совместном заседании Ученого Совета ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им Г Ф Гаузе РАМН и Проблемной комиссии по противоопухолевым антибиотикам Межведомственного Научного Совета по антибиотикам, 28 февраля 2007 года в НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им H H Блохина на совместной научной конференции отдела экспериментальной химиотерапии, лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии, лаборатории фармакологии и токсикологии, лаборатории комбинированной терапии опухолей, лаборатории разработки лекарственных форм, лаборатории экспериментальной терапии метастазов, лаборатории медицинской химии, лаборатории химии природных соединений, лаборатории фармакоцитокинетики, лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории медицинской биотехнологии.

Основные положения диссертации доложены на II, V Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1995, 1998 г), V Международном симпозиуме «Биологически активные добавки к пище и проблемы здоровой семьи» (Красноярск, 2001 г), Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2002, 2003, 2004, 2005 гг), Медико-фармацевтическом форуме «Аптека — 2002» (Москва, 2002 г ), 6-ом конгрессе по антимикробной терапии ECC@RICAI (Франция, Париж, 2004 г), на 31-ом ежегодном собрании общества Annual Meeting of the Controlled Release Soc (Honolulu, 2004), на XV симпозиуме по микроинкапсуляции (Италия, Парма, 2005), 10-ом международном съезде «Фитофарм 2006» (Санкт-Петербург, 2006)

Публикации. По итогам исследований в отечественных и международных журналах, материалах конференций опубликована 31 работа

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 288 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материал и методы исследования», двух разделов, содержащих 6 глав собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложения Указатель литературы включает 246 источников, из которых 102 работы отечественных и 144 работы иностранных авторов Работа содержит 11 таблиц и 160 микрофотографий (Приложение)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Животные. В работе использовано 645 крыс, 347 мышей, 16 собак Исследования проводили на мышах линий С57В1/6.Г, мышах-гибридах (С51Ш16] х БВА2) В6Б2Рь (СВА х С57В1/61) Рь мышатах-сосунках колонии 8НК, крысах линии и^аг и (АМСУ х \Vistar) Бь собаках породы английский бигль, разведения ГУ РОНЦ им Н Н Блохина РАМН Мелких лабораторных животных получали из питомника РАМН «Крюково», содержали в вивариях ГУ РОНЦ им Н Н Блохина и ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им Г Ф Гаузе РАМН в стандартных клетках Для кормления использовали стандартный брикетированный корм Все эксперименты выполнялись в соответствии с правилами работы на животных, принятыми в ГУ РОНЦ им Н Н Блохина, ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им Г Ф Гаузе и РАМН

Препараты. Использовали как коммерческие соединения в виде лекарственных форм или химических реактивов, так и специально приготовленные субстанции и лекформы препаратов морфозол, эфазол,

доксорубицин, олипифат, аскорбиген, адаптовит, риалам, полидан, просидол, аспинат, изоглиопэк, комплексного полимерного носителя КПН-2

Исследование хронической токсичности препаратов При исследовании хронической токсичности препаратов на всем протяжении эксперимента определяли массу тела животных, следили за состоянием и поведением Проводили изучение показателей периферической крови, биохимический анализ сыворотки крови, клинический анализ мочи, определяли суточный диурез, исследовали электрокардиограмму во втором стандартном отведении Для патоморфологического изучения крыс забивали путем декапитации Животных вскрывали, определяли массу внутренних органов, их весовые коэффициенты Собак усыпляли по окончании курса введений препарата при помощи внутривенного введения высокой дозы барбитурата Участки внутренних органов брали для гистологического исследования

Гистологическая обработка В экспериментах по изучению субхронической и хронической токсичности препаратов для гистологического исследования брали сердце, легкое, печень, почку, желудок, все отделы кишечника, поджелудочную и щитовидную железы, надпочечник, гипофиз, семенник (у самок - матку и яичник), мочевой пузырь, тимус, селезенку, лимфоузлы Ткани фиксировали в 10% нейтральном формалине, по стандартной методике заливали в парафин Срезы толщиной 5-7 цк окрашивали гематоксилин-эозином и подвергали световой микроскопии с использованием микроскопа «Olympus ВХ40» (Япония)

Изучение гаметотоксичности различных лекарственных форм доксорубицина (ДОКС) было проведено в Медико-Генетическом Научном Центре РАМН совместно с Н П Макаровой под руководством проф JIФ Курило Гистологическую обработку семенников и количественный анализ состояния сперматогенного эпителия проводили по методике, разработанной для световой микроскопии гонад [Ухов Ю И и соавт, 1983]

Эксперименты по выявлению новых видов специфической активности. Аскорбиген (АСГ) вводили через рот в дозе 100 мг/кг Для гистологического исследования брали участки желудочно-кишечного тракта и органы иммунной системы Олипифат вводили внутримышечно в дозе 100 мг/кг Для гистологического исследования брали участки мышцы бедра с места ведения препарата, контралатеральную мышцу, органы иммунной системы

Экспериментальная оценка антимикробной активности АСГ выполнена в группе д м н Б П Мирчинк на модели сепсиса новорожденных мышей с использованием бактериальной культуры Staphylococcus aureus

Изучение влияния АСГ на развитие и течение токсической алопеции проведено на модели алопеции, развивающейся у новорожденных мышат при введении им циклофосфамида (ЦФ) (совместно с д м н Е П Мирчинк)

Способность АСГ и олипифата модифицировать побочные реакции цитостатиков была изучена на модели введения мышам циклофосфамида, для которого характерны угнетение кроветворения и поражение слизистой оболочки кишечника

Для изучения влияния олипифата на реакции противоопухолевого иммунитета был использован местный нейтрализационный тест по Винну [Winn HJ, 1961] В опыте были использованы штаммы перевиваемых опухолей меланома В-16 и рак легкого Льюис

Результаты обрабатывали статистически Достоверность различия средних определяли по i-критерию Стьюдента Достоверность различия в выживаемости определяли по непараметрическому U-критерию Вилкоксона За достоверное принимали различие при р<0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОВЕДЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

1.Патоморфологические исследования в решении задач доклинической токсикологии лекарственных средств

1 1 Установление особенностей токсического действия новых противоопухолевых средств, созданных на основе комплексных соединений металлов

В данной главе представлены результаты исследования двух комплексных соединений палладия эфазола и морфозола (катионно-анионные комплексы тетрахлорпалладия, различающиеся между собой структурой лиганда в составе эфазола содержится эфедрин, морфозола - морфолин) Морфозол проявил высокую противоопухолевую активность в отношении ряда сингенных перевиваемых опухолей мышей Эфазол эффективно ингибировал метастазирование меланомы В-16 (индекс ингибирования - 97 %) Кроме того, совместное использование локального облучения и эфазола приводило к полному излечению животных с перевиваемой опухолью АК-755 (аденокарцинома молочной железы) [Трещалин И Д и соавт, 2002, Трещалин И Д и соавт, 2005]

Исследуемые палладиевые комплексы вводили крысам в моделях лекарственных форм в дозах, суммарно составляющих ЛД50 и МПД Режим был выбран в соответствии с предполагаемым режимом клинического применения. Морфозол применяли внутрибрюшинно в разовых дозах 5 и 2,5 мг/кг ежедневно в течение 20 дней, эфазол - внутривенно в течение 5 дней с интервалом 24 часа в разовых дозах 15 и 5 мг/кг Животных забивали на 1, 15 и 30 сутки после окончания введений препаратов

По токсическим свойствам, оцененным в функциональных тестах, комплексы не отличались Исследования на мышах, крысах и собаках не выявили гематотоксического, нефротоксического, кардиотоксического, иммунотоксического, эмбриотоксического и других видов побочного действия

При патоморфологическом исследовании было установлено, что комплексы, примененные в эквитоксических дозах, различаются по токсическому воздействию на органы и ткани экспериментальных животных Так, морфозол в обеих исследованных дозах вызывал повреждение ткани печени При этом объем патологических изменений определялся величиной примененной дозы Дистрофические и деструктивные процессы были зарегистрированы сразу после курса введений препарата и протекали как вокруг триад, так и вблизи центральных вен

Эфазол также в обеих изученных дозах вызывал повреждения ткани печени, однако, они различались в зависимости от дозы не только количественно, но и качественно Применение дозы препарата, суммарно составляющей МПД, вызывало, главным образом, дистрофические изменения, которые локализовались вблизи центральных вен Повышение дозы эфазола приводило к развитию деструктивных процессов, причем явления деструкции развивались отсроченно Развитие дегенеративных и некротических изменений происходило на фоне кровоизлияний, и было ассоциировано с триадами

Если при применении морфозола к концу эксперимента структура клеток паренхимы печени не отличалась от контроля, то при введении эфазола явления зернистой дистрофии и вакуольной дистрофии клеток краевой пластинки сохранялись до конца эксперимента

Оба изученных палладиевых комплекса оказывали воздействие на структуру почек При этом эфазол вызывал только дистрофические изменения в клетках извитых канальцев, тогда как под влиянием морфозола преобладали деструктивные процессы, которые затрагивали как канальцевую, так и клубочковую систему нефрона

При применении различных доз препаратов признаки нефротоксичности качественно не изменялись Количество же и размеры очагов повреждения изменялись пропорционально введенной дозе Нефротоксичность эфазола

проявлялась отсроченно Особенность нефротоксического действия морфозола состояла в том, что на всем протяжении наблюдения деструктивным процессам сопутствовали регенераторные

При оценке действия препаратов палладия на ткань желудка было установлено, что эфазол в дозе, суммарно составляющей МПД, патологических изменений в ткани желудка не вызывает При введении морфозола в эквитоксической дозе на первые сутки после курса у 2-х животных в группе было отмечено повреждение слизистой оболочки желудка, которое выражалось в очаговой атрофии покровно-ямочного эпителия и полнокровии сосудов всех калибров

Влияние эфазола на слизистую оболочку желудка в дозе, суммарно составляющей ЛД50, регистрировалось лишь у части животных на 15 сутки после курса введений препарата и выражалось в развитии умеренных атрофических изменений в эпителии желез и в замещении его в зонах повреждения покровно-ямочным эпителием

Патологические изменения в ткани желудка под воздействием дозы морфозола, суммарно составляющей ЛД50, проявлялись уже на 1 сутки после курса введений препарата Явления атрофии и деструкции, вызванные применением морфозола, носили намного более масштабный характер по сравнению с эфазолом Наличие отложений гемосидерина и сидерофагов в зонах повреждений свидетельствовало о предшествующих им кровоизлияниях

При оценке кардиотоксичности было показано, что влияние эфазола на миокард выражено слабо Оно проявлялось у отдельных животных при применении препарата в дозе, суммарно составляющей ЛД50 Интенсивность проявления токсической кардиомиопатии при введении морфозола зависела от дозы препарата При применении препарата в дозе, эквивалентной МПД, она была выражена слабо и исчезала к концу эксперимента С повышением дозы к токсической кардиомиопатии присоединялись процессы атрофии мышечных

волокон В течение месяца кардиотоксическое действие препарата не ослаблялось Более того, через месяц были зарегистрированы деструктивные и метапластические процессы в клапанах

При применении морфозола на 1 сутки после курса введения были выявлены очаги микронекроза разных размеров как в эндокринной, так и в экзокринной части поджелудочной железы Объем деструктивных изменений четко зависел от дозы препарата К 30 суткам происходило склерозирование очагов некроза Ткань поджелудочной железы, не подвергшаяся некротическим изменениям, не отличалась от контроля

Введение морфозола в дозе, суммарно составляющей ЛД50, приводило к появлению в слизистой оболочке толстой кишки множественных мелких очагов некроза К концу наблюдения в зонах деструкции желез было отмечено разрастание элементов собственной пластинки слизистой оболочки При введении препарата в дозе, суммарно составляющей МПД, на 1 сутки после курса были найдены умеренный отек стромы слизистой оболочки, избыточное слизеобразование, единичные очаги деструкции эпителия Через месяц признаки повреждения полностью исчезали

Проведенное исследование позволяет заключить, что повреждающее действие эфазола на органы и ткани экспериментальных животных ограничивается умеренно выраженными и четко зависящими от дозы препарата нарушениями структуры печени, почек, желудка и сердца Характерная особенность эфазола - отсроченность токсического действия Морфозолу также свойственны гепатотоксичность, нефротоксичность, кардиотоксичность и повреждающее действие на слизистую оболочку желудка Особенностью действия морфозола являются некротические изменения в ткани поджелудочной железы и деструкция эпителиальных клеток слизистой оболочки толстой кишки, интенсивность которых зависела от дозы препарата

Таким образом, патоморфологическое исследование внутренних органов экспериментальных животных позволило выявить общие черты и характерные особенности двух близких по структуре комплексных соединений палладия По-видимому, органы-мишени определяются свойствами металла, а специфика токсического действия (сроки проявления, интенсивность повреждающего действия, скорость репарации повреждений, тропность к определенным тканям) зависят от структуры лиганда

1 2 Определение зависимости токсических эффектов от дозы и установление органов-мишеней для препаратов сопровождения цитостатической терапии, относящихся к малотоксичным веществам

При токсикологическом изучении многих препаратов природного происхождения, как правило, не удается выявить каких-либо отклонений физиологических показателей состояния животных Не дают результатов ни многократные превышения эффективных доз при проведении хронических и субхронических экспериментов, ни использование различных видов животных В таких случаях выявление органов-мишеней, установление видов токсичности, характерных для данного потенциального лекарственного средства, их зависимости от дозы и обратимости полностью определяется результатами патоморфологических исследований

В данной главе приведены результаты доклинического токсикологического исследования двух адаптогенов (адаптовита и риалама) и гемостимулятора полидана При доклиническом изучении специфической активности риалама, адаптовита и полидана, в экспериментах на мышах было показано, что они обладают свойством ослаблять цитопению и ускорять восстановление количества лейкоцитов в периферической крови после применения цитостатиков [Бодягин Д А и соавт, 1995; Бодягин Д А и соавт, 1998]

Препарат риалам, представляющий собой аутолизат крови телят, вводили крысам внутрибрюшинно в разовых дозах 50 и 500 мг/кг ежедневно тридцатикратно, что суммарно составляло Уг МПД и 2 ЛДюо Препарат адаптовит, представляющий собой гидролизат пекарских дрожжей, вводили в желудок в разовых дозах 100, 250 и 500 мг/кг ежедневно в течение 30 дней Суммарные дозы соответственно составляли Vi от МПД, ЛДюо, и 2 ЛДюо Препарат полидан, представляющий собой высокоочищенную стандартизованную смесь натриевых солей дериватов ДНК и РНК, получаемых из молок осетровых рыб, вводили крысам подкожно в разовых дозах 6 и 30 мг/кг ежедневно пятикратно Суммарные курсовые дозы составили 30 и 150 мг/кг, что в 10 и 50 раз превышало дозы, рекомендуемые для человека В экспериментах на собаках использовали разовые дозы 5 и 20 мг/кг при пятидневном курсе, что суммарно в 40 и 200 раз превышало рекомендуемые для человека

В результате проведенных исследований клинических признаков интоксикации обнаружено не было Животные нормально прибавляли в весе, состояние и поведение подопытных животных не отличалось от контроля При исследовании весовых коэффициентов внутренних органов крыс отклонений от контроля не выявлено Препараты в изученных дозах и режиме не влияли на клеточный состав периферической крови, биохимические показатели сыворотки крови, ЭКГ, показатели диуреза и клинических анализов мочи Таким образом, эти лекарственные средства не проявили никаких токсических свойств в функциональных, гематологических, биохимических и других тестах на этапе доклинических токсикологических исследований

Патоморфологические исследования показали, что при применении препарата риалам в железах слизистой оболочки желудка происходит увеличение количества обкладочных клеток Выявленные изменения в желудке можно расценить как токсические, так как они могут, в конечном счете,

привести к повышению кислотности желудочного сока В то же время увеличение числа обкладочных клеток под действием риалама может быть проявлением стимулирующего влияния препарата на кроветворение, так как эти клетки вырабатывают внутренний фактор Кастла, необходимый для всасывания витамина В12, регулирующего пролиферативную активность эритроидного ростка кроветворной ткани

При изучении структуры лимфоузлов были найдены признаки бласт-трансформации лимфоцитов в паракортикальной зоне Это позволяет предположить, что специфическая активность риалама связана с активацией клеточного иммунитета

При патоморфологическом исследовании было установлено, что препарат адаптовит вызывает ряд изменений в структуре внутренних органов экспериментальных животных Так, в миокарде крыс, получавших препарат в разовой дозе 500 мг/кг, сразу после курса введений в соединительной ткани, окружающей коронарные сосуды, были найдены лимфоидные инфильтраты различных размеров, а также небольшие очаги токсической кардиомиопатии, которые сохранялись до конца наблюдения У животных, получавших адаптовит в дозе 250 мг/кг, на 1 сутки после курса введений были выявлены мелкие лимфо-гистиоцитарные инфильтраты вблизи коронарных сосудов К 30 суткам по окончании введений препарата в этой дозе никаких изменений структуры органа найдено не было

В печени при использовании адаптовита в дозе 500 мг/кг сразу после курса введений были обнаружены множественные очаги микронекроза между центральными венами, которые сохранялись до конца наблюдения При применении препарата в разовой дозе 250 мг/кг, на 1 сутки после курса были найдены единичные очаги микронекроза в этой же области К концу наблюдения структура ткани печени не отличалась от контроля

В корковой зоне почки по окончании курса введений адаптовита в разовой дозе 500 мг/кг были выявлены множественные очаги некроза извитых канальцев К концу наблюдения структура ткани почки полностью восстанавливалась У животных, получавших препарат в дозе 250 мг/кг, никаких изменений в ткани почки найдено не было

В лимфоузлах при применении адаптовита в изученных дозах и режиме признаков антигенного раздражения выявлено не было На 1 сутки наблюдения структура лимфоузлов не отличалась от контроля К 30 суткам эксперимента у крыс, получавших адаптовит в разовой дозе 500 мг/кг, отмечена атрофия лимфоидной ткани в мозговой зоне лимфоузлов При введении препарата в дозе 250 мг/кг строение лимфоузлов не изменялось

Препарат, примененный в дозе 100 мг/кг, на структуру органов и тканей никакого влияния не оказывал

Препарат полидан вызывал изменения различной интенсивности в лимфоузлах, тимусе, селезенке, поджелудочной железе, гипофизе и семенниках В экспериментах на собаках была выявлена способность препарата оказывать повреждающее действие на гломерулярный аппарат почек, печень и слизистую оболочку желудка

Введение полидана в обеих изученных дозах вызывало как у крыс, так и у собак умеренную атрофию лимфоидной ткани фолликулов лимфоузлов, которая проявлялась уже на ранние сроки наблюдения и сохранялась до конца эксперимента

Применение полидана приводило к возникновению атрофических изменений в мозговой зоне тимуса крыс Интенсивность атрофических изменений зависела от дозы препарата К 20 суткам наблюдения у крыс, получавших полидан в разовой дозе 6 мг/кг, структура тимуса восстанавливалась полностью При использовании препарата в разовой дозе 30 мг/кг восстановление было отмечено к концу эксперимента (45 сутки после

курса введений препарата) У собак атрофические изменения в мозговой зоне тимуса возникали только при введении полидана в разовой дозе 20 мг/кг Они носили умеренный характер, но были стойкими и сохранялись до конца наблюдения

Введение полидана в дозах 150 мг/кг (крысы) и 20 мг/кг (собаки) приводило на первые сутки после курса введений препарата к появлению крупных центров размножения в лимфоидных фолликулах селезенки К 20 суткам после курса введений структура селезенки восстанавливалась, а к концу эксперимента (45 сутки после курса введений препарата) фолликулы становились мелкими с признаками умеренной атрофии лимфоидной ткани Применение препарата в дозах 30 мг/кг (крысы) и 5 мг/кг (собаки) на морфологическое строение органа влияния не оказывало

Введение полидана вызывало деструктивные изменения в ткани поджелудочной железы У собак они возникали при применении полидана в разовой дозе 20 мг/кг и затрагивали только островковый аппарат У крыс препарат оказывал повреждающее действие как на эндокринную, так и на экзокринную часть железы в обеих изученных дозах К концу наблюдения (45 сутки после курса введений) у крыс, получавших более низкую дозу полидана, структура поджелудочной железы полностью восстанавливалась При применении более высокой дозы препарата очаги некроза в стадии организации, а также крупные зоны дегенерации ацинозных клеток встречались до конца наблюдения

В передней доле гипофиза после окончания введений препарата независимо от дозы было выявлено увеличение количества ацидофильных клеток, повышение эозинофилии их цитоплазмы На отдельных участках эти клетки располагались в виде крупных, плотных тяжей Через полтора месяца структура гипофиза не отличалась от контроля

Полидан в обеих изученных дозах оказывал влияние на ткань семенников К концу эксперимента у животных, получавших дозу препарата, в 10 раз превышающую рекомендуемую для человека, структура семенных канальцев восстанавливалась полностью При применении дозы полидана, в 50 раз превышающей рекомендуемую для человека, к 45 суткам наблюдения в канальцах все еще встречались очаги дискомплексации сперматогенного эпителия У собак применение полидана в дозе 20 мг/кг пятикратно вызывало атрофию сперматогенного эпителия в части канальцев, которая проявлялась на 3 сутки эксперимента и сохранялась до конца наблюдения

Повреждающее действие полидана на ткани почки, печени и желудка зависело от вида экспериментального животного Введение препарата крысам в исследованных дозах не вызывало существенных изменений структуры этих органов У собак при введении препарата в разовой дозе 5 мг/кг на 3 сутки после курса отмечен умеренный отек в юкстамедуллярной зоне почек. К 30 суткам наблюдения обширные участки отека стромы появлялись в корковой зоне, сопровождаясь зернистой дистрофией клеток извитых канальцев При использовании препарата в разовой дозе 20 мг/кг патологические изменения в органе появлялись уже на первый срок наблюдения в виде увеличения размера клубочков, полнокровия их капилляров, деструкции капиллярной сети, утолщения капсулы клубочков, очагов некроза извитых канальцев К 30 суткам после курса резкое утолщение капсулы клубочков происходило уже во всей ткани коркового слоя Клетки извитых канальцев находились в состоянии зернистой и вакуольной дистрофии

Изменения в ткани печени отмечены также только у собак При этом низкая доза препарата практически не оказывала влияния на структуру органа При применении полидана в разовой дозе 20 мг/кг на 3 сутки после курса введений возникал умеренный отек вокруг портальных трактов, появлялись мелкие лимфоидные и плазмоцитарные инфильтраты вблизи портальных

трактов и центральных вен, единичные очаги микронекроза, умеренная вакуольная дистрофия гепатоцитов Через месяц после курса введений структура органа восстанавливалась

Полидан, введенный в разовой дозе 20 мг/кг, у собак вызывал на 3 сутки после введения появление очагов атрофии покровно-ямочного эпителия на одних участках и разрастание его вглубь желез, на других - избыток обкладочных клеток в железах К концу наблюдения в части желез эпителиальные структуры частично или полностью были замещены стромальными элементами

Таким образом, установлено, что патоморфологическое исследование позволяет ответить на основные вопросы, стоящие перед доклиническим испытанием малотоксичных фармакологических веществ (выявить органы-мишени, зависимость повреждающего действия от дозы препарата и его обратимость), и определить вероятные токсические реакции при передозировках При этом при изучении структурных изменений органов и тканей, возникающих под воздействием испытуемого препарата, была получена информация не только о его токсических свойствах, но и о возможном механизме действия

1.3 Модуляция токсических эффектов препарата путем изменения его лекарственной Формы на примере доксорубицина

Доксорубицин (ДОКС) - один из наиболее эффективных препаратов при лечении различных злокачественных опухолей Однако его клиническое применение ограничено целым рядом побочных эффектов Кардиотоксичность является главным лимитирующим видом токсичности ДОКС Один из рисков для пациентов при противоопухолевой химиотерапии - потеря репродуктивной способности в результате повреждения семенников или яичников [КоЬауаэЫ Н е1 а1, 1996] Снижение токсичности и повышение эффективности для многих лекарственных препаратов было продемонстрировано при соединении их с

наночастицами (НЧ) [Alyautdm RN et al, 1995, Alyautdin RN et al, 1997] Задачей исследований, результаты которых изложены в данном разделе работы, была патоморфологическая оценка кардио- и тестикулярной токсичности новых наносомальных лекарственных форм доксорубицина

В проведенном исследовании была использована терапевтическая доза ДОКС, которая вызвала на 30 сутки после курса введений умеренные морфологические изменения в сердечной мышце, характерные для данного препарата Повреждения в миокарде выражались в вакуолизации цитоплазмы кардиомиоцитов, клеточной атрофии, пикнозе ядер, утрате миофибрилл, лимфоидной инфильтрации, что полностью согласуется с данными литературы [Klugmann F В et al ,1984, GebbmN et al, 1985]

Применение ДОКС, ассоциированного с полибутилцианоакрилатными наночастицами (ПБЦА), покрытыми полисорбатом 80 (ПС), не изменило качественные морфологические характеристики кардиотоксичности, но привело к уменьшению количества и размеров очагов атрофии кардиомиоцитов и отсутствию лимфоидных инфильтратов, что позволяет сделать заключение об ослаблении токсического воздействия препарата на ткань сердца При применении ДОКС, ассоциированного с альбуминовыми наночастицами (А), повреждений структуры миокарда обнаружено не было По-видимому, различия в степени повреждения миокарда связаны с особенностями фармакокинетики той или иной лекарственной формы ДОКС, которые, в свою очередь, определяют количество препарата, попадающего в сердечную мышцу [Couvreur Р et al, 1982]

Введение терапевтической дозы ДОКС в стандартной лекарственной форме приводило к развитию тестикулярной токсичности Она была отмечена уже на 15 сутки после курса введений антибиотика, что согласуется с данными других исследователей [Tsunenan I et al, 2000] По-видимому, ДОКС в наносомальных лекарственных формах проникал через гемато-тестикулярный

барьер, так как патологические изменения разной степени тяжести были зарегистрированы в сперматогенном эпителии крыс всех экспериментальных групп Значительное ослабление токсического влияния антибиотика на семенники было достигнуто при использовании лекарственных форм ДОКС-А и ДОКС-А-ПС Патологические изменения в органе на 15 сутки наблюдения отсутствовали, а на 30 сутки после курса введений препаратов степень повреждения сперматогенного эпителия была значительно уменьшена При этом, массовые коэффициенты семенников крыс, получавших лекарственные формы ДОКС-А и ДОКС-А-ПС, не отличались от контроля

При использовании лекарственной формы ДОКС-ПБЦА-ПС было получено ослабление токсического влияния препарата на семенники, что выражалось в сохранении структурной целостности значительной части канальцев Результаты количественной оценки гаметотоксичности ДОКС подтвердили, что лекарственная форма ДОКС-ПБЦА-ПС оказывает меньшее повреждающее воздействие на сперматогенный эпителий по сравнению с ДОКС и ДОКС-ПБЦА Очаговый асперматогенез, наблюдавшийся у крыс этой группы, характерен для слабой или средней степени нарушения сперматогенеза [Райцина С С , 1985] Наличие сперматогониев в поврежденных канальцах свидетельствовало о сохранении регенераторного потенциала органа

Таким образом, морфологическими и функциональными методами было оценено влияние различных наносомальных лекарственных форм ДОКС на степень выраженности двух важных видов токсичности этого противоопухолевого антибиотика Использование ПС в лекарственной форме ДОКС не изменяло степень проявления кардиотоксичности и тестикулярной токсичности ДОКС Соединение ДОКС с полибутилцианоакрилатными НЧ также не оказывало влияния на степень их проявления При применении лекарственной формы, содержащей полисорбат, в которой ДОКС был ассоциирован с полибутилцианоакрилатными наночастицами,

кардиотоксические и гонадотоксические свойства противоопухолевого антибиотика существенно ослаблялись Значительного уменьшения тестикулярной и кардиотоксичности ДОКС удалось достигнуть и при использовании альбуминовых наночастиц

1 4 Сравнительная оценка преимуществ и недостатков новых лекарственных форм лечебных средств, применяемых в терапии онкологических больных

В данной главе приводятся результаты сравнительного патоморфологического исследования двух лекарственных форм просидола, аспирина и изониазида Просидол - производное оксипиперидина -оригинальный синтетический анальгетик центрального действия Созданная в Институте химических наук им А Б Бектурова лекарственная форма препарата представляла собой 1% раствор в изотоническом растворе хлорида натрия В эту лекарственную форму был введен стабилизатор, что потребовало дополнительных токсикологических исследований

Нами были изучены обе лекарственные формы препарата при внутримышечном введении в течение 10 дней в эквитоксических дозах 1 % раствор - в разовых дозах 1 и 0,6 мг/кг, стабилизированная лекарственная форма - в разовых дозах 0,8 и 0,4 мг/кг Суммарно примененные дозы препарата превышали дозу, рекомендуемую для человека, в 10 и 20 раз

Проведенные исследования показали, что изученные лекарственные формы просидола по своему токсическому воздействию на ткани печени, почек и сердца не отличаются друг от друга Применение обеих лекарственных форм просидола независимо от дозы приводило к появлению в печени стойкого умеренного отека вокруг центральных вен, сохранявшегося до конца эксперимента В почках при введении препарата в дозе, 20-кратно превышающей терапевтическую, на 1 сутки в корковой зоне была обнаружена деструкция отдельных нефронов и небольших групп извитых канальцев К

концу наблюдения (30 сутки после курса) были выявлены множественные мелкие очаги некроза извитых канальцев и отдельных нефронов в стадии организации При применении лекарственных форм просидола в дозе, в 10 раз превышающей рекомендуемую для человека, очагов некроза выявлено не было, однако через месяц после курса введений препарата сохранялись дистрофические изменения

При применении обеих лекарственных форм просидола в суммарных дозах, в 20 раз превышающих терапевтическую, в сердечной мышце были найдены признаки токсической кардиомиопатии При введении лекарственных форм просидола в более низких дозах изменений в сердечной мышце не выявлено

Введение 1% раствора просидола в разовой дозе 1 мг/кг вызывало в легких по окончании курса утолщение стенок альвеол, сужение их просвета за счет полнокровия капилляров аэрогематического барьера, набухание и вакуолизацию эндотелия капилляров В отдельных альвеолах был найден экссудат При применении стабилизированной лекарственной формы препарата в эквитоксической дозе в легких было выявлено только утолщение стенок альвеол за счет полнокровия капилляров К концу наблюдения изменений в ткани легкого найдено не было При введении низких доз просидола в обеих лекарственных формах морфологических изменений в легких не выявлено

При введении стабилизированной лекарственной формы просидола в разовой дозе 0,8 мг/кг в экзокринной части поджелудочной железы появлялись единичные мелкие очаги микронекроза Низкая доза препарата повреждающего действия на ткань поджелудочной железы не оказывала

Кроме того, у крыс, получавших просидол в стабилизированной лекарственной форме в дозе 0,8 мг/кг, сразу после курса в подслизистом слое желудка появлялись немногочисленные очаговые лимфо-гистиоцитарные

инфильтраты Применение препарата в дозе 0,4 мг/кг изменений в слизистой оболочке желудка не вызывало

Таким образом, изменение лекарственной формы просидола привело к ослаблению повреждающего действия препарата на ткань легкого Это особенно важно, так как известно, что просидол оказывает влияние на дыхательный центр [Пралиев КД и соавт, 1991], и дыхательная недостаточность является одним из противопоказаний для введения препарата С другой стороны, при введении в лекарственную форму просидола стабилизирующих веществ появились дополнительные точки приложения его повреждающей активности, что проявилось в нарушении структуры желудка и поджелудочной железы.

Аспинат - шипучий аспирин, созданный в России - относится к группе нестероидных противовоспалительных препаратов, является

противовоспалительным, жаропонижающим, болеутоляющим средством Его токсические свойства были изучены нами в сравнении с шипучим аспирином фирмы Bayer (Германия) Препараты применяли в дозах 150 мг/кг и 250 мг/кг ежедневно в течение 30 дней Суммарные дозы составили МПД и ЛД50

При сравнительном патоморфологическом исследовании двух лекарственных форм аспирина удалось установить, что повреждающее действие аспината на ткани печени и почек по сравнению с аспирином С выражено слабее На 1 сутки после курса введений аспината в дозе 250 мг/кг в печени был выявлен умеренный отек ткани вокруг центральных вен, который исчезал к концу наблюдения При курсовом введении аспирина С в эквитоксической дозе на 1 сутки был обнаружен сильный отек вокруг центральных вен, зернистая и вакуольная дистрофия гепатоцитов К концу наблюдения структура ткани восстанавливалась При применении препаратов в дозе, суммарно составляющей МПД, повреждений в ткани печени найдено не было

Введение аспината в дозе 250 мг/кг вызывало сильный периваскулярный отек и изменения в клубочках (полнокровие капилляров, вакуолизацию их эндотелия, расширение просвета капсулы клубочков) При применении аспината в дозе 150 мг/кг о отмечен только умеренный периваскулярный отек К 30 суткам после курса введений в структуре почки изменений не найдено

Использование аспирина С в дозе 250 мг/кг приводило, помимо сильного периваскулярного отека, к развитию повреждений как в клубочковом, так и в канальцевом аппарате почки На 1 сутки после введений изменения в клубочках были такими же, как при применении аспината В отдельных дистальных канальцах были выявлены признаки деструкции клеток, в просвете - белковые массы Умеренный отек сохранялся до конца наблюдения При применении аспирина С в дозе 150 мг/кг на 1 сутки после курса возникал умеренный периваскулярный отек, который исчезал к концу эксперимента

Применение аспината в дозах, суммарно соответствующих МПД и ЛД50, вызвало повышенное слизеобразование в клетках покровно-ямочного эпителия желудка и в бокаловидных клетках слизистой оболочки кишечника При этом никаких повреждений собственно слизистой оболочки желудка выявлено не было

Помимо новых лекарственных форм анальгетиков центрального действия и жаропонижающих противовоспалительных средств, широко используемых в терапии онкологических больных, в качестве средства сопровождения нами была исследована новая лекарственная форма изониазида Выбор этого препарата связан с тем, что у онкологических больных микобактериальные инфекции возникают чаще, чем в общей популяции, что обусловлено повышенной восприимчивостью больных к инфекции либо реактивацией туберкулеза Терапия изониазидом назначается и больным, получающим вакцину БЦЖ для лечения поверхностного переходноклеточного рака мочевого пузыря [Давыдов М И, Вышковский Г Л, 2005] Изониазид является базовым

антимикобактериальным препаратом и входит во все терапевтические схемы лечения туберкулеза Быстрая элиминация препарата и низкий процент его доставки в инфекционный очаг обусловливает периодичность его введения для поддержания постоянной терапевтической концентрации в крови С целью получения пролонгированной лекарственной формы изониазид был иммобилизован на композиционный полимерный носитель На основе иммобилизованного изониазида был разработан новый препарат для лечения туберкулеза изоглиопэк, который проявил высокую специфическую активность в эксперименте Изучение токсичности изоглиопэка проводилось в сравнении с изониазидом

Иммобилизованный изониазид, примененный в хроническом токсикологическом эксперименте на собаках в дозах, суммарно превышающих терапевтическую в 2-3 раза, проявил слабые гепато-, нефро- кардио- и гонадотоксические свойства Введение препарата в дозе, суммарно составляющей одну терапевтическую дозу, не приводило к появлению патологических изменений в органах и тканях собак

В сравнительных экспериментах, проведенных на крысах, удалось установить, что иммобилизация изониазида на полимерный носитель не повлияла на спектр органов-мишеней препарата, а также характер и интенсивность его повреждающего действия на структуру печени, почек и сердца В то же время гонадотоксические свойства препарата значительно ослабились, что может быть связано с затруднением его проникновения через гемато-тестикулярный барьер либо со снижением концентрации изониазида в крови в связи с медленным высвобождением препарата из пролонгированной лекарственной формы

Иммобилизация изониазида привела также к ослаблению способности препарата вызывать внутрисосудистый гемолиз, об интенсивности которого

можно было судить по количеству сидерофагов и отложений гемосидерина в красной пульпе селезенки

Данные, полученные при патоморфологическом исследовании, коррелировали с клинико-лабораторными показателями подопытных животных В отличие от изониазида, изоглиопэк не вызывал задержки прироста массы тела, изменений биохимических показателей сыворотки крови, уменьшения массового коэффициента печени

Таким образом, с помощью патоморфологического исследования удалось установить, что введение в лекарственную форму просидола стабилизирующих веществ изменяет его токсические свойства, ослабляя легочную токсичность, но создавая дополнительные точки приложения его повреждающей активности в виде нарушений структуры желудка и поджелудочной железы Изменение лекарственной формы аспирина приводит к ослаблению нефро- и гепатотоксичности препарата, однако, вызывает повышенное слизеобразование в желудке и кишечнике По спектру токсического действия изоглиопэк практически не отличается от изониазида, однако степень выраженности его токсического действия значительно ниже

2. Экспериментальные подходы к выявлению новых видов специфической активности на основе патоморфологического изучения структуры внутренних органов животных, проведенного в ходе доклинических токсикологических экспериментов

2 1 Новый противоопухолевый препарат олипифат

Препарат олипифат представляет собой многокомпонентную смесь веществ, образованную в процессе окислительной деполимеризации лигнина Олипифат был создан в ГУ НИИ онкологии им проф НН Петрова В эксперименте на животных олипифат проявил противоопухолевую активность

на ряде штаммов перевиваемых опухолей и спонтанных опухолях мышей и крыс [Филов В А и соавт, 2000]

Предклиническое исследование хронической токсичности олипифата показало, что его побочное действие при внутримышечном введении проявляется только в виде местно-тканевых реакций При микроскопическом исследовании в мышце бедра крыс, получавших олипифат в разовой дозе 100 мг/кг в течение 5 дней (терапевтическая доза и режим), на 3-й сутки после курса был обнаружен некроз мышечной ткани на месте введения препарата В неповрежденной мышечной ткани был отмечен сильный отек мышечных волокон и соединительной ткани между ними Все зоны повреждения и область неповрежденной мышечной ткани были обильно инфильтрированы макрофагами У трех крыс из пяти на 3-й сутки по окончании введений в мышце бедра были найдены структуры небольших размеров, по морфологическому строению напоминавшие лимфоузлы, содержащие в корковой зоне 1-3 фолликула На 30 сутки после курса введений такие структуры были найдены у двух животных из пяти

Таким образом, нами была обнаружена способность олипифата индуцировать эктопический неогенез лимфоузлов в мышечной ткани крыс в зонах, близких от места введения Было выдвинуто предположение о том, что это неизвестное ранее свойство препарата обусловлено не только местно-тканевой реакцией на введенное вещество, но также его иммуномодулирующей и гемостимулирующей активностью.

В данной главе на здоровых мышах и крысах была подтверждена возможность формирования структур, по морфологическому строению не отличающихся от лимфоузлов, в области внутримышечного введения олипифата Было показано, что у животных с опухолями в области введения олипифата возникают очаги миелоидного кроветворения, заключенные в капсулу из плотной волокнистой соединительной ткани У мышей, получавших

циклофосфамид (ЦФ) в комбинации с олипифатом, в бедренной мышце формируются как лимфоузлы, так и очаги миелоидного кроветворения

Продемонстрировано, что введение препарата вызывает у мышей и крыс выраженные гиперпластические реакции в лимфоидной ткани центральных и периферических органов иммуногенеза и стимулирует экстрамедуллярное кроветворение в селезенке и лимфоузлах У животных с опухолью при введении олипифата в селезенке и лимфоузлах возникают такие же изменения, как у здоровых животных, получавших олипифат в той же дозе и режиме, а морфологическое строение тимуса не отличается от интактного контроля

Показано, что олипифат обладает способностью защищать лимфоидные органы от повреждающего действия ЦФ При его введении после инъекции ЦФ в селезенке, тимусе и лимфоузлах процессы гипоплазии и аплазии не развиваются, и их структура не отличается от интактного контроля При применении олипифата до введения ЦФ в селезенке, тимусе и лимфоузлах происходит гиперплазия лимфоидной ткани по тому же типу, что и у здоровых животных, получавших олипифат Олипифат обладает способностью препятствовать угнетению кроветворения при применении ЦФ Введение олипифата мышам, привитым сингенной опухолью, способно скорректировать их иммунологическую противоопухолевую реактивность

Таким образом, олипифат обладает иммуномодулирующей и гемостимулирующей активностью Его существенной особенностью является способность активировать процессы метаплазии в рыхлой волокнистой соединительной ткани с образованием органов гемопоэза

Известно, что лимфоузлы возникают спонтанно при длительных хронических воспалительных процессах, длительно незаживающих ранах, аутоиммунных заболеваниях [Ruddle N Н , 1999] Примеры таких ситуаций, при которых воспаление сохраняется длительный период времени, а возникающий при этом лимфоидный инфильтрат приобретает вид нового лимфоидного

органа - лимфоидные скопления при болезни Хашимото человека или тиреоидитах крыс, инфильтраты в тимусе при миастении и в суставах при ревматоидном артрите Характерная особенность хронического гастрита, вызванного Helicobacter pylori, - наличие лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистой оболочкой желудка, состоящей из лимфоидных скоплений и организованных фолликулов В норме они не встречаются и исчезают при излечении, что говорит о том, что Helicobacter pylori - агент, инициирующий их возникновение [Mazzucchelli L et al, 1999] Лимфоидные фолликулы были найдены у больных в ткани печени при хроническом гепатите С [Weyand С М et al, 2001]

Специфические свойства лимфоидного неогенеза состоят в накоплении лимфоцитов, разделении их на Т- и В-клеточные зоны, которые продуцируют те же изотипы иммуноглобулинов, что и нормальные лимфоидные органы, наличии венул с высоким эндотелием [Sacca R et al, 1996] В последние годы стало известно, что в развитии лимфоидных органов ключевую роль играют медиаторы воспаления и цитокины семейства лимфотоксинов (лимфотоксин (ЛТ) и фактор некроза опухоли (ФНО)) [Hjelmstroem Р et al, 2000] В развитии лимфоузлов и в хроническом воспалении принимают участие комбинации ЛТ-oi, ЛТ-/3 и ФНО-ог, а также их множественные рецепторы [Ruddle N Н, 1999] Неоорганогенез лимфоузлов был получен на трансгенных мышах в почке и поджелудочной железе с помощью эктопической экспрессии цитокинов семейства ФНО [Fan L et al, 2000, Luther S A et al, 2000] При этом показано, что вновь образованные лимфоузлы имеют не только соответствующее морфологическое строение, но также и характерные антигенные особенности [Sacca R et al, 1996, Sacca R et al, 1997]

Наблюдавшийся в наших экспериментах неоорганогенез лимфоузлов -первый случай индукции лимфоидного неоорганогенеза с помощью экзогенного вещества. По-видимому, олипифат обладает способностью

стимулировать макрофаги, запуская продуцирование ими ФНО-а, а последующий каскад взаимодействий цитокинов приводит к эктопическому образованию лимфоузлов

2 2 Модификатор биологических реакций аскорбиген

Аскорбиген (АСГ) - индольное производное аскорбиновой кислоты - был синтезирован в ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им Г Ф Гаузе РАМН Аскорбиген - природное соединение, он является главным продуктом трансформации алкалоида глюкобрассицина, который содержится в высоких концентрациях в овощах семейства крестоцветных Известны его антиканцерогенные и антитоксические свойства [8еркоУ1с et а1,1994,

КгаусЬепко Ь V ега1,2001]

При проведении токсикологических исследований АСГ вводили мышам ВБР] перорально в дозах 100 и 250 мг/кг в течение 14 дней с интервалом 24 часа Патоморфологическое исследование показало, что препарат вызывает изменения в органах желудочно-кишечного тракта и иммунной системы, которые мы условно разделили на деструктивные и компенсаторно-приспособительные [Саркисов Д С , 1987]

При применении АСГ в дозе 100 мг/кг деструктивные изменения не возникали Они были выявлены в слизистой оболочке желудка и различных отделов тонкой кишки при введении АСГ в дозе 250 мг/кг На 1 сутки после курса в кардиальном отделе желудка эпителий части желез подвергался деструкции и замещался покровно-ямочным Покровно-ямочный эпителий метаплазировал в высокий цилиндрический кишечный эпителий, который на отдельных участках выполнял поверхность слизистой оболочки желудка Железы под цилиндрическим эпителием по структуре были схожи с криптами тонкой кишки Клетки Панета встречались не только среди клеток покровно-ямочного эпителия, но и среди клеток цилиндрического эпителия, а также в кардиальных железах В зонах метаплазии и деструкции желез было выявлено

разрастание собственной пластинки слизистой оболочки в области дна желез Встречались единичные участки атрофии слизистой оболочки с признаками склероза В фундальном и пилорическом отделах желудка процессы деструкции и метаплазии были выражены несколько слабее

В двенадцатиперстной кишке при применении АСГ в дозе 100 мг/кг изменений структуры слизистой оболочки найдено не было При введении АСГ в дозе 250 мг/кг в просвете крипт появлялись рыхлые белковые массы или клеточный детрит На отдельных участках выявлена метаплазия кишечного эпителия в покровно-ямочный, деструкция бруннеровых желез с образованием кист Такие же изменения были обнаружены в тощей и подвздошной кишке

К компенсаторно-приспособительным реакциям мы отнесли процессы гиперплазии Они затрагивали цилиндрический эпителий ворсинок всех отделов тонкой кишки Причем, это касалось не только собственно энтероцитов, но и бокаловидных клеток В криптах гиперплазии подвергались клетки Панета Явления гиперплазии возникали при применении АСГ как в дозе 100 мг/кг, так и в дозе 250 мг/кг

Применение АСГ стимулировало иммунную систему кишечной стенки Существенно увеличивалось число интраэпителиальных лимфоцитов Реакция Пейеровых бляшек на введение препарата выражалась в увеличении их размеров, увеличении числа фолликулов в них, появлении центров размножения в фолликулах Интенсивность изменений зависела от дозы препарата При повышении дозы АСГ усиление активности клеток Панета и активация системы локального иммунитета сопровождались нарастанием токсического влияния АСГ на слизистую оболочку кишки, описанного выше

В органах иммунной системы также были отмечены как токсические, так и компенсаторно-приспособительные реакции Токсические эффекты, которые развивались при применении препарата в дозе 250 мг/кг, были представлены явлениями атрофии. Гиперпластические реакции возникали при использовании

АСГ как в дозе 100 мг/кг, так и в дозе 250 мг/кг АСГ, введенный в разовой дозе 100 мг/кг, инициировал процессы пролиферации в селезенке и лимфоузлах, что выражалось в появлении множественных очагов экстрамедуллярного кроветворения в красной пульпе селезенки и центров размножения в лимфоидных фолликулах лимфоузлов. Интенсивность физиологических изменений усиливалась с увеличением дозы соединения, но при этом нарастали токсические эффекты

На основании проведенного патоморфологического исследования было выдвинуто предположение о том, что АСГ обладает способностью усиливать барьерную функцию двух важнейших систем защиты организма, кишечника и лимфоидных органов

Экспериментальные исследования, посвященные поиску новых видов специфической активности АСГ, показали, что препарат обладает токсикомодифицирующими свойствами Его использование в комбинации с ЦФ приводит к значительному ослаблению кишечной токсичности цитостатика и более быстрому восстановлению повреждений слизистой оболочки тонкой кишки Это свойство препарата, по-видимому, объясняется способностью АСГ активировать клетки Панета и бокаловидные клетки Известно, что цитостатики повреждают в первую очередь пролиферирующие популяции клеток, а высоко дифференцированные клетки, в данном случае клетки Панета и бокаловидные клетки, хотя и подвергаются патологическим изменениям [Pinkerton CR et al, 1982], повреждаются в меньшей степени [Verbürg М et al, 2000] Они и вносят основной вклад в регенерацию слизистой оболочки тонкой кишки [Jeynes В J et al, 1978, Verbürg М et al, 2002]

При комбинированном применении АСГ с цитостатиком удалось предотвратить развитие атрофических изменений в органах иммунной системы и ослабить проявления токсической алопеции В основе данного проявления защитной активности АСГ, вероятно, могут лежать антиоксидантные свойства

АСГ [Patil Р N et al, 2004], так как предотвращение окислительного стресса, индуцируемого ЦФ, способствует снижению его повреждающего действия на лимфоидную ткань [Manda К, Bhatia A L , 2003]

Другой вид активности АСГ, обнаруженный на основании патоморфологических исследований, - индукция дифференцировки и ускорение созревания слизистой оболочки кишечника новорожденных мышей Полученные нами данные свидетельствуют о специализации клеток эпителия кишки у мышат, получавших АСГ, в более ранние сроки

Ускорение созревания эпителия развивающейся кишки усиливало устойчивость кишечника к бактериальной инфекции, что позволяло предотвратить транслокацию микроорганизмов через стенку кишки Введение АСГ перед оральным заражением мышат Staphylococcus aureus приводило к снижению процента высева микроорганизмов из печени, почек и селезенки более чем в 2 раза, а из крови в 3 раза по сравнению с животными, не получавшими АСГ

В специальных экспериментах было показано, что АСГ обладает свойствами антимикробного агента и регулятора микрофлоры кишечника Оральное введение АСГ мышатам с неспецифическим энтеритом, полностью прекращало диарею и способствовало улучшению количественных показателей микрофлоры кишечника Мышата, не получавшие АСГ, погибали в 80% случаев

Механизмы, посредством которых АСГ реализует свое стимулирующее воздействие на процессы созревания слизистой оболочки тонкой кишки, не ясны В антимикробном эффекте АСГ ключевую роль, по-видимому, играет увеличение количества клеток Панета и усиление их секреторной активности [Stappenbeck Т S et al, 2002] Клетки Панета обеспечивают врожденный иммунный ответ и вносят вклад в барьерную функцию слизистой оболочки посредством выделения гранул, содержащих разнообразные

антибактериальные продукты, включая дефенсины, которые проявляют высокую специфичность по отношению к микроорганизмам-мишеням

Таким образом, прогноз на основе данных патоморфологического исследования позволил выявить новые виды фармакологической активности АСГ На основе АСГ может быть создан модификатор токсичности цитостатиков, препарат для предупреждения и лечения инфекционных заболеваний АСГ может быть применен и в педиатрии с целью ускорения дифференцировки и созревания кишечного эпителия у недоношенных младенцев

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные нами исследования свидетельствуют о высокой информативной значимости результатов патоморфологического изучения структуры внутренних органов экспериментальных животных для доклинической оценки безопасности лекарственных средств Морфологическая диагностика патологических процессов, происходящих под действием фармакологических веществ, основывается на регистрации общепатологических признаков, таких как атрофия, гипертрофия, некроз, нарушения кровообращения, дистрофии и т п Проведенные исследования показали, что, оперируя понятиями общей патологии, можно установить такие важные в доклинической токсикологии характеристики токсического действия лекарственного средства, как орган-мишень, зависимость от дозы и обратимость токсических эффектов препарата В нашем исследовании они были определены для малотоксичных лекарственных средств риалама, адаптовита и полидана

С помощью морфологических исследований были установлены особенности повреждающего действия препарата в зависимости от его лекарственной формы в тех случаях, когда они не определялись другими методами На примере просидола, аспирина и изониазида было показано, что от

лекарственной формы зависит не только интенсивность, но и направленность токсического действия препарата Патоморфологическое исследование продемонстрировало снижение кардио- и гонадотоксичности при изменении лекарственной формы доксорубицина, что получило подтверждение в функциональных тестах

Деструктивные изменения органов визуально выявляются значительно проще компенсаторных, поэтому при изучении патологических процессов им уделяется больше внимания, чем защитно-приспособительным реакциям Понимая условность разделения структурных изменений на деструктивные и компенсаторно-приспособительные, мы, тем не менее, считаем такой подход плодотворным, так как он позволяет во многих случаях различить проявления токсических свойств фармакологического средства от проявлений его специфической активности Это нашло подтверждение в представленном исследовании модификаторов биологических реакций для адаптовита, риалама и полидана были выявлены такие изменения структуры внутренних органов, которые указывали на их специфическую активность и служили основой для предположений о механизмах действия препаратов

Деление изменений структуры внутренних органов экспериментальных животных на деструктивные и компенсаторно-приспособительные позволило прогнозировать и затем подтвердить экспериментально новые виды фармакологической активности аскорбигена При изучении олипифата исследование компенсаторно-приспособительных реакций привело не только к прогнозированию новых видов активности препарата, но и к открытию реакции организма, имеющей общебиологическое значение Нами было экспериментально обнаружено и теоретически обосновано неизвестное ранее свойство олипифата, вызывать формирование лимфоузлов в мышечной ткани животных в зонах, близких от места введения Открытие этого явления дало в

руки исследователей простую экспериментальную модель и создало основу для поиска путей целенаправленного влияния на процессы органогенеза

Полученные в настоящем исследовании данные изменили и расширили сложившиеся представления о роли патоморфологических исследований в доклинической токсикологии лекарств

ВЫВОДЫ

1 Разработан методологический подход к патоморфологической оценке токсичности лекарственных веществ, заключающийся в делении вызванных ими структурных изменений на деструктивные и компенсаторно-приспособительные

2 Разработаны принципы доклинической токсикологической оценки малотоксичных веществ (полидан, риалам и адаптовит), позволяющие установить органы-мишени, дозовую зависимость и обратимость повреждающего действия

3 Определены особенности токсического действия 11 противоопухолевых препаратов и средств сопровождения терапии онкологических больных

4 Выявлены общие черты и характерные особенности токсического действия комплексных соединений палладия эфазола и морфозола и установлена роль патоморфологического исследования в определении взаимосвязи между структурой и активностью фармакологических веществ

5 Продемонстрирована роль лекарственной формы препарата в проявлении токсичности Установлено значительное ослабление кардиотоксических и гонадотоксических свойств доксорубицина при применении его в наносомальных лекарственных формах, содержащих полисорбат 80

6 Установлено, что замена в лекарственной форме аспирина аскорбиновой кислоты (аспирин С) на карбонат натрия (аспинат) ослабляет повреждающее действие препарата на ткани печени и почек, но вызывает повышенное слизеобразование в желудке и кишечнике

7 Показано, что введение стабилизатора в лекарственную форму просидола ослабляет его повреждающее действие на ткань легкого, но приводит к появлению деструктивных изменений в поджелудочной железе и слизистой оболочке желудка

8 Установлено, что иммобилизация изониазида на полимерный носитель значительно ослабляет его гонадотоксические и гемолитические свойства, не влияя на спектр органов-мишеней препарата, характер и интенсивность его повреждающего действия на структуру печени, почек и сердца

9 На основе разработанного методологического подхода осуществлен прогноз новых видов фармакологической активности аскорбигена и олипифата, подтвержденный в специальных исследованиях

10 Установлена способность аскорбигена усиливать защитную функцию слизистой оболочки тонкой кишки, оказывать антибактериальное действие, модифицировать токсичность циклофосфамида, ускорять дифференцировку клеток кишечника новорожденных мышей

11 Выявлена токсико-модифицирующая, иммуномодулирующая и гемостимулирующая активность олипифата

12 Установлено неизвестное ранее свойство препарата олипифат вызывать образование лимфоузлов в мышечной ткани животных, обусловленное местно-тканевой реакцией на введенное вещество, а также его иммуномодулирующей и гемостимулирующей активностью

Список опубликованных работ

1 Бодягин Д А, Трещалин И Д, Переверзева Э Р , Асафов А В ,

Безелев В В Полидан - новый гематостимулятор на основе ДНК из молок осетровых рыб // Человек и лекарство Тез докл II Российского национального конгресса - М, 1995 - С 209

2. Бычков М Б , Борисов В И, Бодягин Д А, Возный Э К, Гарин

А М , Горбунова В А, Гершанович М Л, Корман Д Б , Переверзева Э Р , Сыркин А Б , Трещалин И Д, Трещалина Е М Полидан - новый стимулятор лейкопоэза у онкологических больных//Вестник ОНЦ АМН России - 1997 №2 - С 41-49.

3 Бычков М Б , Бодягин Д А , Борисов В И, Возный Э К , Горбунова В А , Корман Д Б , Переверзева Э Р , Сыркин А Б , Трещалин И Д , Трещалина Е М Полидан - новый стимулятор лейкопоэза у онкологических больных // Клинический вестник -1997 №1 - С 85-86

4 Бодягин Д А , Бухман В М , Трещалин И Д, Переверзева Э Р , Бравова Г Б , Шишкова Э А, Иванова Н Г, Сухих О А Гематостимулирующая и противоопухолевая активность препарата адаптовит // Человек и лекарство Тез докл V Российского национального конгресса - М, 1998 - С 349

5 Трещалин И Д, Кримкер В М, Бодягин Д А, Переверзева Э Р , Иванова Н А , Ефименко И А Эфазол — представитель нового класса палладийсодержащих радиомодификаторов // Человек и лекарство Тез докл V Российского национального конгресса -М, 1998 - С 626

6 Королев А М, Преображенская М Н, Переверзева Э Р Аскорбигены и их метаболиты как потенциальные лекарства или

пищевые добавки лекарственного происхождения // Y Международный симпозиум «Биологически активные добавки к пище и проблемы здоровой семьи» - Красноярск, 2001 -С 128

7 Бухман В М, Бодягин Д А, Переверзева Э Р, Трещалин И Д, Исакова Е Б , Кривошеев С Е , Резцова В В , Филов В А Влияние нового противоопухолевого препарата олипифата на реакции противоопухолевого иммунитета у мышей // Бюлл Эксп Биол Мед -2001 Т 132 -№10 - С 446-449

8 Bukhman V М , Bodyagm D.A, Pereverzeva Е R., Treshchahn ID, Isakova E B, Krivosheev S E , Reztsova V V , Filov V A Effect of Novel Antineoplastic Drug Olipifat on Antitumor Immunity m Mice //Bull Exp Biol Med -2001.№4 -P993-995

9 Трещалин И Д, Бодягин Д А , Переверзева Э Р , Бухман В М , Ефименко И А, Либензон А В. Новый противоопухолевый препарат морфозол // Российский биотерапевтический журнал. -2002 Т 1 - №2 - С 146-147 Материалы Всероссийской научно-практ конф «Отечественные противоопухолевые препараты» -М,2002

10 Бухман В.М, Бодягин ДА, Переверзева ЭР, Трещалин ИД., Исакова Е Б, Кривошеев С Е, Резцова В В., Филов В А Оценка иммунокорригирующей и иммунотерапевтической активности олипифата в экспериментах на мышах // Сателлитный симпозиум «Новый отечественный препарат олипифат» Всероссийская научно-практическая конференция «Отечественные противоопухолевые препараты» - М, 2002 -С.67-72

11 Бодягин Д А, Переверзева Э Р, Трещалин И Д, Кривошеев С Е Влияние на индуцированную циклофосфаном цитопению

мышей // В кн «Опыт доклинического исследования на примере олипифата» - С-Пб. Ника, 2002 - С 102-104

12 Бухман ВМ, Бодягин ДА, Переверзева ЭР., Трещалин ИД, Исакова Е Б , Кривошеев С Е , Резцова В В , Филов В А Влияние на реакции противоопухолевого иммунитета у мышей // В кн «Опыт доклинического исследования на примере олипифата» - С-Пб Ника, 2002 - С 218-223

13 Переверзева Э Р , Бодягин Д А , Трещалин И Д , Бухман В М , Исакова Е Б, Кривошеев С Е, Филов В А Патоморфологическое изучение местно-тканевых реакций и состояния центральных и периферических иммунокомпетентных органов при внутримышечном введении олипифата // В кн «Опыт доклинического исследования на примере олипифата» -С-Пб Ника, 2002 - С 223-230

14 Переверзева Э Р , Бодягин Д А, Трещалин М И, Трещалин И Д, Королев А М, Преображенская М Н, Бухман В М Биологическая активность аскорбигена - важнейшего компонента диет, содержащих капусту и другие крестоцветные //Медико-фармацевтический форум -М,2002 - С 160

15 Переверзева Э Р Роль патоморфологических исследований в лекарственной токсикологии // II съезд токсикологов России Тез докл - М , 2003 - С 476

16 Кривошеев С Е , Бухман В М, Трещалин И Д, Бодягин Д А , Переверзева Э Р Влияние нового препарата олипифат на противоопухолевый иммунитет мышей Н Российский биотерапевтический журнал - 2003 Т 2 - №1 - С 7 Материалы научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» - М , 2003

17 Трещалин M И, Бодягин Д А, Переверзева Э Р, Трещалин И Д, Бухман В М. Влияние аскорбигена на кроветворение и защитную функцию тонкой кишки // Российский биотерапевтический журнал - 2003 Т2. - №1 - С 44 Материалы научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» - M, 2003

18 Мирчинк ЕП, Исакова ЕБ, Переверзева ЭР, Бухман В M Противобактериальная активность аскорбигена и его влияние на алопецию у мышей, вызванную применением циклофосфамида // Российский биотерапевтический журнал - 2003 № 1 - С 34

19 Переверзева ЭР, , Бодягин Д А, Трещалин И Д, Бухман В M, Филов В А, Беркович A M, Кривошеев С Е. Свойство продуктов глубокого гидролиза лигнина, содержащих гуминовые кислоты, вызывать эктопический неогенез лимфатических узлов в мышечных тканях животных // Сборник кратких описаний научных открытий, научных гипотез - M, -

2004 вып 2 - С 20-22

20 Pereverzeva Е R, Mirchink Е Р , Isakova Е. В , Preobrazhenskaya M N, Bukhman V M Ascorbigen accelerates small intestine anti-mfective barrier fonction m suckling mice // Intern J Antimicrobal Agents. 6th Congress of ECC@RICAI - Pans - France, 2004 v 24 -S233

21 Трещалин И Д, Бодягин Д А , Переверзева Э Р., Ефименко И.А Повышение эффективности лечения злокачественных опухолей с помощью нового комплексного соединения палладия - эфазола в эксперименте // Российский биотерапевтический журнал -

2005 Т 4 - №1 - С 73 Материалы IV научно-практической

конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» - М, 2005.

22 Трещалин И Д, Переверзева Э Р , Бодягин Д.А , Мирчинк Е.П, Бухман В М Модификация токсичности противоопухолевых препаратов как метод повышения эффективности химиотерапии злокачественных новообразований // Российский биотерапевтический журнал - 2005 Т 4 - №3 - С 87 - 94

23 Переверзева ЭР, Трещалин ИД, Бодягин ДА, Преображенская М Н, Бухман В М Пероральное применение аскорбигена с целью ускорения репарации индуцированных циклофосфамидом повреждений тонкой кишки и лимфоидных органов мышей // Российский биотерапевтический журнал -2005 Т 4 - № 4 - С 129-133

24 Skidan I, Khalansky А, Pereverzeva Е , Bukhman V , Tanski S , Severm S , Gelpenna S , Kreuter J Protection against doxorubicin-mduced testicular toxicity by poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles // Transact 31st Annual Meetmg of the Controlled Release Soc - Honolulu - Hawaii - 2004abstr #518

25 Gelpenna S , Pereverzeva E., Treshalm I, Bodyagin D, Khalansky A, Kunlo L, Makarova N , Maksimenko О , Kreuter J Reduced toxicity of doxorubicin bound to polysorbate 80-coated poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles // Proc XV Microencapsulation Symp -Parma - Italy, 2005 -P 147-148

26 Преображенская M H, Бухман В M, Переверзева Э Р, Королев А М, Резникова М И, Трещалин М.И., Трещалин И Д, Мирчинк Е П, Бодягин Д А, Садовников С В , Соснов А.В Способ повышения неспецифической резистентности организма // Патент РФ № 2235543 от 10 сентября 2004 г

27. Переверзева Э Р, Бодягин Д А., Трещалин И Д, Бухман В М, Филов В.А., Беркович А М., Кривошеее С.Е. «Свойство продуктов глубокого гидролиза лигнина, содержащих гуминовые кислоты, вызывать эктопический неогенез лимфатических узлов в мышечных тканях животных» // Диплом на открытие №233 от 27 октября 2003 г.

28. Переверзева Э Р., Бодягин Д А, Трещалин И.Д., , Филов В А. Беркович А.М, Бухман В.М. Препарат олипифат - индуктор неогенеза лимфоузлов // Материалы X Международного Съезда «ФИТОФАРМ 2006». - С-Пб., 2006. - С. 250.

29. Переверзева ЭР., Трещалин ИД, Бодягин Д.А., Бухман ВМ. Экспериментальная оценка токсических свойств адаптогенов природного происхождения адаптовита и риалама // Материалы X Международного Съезда «ФИТОФАРМ 2006» - С-Пб., 2006. -С.253

30. Переверзева Э Р, Трещалин М.И., Трещалин И.Д, Мирчинк Е П, Исакова Е Б, Бодягин Д А., Бухман В.М Аскорбиген -модификатор токсичности циклофосфана. // Материалы X Международного Съезда «ФИТОФАРМ 2006». - С-Пб., 2006 -С 256.

31. Переверзева Э.Р., Мирчинк Е.П., Исакова ЕБ., Бухман ВМ., Преображенская М.Н Усиление антимикробного барьера тонкой кишки новорожденных мышей при пероральном введении аскорбигена // Антибиотики и химиотерапия. - 2006. Т. 51 - №2. - С.13-17.

Подписано в печать 12 03.07 г. Формат 60x84/16 Тираж 100 экз Заказ № 188 Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им Н Н Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш, 24

Актуальность проблемы

Прогноз безопасности применения лекарственных средств является важнейшей задачей доклинического исследования. Ограниченные возможности экспериментальных моделей, используемых в лекарственной токсикологии, не позволяют установить все неблагоприятные эффекты фармакологического вещества [100, 159]. Токсикологические проблемы, которые должны быть определены на стадии предклинического изучения, часто проявляются при клинических испытаниях или даже во время клинического использования [129]. Несмотря на постоянное совершенствование методических подходов, проблема выявления побочного действия лекарственных средств в эксперименте остается актуальной [78].

Этические нормы резко ограничивают проведение токсикологических исследований на высших животных [35]. Альтернативные методы оценки токсичности (чаще всего биохимические тест-системы с использованием культур клеток) находят все более широкое применение [49, 53, 111, 122, 123, 173]. Однако, в настоящее время при оценке безопасности новых лекарственных препаратов эксперименты на животных альтернативы не имеют [182]. Трудоемкость, длительность и большая стоимость исследований на животных делает актуальным повышение уровня их информативности.

Тенденции современной фармакологии - создание эффективных лекарственных средств на основе малотоксичных соединений, поиск менее токсичных структурных аналогов эффективных препаратов, разработка технологичных лекарственных форм, улучшающих биодоступность и обеспечивающих усиление фармакологического эффекта. Развитие этих направлений привело к возникновению ряда проблем в лекарственной токсикологии. Одна из них состоит в том, что повреждающее действие малотоксичных лекарственных средств, как правило, не удается выявить с помощью клинико-лабораторных исследований. Для препаратов этого класса токсичности стало актуальным выявление органов-мишеней, зависимости степени повреждающего действия от величины примененной дозы и обратимости деструктивных процессов.

Установление различий в токсических эффектах близких по структуре фармакологических веществ также представляет определенные трудности. В целях предсказания токсичности химических соединений определенных классов используются различные системы моделирования, которые лишь отчасти позволяют определить степень токсичности данного соединения, но нивелируют различия между соединениями одной группы [129].

Остается актуальным и выявление особенностей токсического действия новых лекарственных форм препаратов. При изменении лекарственной формы нередко возникают новые виды повреждающей активности фармакологического вещества, которые не проявляются при функциональных тестах.

Патоморфологические исследования включены в современные программы доклинических токсикологических испытаний новых лекарственных средств. Однако их возможности используются далеко не в полной мере [30]. Так, на основе патоморфологических исследований может осуществляться прогнозирование токсических реакций организма на введение препаратов, относящихся по классификации токсичности к малотоксичным веществам. Патоморфологические исследования могут способствовать выявлению взаимосвязи между структурой и активностью фармакологического средства, а также внести свой вклад в решение проблемы выбора оптимальной лекарственной формы.

В лекарственной токсикологии патоморфологические исследования направлены на выявление деструктивных изменений. Что же касается ответных компенсаторных реакций органов и тканей на введение фармакологического вещества, то они, как правило, не учитываются. Между тем, анализ компенсаторно-приспособительных процессов, возникающих под действием лекарственного средства, позволяет оценить вероятный механизм действия препарата и на стадии доклинического изучения прогнозировать иные виды его фармакологической активности. Эта информация необходима при определении наиболее перспективного вида активности для продвижения препарата в клинику или расширении области его применения.

Все вышеизложенное определило актуальность исследования, его цели и задачи.

Цель работы. Целью настоящей работы является разработка методологических подходов к патоморфологической оценке токсичности лекарственных веществ, а также прогнозирование новых видов специфической активности на основе доклинических патоморфологических исследований.

Основные задачи исследования:

1. В субхронических и хронических экспериментах провести сравнительное патоморфологическое исследование изменений внутренних органов экспериментальных животных под воздействием ряда противоопухолевых препаратов и средств сопровождения цитостатической терапии.

2. Разработать систему оценки структурных изменений органов и тканей, позволяющую с помощью патоморфологического исследования определять органы-мишени, зависимость от дозы и обратимость повреждающего действия малотоксичных лекарственных средств.

3. Разработать патоморфологические подходы к оценке токсичности лекарственного средства в зависимости от его лекарственной формы и входящих в нее вспомогательных веществ.

4. Провести патоморфо логическую оценку возможности модификации токсических реакций посредством изменения лекарственной формы препаратов на примере доксорубицина.

5. Оценить возможности патоморфологических исследований в установлении взаимосвязи между структурой и активностью потенциальных лекарственных средств для противоопухолевой терапии на примере комплексных соединений палладия.

6. Разработать патоморфологические подходы для выявления новых видов активности потенциальных фармакологических веществ в ходе доклинических токсикологических исследований на примере препаратов олипифат и аскорбиген.

Научная новизна.

Впервые разработана система оценки патоморфологических изменений внутренних органов экспериментальных животных, позволяющая дифференцировать токсические свойства и специфическую активность потенциальных лекарственных средств.

Впервые на основе разработанной системы выявлены токсикомодифицирующая и антимикробная активность препарата аскорбиген, гемостимулирующая, иммуномодулирующая и токсикомодифицирующая активность препарата олипифат.

Впервые разработаны принципы доклинической токсикологической оценки малотоксичных фармакологических веществ, не проявляющих токсических свойств в функциональных тестах.

Впервые в результате патоморфологических исследований установлено, что при применении комплексных соединений палладия органы-мишени определяются свойствами металла, а специфика токсического действия (сроки проявления, интенсивность повреждающего действия, скорость репарации повреждений, тропность к определенным тканям) зависят от структуры лиганда.

Впервые обоснована возможность патоморфологической оценки особенностей токсических реакций в зависимости от лекарственной формы препарата.

Впервые экспериментально установлено и теоретически обосновано неизвестное ранее свойство препарата олипифат вызывать образование лимфоузлов в мышечной ткани животных, обусловленное местно-тканевой реакцией на введенное вещество, а также его иммуномодулирующей и гемостимулирующей активностью. Получено свидетельство об открытии. Научное значение открытия состоит в том, что оно расширяет представления о неоорганогенезе лимфатических узлов, его связи с местно-тканевой реакцией на экзогенные факторы, а также о возможности искусственного влияния на этот процесс.

Научно-практическое значение.

Установлены особенности токсического действия 11 лекарственных средств различных фармакологических групп, среди которых - противоопухолевые препараты и средства сопровождения терапии онкологических больных. Изучены токсические свойства полимерных носителей для создания иммобилизованных лекарственных форм препаратов.

Выявлены общие черты и характерные особенности токсичности двух близких по структуре комплексных соединений палладия - эфазола и морфозола. Препарат эфазол, который предполагается использовать для повышения эффективности лечения злокачественных опухолей и снижения побочных эффектов химио- или радиотерапии, прошел первую фазу клинических испытаний. Завершено предклиническое изучение препарата морфозол в качестве противоопухолевого средства.

Для малотоксичных средств адаптовита, риалама и полидана определены вероятные токсические реакции при передозировках. Препараты адаптовит и риалам зарегистрированы в реестре лекарственных средств РФ. Полидан в настоящее время используется в клинической практике в качестве гемостимулятора при цитостатической терапии.

Экспериментально установлена возможность снижения кардио- и тестикулярной токсичности доксорубицина при применении его в новой наносомальной лекарственной форме.

Показано, что введение в лекарственную форму просидола стабилизирующих веществ ослабляет повреждающее действие препарата на ткань легкого, но приводит к появлению деструктивных изменений в поджелудочной железе и слизистой оболочке желудка. Стабилизированная лекарственная форма просидола вошла в клиническую практику.

Установлено, что аспинат в меньшей степени повреждает ткани печени и почек по сравнению с аспирином С, но вызывает повышенное слизеобразование в желудке и кишечнике. Препарат аспинат зарегистрирован в реестре лекарственных средств РФ.

Показано, что иммобилизация изониазида на полимерный носитель не влияет на спектр органов-мишеней препарата, характер и интенсивность его повреждающего действия на структуру печени, почек и сердца, но значительно ослабляет его гонадотоксические и гемолитические свойства.

Получен патент и свидетельство об открытии.

Апробация диссертации.

Апробация проведена 30 ноября 2006 года на совместном заседании Ученого Совета ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН и Проблемной комиссии по противоопухолевым антибиотикам Межведомственного Научного Совета по антибиотикам, 28 февраля 2007 года в НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина на совместной научной конференции отдела экспериментальной химиотерапии, лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии, лаборатории фармакологии и токсикологии, лаборатории комбинированной терапии опухолей, лаборатории разработки лекарственных форм, лаборатории экспериментальной терапии метастазов, лаборатории медицинской химии, лаборатории химии природных соединений, лаборатории фармакоцитокинетики, лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории медицинской биотехнологии.

Основные положения диссертации доложены на: II, V Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1995, 1998 г.); V Международном симпозиуме «Биологически активные добавки к пище и проблемы здоровой семьи» (Красноярск, 2001 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2002, 2003, 2004, 2005 гг.); Медико-фармацевтическом форуме «Аптека - 2002» (Москва, 2002 г.); 6-ом конгрессе по антимикробной терапии ECC@RICAI (Франция, Париж, 2004 г.); на 31-ом ежегодном собрании общества Annual Meeting of the Controlled Release Soc. (Hawaii, Honolulu, 2004); на XV симпозиуме по микроинкапсуляции (Италия, Парма, 2005); 10-ом международном съезде «Фитофарм 2006» (Санкт-Петербург, 2006).

Список опубликованных работ

1. Бодягин Д.А., Трещалин И.Д., Переверзева Э.Р., Асафов А.В., Безелев В.В. Полидан - новый гематостимулятор на основе ДНК из молок осетровых рыб // Человек и лекарство. Тез. докл. II Российского национального конгресса. - М., 1995. -С.209.

2. Бычков М.Б., Борисов В.И., Бодягин Д.А., Возный Э.К., Гарин A.M., Горбунова В.А., Гершанович M.JL, Корман Д.Б., Переверзева Э.Р., Сыркин А.Б., Трещалин И.Д., Трещалина Е.М. Полидан - новый стимулятор лейкопоэза у онкологических больных // Вестник ОНЦ АМН России. - 1997. №2. - С.41-49.

3. Бычков М.Б., Бодягин Д.А., Борисов В.И., Возный Э.К., Горбунова В.А., Корман Д.Б., Переверзева Э.Р., Сыркин А.Б., Трещалин И.Д., Трещалина Е.М. Полидан - новый стимулятор лейкопоэза у онкологических больных К Клинический вестник. -1997. №1. - С.85-86.

Бодягин Д.А., Бухман В.М., Трещалин И.Д., Переверзева Э.Р., Бравова Г.Б., Шишкова Э.А., Иванова Н.Г., Сухих О.А. Гематостимулирующая и противоопухолевая активность препарата адаптовит // Человек и лекарство. Тез. докл. V Российского национального конгресса. - М., 1998. - С.349. Трещалин И.Д., Кримкер В.М., Бодягин Д.А., Переверзева Э.Р., Иванова Н.А., Ефименко И.А. Эфазол - представитель нового класса палладийсодержащих радиомодификаторов // Человек и лекарство. Тез. докл. V Российского национального конгресса. - М., 1998. - С.626. Королев A.M., Преображенская М.Н., Переверзева Э.Р. Аскорбигены и их метаболиты как потенциальные лекарства или пищевые добавки лекарственного происхождения // Y Международный симпозиум «Биологически активные добавки к пище и проблемы здоровой семьи». - Красноярск, 2001. -С.128.

Бухман В.М., Бодягин Д.А., Переверзева Э.Р., Трещалин И.Д., Исакова Е.Б., Кривошеев С.Е., Резцова В.В., Филов В. А. Влияние нового противоопухолевого препарата олипифата на реакции противоопухолевого иммунитета у мышей // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. - 2001. Т.132. - №10. - С.446-449.

Bukhman V.M., Bodyagin D.A., Pereverzeva E.R., Treshchalin I.D., Isakova E.B, Krivosheev S.E., Reztsova V.V., Filov V.A. Effect of Novel

Antineoplastic Drug Olipifat on Antitumor Immunity in Mice // Bull. Exp. Biol. Med. - 2001. №4. - P.993-995.

9. Трещалин И.Д., Бодягин Д.А., Переверзева Э.Р., Бухман В.М., Ефименко И.А., Либензон А.В. Новый противоопухолевый препарат морфозол // Российский биотерапевтический журнал. - 2002. Т.1. - №2. - С. 146 - 147. Материалы Всероссийской научно-практ. конф. «Отечественные противоопухолевые препараты». - М., 2002.

10. Бухман В.М., Бодягин Д.А., Переверзева Э.Р., Трещалин И.Д., Исакова Е.Б., Кривошеев С.Е., Резцова В.В., Филов В.А. Оценка иммунокорригирующей и иммунотерапевтической активности олипифата в экспериментах на мышах // Сателлитный симпозиум «Новый отечественный препарат олипифат». Всероссийская научно-практическая конференция «Отечественные противоопухолевые препараты». - М., 2002. - С.67-72.

11. Бодягин Д.А., Переверзева Э.Р., Трещалин И.Д., Кривошеев С.Е. Влияние на индуцированную циклофосфаном цитопению мышей // В кн.: «Опыт доклинического исследования на примере олипифата». - С-Пб.: Ника, 2002. - С. 102-104.

12. Бухман В.М., Бодягин Д.А., Переверзева Э.Р., Трещалин И.Д., Исакова Е.Б., Кривошеев С.Е., Резцова В.В., Филов В.А. Влияние на реакции противоопухолевого иммунитета у мышей // В кн.: «Опыт доклинического исследования на примере олипифата». - С-Пб.: Ника, 2002. - С.218-223.

13. Переверзева Э.Р., Бодягин Д.А., Трещалин И.Д., Бухман В.М., Исакова Е.Б., Кривошеев С.Е., Филов

B.А. Патоморфологическое изучение местно-тканевых реакций и состояния центральных и периферических иммунокомпетентных органов при внутримышечном введении олипифата // В кн.: «Опыт доклинического исследования на примере олипифата». - С-Пб.: Ника, 2002. - С.223-230.

14. Переверзева Э.Р., Бодягин Д.А., Трещалин М.И., Трещалин И.Д., Королев А.М., Преображенская М.Н., Бухман В.М. Биологическая активность аскорбигена - важнейшего компонента диет, содержащих капусту и другие крестоцветные // Медико-фармацевтический форум. - М., 2002.

C.160.

15. Переверзева Э.Р. Роль патоморфологических исследований в лекарственной токсикологии // II съезд токсикологов России. Тез. докл. - М., 2003. -С.476.

16. Кривошеев С.Е., Бухман В.М., Трещалин И.Д., Бодягин Д.А., Переверзева Э.Р. Влияние нового препарата олипифат на противоопухолевый иммунитет мышей // Российский биотерапевтический журнал. - 2003. Т.2. - №1. - С.7. Материалы научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты». - М., 2003.

17. Трещалин М.И., Бодягин Д.А., Переверзева Э.Р., Трещалин И.Д., Бухман В.М. Влияние аскорбигена на кроветворение и защитную функцию тонкой кишки // Российский биотерапевтический журнал. -2003. Т.2. - №1. - С.44. Материалы научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты». - М., 2003.

18. Мирчинк Е.П., Исакова Е.Б., Переверзева Э.Р., Бухман В.М. Противобактериальная активность аскорбигена и его влияние на алопецию у мышей, вызванную применением циклофосфамида // Российский биотерапевтический журнал. - 2003. № 1.-С.34.

19. Переверзева Э.Р., Бодягин Д.А., Трещалин И.Д., Бухман В.М., Филов В. А., Беркович A.M., Кривошеев С.Е. Свойство продуктов глубокого гидролиза лигнина, содержащих гуминовые кислоты, вызывать эктопический неогенез лимфатических узлов в мышечных тканях животных // Сборник кратких описаний научных открытий, научных гипотез. - М., - 2004. вып. 2. - С.20-22.

20. Pereverzeva E.R., Mirchink Е.Р., Isakova Е. В., Preobrazhenskaya М. N., Bukhman Y.M. Ascorbigen accelerates small intestine anti-infective barrier function in suckling mice // Intern. J. Antimicrobal Agents. 6th Congress of ECC@RICAI. - Paris - France, 2004. v.24. -S233.

21. Трещалин И.Д., Бодягин Д.А., Переверзева Э.Р., Ефименко И.А. Повышение эффективности лечения злокачественных опухолей с помощью нового комплексного соединения палладия - эфазола в эксперименте // Российский биотерапевтический журнал. - 2005. Т.4. - №1. - С.73. Материалы IV научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты». - М., 2005. Трещалин И.Д., Переверзева Э.Р., Бодягин Д.А., Мирчинк Е.П., Бухман В.М. Модификация токсичности противоопухолевых препаратов как метод повышения эффективности химиотерапии злокачественных новообразований // Российский биотерапевтический журнал. - 2005. Т.4. - №3. - С.87 -94.

Переверзева Э.Р., Трещалин И.Д., Бодягин Д.А., Преображенская М.Н., Бухман В.М. Пероральное применение аскорбигена с целью ускорения репарации индуцированных циклофосфамидом повреждений тонкой кишки и лимфоидных органов мышей // Российский биотерапевтический журнал. — 2005. Т. 4. - № 4. - С. 129-133. Skidan I., Khalansky A., Pereverzeva Е., Bukhman V., Tanski S., Severin S., Gelperina S., Kreuter J. Protection against doxorubicin-induced testicular toxicity by poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles. // Transact. 31 st Annual Meeting of the Controlled Release Soc. -Honolulu - Hawaii - 2004abstr. #518. Gelperina S., Pereverzeva E., Treshalin I., Bodyagin D., Khalansky A., Kurilo L., Makarova N., Maksimenko O., Kreuter J. Reduced toxicity of doxorubicin bound to polysorbate 80-coated poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles. // Proc. XV Microencapsulation Symp -Parma - Italy, 2005. - P. 147-148.

26. Преображенская М.Н., Бухман В.М., Переверзева Э.Р., Королев A.M., Резникова М.И., Трещалин М.И., Трещалин И. Д., Мирчинк Е.П., Бодягин Д. А., Садовников С.В., Соснов А.В. Способ повышения неспецифической резистентности организма // Патент РФ № 2235543 от 10 сентября 2004 г.

27. Переверзева Э.Р., Бодягин Д.А., Трещалин И.Д., Бухман В.М., Филов В. А., Беркович A.M., Кривошеев С.Е. «Свойство продуктов глубокого гидролиза лигнина, содержащих гуминовые кислоты, вызывать эктопический неогенез лимфатических узлов в мышечных тканях животных» // Диплом на открытие №233 от 27 октября 2003 г.

28. Переверзева Э.Р., Бодягин Д.А., Трещалин И.Д., , Филов В.А. Беркович A.M., Бухман В.М. Препарат олипифат - индуктор неогенеза лимфоузлов // Материалы X Международного Съезда «ФИТОФАРМ 2006». - С-Пб., 2006. - С. 250.

29. Переверзева Э.Р., Трещалин И.Д., Бодягин Д.А., Бухман В.М. Экспериментальная оценка токсических свойств адаптогенов природного происхождения адаптовита и риалама. // Материалы X Международного Съезда «ФИТОФАРМ 2006». -С-Пб., 2006. - С.253.

30. Переверзева Э.Р., Трещалин М.И., Трещалин И.Д., Мирчинк Е.П., Исакова Е.Б., Бодягин Д.А., Бухман В.М. Аскорбиген - модификатор токсичности циклофосфана. // Материалы X Международного Съезда «ФИТОФАРМ 2006». - С-Пб., 2006. - С.256.

31. Переверзева Э.Р., Мирчинк Е.П., Исакова Е.Б., Бухман В.М., Преображенская М.Н. Усиление антимикробного барьера тонкой кишки новорожденных мышей при пероральном введении аскорбигена // Антибиотики и химиотерапия. - 2006. Т. 51. - №2. - С.13-17.

Внедрение

Препараты полидан, аспинат, просидол (стабилизированная лекарственная форма), адаптовит, риалам зарегистрированы в Государственном Регистре лекарственных средств РФ и разрешены к медицинскому применению в России:

1. Полидан - натрия нуклеоспермат. Фармакологическая группа - стимулятор лейкопоэза. №292 от 27.10.95

2. Аспинат. Фармакологические группы: Антиаггреганты. Ненаркотические анальгетики, включая нестероидные и другие противовоспалительные средства. №003132/01 от 22.12.2003.

3. Просидола раствор для инъекций стабилизированный 1%. Фармакологическая группа - Опиоиды, их аналоги и антагонисты. №97/203/1 от 14.07.97.

4. Адаптовит. Фармакологическая группа: Биологически активные добавки к пище. №005056.Р.643.12.2002 от 06.12.2002.

5. Риалам. Фармакологическая группа: Биологически активные добавки к пище. №77.99.20.935.Б.000027.01.04 от 12.01.2004.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Введение

В связи с нарастанием потока новых медикаментов в клиническую практику и увеличением количества осложнений при их использовании проблема доклинического изучения безопасности новых лекарственных веществ привлекает все большее внимание и приобретает все большую социальную значимость. Хотя целенаправленное и интенсивное изучение токсичности фармакологических средств началось в середине 50-х годов прошлого столетия, до сих пор нет общепринятого определения понятия медикаментозного осложнения, а в связи с этим, нет и единой классификации отрицательного действия лекарственной терапии [37].

В настоящее время нежелательные последствия лекарственной терапии описываются несколькими терминами. Термин «побочное действие лекарств» подразумевает нежелательное действие лекарственного препарата, обусловленное его структурой и свойствами, которые он оказывает на организм наряду с основным действием. Термин «токсические эффекты лекарств» подразумевает реакции, обусловленные передозировкой, ускоренным насыщением организма, быстрым введением средних и даже минимальных доз, недостаточной функцией выделения или нарушением процессов обезвреживания их в организме. Понятие «индивидуальная непереносимость» лекарств характеризуется необычной повышенной реакцией организма на обычные дозы лекарств, не дающие каких-либо реакций у большинства людей. К этому понятию относятся идиосинкразия и аллергические реакции [5]. Осложнения, возникающие при применении фармакологических средств, могут быть связаны как с иммунным и гормональным дисбалансом, вызываемым введением лекарства, так и с непосредственным действием препаратов на ткани и системы организма [24].

Соотношения между структурными изменениями органов и клиническими проявлениями этих изменений могут быть разнообразными. В одних случаях структурные изменения задолго предшествуют функциональным, в других - нарастающие морфологические изменения длительный период времени не проявляются клинически, потому что они не преодолевают компенсаторную способность органа. Часто, возникающие структурные изменения не сопровождаются клиническими проявлениями в связи с немедленным их купированием соответствующими компенсаторно-приспособительными реакциями [86].

Отсутствие изменений физиологических показателей функционирования органов и систем организма животных в доклинических токсикологических экспериментах может привести к ложному выводу об отсутствии каких-либо видов токсичности у потенциального лекарственного средства. Поэтому на современном этапе, когда в клиническую практику внедряется большое количество фармакологических веществ, не вызывающих ярко выраженных токсических реакций, роль патоморфологических исследований в лекарственной токсикологии значительно возрастает.

В соответствии с задачами исследования в работе были исследованы противоопухолевые препараты и лекарственные средства сопровождения терапии онкологических больных различных фармакологических групп. В связи с этим в обзоре литературы мы посчитали необходимым отразить их основные свойства, проблемы, связанные с их клиническим применением, и обосновать необходимость дальнейших экспериментальных исследований.

Противоопухолевые препараты

Комплексные соединения палладия

Как известно, лекарственное лечение злокачественных опухолей не обладает достаточной избирательностью действия. Большинство существующих противоопухолевых средств оказывает побочное влияние на нормальные ткани. Создание новых препаратов преследует две цели: 1. повышение противоопухолевой активности путем преодоления естественной и приобретенной устойчивости опухолевых клеток к цитостатикам; 2. снижении токсических свойств антибластомных агентов.

Цитостатики, среди которых ведущую роль играют алкилирующие агенты, составляют наиболее обширную группу противоопухолевых препаратов. Биологическое действие препаратов этой группы определяется тем, что они присоединяются ко многим веществам путем реакции алкилирования, то есть замещения атома водорода какого-либо соединения на алкильную группу. Алкилированию подвергаются многие органические соединения, включая макромолекулы, но определяющим считается взаимодействие с ДНК. При использовании в качестве носителя алкилирующих групп различных соединений удается изменить их свойства, что является основой поиска новых, более совершенных препаратов.

Алкилирующие вещества оказались эффективными при ряде опухолевых заболеваний человека. Однако спектр их действия ограничивался гемобластозами и некоторыми солидными опухолями, такими, как семинома яичка, рак яичников, неостеогенными опухолями костей [96].

В связи с этим особое внимание привлекли к себе препараты из других групп - антиметаболиты и вещества природного происхождения, особенно противоопухолевые антибиотики. Синтез многих антиметаболитов был произведен на рациональной основе (метотрексат - антагонист фолиевой кислоты, 6-меркаптопурин -антагонист пурина, 5-ФУ - антагонист пиримидина).

В 70-е годы широкое распространение получили производные N-нитрозомочевины (США - BCNU, CCNU, метил- CCNU, в России - НММ, араноза), которые также относятся к алкилирующим агентам [57].

К числу алкилирующих агентов относятся и комплексные соединения платины. Производные платины вошли в клиническую практику в конце 70-х годов. Комплексные соединения платины нарушают синтез ДНК путем внутри- и межнитевых сшивок ДНК, а также путем связывания с клеточными мембранами. Препараты этой группы, являясь чрезвычайно эффективными и обладая широким спектром противоопухолевого действия, имеют ряд побочных реакций, которые серьезно осложняют их применение в клинике. Это - нефро- и нейротоксичность, миелосупрессия, тошнота, рвота. Попытки создания новых активных, но менее токсичных соединений на основе платины и металлов платиновой группы не прекращаются многие годы [26].

Одним из методов модификации биологических свойств этих металлов является присоединение к ним лигандов различной природы. Так, был синтезирован ряд координационных соединений родия Rh(III), рутения Ru(III), палладия Pd(II), платины Pt(II) с лигандами, содержащими кольца азола и пиримидина. Способность этих соединений ингибировать пролиферацию клеток была изучена in vitro на линиях опухолевых клеток человека: А 549 (карцинома легких), LS-180 (рак толстой кишки) и MCF-7 (рак молочной железы). Цитотоксическую активность проявили 6 из 13 полученных соединений [242].

Синтезированы и охарактеризованы новые комплексы палладия (И) и платины (II) с простыми ароматическими диаминами [194], с производными цитокинов богемином и оломуцином. Полученные соединения тестировались in vitro на цитотоксическую активность на культурах клеток G-361 (злокачественная меланома человека), HOS (остеогенная саркома человека), К-562 (хронический миелолейкоз человека), MCF-7 (аденокарцинома молочной железы человека). Значение ПК50 (IC50) (подавляющая концентрация) для комплекса платины с богемином показало его перспективность для дальнейших исследований с целью использования в противоопухолевой терапии [232].

В качестве лигандов используют также молекулы гормонов. В частности, для направленной доставки препаратов в ткани, содержащие рецепторы к эстрогенам, среди которых многие виды рака молочной железы, был создан ряд металлоэстрогенов на основе 17-альфа - этинилэстрадиола. Все полученные соединения хорошо связывались с рецепторами эстрогенов и хорошо проникали через мембрану внутрь клеток. Палладиевые и платиновые комплексы обладали одинаковой или даже более выраженной способностью связываться с рецепторами по сравнению с нейтральными свободными лигандами. Впервые было достигнуто более высокое сродство к рецепторам эстрогенов катионного комплекса эстрогена по сравнению с самим эстрогеном [154].

Лигандами могут быть и противоопухолевые препараты. Так, были получены комплексы противоопухолевого антибиотика алыромицина В с ионами Cu(II), Pd(II) и Pt(II) и показано, что присутствие ионов металла придает стабильность альтромицину в растворе. Комплексы были изучены in vitro на линиях клеток лейкоза К562 и линии опухолевых клеток легкого GLC4, чувствительных и устойчивых к доксорубицину. Активность комплексов по сравнению с активностью свободного препарата была выше в отношении устойчивых клеток и умеренно снижена в отношении чувствительных клеток [185].

Часто комплексы разных металлов с одинаковыми лигандами обладают разной активностью. Так, описано получение органических комплексов меди(П) и палладия(И) с амино-метилтио-пиридил-триазолом и с дигидро-амино-пиридил-тиоксо-триазолом. Антипролиферативная активность комплексов и их лигандов была оценена на культуре нормальных фибробластов человека и клетках фибросаркомы человека (НТ1080). Соединения меди показали одинаково выраженную антипролиферативную активность на обеих культурах. В экспериментах, определявших зависимость эффекта от дозы соединения, было показано, что линия злокачественных клеток более чувствительна к изучаемым препаратам, чем линия нормальных фибробластов. Комплексы палладия с этими же лигандами на этих культурах клеток цитотоксической активности не проявили [127].

Нередко сами лиганды цитотоксической активностью не обладают или проявляют очень слабую активность, но при соединении их с металлами платиновой группы образуются вещества с более высокой цитотоксической активностью, чем исходные компоненты. Так, были получены и охарактеризованы комплексы платины(И) и палладия(П) с ацетоновыми основаниями Шиффа S-метил и S-бензилдитиокарбазата. Изучение цитотоксичности полученных соединений на культуре клеток Т-лимфобластного лейкоза показало, что ацетоновое основание Шиффа S-метилдитиокарбазата обладает очень слабой активностью, а S-бензил-производное неактивно совсем. У платиновых комплексов цитотоксическая активность была слабой или не проявлялась совсем, однако палладиевые комплексы проявили значительную цитотоксичность [103].

Токсичность новых цис-комплексов платины(И) и палладия(П) дихлорида с метил-диамин-тетрадезокси-гексопиранозидом сравнивалась по их способности индуцировать перекрестные сшивки ДНК в культурах клеток мышиной лимфомы (L5178Y), отличающихся по способности к восстановлению двунитевых разрывов и делеций нуклеотидов после воздействия цис-диаминдихлорплатины (цис-ДДП). Полученные результаты показали, что эти два соединения вызывают разные типы повреждений ДНК. Повреждения ДНК, вызываемые палладиевым комплексом, отличались от повреждений, вызываемых соединением платины, но это не отражалось на токсичности этих соединений [166].

С целью снижения токсичности противоопухолевых палладиевых препаратов были синтезированы циклические комплексы палладия с лигандом дифенилфосфином. Комплексы были протестированы in vitro и in vivo на клетках мышиной слабо иммуногенной, привитой подкожно меланомы. Один из комплексов оказался активным in vivo, вызвал торможение роста опухоли и значимое увеличение продолжительности жизни мышей [206].

Создание комплексов палладия(П) и платины(И) с би-гетероциклическим лигандом мепиризолом, привело к снижению токсичности новых соединений по сравнению с цисплатином. Однако это было связано с плохой биодоступностью препаратов, так как очень небольшой процент от введенного соединения смог проникнуть через мембрану клетки [186].

Для преодоления перекрестной резистентности с препаратами платиновой группы и снижения нефротоксичности был синтезирован новый палладиевый комплекс палладий(П)-дитиокарбамат. Исследования цитотоксичности комплекса на клетках карциномы яичников человека С13, устойчивых к цисплатину, выявили отсутствие перекрестной резистентности между новым комплексом и цисплатином. По данным биохимического исследования мочи комплекс оказывал такое же влияние на почки, как цисплатин. Однако морфологические исследования показали, что комплекс вызывает диффузные и более тяжелые изменения, чем цисплатин. Новый палладиевый комплекс вызывал повреждения как в области прямых, так и в области извитых канальцев, тогда как цисплатин повреждает только область прямых канальцев [233].

Введение в комплекс палладия с триазолопиримидином второй молекулы палладия вызывало значительные повреждения ДНК клеток карциномы яичников линии TG. По цитотоксическому эффекту новый комплекс превосходил цисплатин, но при этом усиливалась и генотоксичность соединения [104].

Разработка и синтез соединений, представляющих собой комплексы платины и палладия с тиосемикарбазонами, может привести к открытию новых противоопухолевых агентов, способных преодолеть устойчивость к цис-ДДП. Цитотоксический тест на опухолевых клетках, чувствительных и устойчивых к цис-ДДП показал, что эти циклические металлокомплексы обладают способностью убивать устойчивые опухолевые клетки посредством индукции апоптоза [204].

В России также ведутся разработки новых подходов к созданию эффективных и малотоксичных комплексных соединений палладия. В Институте общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова РАН профессором И.А.Ефименко был синтезирован ряд веществ, основу которых составляли металлы платиновой группы: рутений, родий, палладий. Наиболее перспективными с точки зрения биологической активности оказались комплексы палладия: эфазол и морфозол.

Первое палладий-содержащее лекарственное средство -эфазол - было отобрано как противоопухолевый препарат. На модели меланомы В-16 была продемонстрирована высокая антиметастатическая активность эфазола. Индекс ингибирования метастазов с учетом частоты и интенсивности ингибирования составил 97 %. Было показано, что совместное использование локального облучения (45 Гр) и эфазола приводит к полному стабильному излечению животных с опухолью АК-755 [88].

Затем в условиях эксперимента было доказано активирующее влияние эфазола на уровень гуморального и клеточного иммунного ответа организма при вторичных иммунодефицитных состояниях, вызванных введением циклофосфамида или облучением. Показано высокое радиомодифицирующее действие эфазола в условиях эксперимента и на Чернобыльской АЭС, продемонстрирована возможность профилактики и лечения лейкопений, вызванных циклофосфамидом или облучением [87].

Анализ данных литературы показал, что проблема определения зависимости активности соединения от структуры лигандов остается актуальной. Нами была предпринята попытка с помощью патоморфологических исследований установить особенности токсического действия комплексных соединений металлов в зависимости от структуры лигандов на примере двух палладийсодержащих комплексов эфазола и морфозола.

Доксорубицин

Доксорубицин (ДОКС) - один из наиболее эффективных препаратов при лечении различных злокачественных опухолей. Однако его клиническое применение ограничено целым рядом побочных эффектов. Токсическое действие препарата наблюдается как в эксперименте, так и в клинике, и проявляется в миелосупрессии, хронической кардиотоксичности, тестикулярной токсичности, алопеции, образовании катаракты [156].

Как для животных, так и для людей описаны также повреждение слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, токсические повреждения печени, почек и центральной нервной системы [130].

В экспериментах на кроликах была обнаружена скелетная миопатия, которая была выражена намного слабее по сравнению с кардиомиопатией [170].

Кардиотоксичность является главным лимитирующим видом токсичности ДОКС, большинство работ посвящено исследованиям механизмов ее возникновения и способам преодоления.

Механизмы токсического действия ДОКС до конца не ясны. Известно, что ДОКС - цитотоксический препарат, связывается и интеркалирует в ДНК, ингибирует активность топоизомеразы II, генерирует свободные радикалы и ковалентно связывается с ДНК после редуктивного метаболизма [156].

Отсутствие значительных успехов в преодолении кардиотоксичности ДОКС связано, по-видимому, с комплексностью воздействия этиологических факторов, приводящих к токсической кардиомиопатии.

Для объяснения механизма антрациклин-индуцированной кардиотоксичности предлагается множество гипотез (действие на синтез ДНК, РНК, белков, роль свободных радикалов, высвобождение гистамина и др.), но ни одна из них не может считаться точно доказанной [142].

Некоторые авторы считают, стимуляция образования свободных радикалов и перекисное окисление липидов вносят наиболее важный вклад в возникновение кардиомиопатии, а кардиотоксичность ДОКС является результатом неограниченного метаболизма кислорода, индуцируемого препаратом. Накопление реактивных радикалов кислорода вызывает пероксидацию липидов мембраны [130].

Тасса V. и соавторами (1985) было показано, что наиболее важный путь метаболизма адриамицина (ДОКС) - С13-гидроксилирование с участием альдо-кето-редуктазы, которое приводит к образованию адриамицинола. По-видимому, адриамицинол является главным метаболитом, определяющим как токсические, так и фармакологические эффекты ДОКС. И ДОКС, и адриамицинол активируются NADPH-nHToxpoM-P-450оксидоредуктазой с образованием цитотоксических супероксидов. Уровень адриамицинола в сердце значительно увеличивается между 2 и 3 неделями, тогда как уровень ДОКС остается стабильным. В конце 3-ей недели электрокардиограмма показывает максимальное увеличение QRS и ST, а при гистологическом исследовании в ткани сердца выявляются дегенеративные изменения [228].

Патогенез кардиотоксичности ДОКС может быть связан с повреждениями структуры мембран, которые приводят к повышению содержания ионов кальция в клетках [147].

Кардиотоксичность ДОКС связывают не только со значительным увеличением содержания внутриклеточного кальция, и, в частности, со стимуляцией кальций-зависимых потенциалов медленного действия и увеличением количества цАМФ в сердце, но также с уменьшением пула фосфатов высокой энергии в миокарде. Снижение уровня АТФ до 5 микромоль/г сухого веса, которое происходит при применении ДОКС, приводит к значительному разрушению клеток миокарда [147].

В индукции кардиотоксичности может быть решающим высвобождение тистамина и других вазоактивных веществ [ 162].

Среди клеточных органелл кардиомиоцитов препарат оказывает наиболее сильное повреждающее действие на митохондрии и миофибриллы. Это позволило выдвинуть гипотезу о роли лизосом в индукции кардиотоксичности ДОКС, т.к. среди других гидролаз лизосомы содержат катепсин D и эндопептидазу, которые оказывают выраженное действие как на миофибриллы, так и на митохондрии. Gebbia N и соавторами (1985) была предложена схема, основанная на том, что, с одной стороны, ДОКС накапливается в лизосомах в концентрациях, превышающих экстрацеллюлярные, в 3750- 20000 раз, с другой - вызывает образование свободных радикалов. И то, и другое приводит к повреждению клеточных мембран, включая и субцеллюлярные мембраны - мембраны лизосом и митохондрий. Лизосомальные ферменты в результате повреждения мембраны выходят из лизосом и индуцируют кардиотоксичность [142].

Направление поиска веществ, предотвращающих возникновение кардиотоксичности при применении ДОКС, было определено, исходя из понимания механизмов ее развития. В качестве протекторов были испытаны многие химические соединения. Так, с целью удаления свободных радикалов проводилось предварительное введение альфа-токоферола, цистамина, n-ацетилцистеина и аскорбата. Применение этих веществ перед введением ДОКС приводило к снижению летальности у мышей [130].

С этой же целью была предпринята попытка использования амифостина. Амифостин (этиол), недавно вошедший в клиническую практику, является цитопротективным средством, защищающим нормальные ткани от токсического воздействия радиотерапии и цитотоксических препаратов. Амифостин связывает свободные радикалы и образует смешанные дисульфиды, защищающие нормальные ткани. При этом злокачественные клетки не защищаются. В клинических исследованиях было показано, что противоопухолевые эффекты радио- и химиотерапии усиливаются. При применении амифостина в сочетании с ДОКС в экспериментах на крысах удалось предотвратить раннюю гибель животных, которая обычно наступает в течение первых двух недель после применения препарата. Однако введение амифостина не повлияло на отдаленную гибель животных, связанную с кардиотоксичностью [156].

В клиническую практику внедрен кардиопротектор кардиоксан, который, снижая содержание свободных радикалов кислорода в клетках миокарда за счет хелирования железа, позволяет предупредить развитие кардиотоксичности, не снижая противоопухолевого эффекта [74].

При использовании антагонистов кальция было показано, что они могут как уменьшать, так и потенцировать кардиомиопатию [237].

Сочетанное применение полиэтиленгликоля 400 и ДОКС не привело к ослаблению кардиотоксического действия последнего, хотя известно, что диглицериновые и триглицериновые кислоты, образующиеся из полиэтиленгликоля, являются хорошими хелаторами кальция [163].

Значительное ослабление кардиотоксичности, индуцированной острым или хроническим введением ДОКС, было получено при использовании хромогликата натрия, который является стабилизатором тучных клеток и подавляет высвобождение гистамина, которое происходит под действием ДОКС. Предварительное введение хромогликата натрия существенно увеличивало выживаемость животных и уменьшало очаги повреждения в миокарде [162].

В поиске аналогов ДОКС с равным противоопухолевым эффектом, но с более низкой кардиотоксичностью, было синтезировано много соединений, в том числе и 4-эпидоксорубицин (эпирубицин) - 4-эпимер доксорубицина. При клинических испытаниях было показано, что препарат по эффективности не отличается от ДОКС. Более того, в дозах, дающих эквивалентный противоопухолевый эффект, такие проявления токсичности, как тошнота, рвота и миелосупрессия у эпирубицина выражены слабее, чем у ДОКС.

На различных экспериментальных моделях и на биопсийном материале, полученном у людей, было показано, что эпирубицин вызывает в ткани сердца повреждения, качественно не отличающиеся от изменений, вызываемых ДОКС, но количественно выраженные слабее [162]. Клинические исследования показали, что эпирубицин в эквивалентных дозах обладает равной противоопухолевой активностью и меньшей кардиотоксичностью. Меньшая кардиотоксичность позволяет увеличить суммарную дозу препарата без риска развития сердечной недостаточности [89].

Для того, чтобы изменить фармакокинетику доксорубицина, был создан его неактивный коньюгат с пептидом Gly-Pro-Leu-Gly-Val и метиловым эфиром полиэтиленгликоля. Полученная система должна была обеспечить доставку препарата в опухоль, так как мишенью этого пентапептида являются металлопротеиназы, участвующие в ангиогенезе в опухоли. Метиловый эфир использовался для увеличения времени циркуляции в организме и снижения цитотоксичности противоопухолевого препарата. В экспериментах in vivo коньюгат в дозе 50 мг/кг оказал такой же терапевтический эффект, как свободный ДОКС в дозе 10 мг/кг. При этом продолжительность жизни мышей, получавших коньюгат, значительно увеличивалась [110].

За последние 20 лет прогноз при лечении пациентов со злокачественными новообразованиями значительно улучшился. В связи с этим борьба с отдаленными последствиями противоопухолевой терапии, в частности, с кардиотоксичностью и бесплодием, стала более актуальной [156].

Успехи современной химиотерапии требуют повышенного внимания к вопросам «качества жизни» больных [164]. Один из рисков для пациентов репродуктивного возраста при противоопухолевой химиотерапии - потеря репродуктивной способности в результате повреждения семенников или яичников. Клетки семенников особенно чувствительны к повреждающему действию противоопухолевых препаратов, так как в семенниках происходят многие процессы такие, как митоз, мейоз, синтез, морфогенез, которые являются мишенями для химиотерапевтических агентов [212]. На биопсийном материале, полученном от больных, было показано, что противоопухолевая химиотерапия вызывает тяжелые, но не фатальные повреждения ткани семенников. Были зарегистрированы морфологические изменения сперматогоний, клеток Сертоли, аномальное созревание клеток Лейдига, признаки фиброза интерстиция, истончение базальной мембраны [164].

Химиотерапевтические препараты отличаются по механизму токсического воздействия на репродуктивные органы. В ряде работ показано, что стерильность возникает благодаря цитотоксическому воздействию на сперматогонии, клетки Сертоли [199], клетки Лейдига [155] или на сперматогенный эпителий [211]. Так, при введении 5-фторурацила наблюдается асинхронизация цикла сперматогенеза [210]. При применении ЦФ происходит гибель сперматоцитов. В течение первых минут после инъекции цисплатина повреждаются сперматогонии [212].

ДОКС, введенный крысам в дозе 7 мг/кг однократно внутривенно, вызывал сразу после инъекции повреждение сперматогоний типа Al, А2, A3, А4, промежуточных сперматогоний, сперматогоний типа В. К 70 суткам после инъекции в семенных канальцах исчезали популяции промежуточных сперматогоний (стадии 2-4), сперматогоний типа В (стадии 5-6) и сперматоцитов в прелептотене и лептотене. Наиболее дифференцированная популяция клеток, повреждаемых ДОКС, -сперматоциты в зиготене, была значительно уменьшена. Повреждался также механизм выделения сперматид. Наибольшая чувствительность сперматогониев к ДОКС определяется тем, что в них активно идут процессы синтеза ДНК, РНК и белков, кроме того, они быстро делятся. При применении низких доз ДОКС сперматогонии типа А и промежуточного типа повреждаются частично, в более высоких дозах - полностью. При применении самых высоких доз происходит масштабная гибель стволовых клеток [212].

Снижение токсичности и повышение эффективности для многих лекарственных препаратов было продемонстрировано при соединении их с наночастицами (НЧ) [105, 106, 221]. В то же время, НЧ могут служить средством направленной доставки химиотерапевтических препаратов к опухолевым клеткам-мишеням. Среди НЧ до недавнего времени наиболее перспективными считались липосомы. Мембрана липосом состоит из фосфолипидов. Они не токсичны, биодеградируемы, при определенных условиях могут поглощаться клетками. Кроме того, вещество, заключенное в липосомы, защищено от воздействия ферментов, что увеличивает эффективность препаратов, подверженных биодеструкции в биологических жидкостях [40].

В настоящее время на мировом фармацевтическом рынке появилось несколько липосомальных противоопухолевых препаратов доксорубицина, многие из которых находятся на последней стадии клинических испытаний. Липосомальный доксорубицин в течение более длительного времени циркулирует в крови и в большей концентрации накапливается в опухолевой ткани. Длительное время полураспада липосомального доксорубицина имитирует длительную внутривенную инфузию обычного доксорубицина. Липосомальный доксорубицин вызывает меньшую гематологическую и кардиотоксичность, алопецию, тошноту и рвоту по сравнению со струйным введением доксорубицина. Было показано, что по сравнению со свободным препаратом липосомальная форма ДОКС обладает меньшей иммуносупрессивной активностью, кардиотоксичность возникает реже, но при этом полностью сохраняются терапевтические свойства [136].

Так, липосомальный доксорубицин доксил был изучен как в режиме монотерапии, гак и в комбинации с паклитакселом, доцетакселом, винорельбином и циклофосфамидом при проведении исследований по II фазе [150, 174, 205]. Доксил демонстрировал высокую эффективность и меньшую кардиотоксичность по сравнению с доксорубицином. Другой липосомальный доксорубицин TLC D99 в рандомизированном исследовании показал равную эффективность, но меньшую токсичность по сравнению с доксорубицином [112, 148]. Если в проводящихся в настоящее время рандомизированных исследованиях подтвердится равная эффективность и меньшая токсичность липосомальных форм доксорубицина по сравнению с доксорубицином в стандартной лекарственной форме, это будет основанием для их широкого использования [89].

В России также был разработан липосомальный препарат доксорубицина «Липодокс» [40].

Основной недостаток липосом как лекарственной формы -относительно небольшая стабильность при хранении. Этого недостатка лишены полимерные наночастицы, имеющие те же области применения. Но в отличие от липосом, полимерные наночастицы состоят из менее безопасного материала, чем фосфолипиды.

Первые токсикологические данные, касающиеся полиалкилцианоакрилатных наночастиц, не выявили какой-либо особенной токсичности, которая не позволила бы применять их в медицине. Присоединение ДОКС к наночастицам привело к снижению его токсичности, уменьшению потери веса животных. Кроме того, по данным флуоресцентного анализа, присутствие ДОКС в сердечной мышце также резко уменьшалось [125].

В Московском Институте Медицинской Экологии были созданы полибутилцианоакрилатные наночастицы и препарат ДОКС на их основе. Проведенные авторами токсикологические исследования показали, что однократное внутривенное введение наночастиц в диапазоне доз 100-400 мг/кг не вызывает гибели животных, не влияет на массу тела или массу внутренних органов. Ассоциация полибутилцианоакрилатных наночастиц с ДОКС не вызвала значительных изменений острой токсичности антибиотика [22].

Поглощение наночастиц фагоцитирующими клетками ретикуло-эндотелиальной системы приводит к их преимущественному накоплению в селезенке и печени. Для того, чтобы изменить распределение НЧ в организме, было предложено несколько методов, один из которых - использование гидрофильных сульфактантов. Наиболее эффективным среди них оказался полисорбат 80 (ПС) [28].

Присутствие ПС в лекарственной форме не усиливало токсичности свободного и связанного с НЧ ДОКС. При этом было отмечено отсутствие гастро-интестинальной токсичности: в отличие от ДОКС, препараты ДОКС на наночастицах не вызывали макроскопических повреждений слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, их влияние на массу тела животных было менее выражено по сравнению с ДОКС. Масса тела крыс, получавших ДОКС-НЧ-ПС в дозе 4,5 мг/кг, значимо не отличалась от контроля.

Показано, что полибутилцианоакрилатные наночастицы, покрытые полисорбатом 80, обладают при внутривенном введении способностью транспортировать множество лекарств, в том числе и противоопухолевый препарат ДОКС, через гематоэнцефалический барьер. В экспериментах на крысах с привитой интракраниально глиобластомой 101/8 была продемонстрирована способность препарата ДОКС-НЧ-ПС проникать через гематоэнцефалический барьер и значительно угнетать рост опухоли. Проведенные параллельно токсикологические исследования выявили ослабление некоторых видов токсичности ДОКС в данной лекарственной форме. В частности, в группе животных, получавших ДОКС-НЧ-ПС, масса семенников была на 21% больше, чем у крыс, получавших ДОКС и ДОКС-ПС [22]. Последнее обстоятельство заставило обратиться к более углубленному изучению этого вида специфической токсичности новой лекарственной формы известного препарата.

Кроме полибутилцианоакрилатных наночастиц были изучены наночастицы, созданные на основе сывороточного альбумина человека. Перспективность использования коньюгатов противоопухолевых препаратов с наноаггрегатами человеческого сывороточного альбумина в онкологии была показана в эксперименте на модели эритробластного лейкоза Раушера и генерализованной иммунобластной лимфосаркомы JIT у мышей. Эффективность лечения коньюгатами метотрексата и фторурацила с человеческим сывороточным альбумином увеличивалась по сравнению с применением этих препаратов в свободной форме [15, 16]

Проблема кардиотоксичности остается не решенной, актуальность ее снижения сохраняется до настоящего времени. Проблема тестикулярной токсичности стоит не так остро, поскольку структура семенников через определенное, довольно длительное, время частично или полностью восстанавливается. Тем не менее, возможность преодоления или ослабления этого вида токсичности ДОКС позволила бы улучшить качество жизни больных.

В своем исследовании методом патоморфологии мы попытались выявить различия между стандартной лекарственной формой доксорубицина и его новыми наносомальными лекарственными формами по их воздействию на миокард и семенники крыс, а затем найденные различия подтвердить другими методами исследования.

Олипифат

Олипифат был создан в ГУ НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова, в котором были изучены в экспериментах на животных его противоопухолевые свойства. Олипифат проявил противоопухолевую активность на ряде штаммов перевиваемых опухолей и спонтанных опухолях мышей и крыс [93]. На солидной карциноме Эрлиха торможение роста опухоли составило 92%, аденокарциноме молочной железы Са 755 - 90%, меланоме В-16

83%, карциноме легких Льюис - 84%, лимфосаркоме Плисса - 79%, карциносаркоме Уокер - 85%. В экспериментах по изучению противоопухолевого и антиметастатического действия препарата на метастазирующих штаммах перевиваемых опухолей карциномы Льюис и меланомы В-16 было установлено, что олипифат тормозит как рост первичной опухоли, так и процесс метастазирования. Наиболее существенный эффект олипифат оказывал на уже имеющиеся метастазы. Их рост тормозился на 90% [46].

С целью получения более высокого противоопухолевого эффекта были предприняты в эксперименте попытки комбинирования олипифата с различными противоопухолевыми препаратами. Повышение эффективности лечения было получено при сочетании олипифата с цисплатином [77].

Олипифат является продуктом окисления лигнина кислородом воздуха в щелочной среде при нагревании под давлением. В его состав входят различные производные гуминовой кислоты, а также «осколки» этих производных. Препарат представляет собой темно-коричневую жидкость, содержащую, кроме действующего вещества, пирофосфат натрия [63]. Название «Олипифат» является сокращенным от «окисленный лигнин -пирофосфат».

Лигнин не является индивидуальным соединением с вполне определенными свойствами и составом. Выделенные из древесины различных растений лигнины отличаются по содержанию углерода и водорода. С химической точки зрения лигнин является смесью продуктов полимеризации кониферилового спирта, фрагментарно модифицированных гликозидными остатками [27]. Он содержит значительное количество функциональных групп.

Будучи веществом высокомолекулярным, лигнин сам по себе в воде практически нерастворим и биологически инертен. Однако в результате его щелочной обработки образуются продукты с молекулярной массой в 2-4 раза меньшей. Эти продукты весьма разнообразны, существенно более растворимы и обладают различного рода биологической активностью. Среди них основными являются так называемые гуминовые вещества.

Гуминовые вещества - это сложная смесь высокомолекулярных и полифункциональных соединений ациклической, гидроароматической и гетероциклической природы, замещенных разной длины алкильными цепями. В природных условиях гуминовые вещества образуются в процессе окислительной деструкции растительных остатков под действием микроорганизмов или кислорода воздуха.

Гуминовые вещества, являясь биологически активными соединениями, при обработке могут быть источником новых биологически активных веществ.

В ряде работ были продемонстрированы разнообразные биологические эффекты гуминовых кислот. Так, в опытах in vitro на митохондриях гепатоцитов крыс было показано увеличение эффективности процесса окислительного фосфорилирования под влиянием гуминовых кислот [238]. На лабораторных животных установлено снижение уровня холестерина в крови, липидов, глюкозы, увеличение гемоглобина и количества эритроцитов, показана способность гуминовых кислот стимулировать некоторые функции нейтрофилов человека. Имеются данные об антибактериальной активности гуминовых кислот [92].

На основе гуминовых кислот создан ряд лекарственных препаратов. Широко известен применяемый в медицинской практике «медицинский лигнин» Полифепан [48]. В Польше выпускается созданый на основе гуминовых кислот иммуномодулятор природного происхождения, который обладает интерфероногенным эффектом и является индуктором фактора некроза опухолей (ФНО) [152].

Препарат олипифат, помимо противоопухолевой активности, проявил в эксперименте целый ряд иных свойств. На модели токсического повреждения печени тетрахлорметаном было проведено исследование репаративных возможностей олипифата и показано, что у крыс с токсическим гепатитом применение олипифата приводит не только к нормализации биохимических показателей крови, но и к снижению степени повреждения гепатоцитов, уменьшая количество и размеры внутридольковых и портальных инфильтратов [44]. Репаративный потенциал олипифата был изучен также на моделях поверхностных ран, регенерации печени после воздействия четыреххлористым углеродом, на экспериментальных язвах желудка у крыс [44], термического ожога [ 1 ].

Морфологическое исследование показало, что при применении олипифата процессы регенерации в кожной ране у животных сопровождались равномерным созреванием и дифференцировкой соединительной ткани и эпителия. Значительное снижение интенсивности воспалительной инфильтрации, уменьшение протяженности неэпителизированного участка определяло тенденцию к полной эпителизации раны без рубцевания [79].

Воздействие олипифата на экспериментальные язвы желудка было оценено на модели хронической язвы желудка, вызываемой криогенным воздействием. У всех животных, получавших олипифат, была выявлена интенсивная пролиферация и дифференцировка эпителия, которая сопровождалась синхронной регенерацией соединительной ткани [14].

При изучении противоожоговых свойств олипифата было установлено, что нанесение препарата на ожоговую поверхность кожи у крыс сразу после тяжелой ожоговой травмы и последующие ежедневные аппликации заметно ослабляют развитие тяжелых некротических процессов и ускоряют заживление ожога [14].

Высокой оказалась его адаптогенная стресс-корректорная активность [14]. Препарат оказывал влияние на жизнеспособность и «обучаемость» животных, подвергавшихся гипоксии или иммобилизационному стрессу. Введение препарата перед стресс-воздействием предотвращало развитие атрофии лимфоидной ткани в селезенке и лимфоузлах [2].

Антиоксидантные свойства олипифата были изучены in vitro. Их оценка производилась по влиянию препарата на уровень генерации активных форм кислорода, интенсивность течения процессов перекисного окисления липидов и состояние системы антиоксидантной защиты. В малых дозах препарат проявил свои антиоксидантные свойства наиболее ярко [32].

Антивирусная активность в отношении вируса гепатита С была изучена на культурах клеток головного мозга новорожденных мышей, инфицированных вирусом гепатита С. Была выявлена способность инфицированных клеток, обработанных препаратом, индуцировать образование дефектных вирусных частиц [41].

Исследование эффективности олипифата в отношении ВИЧ-инфекции, проведенное на различных клеточных моделях, показало, что препарат обладает ярко выраженной анти-ВИЧ активностью in vitro [41].

Отмеченное выше разнообразие биологических эффектов предполагает наличие различных механизмов воздействия на те или иные органы и системы организма.

При исследовании побочного действия препарата в эксперименте функциональных и морфологических изменений органов и систем организма животных выявлено не было [91]. Однако, при внутримышечном введении олипифата нами были обнаружены местно-тканевые реакции, сопровождающиеся эктопическим образованием лимфоузлов, что послужило основанием для более углубленного изучения этого процесса.

Эктопия - врожденное или приобретенное смещение органа или ткани в необычное место [56]. Одно из направлений теоретической и экспериментальной биологии и медицины посвящено изучению механизмов образования органов и тканей (неоорганогенез) в необычных местах тела. Это явление связывают с особенностями тканевой и клеточной дифференцировки, вызванной эндогенными или экзогенными факторами. Новообразование лимфоузлов является одним из примеров неоорганогенеза.

Лимфоузлы возникают спонтанно при длительных хронических воспалительных процессах, длительно незаживающих ранах, аутоиммунных заболеваниях. Известно несколько ситуаций, при которых воспаление сохраняется длительный период времени, а возникающий при этом лимфоидный инфильтрат приобретает вид нового лимфоидного органа [179]. Среди них - лимфоидные скопления при болезни Хашимото человека или тиреоидитах крыс, инфильтраты в тимусе при миастении и в суставах при ревматоидном артрите, в центральной нервной системе больных рассеянным склерозом или мышей с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом. Характерная особенность хронического гастрита, вызванного Helicobacter pylori, - наличие лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистой оболочкой желудка, состоящей из лимфоидных скоплений и организованных фолликулов. В норме они не встречаются и исчезают при излечении, что говорит о том, что Helicobacter pylori - агент, инициирующий их возникновение [240]. Лимфоидные фолликулы были найдены у больных в ткани печени при хроническом гепатите С [149].

До недавнего времени считалось, что развитие вторичных лимфоидных органов (лимфоузлов и Пейеровых бляшек) и воспаление - различные процессы, как по механизму, так и по функции. В последние годы было доказано, что эти феномены имеют много общего. Стало известно, что в развитии лимфоидных органов ключевую роль играют медиаторы воспаления, и что цитокины семейства лимфотоксинов (лимфотоксин, JIT) и фактор некроза опухоли (ФНО) вовлекаются в оба этих процесса [165]. В развитии лимфоузлов и в хроническом воспалении принимают участие комбинации ЛТ-о, ЛТ-/3 и ФНО-о, а также их множественные рецепторы [179]. Организованная лимфоидная ткань, возникающая в результате микробной инфекции или аутоиммунного заболевания, получила название «третичного лимфоидного органа» [229].

Термин «третичная лимфоидная ткань» был использован для того, чтобы обозначить места, где в нормальных условиях лимфоидный компонент незначителен, но в условия инфекции или хронического аутоиммунного заболевания он приобретает вид лимфоидного органа. Морфологически «третичный лимфоидный орган» представляет собой образование, по клеточной композиции не отличающееся от лимфоузла [134]. Кровеносные сосуды внутри и вокруг места повреждения приобретают вид и антигенную характеристику кровеносных сосудов лимфоузлов.

Неоорганогенез лимфоузлов был получен на трансгенных мышах в почке и поджелудочной железе с помощью эктопической экспрессии цитокинов семейства ФНО [172, 213]. При этом показано, что вновь образованные лимфоузлы имеют не только соответствующее морфологическое строение, но также и характерные антигенные особенности [120, 214].

Исследования, проведенные на животных, полученных с помощью генной инженерии, показали, что цитокины и хемокины, являющиеся медиаторами воспаления и иммунного ответа, одновременно играют важную роль в неогенезе лимфоузлов [214].

Цитокин, играющий критическую роль в развитии лимфоидных органов - один из членов семейства цитокинов туморнекротического фактора - лимфотоксин-а (JlT-а), он же -фактор некроза опухоли (ФНО-{3) [165]. Он необходим для развития вторичных лимфоидных органов в норме. Мыши, генетически дефектные по LT-a, имеют дефекты развития лимфоидных органов. У них происходит утрата лимфоузлов и Пейеровых бляшек, нарушается структура селезенки.

При эктопической экспрессии ЛТ-a в поджелудочной железе и почках у трансгенных животных возникает воспаление, которое имеет характеристики лимфоидных органов. Это касается клеточной композиции (Т-клетки, В-клетки, дендритные клетки, фолликулярные дендритные клетки), В- и Т- компартментализации с формированием фолликулов из В-лимфоцитов и структур, подобных герминативным центрам, специализации сосудистой системы с венулами с высоким эндотелием [246], а также повышенной экспрессии маркеров, связанных с эндотелием лимфоузлов [153], таких как молекула адгезина клеточной адгезии слизистой оболочки (MAdCAM) и адгезина периферических лимфоузлов, т.е. происходит индукция лимфоидного неоорганогенеза. Такая же организованная лимфоидная ткань, расположенная эктопически (третичные лимфоидные органы), была найдена при множестве аутоиммунных заболеваний человека, включая диабет 1 типа, ревматоидный артрит, рассеянный склероз и зоб Хашимото.

При аутоиммунных заболеваниях, характеризующихся хроническим воспалением, в генезисе которого принимают участие цитокины семейства ФНО, происходят характерные события, которые заключаются в проникновении антигенспецифических Т-клеток в орган-мишень, привлечении других Т-клеток, В-клеток и макрофагов, а также активации клеток, находящихся в этом месте [120]. Повреждение ткани вызывается как активированными Т-клетками, так и макрофагами, а «увековечение» повреждения происходит в виде феномена, который был назван лимфоидный неогенез - процесс, при котором длительная продукция цитокинов JIT-a, ФНО-а, ЛТа^ приводит к формированию организованных лимфоидных структур.

Первоначально считалось, что ФНО-а является продуктом макрофагов и Т-клеток, а ЛТ-а3 и ЛТ-а^ч - продуктом CD4THi Т-клеток и CD8 Т клеток. Эти и другие цитокины семейства ФНО играют определенную роль в развитии лимфоидных органов. Предполагается, что эти молекулы продуцируются не только макрофагами и Т-клеткми, но и другими клетками, природу которых предстоит выяснить.

Большая или меньшая роль, которую играют члены семейства ЛТ-ФНО в развитии лимфоидных органов, была объяснена через комбинационные взаимодействия лигандов и их рецепторов. Так, было установлено, что ЛТ-а индуцирует экспрессию хемокина вторичной лимфоидной ткани (SLC) и хемоаттрактанта В-лимфоцитов (BCL), которые являются хоминг-хемокинами для лимфоцитов и дендритных клеток и осуществляют перемещение этих клеток в лимфоидных органах. К тому же BCL привлекает некоторые Т-лимфоциты и Т-клетки памяти [213].

Наиболее вероятными продуцентами BCL являются В-лимфоциты и фолликулярные дендритные клетки [240]. Было показано, что В-лимфоциты являются также источником LT-a и LT-p. При развитии фолликулов и сети фолликулярных дендритных клеток В-лимфоциты являются главным источником ЛТ-а1в2 и ФНО. Сильная привлекающая В-клетки активность BCL вместе с необходимым присутствием В-клеток как источника ЛТ-а1в2 и ФНО говорит о том, что эти цитокины необходимы не только для того, чтобы вызывать привлечение клеток, но и для того, чтобы индуцировать включение программы последующих событий. Таким образом, лимфоидный неогенез может быть инициирован в результате привлечения В-клеток в нелимфоидную ткань, опосредованного через BCL.

Однако, одного накопления В-клеток недостаточно для активирования лимфоидного неогенеза.

ЛТ-а1(32 экспрессируется множеством типов клеток, включая эндотелиальные клетки и фибробласты, уровень его экспрессии высок в большинстве органов [213].

В исследовании, проведенном на культуре клеток эндотелия пупочной вены человека, показано, что ФНО-a и ЛТ обладают способностью активировать эндотелиальные клетки сосудов. При этом ФНО-a и ЛТ увеличивают адгезивность лимфоцитов, усиливают метаболизм эндотелиальных клеток (повышенный синтез РНК и белков), увеличивают их объем. ФНО и ЛТ играют роль в активации эндотелиальных клеток и in vivo, что приводит к развитию высокого эндотелия и усилению привлечения лимфоцитов. Т.о., цитокины принимают участие в мобилизации мононуклеарных клеток при хронических воспалительных реакциях, стимулируя способность эндотелия к ассоциированию лимфоцитов [172].

Показано, что некоторые типы лейкоцитов продуцируют хемокины, на которые отвечают как они сами, так и расположенные рядом клетки. Поэтому было выдвинуто предположение о аутокринных и паракринных амплификационных механизмах патологических процессов, протекающих под влиянием цитокинов [120].

Все вышеизложенное позволило нам предположить, что процесс индукции олипифатом неогенеза лимфоузлов в мышечной ткани идентичен по ключевым механизмам процессу неогенеза лимфоидной ткани при аутоиммунных заболеваниях и некоторых инфекциях, но имеет другой инициирующий фактор. Наличие зоны некроза, привлечение лимфоцитов и большого числа макрофагов к месту введения препарата говорит о большой степени вероятности интенсивной выработки цитокинов семейства ФНО активированными олипифатом лимфоцитами и макрофагами, а последующий каскад взаимодействий цитокинов приводит к эктопическому образованию лимфоузлов. В пользу этого предположения говорят также данные литературы о том, что гуминовые кислоты являются индуктором фактора некроза опухолей (ФНО) [92].

Наш интерес к обнаруженному феномену был обусловлен как задачами, стоящими перед практической медициной (это процессы воспаления, регенерации, иммунитета), так и общебиологическими проблемами, от решения которых зависят представления о морфогенезе в норме и патологии, о тканевой реакции на раздражители.

Средства сопровождения терапии онкологических больных

Модификаторы биологических реакций

Неблагоприятное воздействие на организм человека социальных, экологических и ряда других факторов, отрицательно влияющих на иммунную систему, провоцирует развитие иммунодефицитных состояний [94]. Одним из основных способов противостоять этому является применение модификаторов иммунобиологического ответа или адаптогенов. Адаптогены - это группа лекарственных средств, своеобразно сочетающих свойства протекторов и регуляторов гомеостаза в условиях многофакторного влияния окружающей среды и закономерного старения организма [160, 230, 245]. Как правило, это препараты природного (растительного или животного) происхождения. Механизм действия этих средств недостаточно изучен, но длительный опыт их применения в медицине не оставляет сомнений в их эффективности.

При исследовании механизмов действия адаптогенов был продемонстрирован их интерфероногенный эффект, установлено повышение активности натуральных киллеров как эффекторов системы естественной резистентности организма, усиление Т-клеточного звена иммунитета [7, 168, 178].

Одна из точек приложения действия адаптогенов -стимуляция выработки интерферона. Повышение активности натуральных киллеров, вероятно, является одним из проявлений интерфероногенного действия адаптогенов. Иммунорегуляция, которую наблюдают при использовании адаптогенов, может быть объяснена тем, что интерферон активирует макрофаги, которые, в свою очередь, стимулируют антигензависимые Т-лимфоциты [7]. Образование интерферона лимфоцитами периферической крови человека под действием адаптогенов наблюдалось и в клинических исследованиях [47].

Важным фармакологическим свойством адаптогенов следует считать их антистрессорное действие. Установлено, что введение адаптогенов на фоне стресса препятствует гипертрофии коры надпочечников, замедляет инволюцию тимуса и селезенки [12].

Большое значение при окислительном стрессе имеет предотвращение адаптогенами возрастания уровня перекисного окисления липидов, а также стимуляция антиоксидантных систем организма [109].

В последние годы возросла роль модификаторов биологических реакций (МБР) в онкологии. Появились агенты, обладающие способностью положительно изменять биологическую реакцию организма на опухоль, при этом противоопухолевое действие реализуется опосредованно путем влияния на опухолевый процесс или на организм, в котором развивается злокачественная опухоль. Благоприятный терапевтический эффект подобных препаратов определяется повышением иммунной защиты, усилением определенных звеньев противоопухолевого иммунитета, усилением прямого противоопухолевого ответа путем модификации опухолевых клеток, снижением трансформации и/или усилением дифференцировки опухолевых клеток [66]. Понимание особенностей механизмов противоопухолевого иммунитета, в частности - значения различных цитокинов в реакциях иммунного ответа на опухоль, позволило оценить роль МБР как экзогенных стимуляторов их выработки [39, 75]. Обобщая известные свойства адаптогенов, можно сделать вывод об их сходстве с а-интерфероном по иммуномодуляции (стимуляции NK-клеток, Т-лимфоцитов), антипролиферативной активности в отношении опухолевых клеток, регуляции клеточной дифференцировки, биомодуляции активности цитостатиков, преодолении лекарственной резистентности и др. [12].

Адаптогены не только повышают устойчивость организма к разнообразным вредным воздействиям физической, химической и биологической природы [8, 31, 95, 133], но и ослабляют токсичность разнообразных химических веществ [36, 58, 167]. Часто адаптогены ослабляют токсические проявления побочного действия противоопухолевых препаратов [11].

Поскольку нарушение показателей крови нередко служит серьезным препятствием для проведения химиотерапевтического лечения, представляется перспективным изучение средств, препятствующих нарушению изменений в системе крови, в частности, лейкопении при воздействии цитостатиками [25].

При доклиническом изучении специфической активности адаптогенов полидана, риалама и адаптовита в экспериментах на мышах было показано, что они обладают свойством ослаблять цитопению и ускорять восстановление количества лейкоцитов в периферической крови после применения цитостатиков [9]. Впоследствии препарат полидан (натрия нуклеоспермат) вошел в клиническую практику как стимулятор лейкопоэза [51, 68]. Он восстанавливает гематологические показатели, сниженные в результате химиотерапии цитостатическими лекарственными средствами или лучевой терапии [67].

Полидан обладает способностью стимулировать гемопоэз, оказывая влияние на процессы пролиферации, миграции и дифференцировки колониеобразующих единиц и действуя на всех уровнях кроветворения. Он принимает активное участие в клеточном метаболизме, встраиваясь в клеточные структуры, особенно, в пролиферирующих тканях. Препарат стимулирует продукцию и дифференцировку клеток-предшественников нейтрофильного ряда [43], ускоряет гранулоцитопоэз на стадии промиелоцитов и миелоцитов, увеличивает общее количество и содержание зрелых форм нейтрофильных лейкоцитов в периферической крови, не провоцируя появление последующей компенсаторной цитопенической паузы [17, 18, 19]. Способность препарата стимулировать гемопоэз связана с тем, что препарат вызывает повышение продукции эндогенных колониестимулирующих факторов, действуя посредством микроокружения, индуцирующего кроветворение [10]. Применение полидана способствует повышению уровня тромбоцитов и увеличению относительного количества лимфоцитов [80].

Полидан оказывает иммуномодулирующее действие на клеточном и гуморальном уровнях (активирует клетки-киллеры, стимулирует антителообразование), активирует противовирусный, противогрибковый и противомикробный иммунитет, подавляет репродукцию вируса ВИЧ, эффективно снижает вирусную нагрузку ВИЧ-инфицированных пациентов [62].

Препарат ослабляет выраженность иммунодепрессии после лучевой терапии и полихимиотерапии, увеличивая содержание СД4+, повышает их долю в соотношении иммунорегуляторных субпопуляций (СД4+/СДЗ+), сохраняя высокую пролиферативную активность Т-лимфоцитов [19].

Проявляя умеренную антиоксидантную активность, полидан значительно снижает уровень супероксиддисмутазы (СОД) и малонового диальдегида (МДА) [51].

Все эти свойства позволяют использовать полидан не только для лечения и профилактики лейкопении и тромбоцитопении, возникающей при лучевой и цитостатической терапии у больных со злокачественными новообразованиями, но и для борьбы с иммуносупрессией, возникающей при химио- и лучевой терапии, профилактики вторичной инфекции, сопутствующей цитостатической терапии. Кроме того, описаны положительные эффекты при применении препарата в составе комбинированной терапии при лечении ВИЧ-инфекции [62].

Созданный на основе автолизата пивных дрожжей новый лечебно-профилактический препарат адаптовит вошел в клиническую практику в качестве адаптогена. Обладая адаптогенными и иммунотропными свойствами, он оказывает комплексную регуляцию функций организма на уровне основных гомеостатических систем и рекомендуется к применению для восстановления организма после перенесенных заболеваний, при снижении устойчивости к простудным и другим инфекционным заболеваниям, при иммунодефицитных состояниях, нейроциркуляторной дистонии, гипертонической болезни I-IIA стадии.

Препарат риалам, представляющий собой высушенный гидролизат крови животных, также относится к группе адаптогенов. Он содержит в своем составе аминокислоты, нуклеопептиды, гликопептиды, липидопептидные фрагменты мембран и некоторые другие биологически активные соединения. Препарат оказывает общеукрепляющее, иммуномодулирующее действие при высоких физических и умственных нагрузках.

К лекарственным средствам такого рода предъявляются определенные требования, которые состоят в том, что адаптоген должен обладать нормализующим действием независимо от направленности предшествующих сдвигов. Действие адаптогена должно быть тем более выражено, чем более глубоки неблагоприятные сдвиги в организме.

Безопасность - универсальное требование к медикаментам любого типа - в полной мере относится и к адаптогенам и гемостимуляторам. Препараты этого типа не должны вызывать существенных изменений нормальных функций организма. Обычно эти препараты малотоксичны, но, как и другие стимуляторы, должны применяться с соответствующей осторожностью, так как их нежелательные эффекты могут проявиться при передозировках.

Препараты полидан, адаптовит и риалам были исследованы нами на этапе их доклинического изучения. В токсикологических экспериментах они не проявили никаких токсических свойств. Тем не менее, необходимо было установить основные показатели токсического действия этих фармакологических веществ: определить органы-мишени, продемонстрировать зависимость степени повреждающего действия препаратов от дозы и обратимость токсических эффектов. Нами была предпринята попытка решения этих задач методом патоморфологии. Анальгетики, противовоспалительные, противотуберкулезные средства (просидол, аспинат и изоглиопэк)

Просидол - оригинальный синтетический анальгетик центрального действия, представляющий собой производное оксипиперидина. Препарат разработан в Институте химических наук им. А.Б. Бектурова под руководством профессора К.Д. Пралиева.

Исследования специфической фармакологической активности просидола проводились в сравнении с промедолом и морфином в Новокузнецком научно-исследовательском химикофармацевтическом институте [45, 60, 70]. Просидол в эксперименте проявил выраженную анальгетическую активность. Препарат быстро всасывается и проявляет болеутоляющий эффект как при энтеральных, так и при парентеральных путях введения [70, 97]. По анальгетической активности просидол уступает морфину и сравним с промедолом [97].

С целью получения разрешения на клиническое изучение препарата была проведена доклиническая оценка безопасности просидола [4, 45, 50, 59, 97, 99]. При изучении хронической токсичности было выявлено, что просидол не изменяет показатели ЭКГ. Не установлено существенного влияния препарата на гематологические и биохимические показатели при внутрижелудочном введении субстанции и таблеток. При парентеральном введении растворов наблюдалось сокращение времени свертывания крови. Просидол, подобно промедолу и морфину, оказывает угнетающее действие на центральную нервную систему. При длительном внутрижелудочном введении просидола в дозах, в 30-120 раз превышающих терапевтическую дозу для человека, обнаружены необратимые морфологические изменения в печени. Сравнительное изучение хронической токсичности просидола, промедола, морфина в эксперименте не выявило каких-либо отличий в характере воздействия на организм [38, 59, 70].

Инъекционная лекарственная форма просидола представляет собой 1% раствор в изотоническом растворе хлорида натрия для внутримышечного или внутривенного введения. Впоследствии был создан стабилизированный 1% раствор для инъекций. В соответствии с Методическими указаниями ФК МЗ при введении в лекарственную форму препарата вспомогательных веществ (стабилизаторов, растворителей и т.п.) для новой лекарственной формы фармакологического вещества обязательно проведение токсикологических исследований [52].

Токсикологические исследования новой лекарственной формы были проведены нами в сравнении с уже изученной.

В Институте химии твердого тела и механохимии СО РАН в 1994 году была разработана оригинальная технология получения быстрорастворимых лекарственных препаратов. Суть технологического процесса заключается в механической обработке порошкообразной смеси исходных веществ ударно-истирающими воздействиями в специальных мельницах. В результате формируются композитные частицы порошка с развитой поверхностью контакта твердых фаз компонентов. Уникальной особенностью таких материалов является быстрая реакция нейтрализации при гидратации (растворении) с образованием раствора соли фармацевтического вещества [33]

На основе этой технологии под руководством академика В.В.Болдырева было разработано лекарственное средство растворимый аспирин, названный аспинатом - аналог известного шипучего аспирина фирмы Байер. Российским ученым удалось придать препарату растворимую форму с меньшим количеством вспомогательных веществ. Изменения, внесенные в лекарственную форму препарата, позволили повысить ее растворимость.

Фармакокинетические исследования, проведенные в сравнении с аспирином Байера, показали, что оба препарата совершенно идентичны по таким показателям, как скорость нарастания концентрации в крови и время сохранения максимальной концентрации в крови.

Токсикологическое изучение новой лекарственной формы аспирина производилось нами в сравнении в аспирином фирмы Байер.

Помимо новых лекарственных форм анальгетиков центрального действия и жаропонижающих противовоспалительных средств, широко используемых в терапии онкологических больных, в качестве средства сопровождения нами была исследована новая лекарственная форма изониазида. Выбор этого препарата связан с тем, что у онкологических больных микобактериальные инфекции возникают чаще, чем в общей популяции. Предполагается, что это обусловлено повышенной восприимчивостью больных к инфекции либо реактивацией туберкулеза. С одной стороны, индуцированная химиотерапией иммуносупрессия, кортикостероиды и кахексия повреждают иммунитет. С другой - некроз опухоли может вызвать распад предсуществующих гранулем, освобождая отдельные микобактерии [102]. В случае, если анамнез больного или эпидемиологические данные указывают на контакт с больным туберкулезом или имеются данные об активном лечении туберкулеза, то при развитии легочных симптомов таким больным показана профилактика в виде ежедневного приема изониазида.

Терапия изониазидом назначается и больным, получающим вакцину БЦЖ. Внутрипузырная БЦЖ-терапия зарекомендовала себя как высокоэффективный метод лечения поверхностного переходноклеточного рака мочевого пузыря. У 20% больных отмечают локальные осложнения в виде грануломатозных циститов, простатитов, эпидидимитов. Имеются немногочисленные наблюдения развития в ответ на введение БЦЖ системных осложнений типа сепсиса с очагами специфического воспаления в печени, почках, легких и других органах [102].

Развитие лекарственной устойчивости у микобактерий туберкулеза является одной из проблем лечения этого заболевания. По данным литературы распространение устойчивых штаммов возбудителя туберкулеза происходит практически во всем мире [132, 231].

Установлено, что устойчивость к противотуберкулезным препаратам определяется мутациями в генах, кодирующих биосинтез миколовой кислоты (inhA), каталазную - пероксидазную активность (katG) и других [81]. Уровень устойчивости бактериальной культуры находится в зависимости от концентрации используемого для лечения препарата. При повышении последней повышается и уровень устойчивости бактериальной культуры [82].

Большое значение при выборе терапевтического воздействия на Mycobacterium tuberculosis имеет свойство микроорганизма сохранять жизнеспособность внутри фагоцитов [81].

Исходя из международного опыта, было выделено несколько перспективных направлений в борьбе с туберкулезом, в частности, внедрение лекарственных форм фиксированных комбинаций противотуберкулезных препаратов, отличающихся сравнительно простыми схемами приема, а также пролонгированных аналогов существующих эффективных препаратов.

Изониазид является базовым антимикобактериальным препаратом и входит во все терапевтические схемы лечения туберкулеза. Этот препарат был создан в конце 50-х годов и до настоящего времени не существует более эффективного аналога, превосходящего его по спектру терапевтической активности. In vitro (в клеточных культурах) изониазид обладает высокой антимикобактериальной активностью. Однако in vivo изониазид значительно менее эффективен вследствие внутриклеточной локализации возбудителя. При поступлении изониазида в кровоток происходит гибель свободно-циркулирующих Micobacterium tuberculosis. В зону персистенции микобаьсгерий - инфицированные фагоциты и эпителиоидные клетки гранулем - препарат поступает в незначительном количестве ввиду особенности фармакокинетики. Около 90 % вводимого изониазида элиминируется в течение 24 часов печенью и почками. Следует подчеркнуть, что быстрая элиминация препарата и низкий процент доставки туберкулостатика в инфекционный очаг обусловливает периодичность его введения для поддержания постоянной терапевтической концентрации в крови. К этому следует добавить, что изониазид, как и другие противотуберкулезные препараты, относится к высокотоксичным соединениям и лечение туберкулеза сопровождается токсическими осложнениями со стороны печени, почек и ЦНС. Терапия туберкулеза изониазидом была бы более эффективной и сопровождалась бы значительно меньшим процентом осложнений, если бы удалось получить пролонгированную лекарственную форму этого препарата и осуществить его направленную доставку в инфицированные макрофаги. С этой целью для лечения туберкулеза были разработаны новые лекарственные средства на основе фосфолипидных липосом, содержащие изониазид и стрептомицин [21]. Было показано, что в гранулематозно пораженных органах концентрация липосомальных антибактериальных лекарств увеличивается в 2-9 раз с соответственным повышением их эффективности [20].

Эффект пролонгирования специфической активности лекарственного средства может быть достигнут путем иммобилизации его на какой-либо полимерный носитель. При иммобилизации биологически активное вещество химически связывается с полимерным носителем, что приводит к изменению биологических и фармакологических свойств препарата.

В Новосибирском НИИ туберкулеза МЗ РФ под руководством член-корр. РАМН В. А. Шкурупия изониазид был химическим способом связан с полисахаридной матрицей - декстраном. Проведенные исследования in vitro и in vivo показали, что препарат обладает не только высокой антимикобактериальной активностью, но и значительно менее токсичен, чем свободный изониазид. Основными препятствиями на пути внедрения этого препарата в фармацевтическое промышленное производство были высокая стоимость и сложность химического синтеза.

Для создания перспективного комплекса декстрана с изониазидом в ИЦиГ СО РАН был использован метод радиационной «сшивки» препарата с полимерным носителем и таким образом, получен препарат изодекс, который, в отличие от свободного изониазида, обладал значительно меньшей гепатотоксичностью. Однако, как известно, декстраны являются полисахаридами бактериального происхождения и способны вызывать тяжелые аллергические реакции.

В Научно-техническом центре "Лекбиотех" был создан композиционный полимерный носитель (КПН-2), на который был иммобилизован изониазид. На основе иммобилизованного изониазида был разработан новый препарат для лечения туберкулеза изоглиопэк, который проявил высокую специфическую активность в эксперименте. Предполагалось, что новая лекарственная форма позволит уменьшить токсичность изониазида.

Нами было проведено изучение токсичности изоглиопэка в сравнении с изониазидом. Поскольку в состав лекарственной формы входило вспомогательное вещество - композиционный полимерный носитель КПН-2, не разрешенный ранее к клиническому применению, в соответствии с методическими рекомендациями ФК МЗ РФ отдельно были изучены его токсические свойства.

Сравнительное исследование двух лекарственных форм просидола, аспината и аспирина С, изоглиопэка и изониазида было проведено нами с целью демонстрации возможностей патоморфологического исследования в установлении особенностей токсического действия препарата в зависимости от его лекарственной формы, если эти особенности не регистрируются другими методами.

Аскорбиген

Аскорбиген (АСГ) был синтезирован в ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков под руководством проф. М.Н. Преображенской. На его основе предполагалось создание лекарственного средства, обладающего антиканцерогенной и антитоксической активностью [71]. АСГ - природное соединение, является главным продуктом трансформации алкалоида глюкобрассицина, который содержится в высоких концентрациях в овощах семейства крестоцветных. АСГ образуется при разрушении растительной клетки в результате алкилирования аскорбиновой кислоты.

Во многих эпидемиологических исследованиях и экспериментах на животных было показано, что употребление в пищу большого количества овощей семейства крестоцветных препятствует развитию многих заболеваний, в частности, уменьшает риск заболевания раком различных органов [116, 144, 202]. К семейству крестоцветных относятся все виды кочанной капусты, брюссельская и цветная капуста, брокколи, репа, брюква, редиска и другие. Эти овощи содержат соединения, способные дезактивировать канцерогены, а также изменять метаболизм некоторых эндогенных веществ [42]. Идентификация этих соединений показала, что часть из них относится к группе индолов [73]. Было установлено, что природные индолы 3,3-дииндолилметан, аскорбиген, индол-3-карбинол и индоло[3,2-Ь]карбазол образуются в момент повреждения клеточных мембран при трансформации алкалоида глюкобрассицина или родственных ему соединений, присутствующих в меньших количествах, и обладают антиканцерогенными свойствами.

На основе природных индолов был синтезирован ряд синтетических производных, в частности, метил-аскорбиген.

Обработка культуры клеток РС-3 карциномы простаты человека 1-метил-аскорбигеном в дозе 100 мг/мл приводила к значительному уменьшению числа опухолевых клеток параллельно с увеличением числа клеток в состоянии апоптоза [114, 227]. Апоптоз может стимулироваться и другими индольными соединениями, образующимися при трансформации глюкобрассицина. Это было показано на культуре клеток LS-174 и Сасо-2 аденокарциномы толстой кишки человека [115].

Уменьшение риска возникновения некоторых видов рака при потреблении в пишу большого количества овощей семейства крестоцветных, вероятно, во многом связано с тем, что содержащиеся в них индолы модулируют экспрессию и активность цитохрома Р-450 (CYP) [225]. Обработка клеток LS-174 нетоксическими дозами 3,3'-дииндолилметана, аскорбигена, индол-3-карбинола и индоло[3,2-Ъ]карбазола в 21 раз усиливала активность цитохрома Р450 1А1. На клетках Сасо-2 аденокарциномы толстой кишки человека были получены такие же результаты [115].

Изменение активности цитохрома Р4501А1 (CYP1A1) - это механизм, посредством которого индолы, имеющиеся в овощах семейства крестоцветных, могут влиять на метаболизм ксенобиотиков. Аскорбиген (АСГ) - преобладающий индол, образующийся при деградации глюкобрассицина. Механизм, при помощи которого АСГ изменяет активность CYP1A1, неизвестен. АСГ в низких концентрациях ингибирует активность указанной изоформы цитохрома, а в высоких - ее индуцирует. На культуре клеток мышиной гепатомы Нера 1с1с7 была получена индукция активности CYP1A1, которая зависела от дозы препарата. Активность цитохрома возрастала в течение 72 часов и достигала уровня положительного контроля, в качестве которого использовали индолокарбазол - известный индуктор CYP1A1. Показано, что АСГ в культуральной среде превращается в индолокарбазол или соединение, по хроматографическим параметрам не отличающееся от него [226].

Эксперименты на крысах линии Вистар показали, что при введении в рацион питания индол-3-карбинола и АСГ в 0,1% концентрации в течение 3 недель увеличивает активность ферментов, осуществляющих метаболизм ксенобиотиков, в печени и слизистой оболочке кишечника и ослабляет токсические эффекты Т-2-микотоксина. Активность ключевых ферментов детоксикации (микросомальной карбоксилэстеразы и глюкуронозилтрансферазы) была в 1,5 - 2 раза выше у крыс, получавших с пищей индол-3-карбинол и АСГ, по сравнению с контрольными животными, которых содержали на обычном рационе [42].

Введение в рацион питания крыс в течение 5 дней белой и Савойской капусты, которая составила 25% сухого веса всего корма, привело к усилению активности ферментов (оксидаз со смешанными функциями) кишечника и печени. Индол-3-карбинол -потенциальный индуктор активности цитохрома Р-450 в печени, но в меньшей степени активирует ферменты в кишечнике, в то время как АСГ значительно усиливает активность оксидаз тонкой и толстой кишки, но не оказывает никакого воздействия на оксидазы печени [180].

В экспериментах на животных АСГ слабо индуцировал в печени CYP 1А1 и 1А2 и не влиял на CYP 2В1/2 [225].

D. W. Sepkovic и соавторы (1994) показали, что индолы, имеющиеся в овощах семейства крестоцветных, увеличивают образование катехолэстрогена и уменьшают частоту возникновения рака молочной железы у мышей. Протективное действие этих веществ может быть связано с общим уменьшением пула эстрогенов, способных превращаться в 16-альфа-гидроксиэстрон. 16-альфа-гидроксиэстрон - метаболит, обладающий значительной эстрогенной активностью, а также, вероятно, и мутагенными свойствами, может представлять собой потенциально канцерогенное соединение, образующееся в качестве промежуточного продукта при деградации эстрадиола. В микросомах крыс, предварительно получавших индол-3 -карбинол или АСГ, был найден высокий уровень 2-гидроксиэстрадиола. Основываясь на этих данных, авторы предполагают, что АСГ может действовать как антиканцерогенный агент и может предотвращать или уменьшать частоту возникновения рака молочной железы [220].

Аскорбиген был открыт на несколько лет позже, чем аскорбиновая кислота. В 1937 году он был выделен [201], а в 1966 году была установлена его структура [161]. Аскорбиген - 2-С-(индол-3-ил)метил-а-Ь-ксило-гекс-3-улофуранозоно-1,4-лактон получают синтетически из L-аскорбиновой кислоты и индолил-3-карбинола. Это индивидуальное оптически активное соединение [54]. Синтетический продукт по данным ЯМР, ВЭЖХ и ТСХ полностью идентичен природному.

АСГ применяется в США как пищевая добавка для снижения проявлений синдрома хронической усталости, а также при фибромиалгии у женщин. В предварительном исследовании было показано, что ежедневный прием женщинами с синдромом фибромиалгии по 500 мг в день смеси, содержащей 100 мг аскорбигена и 400 мг порошка брокколи, в течение 1 месяца приводил к уменьшению чувствительности к боли и улучшению качества жизни [117].

В настоящее время установлено, что антиканцерогенные свойства растений семейства крестоцветных определяются аскорбигеном, который обладает способностью активировать некоторые формы цитохрома Р-450, усиливать активность ряда ферментов, участвующих в метаболизме ксенобиотиков, инактивировать эстрогены в клетках рака молочной железы человека, ослаблять токсические эффекты отдельных веществ, в частности, техногенного токсина тетрахлородибензодиоксина.

Проведенные нами патоморфологические исследования внутренних органов экспериментальных животных в рамках доклинического токсикологического изучения препарата показали, что пероральное введение АСГ приводит к резкому увеличению числа и значительному усилению активности (по морфологическим критериям) клеток Панета [65].

Для того, чтобы понять логику дальнейших исследований, необходимо остановиться на свойствах этих клеток, а также природе и функциях продуцируемых ими соединений. До середины 90-х годов их происхождение, структура и функция были изучены недостаточно хорошо. В настоящее время известно, что клетки Панета (эпителиальные гранулоциты или экзокринные энтероциты) - это высоко дифференцированные клетки, расположенные в основании крипт тонкой кишки у многих видов животных. Эти секреторные клетки вносят свой вклад в барьерную функцию слизистой оболочки, выделяя гранулы, содержащие множество различных биологически активных веществ. Маркерами клеток Панета являются мурамидаза (лизоцим), фосфолипаза А2 второго типа и антимикробные пептиды, называемые криптдинами или дефенсинами крипт.

Известно, что лизоцим обладает способностью контролировать рост бактерий и активировать защитные реакции организма против инфекций [3]. Его антибиотическая активность и иммуностимулирующее действие используются при лечении инфекций желудочно-кишечного тракта. Лизоцим взаимодействует с антиген-презентирующими клетками лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником (GALT) и, в особенности, с лимфоидной тканью Пейеровых бляшек. Введение лизоцима приводило к значительному увеличению популяции CD4+T-лимфоцитов в популяции интраэпителиальных лимфоцитов. В Пейеровых бляшках увеличивались популяции CD3+, CD4+b CD8+ [189]. Эта его способность наряду с множеством других видов активности позволила предположить, что он может быть полезным при лечении онкологических больных и как противоопухолевый препарат, и как средство, позволяющее ускорить восстановление иммунитета после противоопухолевой химиотерапии. Попытки использовать лизоцим для лечения опухолей в эксперименте показали, что он не оказывает значительного действия на опухоль, но существенно тормозит возникновение метастазов [101]. Механизм контроля метастазирования не связан с прямым цитотоксическим действием лизоцима на опухолевые клетки, а, по-видимому, основан на активировании противоопухолевого иммунного ответа.

В клетках Панета была выявлена экспрессия фосфолипазы А2 2-ого типа, которая играет существенную роль при воспалении [184]. Помимо клеток Панета, фосфолипазу А2 2-ого типа экспрессируют кишечные энтероциты и культивируемые цитотоксические Т-клетки. Она участвует в обеспечении цитотоксической активности Т-клеток и играет ключевую роль в переваривании жиров грудного молока у новорожденных [171].

Криптдины - антимикробные пептиды семейства а-дефенсинов [218]. Пептидные антибиотики высших животных, в число которых входят и дефенсины, впервые были обнаружены в фагоцитирующих клетках, а затем были найдены и в эпителиальных. При применении иммунопероксидазного метода антитела к ним избирательно окрашивали клетки Панета в нормальной тонкой кишке взрослых животных. При электронной микроскопии было определено, что они локализуются в гранулах этих клеток [200].

Семейство ог-дефенсинов состоит из катионных богатых цистеином антимикробных пептидов, широко распространенных в природе. Кодируемые генами пептидные антибиотики непременные компоненты защитной системы млекопитающих, птиц, амфибий, насекомых, растений. Они обладают широким спектром антибиотической активности, связанной с их способностью нарушать функцию мембраны бактерий. Криптдины продуцируются клетками Панета в виде препропептидов и подвергаются посттрансляционному процессингу при участии матрилизина - металлопротеиназы матрикса [215]. В кишечнике мышей было найдено, по крайней мере, 17 изоформ криптдинов [187]. Различные изоформы криптдинов в разной степени экспрессируются в различных отделах тонкой кишки. В отдельных криптах обнаруживается один вид криптдинов, но отсутствует другой. Это говорит о том, что клетки Панета гетерогенны. Различия между ними связаны с позицией, которую они занимают на протяжении от проксимального к дистальному концу тонкой кишки [128].

Синтез пептидных антибиотиков de novo можно быстро индуцировать, что делает их особенно важными в начальной фазе образования устойчивости к микробной инвазии. Пептиды высших эукариот заслуживают особенного внимания с точки зрения их роли в естественном иммунитете и потенциальных возможностей как терапевтических агентов [176].

Секреция антимикробных пептидов регулируется автономной (парасимпатической) холинэргической нервной системой.

Включение секреции антимикробных пептидов происходит при появлении в просвете кишки бактериальных липополисахаридов. In vitro показано, что антимикробные пептиды, выделяемые клетками Панета, убивают Escherichia coli, Salmonella typhimurium и Listeria monocytogenes [203].

Дефенсины обладают высокой степенью специфичности по отношению к определенным микроорганизмам-мишеням. Гены криптдинов активны в эпителии кишки еще до дифференцировки клеток Панета [141]. Дефенсины клеток Панета являются ранними маркерами онтогенеза крипт. Их выявление играет существенную роль при изучении детерминирования клеточных типов кишечного эпителия. Дефенсины определяют врожденный иммунитет, защищающий внутреннюю среду организма хозяина [188].

Помимо лизоцима, фосфолипазы А2 второго типа и антимикробных пептидов, в клетках Панета был найден целый ряд биологически активных соединений. Так, О. Shimada и соавторы (1998) методами иммунофлуоресценции, ультраструктурной иммуноцитохимии, гибридизации in situ обнаружили, что клетки Панета синтезируют ДНК-азу-I и секретируют ее в просвет кишки в виде экзокринных секреторных гранул. Высокий уровень ДНК-азы-I был определен в цитоплазме клеток Панета в 12-перстной кишке, тощей и подвздошной кишке человека [222].

В клетках Панета и в некоторых бокаловидных клетках при иммуногистохимическом исследовании был найден белок, ассоциированный с панкреатитом (ПАП), - стрессорный белок, экспрессируемый в поджелудочной железе человека при панкреатите. Его экспрессия в кишечнике была обнаружена у людей с заболеваниями органов брюшной полости [119]. ПАП относится к лектинам. Конституционально ПАП экспрессируется у людей в подвздошной кишке в клетках Панега и иногда в бокаловидных клетках, но никогда - в толстой [177].

Клетки Панета играют определенную роль в гомеостазе цинка [158]. При ультраструктурном анализе клеток Панета Dinsdale D. (1984) обнаружил, что в их гранулах содержится цинк и кальций, причем, чем выше по направлению к верхушке клетки расположены гранулы, тем выше в них концентрация цинка [131]. В цитоплазматических гранулах клеток Панета также с помощью электронной гистохимии был обнаружен кишечный белок, богатый цистеином, и содержащий двойной цинк. В норме он содержится в кишечнике, перитонеальных макрофагах и мононуклеарных клетках периферической крови. Локализация этого белка в клетках Панета и в мононуклеарных клетках позволила авторам предположить, что его функция связана с механизмами защиты организма и/или процессами дифференцировки, общими для этих типов клеток [137].

По-видимому, элиминация металлов из организма также является функцией клеток Панета. Введенные через рот, ртуть и кадмий накапливались в клетках Панета. Часть клеток подвергалась дегенерации и некрозу [195].

Bulow S. с соавторами (1988) в клетках Панета тонкой кишки был выявлен эпидермальный фактор роста - полипептид, стимулирующий рост и дифференцировку клеток [118].

На базо-латеральной мембране клеток Панета был найден белок, связанный с множественной лекарственной устойчивостью (MRP). Тип субклеточного и клеточного распределения этого белка говорит о том, что он может играть особую роль в базо-латеральном транспорте эндогенных соединений [193].

Клетки Панета содержат в своих цитоплазматических гранулах ТНФ-а, который оказывает пролиферативное действие на клетки эпителия кишки in vitro. ТНФ-о; выделяющийся из разрушенных клеток Панета, ответственен за пролиферацию клеток тонкой кишки и осуществляет свое влияние через активацию NF-карраВ [219].

Клетки Панета экспрессируют высокий уровень лиганда CD95 - уникальное свойство для клеток желудочно-кишечного тракта. CD95 является лигандом рецептора CD35 (члена семейства рецепторов ТНФ), находящегося на поверхности клеток. CD35 широко экспрессируется в нормальных тканях. Его функция -индукция апоптоза. Его лиганд (CD95L) - член семейства цитокинов ТНФ. In vitro CD95L экспрессируется и выделяется Т-лимфоцитами. Спектр клеток, способных экспрессировать его in vivo, неизвестен. В лимфо-гистиоцитарных инфильтратах собственной пластинки слизистой оболочки, было найдено небольшое число таких клеток, часть из которых имели цитоплазматические отростки, а другие - лимфоидную морфологию. Собственно клетки желудочно-кишечного тракта не содержат этого лиганда, за исключением клеток Панета, экспрессирующих его в больших количествах. При язвенном колите увеличивается экспрессия этого лиганда в клетках воспалительного инфильтрата, при этом метаплазированные клетки Панета становятся единственными эпителиальными клетками, экспрессирующими CD95L. Клетки Панета негативны по CD35, следовательно, они не способны совершать опосредованный через CD95 аутокринный апоптоз. Однако, секретируя растворимый лиганд, они могут вносить вклад в сохранение целостности слизистой оболочки [181].

Клетки Панета экспрессируют CD 15 в норме и при заболеваниях желудочно-кишечного тракта. Так как CD 15 принимают участие в активации фагоцитов, их экспрессия в клетках Панета подтверждает предположение об их роли как антимикробных агентов и регуляторов флоры кишечника [108].

Клетками Панета у мышей вырабатывается ангиогенин Ang4. Это - циркулирующий белок, индуцируемый воспалением. Он выделяется в просвет кишки и проявляет бактерицидную активность против кишечных микробов [151].

Verburg М. И соавторы (2000), изучая пролиферацию, дифференцировку и гибель клеток эпителия тонкой и толстой кишки крыс после применения метотрексата, показали, что для его воздействия характерно снижение пролиферации, увеличение апоптоза и уменьшение числа и глубины кишечных крипт тонкой кишки по направлению от проксимального конца к дистальному. Повреждения не затрагивают клетки Панета, в которых увеличивается количество лизоцима и усиливается экспрессия mRNA. Бокаловидные клетки на верхушках ворсин также сохраняют свою структуру и функцию. Сохранность клеток Панета и бокаловидных клеток после воздействия метотрексатом, по-видимому, вносит свой вклад в эпителиальную защиту в период повышенной уязвимости кишечного эпителия [235].

Регенерация подвздошной кишки после воздействия цитотоксическими агентами начинается в области дна крипт. Она происходит за счет пролиферирующих клеток, находящихся на дне крипт. Клетки Панета не чувствительны к их воздействию и могут оказывать помощь в регенерации, участвуя в сохранении архитектоники основания крипт и создании микроокружения [121].

Анализ данных литературы о свойствах клеток Панета и секретируемых ими биологически активных соединений, позволил выбрать несколько направлений для поиска новых видов специфической активности АСГ:

1. Экспериментальная оценка антимикробной активности АСГ

2. Оценка возможности использования АСГ для защиты организма от токсического воздействия цитостатиков или для ускорения репарации вызванных ими повреждений;

3. Экспериментальная оценка способности АСГ стимулировать пролиферацию и дифференцировку клеток кишечника.

До настоящего времени нет единого мнения относительно того, определяются ли биологические эффекты АСГ его собственным действием, или они могут быть связаны с аскорбиновой кислотой (АК) и индол-3-карбинолом (И-З-К), которые образуются в организме в процессе трансформации АСГ. В связи с этим был поставлен ряд экспериментов, целью которых было сравнительное изучение биологических эффектов всех трех соединений.

Заключение

Таким образом, анализ современной литературы, посвященной свойствам, экспериментальным подходам к созданию и изучению, проблемам практического применения препаратов различных фармакологических групп природного и синтетического происхождения, показал следующее.

Не прекращаются попытки создания на рациональной основе новых лекарственных средств, не уступающих по противоопухолевой активности наиболее эффективным препаратам платины, имеющимся в распоряжении клинических онкологов. Поиск идет в ряду комплексных соединений металлов платиновой группы, и, хотя получены некоторые обнадеживающие результаты, до настоящего времени остается неясной связь между структурой лигандов и биологическими свойствами соединений. Проблема рационализации синтеза требует комплексного подхода, при котором необходимо учитывать данные о влиянии того или иного вещества не только на экспериментальную опухоль, но и на органы и ткани здоровых животных.

Одна из тенденций современной фармакологии - изменение фармакологической активности и токсических свойств лекарственного средства путем изменения его лекарственной формы, в частности, создание пролонгированных лекарственных форм, а также систем направленной доставки препаратов посредством их иммобилизации на полимерный носитель. Определенный вклад в решение проблемы модификации токсичности препарата при изменении его лекарственной формы может внести углубленное изучение структурных особенностей органов-мишеней.

Развитие иммунодефицитных состояний, связанных с резким ухудшением среды обитания человека, обуславливает необходимость внедрения в клиническую практику все большего числа протекторов и регуляторов гомеостаза - модификаторов биологических реакций. Модулирующие свойства препаратов этого типа позволяют повышать терапевтический потенциал других методов лечения и ослаблять их побочное действие. Зачастую информация об эффективности этих веществ является гораздо более полной, чем информация о безопасности их применения. Это обстоятельство диктует необходимость совершенствования экспериментальных подходов к изучению токсических свойств новых агентов.

Лекарственные средства, созданные на основе природных соединений, как правило, являются многокомпонентными смесями, но, даже, представляя собой одно вещество, они обладают

78 несколькими видами биологической активности. Поэтому очень часто на доклиническом этапе перед исследователями встает вопрос о том, какой вид активности данного соединения является основным, а какой - побочным. Для решения этой проблемы, по-видимому, целесообразно разработать приципы оценки морфологических изменений органов и тканей животных при патоморфологическом исследовании, проводимом в рамках доклинических токсикологических экспериментов.

В представленной работе предпринята попытка решения перечисленных задач, а также формирования подходов к прогнозированию побочного действия и специфической активности новых лекарственных средств на основе доклинических патоморфологических исследований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные.

В работе использовано 645 крыс, 347 мышей, 16 собак.

Исследования проводили на мышах линий C57B1/6J, мышах-гибридах (C57B1/6J х DBA2) B6D2Fb (СВА х C57BI/6J) Fb мышатах-сосунках колонии SHK, крысах линии Wistar и (AMCY х Wistar) Fb собаках породы Английский бигль. В опытах использованы животные обоего пола. Мелких лабораторных животных получали из питомника РАМН «Крюково», содержали в вивариях ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина и ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН в стандартных клетках: мышей - по 10 особей, крыс - по 5. Собак, разведения ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, содержали по одной особи в клетке. Для кормления использовали стандартный брикетированный корм. Все эксперименты выполнялись в соответствии с правилами работы на животных, принятыми в ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина, ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе и РАМН.

Эвтаназия. Для патоморфологического изучения внутренних органов крыс и мышей забивали путем декапитации. Собак усыпляли при помощи внутривенного введения высокой дозы барбитурата.

Препараты.

Изучены патоморфологические изменения внутренних органов экспериментальных животных при применении противоопухолевых препаратов морфозол, эфазол, доксорубицин, олипифат, и средств сопровождения терапии онкологических больных: полидана, адаптовита, риалама, просидола, аспината, изоглиопэка, аскорбигена, а также полимерных носителей иммобилизованных лекарственных форм.

Морфозол и эфазол. Комплексные соединения палладия морфозол и эфазол были получены из ИОНХ им. Н.С. Курнакова РАН. Синтезированы под руководством проф. И.А. Ефименко Исследуемые палладиевые комплексы вводили животным в моделях лекарственных форм. Испытуемые дозы суммарно составляли ЛД50 и МПД. Режим был выбран в соответствии с предполагаемым режимом клинического применения.

При исследовании хронической токсичности препаратов на всем протяжении эксперимента определяли массу тела животных, следили за состоянием и поведением. Проводили изучение показателей периферической крови, биохимический анализ сыворотки крови, клинический анализ мочи, определяли суточный диурез, исследовали электрокардиограмму во втором стандартном отведении.

Изучение морфологических изменений внутренних органов под действием препарата морфозол было проведено на 120 крысах Wistar самцах и самках, массой тела 120-140 граммов. Препарат вводили внутрибрюшинно в виде 0,1% раствора в изотоническом NaCl ежедневно в течение 20 дней с интервалом 24 часа в разовых дозах 5 и 2,5 мг/кг.

Патоморфологическое изучение препарата эфазол было проведено на 120 крысах линии Wistar самцах и самках, массой тела 130-160 граммов. Эфазол вводили внутривенно крысам в течение 5 дней с интервалом 24 часа в разовых дозах 15 и 5 мг/кг.

Животных забивали на 1, 15 и 30 сутки после окончания введений препаратов, вскрывали, определяли массу внутренних органов, их весовые коэффициенты. Участки внутренних органов брали для гистологического исследования.

Доксорубицин. Доксорубицин (ДОКС) и его лекарственные формы были получены из Московского Института Медицинской Экологии. Для создания наносомальных лекарственных форм использовали субстанцию доксорубицина гидрохлорида (Sicor, Italy), полисорбат 80 и декстран 70000 (Sigma, USA), бутилцианоакрилат (Sichel-Werke, Germany).

Доксорубицин, ассоциированный с полибутилцианоакрилатными наночастицами (ДОКС-НЧ), получали путем анионной полимеризации [28]. Средний диаметр частиц, определенный методом лазерного светорассеяния (Nanosizer Malvern, Great Britain), составлял 270±30 nm. Спектрофотометрическая оценка количества ДОКС в растворе после центрифугирования и выделения наночастиц показала, что с наночастицами связывается 56% препарата. Модификацию поверхности наночастиц полисорбатом 80 проводили непосредственно перед опытом. Суспензию наночастиц в 1%полисорбате 80 инкубировали 30 мин при 37°С и использовали в течение 2 ч. 1 мг наночастиц содержал 137,5 ±3,5 мкг ДОКС.

Альбуминовые НЧ получали методом высаливания. ДОКС адсорбировали на сывороточный альбумин человека (Sigma, Steinheim, Germany). Наночастицы формировали добавлением этанола и стабилизировали раствором глутаральдегида. Размер частиц составлял 404 ± 24 nm. 1 мг наночастиц содержал 44,3 ± 0,3 мкг ДОКС.

Исследование влияния различных вариантов лекарственных форм ДОКС, созданных на основе полибутилцианоакрилатных наночастиц. на сердечную мышцу и семенники крыс при однократном внутривенном введении в дозе 9 мг/кг, близкой к ЛД50, было проведено на неинбредных крысах-самцах массой тела 180-220 граммов. Одна группа крыс получала субстанцию препарата в физиологическом растворе, вторая - ДОКС-НЧ. Животные третьей группы получали ДОКС-НЧ в физиологическом растворе, содержавшем 1% полисорбата 80 (ДОКС-НЧ-ПС). Крысам четвертой группы вводили субстанцию ДОКС в физиологическом растворе, содержавшем 1% полисорбата 80 (ДОКС-ПС), пятая группа - интактный контроль.

Выживших животных забивали на 30 сутки после однократного внутривенного введения препаратов. Сердце и семенники фиксировали в 10% нейтральном формалине.

Исследование влияния различных вариантов лекарственных форм ДОКС, созданных на основе полибутилцианоакрилатных наночастиц, на сердечную мышцу и семенники крыс при многократном внутривенном введении было проведено на 72 крысах Wistar самцах массой тела 120-150 граммов. Животные были разделены на 6 групп по 12 особей, подвергавшихся следующим воздействиям:

1. Интактный контроль;

2. НЧ-ПС - наночастицы в физиологическом растворе, содержавшем 1% полисорбата 80, внутривенно трехкратно с интервалом 72 часа;

3. ДОКС - доксорубицин в стандартной лекарственной форме внутривенно трехкратно с интервалом 72 часа в разовой дозе 1,5 мг/кг;

4. ДОКС-ПС - доксорубицин в физиологическом растворе, содержавшем 1% полисорбата 80; в тех же дозе и режиме;

5. ДОКС-НЧ - доксорубицин, ассоциированный с наночастицами, в тех же дозе и режиме;

6. ДОКС-НЧ-ПС - доксорубицин, ассоциированный с наночастицами, в физиологическом растворе, содержавшем 1% полисорбата 80, в тех же дозе и режиме.

Перед началом введений препарата, а также на 15 и 30 сутки после курса снимали ЭКГ во втором стандартном отведении при помощи электрокардиографа ЭК1Е-07 «АКСИОН» (Россия).

На 15 и 30 сутки после курса введений препарата по 6 животных из группы декапитировали, вскрывали. При помощи электронных весов «Ochaus» (США) определяли массу сердца и семенников и рассчитывали их массовые коэффициенты. Статистическую обработку материалов проводили по f-критерию Стьюдента при помощи программы Microsoft Excel. Отличия считали достоверными при р <0,05.

Сердце и семенники затем фиксировали в 10% нейтральном формалине.

Исследование влияния лекарственных форм ДОКС, созданных на основе сывороточного альбумина человека, на сердечную мышцу и семенники крыс было проведено на 48 крысах Wistar самцах массой тела 200-250 граммов. Животные были разделены на 4 группы по 12 особей:

1. Интактный контроль;

2. ДОКС в стандартной лекарственной форме внутривенно трехкратно с интервалом 72 часа в разовой дозе 1,5 мг/кг;

3. ДОКС, ассоциированный с наночастицами, в тех же дозе и режиме в 1% растворе полисорбата 80 (ДОКС-А-ПС);

4. ДОКС, ассоциированный с наночастицами, в тех же дозе и режиме в растворе, не содержавшем полисорбата 80 (ДОКС-А).

На 15 и 30 сутки после курса введений препарата, гак же как и в предыдущем эксперименте, снимали ЭКГ во втором стандартном отведении, забивали по 6 животных из группы. Сердце и семенники взвешивали для того, чтобы рассчитать затем массовые коэффициенты, фиксировали в 10% нейтральном формалине.

Изучение гаметотоксичности различных лекарственных форм ДОКС на основе полибутилцианоакрилатных наночастиц было проведено в Медико-Генетическом Научном Центре РАМН совместно с Н.П. Макаровой под руководством проф. Л.Ф. Курило. Половозрелые самцы крыс линии Wistar, массой 120-150 граммов, были разделены на группы по 12 голов, которые получали одну из следующих лекарственных форм:

1 группа - наночастицы, обработанные полисорбатом 80 (НЧ+ПС);

2 группа - доксорубицин в стандартной лекарственной форме (ДОКС);

3 группа - доксорубицин в 1% растворе полисорбата 80 (ДОКС-ПС);

4 группа - доксорубицин, ассоциированный с наночастицами (ДОКС-НЧ);

5 группа - доксорубицин, ассоциированный с наночастицами, в 1% растворе полисорбата 80 (ДОКС-НЧ-ПС).

Препараты ДОКС вводили в хвостовую вену крыс в режиме 3x1.5 мг/кг с интервалом 72 часа. В качестве контрольной группы использовали интактных животных. По 6 животных из каждой группы забивали на 15 и 30 сутки после курса введений препаратов.

Гистологическую обработку семенников проводили по общепринятой методике, разработанной для световой микроскопии гонад [90].

Для количественного анализа состояния сперматогенного эпителия (СЭ) использовали определение индекса сперматогенеза: подсчитывали количество поперечных срезов извитых семенных канальцев (ИСК) с 4-мя, 3-мя и т.д. до 0 генераций половых клеток (ПК) на 100 срезов ИСК; по формуле рассчитывали индекс сперматогенеза [90], отмечали состояние собственной оболочки

ИСК, количество ИСК с десквамацией незрелых половых клеток (НПК) в просвет и количество ИСК с расслоением СЭ, появлением пустот и лакун в СЭ (на 100 ИСК).

Степень достоверности полученных результатов устанавливали при статистической обработке в системе STATISTIC А 6.0 с использованием f-критерия Стьюдента. Результаты считали достоверными при р ^),05.

Полидан. Препарат полидан был получен из НПФП «ПОЛИДАН», представляет собой высокоочищенную стандартизованную смесь натриевых солей полихлоргидратов дериватов ДНК и РНК, выделенных из молок осетровых рыб.

Исследования были проведены на 45 крысах Fi (AMCY х Wistar) самцах массой 220-250 граммов. Животные получали препарат в лекарственной форме в виде 1,5% раствора в 0,1% растворе хлорида натрия. Для изучения токсичности препарата на крысах режим пятикратного ежедневного подкожного введения в дозах 6 и 30 мг/кг был выбран, исходя из рекомендованных для клинического применения доз и режима. Суммарные курсовые дозы составили 30 и 150 мг/кг соответственно, что в 10 и 50 раз превышает рекомендуемую дозу для человека.

В субхронических экспериментах на собаках использовали разовые дозы 5 и 20 мг/кг при пятидневном курсе, что суммарно, при пересчете через поверхность тела, составляет дозы примерно в 40 и 200 раз превышающие рекомендуемые для человека. Эксперимент был выполнен на 4-х половозрелых собаках породы Английский бигль - самцах и самках массой тела 12,7 - 21кг.

Адаптовит. Препарат адаптовит был получен из ООО «Биотехнология», представляет собой гидролизат пекарских дрожжей.

Исследования препарата адаптовит проведены на 90 крысах самцах линии Wistar, массой 120-140 граммов. Животным вводили препарат в желудок с помощью металлической канюли в разовых дозах 100; 250 и 500 мг/кг ежедневно в течение 30 дней в виде 10 % взвеси в водопроводной воде и забивали на 1 и 30 сутки после окончания курса введений. Дозы препарата рассчитывали, исходя из данных по острой токсичности препарата на крысах при пероральном введении. Суммарные дозы соответственно составляли Уг от МПД, ЛДюо, и 2 ЛДюо

Риалам. Препарат риалам был получен из НПО «РИАЛ», представляет собой высушенный аутолизат крови телят. Исследования препарата риалам были проведены на крысах (AMSY х Wistar) Fi 45 самках и 45 самцах, массой тела 120 - 150 граммов. Субстанцию риалама растворяли в 0,9 % растворе хлорида натрия и в 10% концентрации вводили крысам внутрибрюшинно в разовых дозах 500 и 50 мг/кг ежедневно тридцатикратно. Дозы препарата рассчитывали, исходя из данных по острой токсичности риалама на крысах при внутрибрюшинном введении. Суммарные дозы соответственно составляли 15000 мг/кг (доза, превышающая в 2 раза ЛДюо) и 1500 мг/кг (доза, составляющая Уг от МПД).

Изучение морфологических изменений внутренних органов под действием препарата риалам было проведено также на 4 собаках (2 самца и 2 самки) породы Английский бигль. Препарат вводили внутривенно в разовых дозах 200 и 300 мг/кг ежедневно в течение 10 дней в виде 10 % раствора в 0,9% растворе хлорида натрия.

При исследовании хронической токсичности препаратов адаптовит, риалам и полидан проводили изучение показателей периферической крови, биохимический анализ сыворотки крови, определяли суточный диурез и исследовали клинические анализы мочи. Еженедельно на всем протяжении эксперимента определяли массу тела животных, следили за поведением и состоянием животных (состояние шерстного покрова, наличие поноса, положение в пространстве, двигательная активность, состояние глазных щелей). Исследовали электрокардиограмму животных во втором стандартном отведении.

Для патоморфологического изучения забивали по 5 крыс из каждой группы на 1 и 30 сутки после окончания курса введений риалама и адаптовита. При исследовании полидана крыс забивали на 1, 20 и 45 сутки после курса введений. Животных вскрывали, определяли массу внутренних органов, их весовые коэффициенты. Кусочки органов фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина.

Собак усыпляли на 3 и 30 сутки по окончании курса введений препарата при помощи внутривенного введения высокой дозы барбитурата. Участки внутренних органов брали для гистологического исследования.

Просидол. Лекарственные формы просидола были получены из Института химических наук им. А.Б. Бектурова. Исследование было проведено на 60 крысах самцах (AMSY х Wistar) F^ массой тела 130 - 160 граммов. Обе лекарственные формы вводили внутримышечно в течение 10 дней в эквитоксических дозах: 1% раствор препарата в изотоническом растворе хлорида натрия в разовых дозах 1 и 0,6 мг/кг, стабилизированную лекарственную форму - в разовых дозах 0,8 и 0,4 мг/кг. Продолжительность наблюдения составляла 30 дней. Животных забивали на 1 и 30 сутки после курса введений препарата. Участки внутренних органов брали для гистологического исследования.

Аспинат и аспирин С. Препарат аспинат в таблетках был получен из ИХТТ и МС СО РАН. В состав таблетки входили 400 мг ацетилсалициловой кислоты и 235 мг карбоната натрия.

Препарат аспинат в прямых экспериментах сравнивали с препаратом аспирин С фирмы BAYER AG (Germany). Таблетка аспирина С содержала 400 мг ацетилсалициловой кислоты и 240 мг аскорбиновой кислоты.

Исследования были проведены на крысах гибридах (AMSY х Wistar) Fi самцах, массой 150-170 граммов. Препараты аспинат и аспирин С растворяли в воде и в 4% концентрации вводили животным в желудок при помощи шприца с металлической канюлей. Дозы препаратов соответственно составляли 150 мг/кг и 250 мг/кг ежедневно в течение 30 дней. Суммарные дозы составили 4500 и 7500 мг/кг, что соответствовало однократной МПД и ЛД50. Одна группа животных служила контролем. Каждая группа насчитывала по 15 животных.

На 1 и 30 сутки по окончании курса введений препарата по 5 животных из группы забивали. Участки внутренних органов брали для гистологического исследования.

КПН-2. Композиционный полимерный носитель (КПН-2) был получен из НТЦ «Лекбиотех». Хроническая токсичность комплексного полимерного носителя (КПН-2) была изучена на 8 беспородных собаках. КПН-2 был предоставлен для изучения в виде таблеток массой 100 мг. Собаки получали таблетки носителя в желудок в течение 120 дней. Первая группа животных (2 самца и 2 самки) получали низкую дозу КПН-2, по 2 таблетки в сутки, что суммарно превышало терапевтическую в 5 раз. Животным второй группы (2 самца и 2 самки) вводили высокую дозу носителя — по 10 таблеток на прием, что суммарно превышало терапевтическую дозу в 15 раз.

Животные были усыплены (по 1 самцу и одной самке из группы) на 1 и 30 сутки после завершения курса введений КПН-2. Внутренние органы были подвергнуты патоморфологическому исследованию.

Изоглиопэк и изониазид. Препарат изоглиопэк в виде таблеток был получен из НИЦ БМТ ВИЛАР. В состав одной таблетки входили 300 мг изониазида, 70 мг дибазола, 76 мг композиционного полимерного носителя, 4 мг кальция стеарата.

Исследования токсичности препарата изоглиопэк в хроническом эксперименте были проведены на крысах самцах линии Wistar, массой 180-200 граммов, которым вводили препарат в виде таблеточной массы: таблетки изоглиопэка растирали в ступке в 1% крахмальном геле. Субстанцию изониазида растворяли в водопроводной воде. При помощи шприца с металлической канюлей препараты вводили в желудок крысам ежедневно на протяжении 90 дней.

Дозы изоглиопека рассчитывали по содержанию изониазида в таблеточной массе. Изоглиопэк вводили в однократных дозах 25 и 8 мг/кг, изониазид - 8 и 3 мг/кг, которые суммарно составляли дозы, близкие к однократным ЛД50 и МПД. Животные были забиты на 1 и 30 сутки по окончании курса введений.

Поскольку лекарственная форма изоглиопэка в связи с особенностью композиции не предполагает дробления таблетки, так как при этом нарушается свойство пролонгированного высвобождения препарата, дополнительно было проведено исследование на 5 беспородных собаках (3 самцах и 2 самках).

Изоглиопэк в лекарственной форме вводили собакам внутрь тридцатикратно ежедневно по 1 (300 мг) или 2 таблетки (600 мг). Так как определение острой токсичности на собаках не проводилось, дозы рассчитывали, исходя из терапевтической дозы изониазида для человека при тридцатидневном курсе. Пересчет доз для собак производили по методу Freiriech J. et. al. [137] с использованием коэффициентов поверхности тела. Собаки № 1 и 2 получали препарат в дозе, равной 1 терапевтической дозе, собаки № 3 и 5- в дозе, вдвое превышающей терапевтическую, собака № 4 - в дозе, в три раза превышавшей терапевтическую.

Собаки были усыплены - на 1 (№ 1, 2 и 3) и на 30 (№ 4 и 5) сутки после окончания курса введений препарата.

Участки органов были взяты для гистологического исследования.

Олипифат. Препарат получен из ОАО «ЛИГФАРМ», представляет собой многокомпонентную смесь веществ, образованную в процессе окислительной деполимеризации лигнина.

Исследование местно-тканевых реакций было проведено на 10 половозрелых крысах самцах линии Wistar, массой тела 180-220 граммов. Олипифат вводили внутримышечно ежедневно в разовой дозе 100 мг/кг в течение 5 дней. На 3 и 30 сутки по окончании курса введений препарата по 5 животных забивали. Для гистологического исследования брали мышцу бедра с места введения.

Методы, использованные для выявления новых видов специфической активности олипифата:

1). Подтверждение возможности образования лимфоузла в мышечной ткани и изучение изменений в иммунокомпетентных органах при введении олипифата на крысах.

Для подтверждения возможности образования лимфоузла в мышечной ткани в области введения олипифата, а также с целью изучения изменений в иммунокомпетентных органах под воздействием препарата был поставлен опыт на 40 крысах самцах линии Wistar, массой тела 180-220 граммов. Животные получали препарат внутримышечно ежедневно пятикратно в разовой дозе 100 мг/кг. На 3, 10, 30 и 60 сутки по окончании курса введений препарата животных забивали (по 10 голов). Для гистологического исследования брали мышцу бедра с места введения, контралатеральную мышцу бедра, тимус, селезенку, лимфоузлы паховые со стороны введения препарата и контралатеральные, подмышечные и паратрахеальные.

2). Воспроизведение способности препарата индуцировать эктопический неогенез лимфоузлов, а также его влияния на иммунокомпетентные органы, на другом виде животных.

Исследование проведено на 30 мышах самцах гибридах (СВА х C57B1/6J) Fi массой тела 18-22 грамма. Животные получали препарат внутримышечно ежедневно пятикратно в разовой дозе 100 мг/кг. На 3; 10 и 30 сутки по окончании курса введений препарата животных забивали (по 10 голов). Для гистологического исследования брали мышцу бедра с места введения, тимус, селезенку и паховые лимфоузлы со стороны введения препарата.

3). Определение способности олипифата индуцировать эктопический неогенез лимфоузлов в зависимости от кратности введений препарата.

Представлялось интересным определить, сколько раз нужно ввести олипифат для того, чтобы индуцировать образование лимфоузла. Для этого было проведено исследование на 15 мышах С57 B1/6J самках массой тела 18-22 грамма. Мышей разделили на группы по пять животных в каждой, и вводили олипифат однократно; трех- и пятикратно с интервалом 24 часа в разовой дозе 100 мг/кг. На 9 сутки после последнего введения препарата для гистологического исследования брали мышцу бедра с места введения.

4). Изучение местно-тканевых реакций и структуры иммунокомпетентных органов мышей, получавших олипифат в комбинации с ЦФ.

Исследование проведено на 30 мышах гибридах (СВА х С57 B1/6J) F! самцах, массой тела 18-22 грамма. С целью оценки влияния олипифата на развитие гипоплазии в лимфоидных органах мышам вводили циклофосфамид (ЦФ) однократно внутрибрюшинно в дозе 200 мг/кг, эквивалентной МПД. Одна группа животных получала ЦФ за 24 часа до начала введений олипифата, другая - через 24 часа после 5-дневного курса олипифата. На 10 сутки по окончании введений олипифата животных декапитировали. Для гистологического исследования брали мышцу бедра с места введения, тимус, селезенку, лимфоузлы паховые со стороны введения препарата.

5). Изучение местно-тканевых реакций и структуры иммунокомпетентных органов мышей с опухолью, получавших олипифат.

Исследование проведено на 10 мышах С57 B1/6J самках, массой тела 18-22 грамма. Животным подкожно прививали меланому Bi6 по 1 х 106 клеток. Лечение начинали на 3 сутки после перевивки, вводя олипифат в той же дозе и режиме, что и в других экспериментах. На 5 сутки после окончания курса введений для гистологического исследования брали мышцу бедра с места введения, тимус, селезенку, лимфоузлы паховые со стороны введения препарата.

6). Изучение влияния олипифата на реакции противоопухолевого иммунитета.

В опыте были использованы мыши линии C57B1/6J самки. Олипифат вводили в дозе 100 мг/кг в мышцу бедра 1 раз в сутки в течение 5 дней.

Для оценки состояния противоопухолевого иммунитета был использован местный нейтрализационный тест по Wirm'y [241]. Донорские клетки селезёнки и опухоли (меланома В]б или рак лёгкого Льюис) смешивали непосредственно перед введением мышам-реципиентам в соотношении 50-100 к 1. Инокулят, содержащий 106 опухолевых клеток, вводили под кожу правого бока мышам-реципиентам в объёме 0,2 мл. День инокуляции опухолевых клеток принимали за 0. Мыши всех сравниваемых групп получали либо смесь опухолевых клеток с клетками селезёнки, полученными от доноров, либо только клетки опухоли. Полученные результаты обрабатывали статистически. Достоверность различия средних определяли по /-критерию Стьюдента. Достоверность различия в выживаемости определяли по непараметрическому U-критерию Вилкоксона. За достоверное принимали различие при р<0,05.

7). Влияние олипифата на индуцированную циклофосфамидом цитопению у мышей

Эксперимент был проведен совместно с к.б.н. Д.А. Бодягиным. В опытах использованы мыши (СВА х C57BI/6J) Fi самцы, массой тела 18-22 г, из которых сформировали 3 группы животных по 10 голов в каждой. В первой группе у животных индуцировали цитопению внутрибрюшинным введением ЦФ в дозе 200 мг/кг. Через 24 часа проводили пятидневный курс внутримышечных введений олипифата в дозе 100 мг/кг. Во второй группе сначала проводили курс введений олипифата в той же разовой дозе, а затем через 24 часа вводили внутрибрюшинно ЦФ в дозе 200 мг/кг. Положительным контролем служила третья группа мышей, получивших однократное внутрибрюшинное введение ЦФ в тот же день, когда вводили ЦФ другим группам животных. По стандартной методике у всех животных из всех групп брали кровь из хвостовой вены на 0 (фон). 3, 5, 7, 10, 14 и 21 сутки после введения ЦФ. В камере Горяева подсчитывали общее количество лейкоцитов. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием /-критерия Стьюдента.

Аскорбиген. Аскорбиген (АСГ) был синтезирован в ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН под руководством проф. М.Н. Преображенской.

Токсикологическое исследование. Изучение влияния АСГ на структуру внутренних органов экспериментальных животных при субхроническом пероральном применении этого соединения было проведено на 36 мышах (C57BI/6J х DBA2) B6D2F! самках, массой 18-22 грамма. Животные были разделены на группы по 12 голов. АСГ вводили в дозах 100 и 250 мг/кг в течение 14 дней в виде 1 % водного раствора. Животные контрольной группы получали питьевую воду в объеме вводимого препарата. Мышей забивали на 1 сутки после курса введений АСГ. Для гистологического исследования брали почку, печень, сердце, легкое, желудок, 12-перстную кишку, участки тощей, подвздошной и толстой кишки, поджелудочную железу, тимус, селезенку, лимфоузел.

Методы, использованные для выявления новых видов специфической активности АСГ:

1). Экспериментальная оценка антимикробной активности

АСГ.

Работа выполнена в ГУ НИИНА им. Г.Ф.Гаузе РАМН в группе д.м.н. Е.П. Мирчинк на модели сепсиса новорожденных мышей. В опытах использовали мышат-сосунков колонии SHK в возрасте 3-4 дней. Беременные самки SHK были получены из вивария ВНИХФИ (собственное разведение). За самками велось ежедневное наблюдение, сроки родов фиксировали.

Для получения сепсиса 3-4 дневным мышатам орально (через эластичный зонд) вводили бактериальные культуры Staphylococcus aureus, Е. coli, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae в дозе 5x106 КОЕ / мышь. Через 24 часа мышат осматривали, учитывали % гибели животных; далее мышат в стерильных условиях вскрывали и делали высевы на питательные среды путём отпечатков органов - селезёнки, печени, почек. Кроме того, для посева брали кровь из сердца. Для высева Staphylococcus aureus использовали желточно-солевой агар (МЖСА), для высева грамотрицательных культур - среду Левина.

При изучении профилактического действия АСГ новорожденных мышат в помёте условно делили на 2 группы; в первой группе мышатам, начиная с 3-4 дневного возраста орально (через эластичный зонд) вводили АСГ в разовой дозе 100 мг/кг в течение 7-8 дней. Мышата второй группы препарат не получали. Животным обеих групп одновременно орально вводили Staphylococcus aureus (клинический изолят) в дозе 5x106 КОЕ/мышь. Через 24 часа учитывали гибель. Мышат, включая павших, в стерильных условиях вскрывали, путём отпечатков высевали микроорганизмы из органов и крови, взятой из сердца.

2). Оценка возможности использования АСГ для предотвращения токсического воздействия цитостатиков и ускорения процессов репарации повреждений в кишечнике и органах иммунной системы.

Способность АСГ модифицировать побочные реакции цитостатиков была изучена на модели введения мышам циклофосфамида (ЦФ), для которого характерны угнетение кроветворения и поражение слизистой оболочки кишечника.

Исследование было проведено на 60 мышах (C57B1/6J х DBA2) B6D2Fi самцах, массой тела 20-22 грамма. Животные были разделены на 5 групп по 12 голов в каждой. ЦФ вводили в дозе 200 мг/кг (МПД) однократно внутрибрюшинно, АСГ - в разовой дозе 100 мг/кг в желудок ежедневно в течение 14 дней. АСГ применяли как до, так и после введения ЦФ. Схема эксперимента была следующей:

1 группа - ЦФ, на следующие сутки - курс АСГ. Забой на 1 сутки по окончании введений АСГ;

2 группа - курс АСГ, на следующие сутки - ЦФ. Забой на 8 сутки после курса введений аскорбигена.

3 группа - курс АСГ. Забой на 1 и 8 сутки по окончании курса.

4 группа - ЦФ. Забой на 8 и 15 сутки после введения.

5 группа - интактный контроль

Для морфологического исследования были взяты желудок, двенадцатиперстная кишка, поджелудочная железа, участки тонкой и толстой кишки, тимус, селезенка, паховый лимфоузел.

3). Влияние АСГ на развитие и течение токсической алопеции у новорожденных мышей, получавших циклофосфамид.

Применение цитостатиков, в частности ЦФ, часто сопровождается развитием токсической алопеции. На модели алопеции, развивающейся у новорожденных мышат при введении им ЦФ, было изучено влияние АСГ на этот вид токсичности цитостатика. Новорожденным мышатам колонии SHK в возрасте 10 дней перорально вводили АСГ в разовой дозе 100 мг/кг в течение 5 дней, затем - однократно внутрибрюшинно ЦФ в дозе 200 мг/кг и продолжали вводить АСГ еще 5 дней. На 6 сутки после введения ЦФ мышат забивали. Для гистологического исследования брали участки кожи бока.

4). Оценка способности АСГ стимулировать пролиферацию и дифференцировку клеток кишечника.

Исследование было проведено на новорожденных мышах. Беременные самки SHK были получены из питомника РАМН

Крюково». В первом эксперименте 12 мышат 5-дневного возраста были разделены на две группы. 6 новорожденным мышатам первой группы интрагастрально с помощью гибкого зонда вводили АСГ в ежедневной дозе 100 мг/кг в течение 10 дней. Вторая группа служила интактным контролем. По окончании введений препарата животных обеих групп забивали, участки подвздошной кишки фиксировали в 10% нейтральном формалине. Структурные изменения в развивающемся кишечнике мышат-сосунков анализировали с помощью световой микроскопии.

Во втором эксперименте были использованы мышата 3-4-дневного возраста. Животным одной из двух групп перорально вводили АСГ в ежедневной дозе 100 мг/кг в течение 7 дней. Затем мышатам обеих групп в желудок вводили клинические изоляты Staphylococcus aureus или Escherichia coli. Животным первой группы клинические изоляты вводили за 30 минут перед последним введением АСГ. На следующий день животных забивали и определяли частоту высеваемости микроорганизмов из крови, селезенки, почки и печени.

5). Оценка влияния аскорбиновой кислоты (АК) и индол-3-карбинола (И-З-К), а также их комбинаций с ЦФ, на слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта и структуру лимфоидных органов мышей.

Исследование проведено на 36 мышах СВА самцах, массой тела 20-22 грамма. Животные были разделены на группы по 6 голов, получавшие препараты в следующих дозах и режимах:

1. Интактный контроль

2. Циклофосфамид (ЦФ) 200 мг/кг однократно внутрибрюшинно

3. АК в разовой дозе 50 мг/кг в желудок в течение 14 дней.

4. И-З-К в разовой дозе 100 мг/кг в желудок в течение 14 дней.

5. ЦФ однократно внутрибрюшинно в дозе 200 мг/кг, на следующие сутки - АК в разовой дозе 50 мг/кг в течение 14 дней.

6. ЦФ однократно внутрибрюшинно в дозе 200 мг/кг, на следующие сутки - И-З-К в разовой дозе 100 мг/кг в течение 14 дней.

Животных забивали на 1 сутки после курса введений АК и И

3-К.

Для гистологического исследования брали желудок, поджелудочную железу, 12-перстную кишку, участки подвздошного отдела тонкой кишки, тимус, селезенку, паховый лимфоузел.

Гистологическая обработка. В экспериментах по изучению субхронической и хронической токсичности препаратов при забое для гистологического исследования брали сердце, легкое, печень, почку, желудок, все отделы кишечника, поджелудочную и щитовидную железы, надпочечник, гипофиз, семенник (у самок -матку и яичник), мочевой пузырь, тимус, селезенку, лимфоузлы.

Ткани фиксировали в 10% нейтральном формалине, по стандартной методике заливали в парафин. Срезы толщиной 5-7 jik окрашивали гематоксилин-эозином и подвергали световой микроскопии с использованием микроскопа «Olympus ВХ40» (Япония).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

1. Разработан методологический подход к патоморфологической оценке токсичности лекарственных веществ, заключающийся в делении вызванных ими структурных изменений на деструктивные и компенсаторно-приспособительные.

2. Разработаны принципы доклинической токсикологической оценки малотоксичных веществ (полидан, риалам и адаптовит), позволяющие установить органы-мишени, дозовую зависимость и обратимость повреждающего действия.

3. Определены особенности токсического действия 11 противоопухолевых препаратов и средств сопровождения терапии онкологических больных.

4. Выявлены общие черты и характерные особенности токсического действия комплексных соединений палладия эфазола и морфозола и установлена роль патоморфологического исследования в определении взаимосвязи между структурой и активностью фармакологических веществ.

5. Продемонстрирована роль лекарственной формы препарата в проявлении токсичности. Установлено значительное ослабление кардиотоксических и гонадотоксических свойств доксорубицина при применении его в наносомальных лекарственных формах, содержащих полисорбат 80.

6. Установлено, что замена в лекарственной форме аспирина аскорбиновой кислоты (аспирин С) на карбонат натрия (аспинат) ослабляет повреждающее действие препарата на ткани печени и почек, но вызывает повышенное слизеобразование в желудке и кишечнике.

7. Показано, что введение стабилизатора в лекарственную форму просидола ослабляет его повреждающее действие на ткань легкого, но приводит к появлению деструктивных изменений в поджелудочной железе и слизистой оболочке желудка.

8. Установлено, что иммобилизация изониазида на полимерный носитель значительно ослабляет его гонадотоксические и гемолитические свойства, не влияя на спектр органов-мишеней препарата, характер и интенсивность его повреждающего действия на структуру печени, почек и сердца.

9. На основе разработанного методологического подхода осуществлен прогноз новых видов фармакологической активности аскорбигена и олипифата, подтвержденный в специальных исследованиях.

10. Установлена способность аскорбигена усиливать защитную функцию слизистой оболочки тонкой кишки, оказывать антибактериальное действие, модифицировать токсичность циклофосфамида, ускорять дифференцировку клеток кишечника новорожденных мышей.

11. Выявлена токсико-модифицирующая, иммуномодулирующая и гемостимулирующая активность олипифата.

12. Установлено неизвестное ранее свойство препарата олипифат вызывать образование лимфоузлов в мышечной ткани животных, обусловленное местно-тканевой реакцией на введенное вещество, а также его иммуномодулируюгцей и гемостимулирующей активностью.

258

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные нами исследования свидетельствуют о высокой информативной значимости результатов патоморфологического изучения структуры внутренних органов экспериментальных животных при доклинической оценке безопасности лекарственных средств. Морфологическая диагностика патологических процессов, происходящих под действием фармакологических веществ, основывается на регистрации общепатологических признаков, таких как атрофия, гипертрофия, некроз, нарушения кровообращения, дистрофии и т.п. [83]. Оперируя понятиями общей патологии, мы установили такие важные в доклинической токсикологии характеристики токсического действия лекарственного средства, как орган-мишень, зависимость от дозы и обратимость токсических эффектов препарата. Они были определены для малотоксичных лекарственных средств риалама, адаптовита и полидана.

Вопросы обратимости токсического действия лекарственных средств не всегда могут быть решены на функциональном уровне в силу высоких компенсаторных возможностей органов и систем организма [84]. Как показали проведенные исследования, прогноз обратимости повреждающего действия препарата может быть сделан на основании результатов патоморфологического исследования.

С помощью патоморфологических исследований были выявлены особенности повреждающего действия препарата в зависимости от его лекарственной формы в тех случаях, когда они не определялись другими методами. На примере просидола, аспирина и изониазида было показано, что от лекарственной формы зависит не только интенсивность, но и направленность токсического действия препарата. Патоморфологическое исследование продемонстрировало снижение кардио- и гонадотоксичности при изменении лекарственной формы доксорубицина, что получило подтверждение при анализе электрокардиограммы и при количественной оценке состояния сперматогенного эпителия.

Поскольку целью доклинических токсикологических исследований является оценка безвредности новых лекарственных средств, основное внимание уделяется патологическим изменениям структуры органов и тканей. Из 12 изученных нами препаратов 10 вызвали патологические изменения различной степени выраженности в печени и почках. Это согласуется и с данными литературы, которые подтверждают, что большинство медикаментозных осложнений в клинической практике связано с поражением этих органов [69, 107]. Противоопухолевые препараты (морфозол и эфазол) вызывали как деструктивные, так и дистрофические процессы в тканях печени и почек, степень выраженности которых зависела от величины примененной дозы. При применении средств сопровождения (просидол, аспирин, изониазид, адаптовит, полидан) деструктивные явления проявлялись при введении препаратов в дозах, многократно превышающих лечебные, и носили мелкоочаговый характер. В основном, преобладали дистрофические изменения и нарушения кровообращения в виде очагового отека и полнокровия капилляров.

Гепато- и нефротоксичность лекарственных средств, как правило, относят к неспецифическим видам токсичности, связанным с метаболизмом и экскрецией препаратов [29]. M.JI. Гершанович считает, что разделение токсического действия на специфическое и неспецифическое весьма условно [24]. К относительно специфическим видам токсичности он относит повреждения структуры медленно обновляющихся тканей.

Кардиотоксичность противоопухолевого антибиотика доксорубицина относится к специфическим видам токсичности. Она является фактором, лимитирующим дозу препарата, и ограничивает его терапевтические возможности. Влияние изученных нами комплексных соединений палладия на миокард проявлялось в очаговых атрофических и дистрофических изменениях кардиомиоцитов. Средства сопровождения (адаптовит, просидол, изониазид) вызывали слабые дистрофические изменения только в дозах, многократно превышающих лечебные.

В решении вопроса о специфичности токсического воздействия на тот или иной орган или ткань данные патоморфологического исследования играют важную роль. Так, морфозол, полидан и стабилизированная лекарственная форма просидола оказали повреждающее действие на ткань поджелудочной железы, но только для морфозола этот вид токсичности можно считать специфическим, так как он ограничивает терапевтические возможности фармакологического средства. Некрозы в экзокринной и эндокринной части железы появлялись при применении морфозола уже в дозе, суммарно составляющей максимально переносимую, и с увеличением дозы усиливались.

Гонадотоксичность доксорубицина также проявлялась в лечебных дозах. Противоопухолевые препараты палладия гонадотоксическими свойствами не обладали. Полидан вызывал дистрофию и дискомплексацию сперматогенного эпителия в дозах, многократно превышающих терапевтические. Введение изониазида в дозе, близкой к ЛД50, приводило к глубокой атрофии сперматогенного эпителия, которую удалось значительно ослабить при иммобилизации препарата на комплексный полимерный носитель.

Парентеральное применение высоких доз морфозола, эфазола, полидана и риалама оказывало повреждающее действие на слизистую оболочку желудка. При этом под влиянием противоопухолевых препаратов возникали атрофические и некротические изменения покровно-ямочного эпителия и эпителия желез, под влиянием полидана - только очаговые атрофические изменения покровно-ямочного эпителия. Изменения в слизистой оболочке желудка при парентеральном введении риалама и внутрижелудочном введении аспината были связаны с изменением функциональной активности клеток.

Морфозол, как и многие другие противоопухолевые препараты, вызывал атрофию лимфоидной ткани иммунокомпетентных органов. Атрофические изменения в лимфоидных органах, возникавшие в отдаленные сроки после введений полидана, адаптовита и олипифата, связаны с их гемостимулирующей активностью, которая проявлялась сразу после введения препаратов в виде гиперплазии лимфоидной ткани. Эти реакции кроветворной ткани мы рассматриваем как копенсаторно-приспособительные.

Деструктивные изменения органов визуально выявляются значительно проще компенсаторных, поэтому при изучении патологических процессов им уделяется больше внимания, чем защитно-приспособительным реакциям.

Деление структурных изменений органов и тканей на патологические и компенсаторно-приспособительные условно. При исследовании морфозола, эфазола, аскорбигена и олипифата нами были отмечены явления метаплазии. Метаплазия соединительной ткани была найдена в клапанах сердца при исследовании препарата морфозол. Кишечная метаплазия эпителия желудка была обнаружена при изучении морфозола, эфазола и аскорбигена.

Метаплазия - процесс, при котором одна дифференцированная ткань замещается другой дифференцированной тканью в пределах одного гистиотипа. Хотя такое замещение носит адаптационный характер, оно является патологическим. Импульсами для подобных изменений часто служат воздействия различных фармакологических средств [61]. Морфозол вызывал неполную кишечную метаплазию, аскорбиген - полную, т.е. с присутствием всех клеток, которые встречаются в слизистой оболочке тонкой кишки. Способность аскорбигена индуцировать полную кишечную метаплазию в слизистой оболочке желудка имеет значение не только для понимания механизмов токсического действия этого вещества. Моделирование этого процесса в эксперименте открывает дополнительные возможности для изучения дифференцировки эпителиальной ткани и расшифровки механизмов такого распространенного патологического изменения, как кишечная метаплазия.

Понимая условность разделения структурных изменений на деструктивные и компенсаторно-приспособительные, мы, тем не менее, считаем такой подход плодотворным, так как он позволяет во многих случаях отличать проявления токсических свойств фармакологического средства от проявлений его специфической активности. Это нашло подтверждение в представленном исследовании: для адаптовита, риалама и полидана были выявлены такие изменения структуры внутренних органов, которые указывали на их специфическую активность и служили основой для предположений о механизмах действия препаратов.

Деление изменений структуры внутренних органов экспериментальных животных на деструктивные и компенсаторно-приспособительные позволило прогнозировать и затем подтвердить экспериментально новые виды фармакологической активности